CN113583925B - 一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法 - Google Patents

一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法，属于生物工程领域。本发明改造广藿香醇合酶及宿主菌株，获得能够高效发酵生产广藿香醇的重组菌及其发酵方法。该重组菌株能够以廉价的葡萄糖为底物，发酵生成高附加值的广藿香醇，摇瓶发酵96h广藿香醇产量达到338.6mg/L，得率为48.6mg/g干2细胞重量，体积生产强度为84.6mg/L/d。在5L发酵罐中，广藿香醇产量可达到970.1mg/L，体积生产强度为199mg/L/d。

Description

一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法
技术领域
本发明涉及一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法，属于生物工程领域。
背景技术
广藿香醇(patchoulol)又名百秋李醇，是天然植物中存在的三环倍半萜化合物，作为一种重要的香料 被广泛应用于香水、化妆品、精油等的制作，并具有保护神经、抗炎、抗癌、抗菌、镇痛、抗氧化、抗血 小板、抗血栓、抗抑郁和止吐等活性，显示出极高的药用价值。
广藿香醇生产的传统方法主要是从植物中萃取和化学合成法，但传统方法收率低，能耗大，产品不纯， 使得广藿香醇得不到大批量的生产，更不用说得到大批量的应用。虽然微生物发酵合成广藿香醇尚处于起 步阶段，但由于其生长周期短，适应性强等优势，有望成为广藿香醇生产的主要方法。目前有利用酿酒酵 母和谷氨酸棒杆菌发酵合成广藿香醇的报道(Ma et al.,Signifcantly enhanced production of patchoulol inmetabolically engineered Saccharomyces cerevisiae.J.Agric.Food Chem.,2019,67(31)：8590-8598)，但其产 量仍较低，还未达成广藿香醇的工业化发酵生产。
大肠杆菌具有遗传背景清晰、遗传操作容易、生长速率快、营养要求低等特点，作为细胞工厂应用于 多种产品的发酵生产。构建广藿香醇合成重组大肠杆菌，并对重组菌株及其发酵过程进行改良，将有助于 进一步提高广藿香醇的产量，降低成本，并促进广藿香醇的大规模发酵生产。
发明内容
针对目前存在的广藿香醇生产方法还较少、或产量较低等问题，本发明以大肠杆菌为出发菌株，构建 广藿香醇合成重组大肠杆菌，并对重组菌株及其发酵过程进行改良，以期进一步提高广藿香醇的产量，降 低成本，并促进广藿香醇的大规模发酵生产。
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了来源于Pogostemoncablin广藿香醇合酶突 变体和来源于Escherichia coli的法尼基焦磷酸合成酶，所述广藿香醇合酶GenBank为AY508730.1；所述 法尼基焦磷酸合成酶的Gene ID为945064。
在一种实施方式中，编码广藿香醇合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述广藿香醇合酶突变体为将GenBank号为AY508730.1的广藿香醇合酶第415 位突变，或将第415位和第454位同时突变。
在一种实施方式中，将所述广藿香醇合酶第415位突变为苯丙氨酸，或在第415位突变为苯丙氨酸的 同时将第454位的组氨酸突变为丙氨酸。
在一种实施方式中，在所述广藿香醇合酶C端融合表达T7A标签，所述T7A标签的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，法尼基焦磷酸合成酶与广藿香醇合酶通过(PT)4P短肽融合表达。
在一种实施方式中，以代谢改造的菌株为底盘细胞，所述代谢改造的菌株沉默了乙酸合成代谢途径编 码基因ackA-pta、乳酸代谢途径编码基因ldhA、乙醇合成代谢途径编码基因adhE、琥珀酸合成代谢途径编 码基因frdA的表达，表达了T7 RNA聚合酶编码基因T7RNAP，强化表达染色体上分泌代谢途径编码基因 macAB、tolC、msbA、yadGH、lptAB，并强化表达NADPH辅酶循环代谢途径编码基因pntAB。
在一种实施方式中，所述ackA-pta的Gene ID为为946775和946778；所述ldhA的Gene ID为为 946315；所述adhE的Gene ID为945837；所述frdA的Gene ID为948667；所述T7RNAP的Gene ID为 M38308.1；所述macAB的Gene ID为947322和945164；所述tolC的Gene ID为947521；所述msbA的 Gene ID为945530；所述yadGH的Gene ID为944833和944836；所述lptAB的Gene ID为947920和 947725；所述pntAB的Gene ID为946628和946144。
在一种实施方式中在大肠杆菌中沉默了乙酸合成代谢途径编码基因ackA-pta的表达，构建得到重组菌 株E.coli B0016-010，所述重组菌株E.coli B0016-010的构建方法公开于周丽等，温度调节基因开关调控 大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸，公开于2015年。
在一种实施方式中，所述强化表达是通过T7启动子进行目的基因的表达。
本发明提供了一种生产广藿香醇的方法，利用所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖、甘油、丙酮 酸钠为底物，或以葡萄糖、甘油、含有丙酮酸钠的物质为底物，生产广藿香醇。
