CN111206026A

CN111206026A - 酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111206026A
Application number: CN201811388687.5A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 方欣; 杨蕾; 李辰意; 王凌健
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN111206026B

Abstract

本发明涉及酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。本发明揭示了突变型广藿香醇合酶，其催化特异性发生变化，从而可根据需要调控其催化产物的产量，特别是提高主产物广藿香醇的产量。

Description

酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。

背景技术

植物挥发油(精油)是具有一定挥发性的油状液体的统称，是植物芳香物质的提取物。含挥发油的中草药非常多，亦多具芳香气味，尤以唇形科(薄荷、紫苏、藿香等)、伞形科(茴香、当归、芫荽、白芷、川芎等)、菊科(艾叶、茵陈篙、苍术、白术、木香等)、芸香科(橙、桔、花椒等)、樟科(樟、肉桂等)、姜科(生姜、姜黄、郁金等)等科更为丰富。植物挥发油成分复杂，主要由萜类化合物构成，芳香族化合物次之，还包含少量的脂肪酸衍生物。其中萜类化合物又分为单萜、倍半萜以及少量的二萜，常见的如薄荷中的薄荷酮、广藿香中的广藿香醇等。挥发油大多具有抑菌杀毒、凝神静气、解热镇痛、矫味定香等作用，在医药、食品、日化用品等方面应用广泛。目前植物挥发油的研究主要集中在提取工艺优化、化学成分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，挥发油合成途径的酶工程改造方面的研究很少。

广藿香(Pogostemon cablin)是唇形科多年生草本植物，所产生的广藿香精油被广泛应用于香料及医疗行业。与其它唇形科植物产生的混合型精油不同，广藿香精油主要是由倍半萜构成(Deguerry，F.等(2006).Archives of biochemistry and biophysics454，123-136)。广藿香精油包含约24种倍半萜(Buré，C.M.等(2004).Journal ofEssential Oil Research 16，17-19)，其中广藿香醇((-)-patchoulol)约占34.8％，是其重要组分。广藿香醇香味持久、独特宜人是良好的定香剂，目前作为天然香料被广泛用于日化产品中。它也是传统中药藿香正气水的主要药效成分。此外，广藿香醇还具有抑制真菌繁殖，驱除和毒杀白蚁的作用(杜一民等(1998)，广藿香的化学成分及其药理作用研究进展；中药新药与临床药理9，238-240)。广藿香精油的生物合成主要由在广藿香中发现的广藿香醇合酶(patchoulol synthase，PTS)完成，它是一个多产物酶合成了广藿香叶片提取物中广藿香醇以及其它13种倍半萜产物，在大肠杆菌异源表达的蛋白能够产生36.9％相对含量的广藿香醇(Deguerry，F.等)。此外，在广藿香中还存在与PTS有3.4％蛋白序列差异的广藿香醇合酶异构体(PTSiso)，大肠杆菌重组表达的蛋白催化产物与PTS有很大的差异，其中广藿香醇相对含量只有27.2％。

因此，如何有效地提高广藿香醇的重组表达产量或活性，是本领域需要深入研究的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供广藿香醇合酶突变体，所述突变体相对于野生型的广藿香醇合酶，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

在一个优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2但第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸所示的蛋白；

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；

(c)与(a)所示的氨基酸序列具有80％以上(较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上)序列相同性的保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；或

(d)(a)～(c)的蛋白的生物活性片段，其保留(a)蛋白活性。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码所述的广藿香醇合在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的广藿香醇合酶突变体的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的广藿香醇合酶突变体。

在本发明的另一方面，提供一种调节广藿香醇合酶的催化活性或选择性的方法，所述方法包括：将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

在一个优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸，从而促进其催化产生α-广藿香醇；或抑制其产生石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯。

在另一优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为半胱氨酸，从而促进其催化产生β-广藿香烯、β-榄香烯、大根香叶烯A、石竹烯、α-人参烯、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯、α-广藿香醇。

在另一优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为甘氨酸，从而促进其催化产生法尼醇、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生β-广藿香烯、石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、γ-广藿香烯、4,11-愈创木二烯、α-人参烯、α-广藿香醇。

在本发明的另一方面，提供所述的广藿香醇合酶突变体的用途，用于作为催化剂，催化产生α-广藿香醇；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQID NO:2，第445位突变为丝氨酸。