在一种实施方式中，以100～200r/min摇瓶培养菌株。
在一种实施方式中，在菌株OD600为0.8～4时，用IPTG进行诱导，并添加十二烷萃取广藿香醇。
在一种实施方式中，发酵罐发酵培养细胞生长阶段在35-40℃条件下进行，当细胞干重达到不低于14 g/L时，开始广藿香醇合成阶段；在20℃下培养，溶解氧浓度不高于20％，并添加终浓度为0.2mM IPTG， 并在接下来的10h内以0.06mM/h的速率连续补加IPTG；从IPTG补加开始，以10mL/h的流速共添加 400mL十二烷萃取剂，葡萄糖和硫酸镁的补料速度率分别维持在3.6g/L/h和0.036g/L/h至发酵结束，共 发酵117h。
本发明提供了所述重组大肠杆菌在制备广藿香醇中的应用。
本发明的有益效果：本发明改造广藿香醇合酶及大肠杆菌宿主菌株，构建了一种高效合成广藿香醇的 重组大肠杆菌菌株，获得能够发酵法生产广藿香醇的重组菌及发酵方法。该重组菌株能够以廉价的葡萄糖 为底物，发酵生成附加值更高的广藿香醇，在摇瓶发酵条件下，发酵96h，广藿香醇产量可达338.6mg/L， 得率达到48.6mg/g细胞干重，体积生产强度达到84.6mg/L/d。得率和生产强度远高于现有报道水平。在 发酵罐条件下，发酵117h，广藿香醇产量可达970.1mg/L，体积生产强度达到199mg/L/d。该结果是目前 以葡萄糖为唯一碳源的最高报道。
附图说明
图1为PTS氨基酸序列比对结果图；PTS1和PTS2氨基酸序列比对；多个与PTS2同源性高的酶氨基 酸比对。
图2为不同来源广藿香醇合酶在大肠杆菌中表达SDS-PAGE图谱；M：ProteinMolecular Weight Marker； P：细胞破碎液沉淀；S：细胞破碎上清液。
图3为广藿香醇发酵样品鉴定结果图；(A)：标样和发酵样品的GC图谱和MS比对图谱；(B)：左图 为标样的母离子m/z为138.2产生的定量子离子m/z为95.1、110.1、123.1的离子峰图，右图为样品相应 离子的峰图。
图4为本研究发酵合成广藿香醇的代谢途径图。
图5为不同来源广藿香醇合酶发酵合成广藿香醇的产量比较图。
图6为广藿香醇发酵条件优化结果图；(A)：IPTG诱导时机优化；(B)：摇瓶转速优化；(C)：发酵过程 添加十二烷优化。
图7为添加促溶标签改造结果图；(A)：促溶标签结构及对广藿香醇合酶表达的作用；(B)：添加不同 促溶标签对菌株发酵合成广藿香醇的作用。
图8为法尼基焦磷酸合酶与广藿香醇合酶融合表达结果；(A)：连接短肽结构及对广藿香醇合酶表达的 作用；(B)：添加不同连接短肽对菌株发酵合成广藿香醇的作用。
图9为广藿香醇合酶分子改造结果图；(A)：广藿香醇合酶单点突变对广藿香醇发酵合成的作用；(B)： 单点突变对广藿香醇合酶表达的作用；(C)：广藿香醇合酶多点组合突变对广藿香醇发酵合成的作用；(D)： 多种策略组合对广藿香醇发酵合成的作用。
图10为宿主菌染色体基因改造菌落PCR电泳验证结果图；(A)：ldhA基因删除菌株PCR验证电泳图 谱，M：DL 5000Marker，泳道1：B0016-010菌株用YldhAF+YldhAR PCR产物，2：菌株020H用 YldhAF+YldhAR PCR产物；(B)：adhE基因删除菌株PCR验证电泳图谱，M：DL5000Marker，泳道1： 020H菌株用YadhER+AdhE-pKD13F PCR产物，泳道2：菌株030H用YadhER+AdhE-pKD13F PCR产物； (C)：T7 RNA聚合酶替换染色体上frdA基因PCR验证电泳图谱，M：DL 5000Marker，泳道1：030H菌 株用YfrdAF-2+YfrdAR PCR产物，泳道2：菌株040H frdA::T7RNAP-FRTKan用YfrdAF-2+YfrdAR PCR 产物，泳道3：菌株040H用YfrdAF-2+YfrdAR PCR产物；(D)：macAB启动子替换PCR验证电泳图谱， M：DL 5000Marker，泳道1：040H菌株用YmacAF+YmacAR PCR产物，泳道2：菌株050H PmacA::PT7- FRTKan用YmacAF+YmacAR PCR产物，泳道3：菌株050H用YmacAF+YmacAR PCR产物；(E)：tolC 启动子替换PCR验证电泳图谱，M：DL5000Marker，1：050H菌株用YtolCF+YtolCR PCR产物，泳道2： 菌株060H用YtolCF+YtolCRPCR产物。(F)msbA启动子替换PCR验证电泳图谱，M：DL 5000Marker， 泳道1：050H菌株用YmsbAF+YmsbAR PCR产物，泳道2菌株060H用YmsbAF+YmsbAR PCR产物； (G)：yadGH启动子替换PCR验证电泳图谱，M：DL 5000Marker，泳道1：060H菌株用YyadGHF+YyadGHR PCR产物，泳道2：菌株070HA(PyadGH::PT7-FRTKan)用YyadGHF+YyadGHR PCR产物；(H)lptAB启 动子替换PCR验证电泳图谱，M：DL 5000Marker，泳道1：070HA菌株用YlptABF+YlptABR PCR产物，泳道2：菌株080H(PlptAB::PT7-FRTKan)用YlptABF+YlptABR PCR产物；泳道3：菌株080H用YlptABF+YlptABR PCR产物；(I)pntAB启动子替换PCR验证电泳图谱，M：DL 5000Marker，泳道1： 080H菌株用YpntABF+YpntABR PCR产物；泳道2菌株090H(PpntAB::PT7-FRTKan)用YpntABF+YpntABR PCR产物。
图11为宿主菌染色体改造对发酵合成广藿香醇的作用。
图12为菌株060HA2在5L发酵罐中广藿香醇发酵结果。
具体实施方式
(一)培养基
LB液体培养基：先用电子天平称取10g胰蛋白胨(Tryptone)、5g酵母粉(Yeastextract)、10g氯化 钠(NaCl)于烧杯中，然后再加去离子水于烧杯中定容至1L，最后再于高压蒸汽灭菌锅中121℃湿热灭 菌20min。
LB固体培养基：称取20g琼脂粉加到1L的LB液体培养基中，然后放于高压蒸汽灭菌锅中121℃ 湿热灭菌20min。
M9-3培养基：Na2HPO4 6.0g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.3g/L，NH4Cl 1.0g/L，葡萄糖5g/L，MgSO4 2.0mM，微量元素液0.1％(v/v)。
微量元素液：MnSO4·4H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10.0g/L，CaCl2 2.0g/L，(NH4)Mo7O24 0.1g/L， CuSO4·5H2O 3.0g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，ZnSO4·7H2O 5.25g/L，用0.1mol/L HCl配置。
发酵罐发酵培养基：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 2g/L，KH2PO4 4.2g/L，K2HPO411.24g/L，柠檬酸1.7 g/L，MgSO4 0.5g/L。
培养基中根据需要添加相应的抗生素，抗生素添加量为：卡那霉素终浓度为50μg/mL，氯霉素终浓度 为34μg/mL。
(二)广藿香醇合酶诱导表达方法
-80℃甘油保藏菌划线在含有卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱培养过夜。5mL试管LB培养基中 加入抗生素，从平板上挑取单菌落进行接种，置于37℃、200r/min摇床震荡8h。50mL摇瓶LB培养基 中加入卡那霉素，从试管中吸取菌液到摇瓶中，接种量为2％(v/v)，置于37℃200r/min摇床震荡2～2.5 h。从摇瓶中取样，用分光光度计检测600nm处的吸光值，吸光值达到0.6～0.8，向摇瓶中加入诱导剂IPTG， 诱导剂终浓度为0.2mmol/L，置于20℃200r/min摇床震荡20h。
(三)广藿香醇摇瓶发酵方法
(1)菌株的预培养
重组菌株划线于LB平板培养基，37℃培养24h。平板单菌落接种于LB液体培养基，于37℃、200 r/min培养10h。
(2)摇瓶发酵培养
往50mL含有5g/L葡萄糖的M9-3培养基中接种2mL菌液，37℃、200r/min摇床震荡培养。菌体 OD600值达到2时，加入的IPTG诱导剂至终浓度为0.5mmol/L，同时加入3mL 500g/L葡萄糖，按照需要 添加10mL十二烷，将摇瓶放在20℃、200r/min摇床震荡诱导培养至96h。期间，每12h用pH试纸测 量pH值，并用氨水调节发酵液pH至中性；并添加葡萄糖，维持残糖浓度大于1g/L。
(3)5L发酵罐发酵培养
细胞在LB培养基中摇瓶预培养方法如上所述。100mL LB种子培养液接种于含有2L培养基的5L发 酵罐中，控制通气量为3-10L/min、搅拌转速为200-1000r/min，以控制溶解氧浓度大于30％；添加氨水控 制发酵液pH值为7；细胞生长阶段在37℃条件下进行，在溶解氧浓度突然升高后，指数流加补料液(500g/L 葡萄糖和5g/L硫酸镁)以满足菌体指数生长过程；当细胞干重达到约15.3g/L时，开始广藿香醇合成阶 段。培养温度设定在20℃，溶解氧浓度控制在20％以下。添加终浓度为0.2mM IPTG，并在接下来的10h 内以0.06mM/h的速率连续补加IPTG；从IPTG补加开始，以10mL/h的流速共添加400mL十二烷萃取 剂(共流加40h)，葡萄糖和硫酸镁的补料速度率分别维持在3.6g/L/h和0.036g/L/h至发酵结束，发酵在 117h结束。
(四)广藿香醇的提取方法
(1)乙酸乙酯提取方法：离心1mL发酵液，分别收集发酵上清液和菌体细胞。菌体用1mL ddH2O 洗涤1次，再悬浮于1mL ddH2O中。用超声破碎仪破碎细胞，每工作3s，停5s，重复40次。
向0.8mL细胞破碎液和0.8mL发酵上清液中分别加入0.8mL乙酸乙酯，冰浴超声提取2h(功率为 80％)，并不时摇晃混匀。离心取上层乙酸乙酯相液体至离心管中，加入0.1g无水硫酸钠吸附残留水分， 并用0.22μm微孔滤膜过滤后进行GC/MS检测。
(2)十二烷相样品处理方法：离心收集发酵液上层的十二烷相，用乙酸乙酯适度稀释，加入0.1g无 水硫酸钠吸附残留水分，并用0.22μm微孔滤膜过滤后进行GC/MS检测。
(五)广藿香醇的测定方法
利用GC/MS气相色谱质谱联用仪检测样品中广藿香醇的含量。
色谱分离条件：使用TR-5MS气相色谱柱，初始柱温为50℃，恒温1min；以10℃/min的升温速度 升至200℃；再以20℃/min的升温速度升至280℃，恒温持续3min。
质谱条件：选择扫描m/z为35～300的离子，进样口温度为280℃，He流速为1.2mL/min，离子源温 度为280℃，电离模式为电子电离(60EV)，选择分流进样模式，分流比为4.2，进样量为1μL，用选 择性反应监测进行定量分析。定量母离子m/z为138.2，子离子m/z分别为110.1、95.1和123.1，碰撞能 量分别为8、14和10。
配置浓度为0.008875、0.0355、0.071、0.142、0.284、1.42mg/L的广藿香标准样品，利用GC/MS气相 色谱质谱联用仪检测，根据峰面积绘制标准曲线。R2＝0.9997，表明在标样浓度范围内，线性关系良好。
(六)吉布森组装方式构建重组质粒
具体步骤参见Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nat. Methods,2009,6(5):343–5.