在本发明的另一方面，提供一种催化产生α-广藿香醇的方法，所述方法包括：以所述的广藿香醇合酶突变体为催化剂进行反应，催化法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate，FPP)环化，获得包含α-广藿香醇的产物；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸。

在一个优选例中，广藿香醇合酶突变体催化FPP环化在细胞内或细胞外进行。

在另一优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。

在另一优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。

在另一优选例中，所述的法尼基焦磷酸产生酶为MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等。

在另一优选例中，所述的细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括(但不限于)大肠杆菌、枯草杆菌；所述真核宿主细胞包括(但不限于)真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。更具体地，所述真核宿主细胞例如为酵母细胞，包括但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、假丝酵母等。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有所述的广藿香醇合酶突变体，以及工业合成上可接受的载体；或含有所述的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中含有所述的广藿香醇合酶突变体，或含有所述的宿主细胞，或含有所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、PTSiso及突变克隆的序列对比结果。从结果中可以看出，445位氨基酸残基A突变成了中性氨基酸残基S。

图2、PTSiso及其突变体的GC-MS图。A、野生型PTSiso和突变体PTSiso-A445S、PTSiso-A445G、PTSiso-A445C的体外酶活GC-MS分析结果。B、产物的化学结构，其中β-elemene是germacrene A在GC分析中发生Cope重排的产物。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，获得了一种突变型广藿香醇合酶，所述的突变型广藿香醇合酶的催化特异性发生变化，可显著地提高主产物广藿香醇的相对含量；同时，针对同一位点的其它形式的突变，还能调控其它产物的生成量。

本发明人经过深入的研究，发现广藿香醇合酶的一些氨基酸残基位点与其催化活性显著性相关，尤其体现在对应于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第445位的位置。在此基础上，通过对该位点进行设计改造，获得了本发明的广藿香醇合酶突变体。与野生型酶相比，当应用所述突变体在原核表达系统中表达时，广藿香醇的相对含量由27.2％提高为43.3％。

如本文所用，除非另外说明，所述的“广藿香醇合酶突变体”、“突变型广藿香醇合酶”、“突变型PTSiso”、“PTSiso突变体”可互换使用，是指对应于野生型广藿香醇合酶(如SEQ ID NO:2)，发生突变后构成的多肽，更优选地为：对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸的多肽。

若需要表示野生型的广藿香醇合酶，其将被标示为“其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，或者也可以是该序列的简并序列。野生型广藿香醇合酶”、“PTSiso”或“野生型多肽(蛋白)”，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，较佳地，所述的野生型广藿香醇合酶来源于广藿香(Pogostemon cablin)。

如本文所用，“分离的广藿香醇合酶”是指广藿香醇合酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化广藿香醇合酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述广藿香醇合酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然广藿香醇合酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的广藿香醇合酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在本发明上面所述的任一组突变，也即对应于SEQ ID NO:2中的第445位氨基酸突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

在本发明中，术语“广藿香醇合酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括广藿香醇合酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的任一组突变，也即对应于SEQ ID NO:2中的第445位氨基酸突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

在本发明中，术语“广藿香醇合酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的广藿香醇合酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的任一组突变，也即对应于SEQ ID NO:2中的第445位氨基酸突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

本发明还提供了编码本发明广藿香醇合酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明的广藿香醇合酶突变体核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或广藿香醇合酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的广藿香醇合酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码广藿香醇合酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，广藿香醇合酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含广藿香醇合酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞，用于高效表达目标蛋白。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

在获得了本发明所述的突变型广藿香醇合酶的信息后，本领域人员清楚如何用于后续制备广藿香醇。所述的突变型广藿香醇合酶催化FPP环化，从而获得广藿香醇。各种胞内或胞外的制备方法均包含在本发明中，或可被运用于本发明中。

所述的突变型广藿香醇合酶催化FPP环化可在胞内或胞外进行。作为本发明的一种优选方式，提供了一种胞内生物合成广藿香醇的方法：将所述的突变型广藿香醇合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产高含量广藿香醇。

作为本发明的优选方式，提供了一种在胞内直接生产高含量广藿香醇的方法，所述的方法包括：将所述的突变型广藿香醇合酶的编码基因以及FPP产生酶(即：MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产广藿香醇。FPP产生酶及其编码基因是本领域已知的，本领域技术人员清楚如何获得这些酶以及如何将之转化细胞。以上MVA/MEP途径中的酶也是本领域技术人员熟知的。