(七)利用Red重组方法对染色体基因进行改造
步骤参见K.A.Datsenko et al.,One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,6640–6645.
实施例1：广藿香醇合酶的表达及广藿香醇的发酵合成
1)广藿香醇合酶的克隆表达
根据GenBank编号为MG386648.1和AY508730.1的广藿香醇合酶的氨基酸序列(图1)，按照大肠 杆菌密码子偏好性优化基因序列，并利用化学合成方法合成PTS1(碱基序列如SEQ ID NO.1所示)和PTS2 基因(碱基序列如SEQ ID NO.2所示)。将这两个基因分别克隆于商业化pET28a载体的BamHI和EcoRI 位点，获得pET28a-PTS1和pET28a-PTS2重组质粒。
将该重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株，获得E.coli BL21(DE3)/pET28a-PTS2重组菌株。经IPTG 诱导表达，收集菌体，细胞破碎后进行SDS-PAGE电泳，图谱如图2所示。可见，两种来源的广藿香醇合 酶都成功实现了表达，且在细胞破碎液沉淀中表达量高于细胞破碎上清液。
2)PTS1与PTS2用于发酵合成广藿香醇能力比较
将含有法尼基焦磷酸合成代谢途径的重组质粒pBbA5c-MevT(CO)-MBIS(CO,ispA)(含有法尼基焦磷 酸(FPP)合成代谢途径，购自Addgene公司，简写为pMev)转化于E.coliBL21(DE3)/pET28a-PTS1和 E.coli BL21(DE3)/pET28a-PTS2重组菌株中，获得E.coliBL21(DE3)/pET28a-PTS1+pMev和E.coli BL21 (DE3)/pET28a-PTS2+pMev重组菌株。将该菌株在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中进行发酵，发酵液和菌 体破碎液用乙酸乙酯萃取，用GC/MS检测萃取产物。
广藿香醇标样和发酵样品GC/MS图如图3所示。样品的GC图谱上获得了与标样相同出峰时间的峰； 且以全扫描(full scan)方式对m/z为35～300的离子进行扫描，样品的MS图谱也与标样相同(图3A)。 为了提高准确性，采用SRM(Selective Reaction Monitoring)进行定量，定量母离子m/z为138.2，定量子 离子m/z为110.1、95.1和123.1。样品与标样检测结果如图3B所示。左图为标样m/z为95.1、110.1、 123.1的离子峰图，右图为样品相应离子的峰图。由图可知出峰时间一致说明样品在15.83～15.84min处的 峰确实是广藿香醇，且响应值较高。
E.coli BL21(DE3)/pET28a-PTS1和E.coli BL21(DE3)/pET28a-PTS2菌株合成广藿香醇的代谢途径如 图4所示，细胞中和发酵液中广藿香醇浓度结果如图5所示。含有PTS2的广藿香醇合酶的E.coli BL21 (DE3)/pET28a-PTS2+pMev重组菌株，细胞中提取出的广藿香醇浓度达到4539.6μg/L，发酵上清液中广藿 香醇浓度也达到了3491.3μg/L，产量远高于含有PTS1广藿香醇合酶的E.coli BL21(DE3)/pET28a- PTS1+pMev菌株。因此选择PTS2广藿香醇合成酶进行分子改造及发酵合成广藿香醇。
3)广藿香醇发酵合成培养条件优化
对IPTG诱导时机进行优化(图6A)。在菌体OD600值达到0.8、2.0、4.0时分别进行诱导，发酵上清 液和细胞中广藿香醇总含量如图6A所示。可见OD600 2.0为较佳诱导时机，其广藿香醇产量显著高于OD600 0.8或者4时诱导的产量。
对E.coli BL21(DE3)/pET28a-PTS2+pMev重组菌株发酵合成广藿香醇的摇瓶转速进行优化(图6B)。 以葡萄糖为底物合成广藿香醇的代谢途径中，需要消耗NADPH还原力。为了避免好氧发酵过程大量消耗 还原力，同时细胞大量生长与目的产物竞争底物，降低产物的得率，考察降低供氧抑制TCA循环对广藿 香醇发酵合成的影响。IPTG诱导后摇瓶转速分别设定为0、50、100、200r/min，发酵96h后，测定发酵 上清液和细胞内广藿香醇总含量，并以200r/min摇瓶发酵广藿香醇含量数据为100％作图，结果如图6B 所示。低供氧发酵可以显著抑制菌体的生长，但广藿香醇的合成总量以及单位OD600值广藿香醇的合成量 也显著降低，广藿香醇合成的最佳摇瓶转速为200r/min。
对发酵过程中是否需要添加十二烷萃取剂进行优化(图6C)。菌体培养至OD600达到2.0后，添加十 二烷，可以在发酵过程中同时萃取广藿香醇产物，有望降低细胞内广藿香醇积累量，促进广藿香醇合成。 如图6C所示，发酵过程中不添加十二烷，发酵液中广藿香醇合成量仅为8mg/L；而发酵过程中添加十二 烷，发酵液中广藿香醇残留量仅为0.1mg/L，发酵上清液中广藿香醇含量提高为14mg/L，表明添加十二 烷在发酵过程中同步萃取产物可以有效促进广藿香醇的发酵合成。
实施例2：添加促溶标签提高广藿香醇合成水平
1)含有不同促溶标签广藿香醇合酶重组质粒的构建
广藿香醇合酶在大肠杆菌中多以不可溶的包涵体形式表达，进一步在PTS2的C端添加T7A、T7A2 和T7A3标签(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)，以期提高其可溶性表达。 以pET28a-PTS2质粒为模板，用T7A-PET28aF和T7A-PTSR引物(如表1所示)全质粒PCR，构建pET28a- PTS2T7A质粒；用T7A2-PET28aF和T7A1-PTSR引物(如表1所示)全质粒PCR，构建pET28a-PTS2T7A2 质粒；用T7A3-PET28aF和T7A1-PTSR引物(如表1所示)全质粒PCR，构建pET28a-PTS2T7A3质粒， 经DNA测序验证，表明重组质粒构建成功。
表1添加促溶标签所使用的引物
2)添加促溶标签对发酵合成广藿香醇的作用
含有促溶标签的广藿香醇合酶的重组质粒以及pMev质粒依次转化入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得 一系列合成广藿香醇的重组菌株。以葡萄糖为唯一碳源进行发酵，广藿香醇检测结果如图7所示。SDS- PAGE表明，添加酸性促溶标签T7A、TA2、TA3后，广藿香醇合酶的可溶表达量提高(图7A)。与不加 标签的菌株相比，添加弱酸性标签T7A，可将广藿香醇产量提高39.7％；而添加酸性更强的TA2、TA3标 签，或者添加NT11、SKIK标签，导致广藿香醇产量降低，甚至不能合成广藿香醇(图7B)。
实施例3：广藿香醇合酶与法尼基焦磷酸合成酶融合表达对广藿香醇合成的影响
1)融合表达质粒的构建
将广藿香醇合酶与法尼基焦磷酸合成酶融合表达，首先构建融合表达这两个酶的重组质粒，引物序列 如表2所示。
以pMev质粒为模板，用引物NcoI-FPPSF和NcoI-RBS-FPPSR扩增FPPS基因，克隆于pET28a-PTS2 质粒的NcoI酶切位点，获得重组质粒pET28a-FPPS-PTS2。用T7 promoter和T7terminator通用引物验证 该重组质粒，获得了3kb左右条带，表明成功构建了pET28a-FPPS-PTS2质粒。以质粒pET28a-FPPS-PTS2 为模板，用FPPS-GGGS-PTSF和PTS-GGGS-FPPSR引物进行全质粒PCR，将FPPS和PTS2基因用 “GGGS”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建了重组质粒pET28a-FPPS-GGGS-PTS2。
以pMev质粒为模板，用引物EcoRI-RBS-FPPSF和HindIII-FPPSR扩增FPPS基因，克隆于pET28a- PTS2质粒的EcoRI和HindIII酶切位点，获得重组质粒pET28a-PTS2-FPPS。用T7 promoter和T7 terminator 通用引物验证该重组质粒，获得了3kb左右条带，表明成功构建了pET28a-PTS2-FPPS质粒。以质粒pET28a- PTS2-FPPS为模板，用GGGS-FPPS和GGGS-PTSR引物进行全质粒PCR，将PTS2和FPPS基因用 “GGGS”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建了重组质粒pET28a-PTS2-GGGS-FPPS。
用FPPS-GGGGS3-PTSF和FPPSR-1引物，以质粒pET28a-FPPS-PTS2为模板，全质粒PCR，将PTS2 和FPPS基因用“GGGGS3”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建pET28a-FPPS-GGGGS3- PTS2质粒。
用FPPS-PT4P-PTSF和FPPSR-1引物，以质粒pET28a-FPPS-PTS2为模板，全质粒PCR，将PTS2和 FPPS基因用“(PT)4P”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建pET28a-FPPS-(PT)4P-PTS2 质粒。
用FPPS-(PA)4-PTSF和FPPSR-1引物，以质粒pET28a-FPPS-PTS2为模板，全质粒PCR，将PTS2和 FPPS基因用“(PA)4”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建pET28a-FPPS-(PA)4-PTS2质 粒。
用FPPS-A(EAAAK)4-PTSF+FPPSR-1引物，以质粒pET28a-FPPS-PTS2为模板，全质粒PCR，将PTS2 和FPPS基因用“A(EAAAK)4”linker连接，进行融合表达。经DNA测序，表明成功构建pET28a-FPPS- A(EAAAK)4-PTS2质粒。
用引物XhoI-IdiR+XhoI-pMevF，以pMev质粒为模板，PCR扩增整个质粒，用XhoI酶切后自环化连 接，构建不含有FPPS基因的质粒pMev△FPPS，用来验证PTS2与FPPS融合表达对广藿香醇合成的作 用。DNA测序验证，表明成功构建了重组质粒pMev△FPPS。
表2融合表达策略所使用的引物
注：下划线标出的序列为酶切位点。
2)融合表达菌株的广藿香醇发酵合成
将上述重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)菌株，获得重组菌株，以葡萄糖为唯一碳源进行摇瓶发酵， 结果如图8所示。表明，将FPPS基因从pMev质粒载体上去除，并放在pET-PTS2载体上共表达，导致广 藿香醇合成水平略有降低。在PTS2和FPPS之间加入GGGSlinker进行融合表达导致广藿香醇的合成水平 大幅度降低。由于FPPS放在PTS2前端，广藿香醇合成量的降低幅度较小，因此，后续将FPPS放在PTS2 前端融合表达。进一步对linker序列进行优化，表明添加(GGGGS)3和(PA)4linker广藿香醇合成水平与原 始菌株相当，添加A(EAAA)4linker广藿香醇合成水平略有降低，而添加(PT)4P linker广藿香醇合成量显著提高了94.4％。
实施例4：广藿香醇合酶的分子改造
1)突变体酶重组质粒的构建
PTS1与PTS2的广藿香醇合成酶来源于Pogostemon cablin的不同植株，它们的氨基酸序列相似性为 96.2％。在PTS2基础上，分别将同源比对氨基酸序列不一致、且距离活性中心较近的H454、E457、K458 位点突变为丙氨酸(A)以及另外两种非极性氨基酸即亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)。进一步利用BLAST 软件搜索与PTS2氨基酸序列相似性高的酶，将相似度高的前10个酶与PTS1、PTS2氨基酸序列进行比对 (图1)，发现PTS2上C415在其他酶中都为苯丙氨酸，因此将C415位点突变为相对保守的苯丙氨酸。 以pET28a-PTS2质粒为模板，通过全质粒PCR方式构建具有H454A、H454L、H454F、E457A、K458A、 K458L、K458F、C415F突变体的重组质粒，引物序列如表3所示。经DNA测序验证，表明重组质粒构建 成功。
表3广藿香醇合酶分子改造引物
2)广藿香醇合酶单点突变对发酵合成广藿香醇的作用
将改造过的广藿香醇合酶突变体质粒和含有FPP合成代谢途径的pMev质粒依次转化入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得一系列合成广藿香醇的重组菌株。以葡萄糖为唯一碳源进行发酵，结果如图9A所 示。可见，E457位突变为丙氨酸会导致产量极低，H454A、K458A、K458L突变可以有效提高广藿香醇的 合成水平，相对于原始PTS2广藿香醇发酵合成水平分别提高了76.9％、65.2％、76.1％；而将H454突变为 另外两种非极性氨基酸亮氨酸和苯丙氨酸，或者将K458突变为苯丙氨酸，会导致广藿香醇合成量大幅度 降低或者不能合成广藿香醇。C415F突变可将广藿香醇产量提高95.8％。
由图9B所示，H454A、K458A、K458L、C415F突变并未显著提高酶的表达水平，表明广藿香醇合成 量的提高是酶活提高导致的。