作为本发明的优选方式，所述的突变体为A445S(SEQ ID NO:3)，其用于作为催化剂，所获得的产物中，具有高含量的α-广藿香醇。根据本发明的实施例，所述广藿香醇相对含量由野生型的27.2％提升到43.3％，这是极为显著的提高。

作为本发明的另一可选择的方式，所述的突变体为A445C，以其作为催化剂，显著地促进产物中β-广藿香烯、β-榄香烯、大根香叶烯A、石竹烯、α-人参烯、榄香醇、蓝桉醇的含量；或，显著地抑制α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯、α-广藿香醇的含量。

作为本发明的另一可选择的方式，所述的突变体为A445G，以其作为催化剂，显著地促进产物中法尼醇、榄香醇、蓝桉醇的含量；或，显著地抑制产物中β-广藿香烯、石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、γ-广藿香烯、4,11-愈创木二烯、α-人参烯、α-广藿香醇的含量。

本发明的广藿香醇合酶突变体可以被配制于工业合成上可接受的载体中，获得适于进行催化反应、或适于储存的组合物。其也可以被置于试剂盒中，以便于使用或销售。

与现有技术相比，本发明的进步效果在于：提供了新的广藿香醇合酶突变体，其催化活性或选择性发生了变化，从而可以根据研究或生产的需要，来提高所需产物的产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、广藿香总RNA的提取、PCR扩增目的基因ADS及定点突变

A、广藿香总RNA的提取

野生栽培品系T002由芬美意香料(上海)有限公司提供。根据广霍香形态和挥发油成分鉴定分析，可分为3种生态类型(Sugimura等，1990)。T002为Class I(广霍香醇型)，其挥发油中富含广霍香醇，含量30％左右。

取广霍香材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至1.5ml离心管中，加入1mLTrizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃取沉淀。上清中加入200μL三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入500μL异丙醇沉淀RNA。12,000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNasefree)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH 7.5)做适当稀释，测定波长在200-300nm之间的UV吸收值。RNA浓度＝40μg/mL×A₂₆₀×稀释倍数。A₂₆₀/A₂₈₀应当在1.9至2.1之间。PolyA mRNA第一链反转录采用RNA PCR体系(TaKaRa，Cat.DRR019A)。反应体系如下：

42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。

B、PCR扩增目的基因PTSiso

用高保真酶KOD-plus DNA聚合酶(ToYoBo)扩增PTSiso全长基因序列(1659bp)，引物序列：

PTSiso-S：5’-TTTGGATCCATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTG-3’(SEQ ID NO:10)；

PTSiso-AS：5’-TTTGAGCTCATATGGAACAGGGTGAAGGTACAACT-3’(SEQ ID NO:11)。

PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，68℃延伸120s，扩增30至35个循环；68℃保温10min。4℃保温。

C、定点突变

使用重叠延伸PCR技术，构建成功多个单点突变体。对这些突变体的DNA序列进行了测定。

引物序列如下：

PTSiso第445位的A→S(PTSiso-A445S)，突变相应位点密码子的引物：

PTSiso-A445S-S：5’-CGTTAATCATTTCTAGGCTCATC-3’(SEQ ID NO:4)，

PTSiso-A445S-AS：5’-GATGAGCCTAGAAATGATTAACG-3’(SEQ ID NO:5)；

PTSiso第445位的A→G(PTSiso-A445G)，突变相应位点密码子的引物：

PTSiso-A445G-S：5’-CGTTAATCATTGGTAGGCTCATC-3’(SEQ ID NO:6)，

PTSiso-A445G-AS：5’-GATGAGCCTACCAATGATTAACG-3’(SEQ ID NO:7)；

PTSiso第445位的A→C(PTSiso-A445C)，突变相应位点密码子的引物：

PTSiso-A445C-S：5’-CGTTAATCATTTGTAGGCTCATC-3’(SEQ ID NO:8)，

PTSiso-A445C-AS：5’-GATGAGCCTACAAATGATTAACG-3’(SEQ ID NO:9)；

PTSiso-A445S蛋白突变测序结果见图1。

野生型广藿香PTSiso序列如下(SEQ ID NO:2)：

广藿香PTSiso A445S序列如下(SEQ ID NO:3)：

实施例2、载体构建和大肠杆菌转化

A、载体构建

KOD-plus DNA聚合酶扩增PTSiso编码区片段(PTSiso)及突变体片段(PTSiso-A445S，PTSiso-A445G，PTSiso-A445C)，经BamHI/SacI酶切连入pET-32a载体(Amp^r，Novagen，America)，获得重组载体。

B、感受态细胞制备

-70℃储存的大肠杆菌DH5α或BL-21，在固体LB平板上划线，37℃培养过夜；挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，250rpm培养过夜。第二天，按1/50的比例放大接种到500mL液体LB培养基中，18-22℃培养，至OD₆₀₀≈0.5(约5-6h)，冰上冷却10min。4℃2,500g离心10min，菌体用160mL转化缓冲液重悬，离心弃上清，菌体最后用40mL转化缓冲液重悬，加入3mLDMSO，混匀。分装，每管50μL，液氮速冻，-70℃保存。

转化缓冲液：55mM MnCl₂，15mM CaCl₂，250mM KCl，10mM PIPES(pH 6.7)，新鲜配制，冰上预冷。

LB培养基(1L)：10g NaCl，5g酵母抽提物，10g蛋白胨，pH 7.0。固体LB培养基加入15g/L琼脂粉。

C、转化

加DNA样品(以上获得的重组载体，0.1-0.5μg)于50μL融化的BL21(DE3)E.coli细胞中，混匀，冰上放置25min；42℃热处理90s，冰上放置3min；加100μL液体LB培养基，37℃复苏培养30min；涂于选择平板，培养12-16h。然后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例3、RT-PCR

1μg总RNA，Oligo(dt)₂₀为引物，10μL反应体系，按照反转录试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)要求进行反转录。42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR检测。

根据已知的PTSiso序列，合成了PCR引物，分析PTSiso表达时，以广藿香Pat18S(GenBank:EF529587)作为内标参考。PCR条件为：反应的复性温度和延伸时间由引物和扩增片段长度决定。一般反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，55-60℃复性30s，72℃延伸30s，扩增25至35个循环；72℃保温10min。4℃保温。

实施例4、原核表达和酶活测定

A、原核表达

大肠杆菌BL21细胞在含50μg/mL Ampicillin的LB平板上37℃生长过夜，PCR鉴定挑取阳性单菌落在液体培养基中培养过液，取500μL培养物扩大培养到50mL，直到OD₆₀₀≈0.6加入IPTG到终浓度为0.5mmol/L，继续在20℃诱导培养过夜(20h)。取6mL菌液12000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于预冷的3mL Buffer(25mM Mopso，pH 7.0，5mM DTT，和10％[v/v]甘油，5mMMgCl₂)中，超声波破碎(3S开，7S关，处理3min，25％power)细胞，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定或做体外酶活检测。或者依照Ni-NTA SpinKit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白(PTSiso酶或其各突变体)，并电泳鉴定。

B、酶活测定

上述获得的PTSiso酶或其各突变体蛋白在1.5mL EP管中进行酶活测定，500μL上述蛋白中加入FPP(Farnesyl pyrophosphate，Sigma-Aldrich，F6892)至终浓度40μmol/L，在反应体系上方覆盖400μL正己烷，37℃反应1小时，取4μL进行GC-MS分析(安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器)。

C、仪器和色谱条件

安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，采用HP5-MS石英毛细管柱(30m x0.25mm x0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为80℃起始，10℃/min升到250℃，然后20℃/min升到280℃，保持2.5min。质谱采用EI源，扫描范围为30-500m/z，离子源和四级杆温度分别为250℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(National Institute of Standardsand Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定。

PTSiso及其突变体的GC-MS图见图2。在BL-21大肠杆菌中表达野生型PTSiso，体外酶活检测发现：14.5分钟左右的地方产生了β-榄香烯(β-elemene)的峰，而β-榄香烯是大根香叶烯A(germacrene A)在GC-MS检测过程中重排而产生的；15.2分钟出现了α-愈创木烯(α-guaiene)峰；16.1分钟出现α-布藜烯(α-bulnesene)峰；在18分钟出现广藿香醇峰。