3)广藿香醇合酶多点组合突变对发酵合成广藿香醇的作用
进一步将引起广藿香醇产量提高的突变位点进行组合，重组菌株广藿香醇发酵合成水平如图9C所示。 可见，H454A和K458A组合突变，导致广藿香醇合成量降低。C415F/H454A突变体广藿香醇产量提高为 原始PTS2的2.9倍。
进一步将C415F和C415F/H454A突变添加到FPPS-(PT)4P-PTS2融合蛋白(分别用突变体C415F和 C415F/H454A替换PTS2)中。得到重组菌株B11和B12，其广藿香醇发酵产量为原菌株B0的4.3倍和4.7 倍(图9D)。因此，FPPS与PTS2融合表达和PTS2点突变改造的有益效果成功实现了叠加。
实施例5：广藿香醇合成底盘菌株改造
1)删除竞争代谢途径菌株的构建
大肠杆菌以葡萄糖为碳源，经EMP途径合成大量的有机酸、醇等代谢副产物，不仅与目的代谢产物 竞争碳源，还严重抑制菌体的生长和活性，最终导致目的代谢产物的产量、转化率、生产强度都大幅度降 低。
在野生型E.coli B0016中删除了乙酸合成代谢途径编码基因ackA-pta，获得了重组菌株E.coli B0016- 010(公开于周丽等，温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨酸.微生物学通报,2015,42(11),2272– 2281)，以此重组菌株为基础上进一步删除染色体上竞争代谢途径编码基因、表达异源T7 RNA聚合酶编 码基因、强化细胞壁上分泌酶的表达，构建高效的底盘菌株，所使用的引物序列如表4所示。
以pKD13质粒(记载于K.A.Datsenko et al.,One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,6640–6645)为模板，用LdhA-pKD13F+ LdhA-pKD13R引物PCR扩增打靶基因片段，整合于菌株B0016-010染色体上ldhA基因处。转化子用 YldhAF+YldhAR引物PCR验证，如图10A所示，野生型应为1.3kb，基因敲除后应为0.5kb。表明ldhA 基因已被成功敲除，获得菌株020H。
以pKD13质粒为模板，用AdhE-pKD13F+AdhE-pKD13R引物PCR扩增打靶基因片段，整合于菌株 B0016-020染色体上adhE基因处。转化子用如图10B所示，用YadhER+AdhE-pKD13F引物PCR验证， 野生型应为2.8kb，基因敲除后应为0.3kb。表明adhE基因已被成功敲除，获得菌株030H。
进一步删除菌株030H染色体上合成副产物除琥珀酸的基因frdA，同时将T7 RNA聚合酶整合在该基 因处，为T7强启动子启动的基因转录提供工具酶。用FrdA-T7RNAPF+FrdA-T7RNAPR引物以pMD19- T7RNAP-kan质粒为模板PCR扩增含有T7 RNA聚合酶的突变盒片段，整合于染色体frdA基因处。转化 子用YfrdAF-2+YfrdAR引物PCR验证(如图10C所示)，野生型菌获得2.1kb片段，整合了KanFRT- T7RNAP片段后获得5kb片段，卡那霉素抗性去除后获得3.7kb片段。构建有机酸、醇副产物合成量低的 底盘菌株040H。
2)强化分泌代谢途径菌株的构建
将宿主菌染色体上macAB、tolC、msbA、yadGH、lptAB的启动子分别用T7强启动子替换，以加强这 些转运蛋白的表达强度。
用PmacA-pKD13F-2+macA-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合于 染色体macA基因上游。如图10D所示，转化子用YmacAF+YmacAR引物PCR验证，野生型菌获得239 bp片段，整合了KanFRT-PT7后获得1.6kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得396bp片段，表明已成功 将T7强启动子插入到菌株040H染色体上macAB基因前，获得菌株050H。
用PtolC-pKD13F+tolC-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合于染 色体tolC基因上游。如图10E所示，转化子用YtolCF+YtolCR引物PCR验证，野生型菌获得210bp片 段，整合了KanFRT-PT7后获得1.6kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得367bp片段，表明已成功将T7 强启动子插入到菌株050H染色体上tolC基因前，获得菌株060H。
用PmsbA-pKD13F+msbA-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合于染 色体msbA基因上游。如图10F所示，转化子用YmsbAF+YmsbAR PCR验证，野生型菌获得242bp片段， 整合了KanFRT-PT7后获得1.6kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得399bp片段，表明已成功将T7强 启动子插入到菌株060H染色体上msbA基因前，获得菌株070H。
在菌株050H中，将T7强启动子插入到染色体上msbA基因前，获得菌株060HA。
用PyadGH-pKD13F+YadGH-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合 于染色体yadGH基因上游。如图10G所示，YyadGHF+YyadGHR PCR验证，野生型菌获得328bp片段， 整合了KanFRT-PT7后获得1.7kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得485bp片段，表明已成功将T7强 启动子插入到菌株060HA染色体上yadGH基因前，获得菌株070HA。
用LptAB-pKD13F+LptAB-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合于 染色体lptAB基因上游。如图10H所示，YlptABF+YlptABR PCR验证，野生型菌获得352bp片段，整合 了KanFRT-PT7后获得1.8kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得509bp片段，表明已成功将T7强启动 子插入到菌株060HA染色体上lptAB基因前，获得菌株070HB。
在菌株070HA中，将T7强启动子插入到染色体上lptAB基因前，获得菌株080H。
3)强化辅酶循环代谢途径菌株的构建
用PntA-pKD13F+PntA-PT7R引物以pACYC-pntAB-T7100质粒为模板PCR扩增突变盒，整合于染色 体pntAB基因上游。如图10I所示，YpntABF+YpntABR PCR验证，野生型菌获得400bp片段，整合了 KanFRT-PT7后获得1.6kb片段，卡那霉素抗性基因去除后获得557bp片段，表明已成功将T7强启动子 插入到菌株080H染色体上pntAB基因前，获得菌株090H。
表4染色体基因改造所使用的引物
注：下划线标出的是与染色体上同源的序列，小写字母表示与pKD13质粒同源的序列
4)宿主菌改造对广藿香醇发酵合成的影响
将重组质粒pMev与pET28a-PTS2电击转化上述染色体改造后的重组菌株，重组菌株分别进行摇瓶发 酵，分别测定发酵液和菌体细胞中广藿香醇的合成量。如图11所示，删除了有机酸、醇副产物合成途径的 重组菌株040H，其广藿香醇合成量可达192.8mg/L，得率达到17.7mg/g细胞干重，分别是BL21(DE3)宿 主菌发酵产量的13.8倍和5.3倍，表明删除副产物合成竞争代谢途径可有效将代谢流引向广藿香醇的合成。 强化macAB基因的表达后，菌株050H1广藿香醇合成水平提高为264mg/L。进一步强化msbA，构建 060HA1菌株，可将广藿香醇得率提高89.5％。而tolC、yadGH、lptAB、pntAB基因的过量表达不利于促进 广藿香醇的发酵合成。
将先前优化的质粒pMevΔFPPS和pET-FPPS-(PT)4P-PTS2C415F/H454A转化到优化后的底盘菌株 060HA中，获得060HA2菌株，其广藿香醇产量达到338.6mg/L，得率为48.6mg/g干细胞重量，体积生 产强度为84.6mg/L/d。
表5不同菌株广藿香醇产量
实施例6：广藿香醇发酵罐发酵
在5L发酵罐中进一步用060HA2菌株进行广藿香醇发酵，以测试在可控的放大条件下的发酵效果(图 12)。发酵液中广藿香醇产量达到970.1mg/L，体积生产强度为199mg/L/d，分别是摇瓶实验的2.9倍和 2.4倍。这一结果也是目前使用葡萄糖作为唯一碳源的最高水平。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本 发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种代谢工程大肠杆菌发酵制备广藿香醇的方法
<130> BAA210198A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaactgt atgcacagag tgttggcgtt ggtgccgcca gtcgtccgct ggcaaatttt 60
catcagtgcg tgtggggcga taaattcatt gtttataatc cgcagagcag ccaggcaggc 120
gaacgtgaac aggccgaaga actgaaagtt gaactgaaac gcgaactgaa agaagcaagt 180
gataattata tgcgtcagct gaaaatggtg gatgccattc agcgtctggg cattgattat 240
ctgtttgtgg aagatgttga tgaagcactg aaaaatctgt ttgaaatgtt tgatgccttc 300
tgtaaaagca atcatgatat gcatgccacc gcactgagtt ttcgtctgct gcgtcagcat 360
ggttatcgtg tgagttgcga agtgtttgaa aaattcaaag atggtaaaga cggctttaaa 420
gtgccgaatg aagatggcgc cgtggccgtt ctggaatttt tcgaagcaac ccatctgcgc 480
gtgcatggtg aagatgtgct ggataatgcc tttgttttta cccgtaatta tctggaaagc 540
gtttatgcaa ccctgaatga tccgaccgcc aatcaggtgc ataatgcact gaatgaattt 600
tcttttcgtc gcggtctgcc gcgtgttgaa gcacgcaaat atattagtat ctatgaacag 660
tacgccagcc atcataaagg cctgctgaaa ctggcaaaac tggattttaa tctggtgcag 720
gcactgcatc gtcgcgaact gagcgaagat agccgctggt ggaaaaccct gcaggtgccg 780
accgaactga gttttgtgcg tgatcgtctg gtggaaagct atttttgggc aagcggtagc 840
tattttgaac cgaattatag cgtggcccgc atgattctgg caaaaggtct ggcagttctg 900
agtctgatgg atgatgttta tgatgcatat ggcacctttg aagaactgca ggtttttacc 960
gatgcaattg aacgctggga tgcaagctgc ctggataaac tgccggaata tatgaaaatt 1020
gtgtataaag cactgctgga tgtttttgaa gaagtggatg aagaagtgat taagctgggc 1080
gcaccgtatc gcgtgtatta tggtaaagaa gccatgaaat atgccgcccg cgcctatatg 1140
gaagaagcac agtggcgtga acagaaacat aaaccgacca ccaaagaata tatgaagctg 1200
gccaccaaaa cctgcggcta tattaccctg attattctga gttttctggg tgttgaagaa 1260
ggcattgtga ccaaagaagc ctttgattgg gtgtttagtc gcccgccgtt tgttgaagcc 1320
accctgatta tcgcccgcct gattaatgat attaccggtt gcgaatttgg taataagcgt 1380
gaacatgttc gcaccgccgt tgaatgctat atggaagagc ataaagttgg caaacaggaa 1440
gttgtgagcg aattttataa tcagatggaa agcgcctgga aagatattaa tgaatgtctg 1500
ctgcgcccgg cagaatttcc gattccgctg ctgaatctga ttctgaatag tgttcgcacc 1560