表达455位带羟基氨基酸残基(A455S)突变体，会造成广藿香醇峰明显增大，而α-愈创木烯和α-布藜烯明显变小。

表达455位中性氨基酸残基突变体(A455G)，会造成在18.6分钟处出现额外的含量较高的法尼醇峰。

表达455位带巯基氨基酸残基(A455C)突变体，β-榄香烯含量显著增加，而其他产物含量大幅下降，同时有少量法尼醇产生。

表1、PTSiso及其突变体的酶活产物成分(％)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用

<130> 188171

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 广藿香(Pogostemon cablin)

<400> 1

atggagttgt atgcccaaag tgttggagtg ggtgctgcct ctcgtcctct tgcgaatttt 60

catcaatgtg tgtggggaga caaattcatt gtgtacaacc cacaatcaag ccaggctgga 120

gagagagaac aggctgagga gctgaaagtg gagctgaaaa gagagctgaa ggaagcatca 180

gacaactaca tgcggcaact gaaaatggtg gatgcaatac aacgattagg cattgactat 240

ctttttgtgg aagatgttga tgaagctttg aagaatctgt ttgaaatgtt tgatgctttc 300

tgcaagaata atcatgacat gcacgccact gctctcagct ttcgccttct aagacaacat 360

ggctatagag tttcatgtga agtttttgaa aagtttaagg atggcaaaga tggatttaag 420

gttccaaatg aggatggagc ggttgcagtc cttgaattct tcgaagccac gcatctcaga 480

gtccatggag aagacgtcct tgataatgct tttgtcttca ctaggaacta cttggaatca 540

gtctatgcaa ctttgaacga tccaaccgcg aatcaagtcc acaacgcatt gaatgagttc 600

tcttttcgaa gaggattgcc acgcgtggaa gcaaggaagt acatatcaat ctacgagcaa 660

tacgcatctc atcacaaagg cttgctcaaa cttgctaagc tggatttcaa cttggtacaa 720

gctttgcaca gaagggagct gagtgaagat tctaggtggt ggaagacttt acaagtgccc 780

acagagctat cattcgttag agatcgattg gtggagtcct acttttgggc ttcgggatct 840

tatttcgaac cgaattattc ggtagctagg atgattttag caaaagggct ggctgtatta 900

tctcttatgg acgatgtgta tgatgcatat ggtacttttg aggaattaca agtgttcaca 960

gatgcaatcg aaaggtggga tgcttcgtgt ttagataaac ttccagagta catgaaaata 1020

gtatacaagg cccttttgga tgtgtttgag gaagttgacg aggaggtgat caagctaggt 1080

gcaccatatc gagtctacta tggaaaagaa gccatgaaat atgccgctag agcttacatg 1140

gaagaggccc aatggaggga gcaaaagcac aaacccacaa ctaaggagta tatgaagctg 1200

gcaacaaaga cctgtggcta tataactcta ataatattat catttcttgg agtggaagag 1260

ggcattgtga ctaaagaagc cttcgattgg gttttctccc gacctccttt cgtcgaggct 1320

acgttaatca ttgctaggct catcaatgat attacaggat gcgagtttga gaacaaacga 1380

gagcacgttc gcactgcagt agaatgctac atggaagagc acaaagtggg aaagcaagag 1440

gtggtgtctg aattctacaa ccaaatggag tcagcatgga aggacataaa tgagtgcctc 1500

ctcagaccag ctgaatttcc aatccctcta cttaatctta ttctcaattc tgtccgaaca 1560

cttgaggtta tttacaaaga gggcgattcc tatacacacg tgggtcctgc aatgcaaaac 1620

atcatcaagc agttgtacct tcaccctgtt ccatattaa 1659

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> 广藿香(Pogostemon cablin)

<400> 2

Met Glu Leu Tyr Ala Gln Ser Val Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Pro

1 5 10 15

Leu Ala Asn Phe His Gln Cys Val Trp Gly Asp Lys Phe Ile Val Tyr

20 25 30

Asn Pro Gln Ser Ser Gln Ala Gly Glu Arg Glu Gln Ala Glu Glu Leu

35 40 45

Lys Val Glu Leu Lys Arg Glu Leu Lys Glu Ala Ser Asp Asn Tyr Met

50 55 60

Arg Gln Leu Lys Met Val Asp Ala Ile Gln Arg Leu Gly Ile Asp Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Val Glu Asp Val Asp Glu Ala Leu Lys Asn Leu Phe Glu Met