ctggaagtga tctataaaga aggcgatagt tatacccatg tgggcccggc aatgcagaat 1620
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<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggagctgt acgcccaaag cgtgggcgtt ggtgccgcga gtcgcccact cgccaacttt 60
catccgtgcg tgtggggtga caagttcatc gtgtacaacc cgcaaagctg ccaagccggt 120
gaacgcgagg aagcggagga actgaaagtt gagctgaagc gcgagctgaa ggaagcgagc 180
gacaattaca tgcgccagct gaaaatggtg gatgccattc aacgtctggg catcgactat 240
ctgttcgtgg aggatgttga tgaggcgctc aagaatctgt tcgagatgtt cgacgcgttc 300
tgtaaaaata atcatgacat gcacgcgacc gcgctgagtt ttcgtctgct gcgccagcat 360
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gtggttagcg agttctacaa ccagatggag agcgcgtgga aagacatcaa cgagggcttt 1500
ctccgtccgg tggagtttcc aatcccgctg ctctatctga ttctgaacag tgtgcgcacg 1560
ctggaagtga tctacaaaga gggcgacagc tacacccacg tgggcccagc gatgcagaac 1620
atcatcaagc agctgtacct ccatccggtt ccgtattaa 1659
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggaagacc cggctgctaa caaagctcgt aaagaagctg aactggctgc tgctaccgct 60
gaacag 66
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctggaagacc cggaacgtaa caaagaacgt aaagaagctg aactggaagc tgctaccgct 60
gaacag 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggaagacc cggaacgtaa caaagaacgt aaagaagctg aactggaagc tgaaaccgct 60
gaacag 66

Claims (9)

1. 一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达了来源于Pogostemon cablin广藿香醇合酶突变体和来源于Escherichia coli的法尼基焦磷酸合成酶；所述法尼基焦磷酸合成酶的Gene ID为945064；所述广藿香醇合酶突变体是将GenBank：AY508730.1所示序列编码的广藿香醇合酶的第415位半胱氨酸突变为苯丙氨酸，或第415位半胱氨酸突变为苯丙氨酸的同时将第454位的组氨酸突变为丙氨酸获得的。
2. 根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在所述广藿香醇合酶突变体C端融合表达T7A标签，所述T7A标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，法尼基焦磷酸合成酶与广藿香醇合酶突变体通过(PT)4P短肽融合表达。
4. 根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以代谢改造的菌株为底盘细胞，所述代谢改造的菌株沉默了乙酸合成代谢途径编码基因ackA-pta、乳酸代谢途径编码基因ldhA、乙醇合成代谢途径编码基因adhE、琥珀酸合成代谢途径编码基因frdA的表达，表达了T7 RNA聚合酶编码基因T7RNAP，强化表达染色体上分泌代谢途径编码基因macAB、tolC、msbA、yadGH、lptAB，并强化表达NADPH辅酶循环代谢途径编码基因pntAB；
所述基因ackA-pta中基因ackA的Gene ID为946775，基因pta 的Gene ID为946778；所述ldhA的Gene ID为946315；所述adhE的Gene ID为945837；所述frdA的Gene ID为948667；所述T7 RNAP的Genbank登录号为M38308.1；所述macAB中基因macA的Gene ID为947322，基因macB的Gene ID为945164；所述tolC的Gene ID为947521；所述msbA的Gene ID为945530；所述yadGH中基因yadG的Gene ID为944833，基因yadH的Gene ID为944836；所述lptAB中基因lptA的Gene ID为947920，基因lptB的Gene ID为947725；所述pntAB中基因pntA的GeneID为946628，基因pntB的Gene ID为946144。
5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达是通过T7启动子进行目的基因的表达。
6.一种生产广藿香醇的方法，其特征在于，利用权利要求1~5任一项所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖、甘油、丙酮酸钠或含有丙酮酸钠的物质为底物，生产广藿香醇。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在菌株OD600为0.8~4或细胞干重达10 g/L时，用IPTG在20-25℃下进行诱导，并添加十二烷萃取广藿香醇。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述IPTG在体系中的浓度为0.2-0.8 mM。
9.权利要求1~5任一项所述重组大肠杆菌在制备广藿香醇中的应用。
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