85 90 95

Phe Asp Ala Phe Cys Lys Asn Asn His Asp Met His Ala Thr Ala Leu

100 105 110

Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Arg Val Ser Cys Glu Val

115 120 125

Phe Glu Lys Phe Lys Asp Gly Lys Asp Gly Phe Lys Val Pro Asn Glu

130 135 140

Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Glu Phe Phe Glu Ala Thr His Leu Arg

145 150 155 160

Val His Gly Glu Asp Val Leu Asp Asn Ala Phe Val Phe Thr Arg Asn

165 170 175

Tyr Leu Glu Ser Val Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Pro Thr Ala Asn Gln

180 185 190

Val His Asn Ala Leu Asn Glu Phe Ser Phe Arg Arg Gly Leu Pro Arg

195 200 205

Val Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Ser Ile Tyr Glu Gln Tyr Ala Ser His

210 215 220

His Lys Gly Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu Val Gln

225 230 235 240

Ala Leu His Arg Arg Glu Leu Ser Glu Asp Ser Arg Trp Trp Lys Thr

245 250 255

Leu Gln Val Pro Thr Glu Leu Ser Phe Val Arg Asp Arg Leu Val Glu

260 265 270

Ser Tyr Phe Trp Ala Ser Gly Ser Tyr Phe Glu Pro Asn Tyr Ser Val

275 280 285

Ala Arg Met Ile Leu Ala Lys Gly Leu Ala Val Leu Ser Leu Met Asp

290 295 300

Asp Val Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Phe Glu Glu Leu Gln Val Phe Thr

305 310 315 320

Asp Ala Ile Glu Arg Trp Asp Ala Ser Cys Leu Asp Lys Leu Pro Glu

325 330 335

Tyr Met Lys Ile Val Tyr Lys Ala Leu Leu Asp Val Phe Glu Glu Val

340 345 350

Asp Glu Glu Val Ile Lys Leu Gly Ala Pro Tyr Arg Val Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Glu Ala Met Lys Tyr Ala Ala Arg Ala Tyr Met Glu Glu Ala Gln

370 375 380

Trp Arg Glu Gln Lys His Lys Pro Thr Thr Lys Glu Tyr Met Lys Leu

385 390 395 400

Ala Thr Lys Thr Cys Gly Tyr Ile Thr Leu Ile Ile Leu Ser Phe Leu

405 410 415

Gly Val Glu Glu Gly Ile Val Thr Lys Glu Ala Phe Asp Trp Val Phe

420 425 430

Ser Arg Pro Pro Phe Val Glu Ala Thr Leu Ile Ile Ala Arg Leu Ile

435 440 445

Asn Asp Ile Thr Gly Cys Glu Phe Glu Asn Lys Arg Glu His Val Arg

450 455 460

Thr Ala Val Glu Cys Tyr Met Glu Glu His Lys Val Gly Lys Gln Glu

465 470 475 480

Val Val Ser Glu Phe Tyr Asn Gln Met Glu Ser Ala Trp Lys Asp Ile

485 490 495

Asn Glu Cys Leu Leu Arg Pro Ala Glu Phe Pro Ile Pro Leu Leu Asn

500 505 510

Leu Ile Leu Asn Ser Val Arg Thr Leu Glu Val Ile Tyr Lys Glu Gly

515 520 525

Asp Ser Tyr Thr His Val Gly Pro Ala Met Gln Asn Ile Ile Lys Gln

530 535 540

Leu Tyr Leu His Pro Val Pro Tyr

545 550

<210> 3

<211> 552

<212> PRT

<213> 广藿香(Pogostemon cablin)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(552)

<400> 3

Met Glu Leu Tyr Ala Gln Ser Val Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Pro

1 5 10 15

Leu Ala Asn Phe His Gln Cys Val Trp Gly Asp Lys Phe Ile Val Tyr

20 25 30

Asn Pro Gln Ser Ser Gln Ala Gly Glu Arg Glu Gln Ala Glu Glu Leu

35 40 45

Lys Val Glu Leu Lys Arg Glu Leu Lys Glu Ala Ser Asp Asn Tyr Met

50 55 60

Arg Gln Leu Lys Met Val Asp Ala Ile Gln Arg Leu Gly Ile Asp Tyr

65 70 75 80

Leu Phe Val Glu Asp Val Asp Glu Ala Leu Lys Asn Leu Phe Glu Met

85 90 95

Phe Asp Ala Phe Cys Lys Asn Asn His Asp Met His Ala Thr Ala Leu

100 105 110

Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Arg Val Ser Cys Glu Val

115 120 125

Phe Glu Lys Phe Lys Asp Gly Lys Asp Gly Phe Lys Val Pro Asn Glu

130 135 140

Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Glu Phe Phe Glu Ala Thr His Leu Arg

145 150 155 160

Val His Gly Glu Asp Val Leu Asp Asn Ala Phe Val Phe Thr Arg Asn

165 170 175

Tyr Leu Glu Ser Val Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Pro Thr Ala Asn Gln

180 185 190

Val His Asn Ala Leu Asn Glu Phe Ser Phe Arg Arg Gly Leu Pro Arg

195 200 205

Val Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Ser Ile Tyr Glu Gln Tyr Ala Ser His

210 215 220

His Lys Gly Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu Val Gln

225 230 235 240

Ala Leu His Arg Arg Glu Leu Ser Glu Asp Ser Arg Trp Trp Lys Thr

245 250 255

Leu Gln Val Pro Thr Glu Leu Ser Phe Val Arg Asp Arg Leu Val Glu

260 265 270

Ser Tyr Phe Trp Ala Ser Gly Ser Tyr Phe Glu Pro Asn Tyr Ser Val

275 280 285

Ala Arg Met Ile Leu Ala Lys Gly Leu Ala Val Leu Ser Leu Met Asp

290 295 300

Asp Val Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Phe Glu Glu Leu Gln Val Phe Thr

305 310 315 320

Asp Ala Ile Glu Arg Trp Asp Ala Ser Cys Leu Asp Lys Leu Pro Glu

325 330 335

Tyr Met Lys Ile Val Tyr Lys Ala Leu Leu Asp Val Phe Glu Glu Val

340 345 350

Asp Glu Glu Val Ile Lys Leu Gly Ala Pro Tyr Arg Val Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Glu Ala Met Lys Tyr Ala Ala Arg Ala Tyr Met Glu Glu Ala Gln

370 375 380

Trp Arg Glu Gln Lys His Lys Pro Thr Thr Lys Glu Tyr Met Lys Leu

385 390 395 400

Ala Thr Lys Thr Cys Gly Tyr Ile Thr Leu Ile Ile Leu Ser Phe Leu

405 410 415

Gly Val Glu Glu Gly Ile Val Thr Lys Glu Ala Phe Asp Trp Val Phe

420 425 430

Ser Arg Pro Pro Phe Val Glu Ala Thr Leu Ile Ile Ser Arg Leu Ile

435 440 445

Asn Asp Ile Thr Gly Cys Glu Phe Glu Asn Lys Arg Glu His Val Arg

450 455 460

Thr Ala Val Glu Cys Tyr Met Glu Glu His Lys Val Gly Lys Gln Glu

465 470 475 480

Val Val Ser Glu Phe Tyr Asn Gln Met Glu Ser Ala Trp Lys Asp Ile

485 490 495

Asn Glu Cys Leu Leu Arg Pro Ala Glu Phe Pro Ile Pro Leu Leu Asn

500 505 510

Leu Ile Leu Asn Ser Val Arg Thr Leu Glu Val Ile Tyr Lys Glu Gly

515 520 525

Asp Ser Tyr Thr His Val Gly Pro Ala Met Gln Asn Ile Ile Lys Gln

530 535 540

Leu Tyr Leu His Pro Val Pro Tyr

545 550

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cgttaatcat ttctaggctc atc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

gatgagccta gaaatgatta acg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cgttaatcat tggtaggctc atc 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gatgagccta ccaatgatta acg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

cgttaatcat ttgtaggctc atc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gatgagccta caaatgatta acg 23

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tttggatcca tggagttgta tgcccaaagt gttg 34

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

tttgagctca tatggaacag ggtgaaggta caact 35

Claims

1.广藿香醇合酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型的广藿香醇合酶，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

2.如权利要求1所述的广藿香醇合酶突变体，其特征在于，其是：

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；

(c)与(a)所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性的保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；或

(d)(a)～(c)的蛋白的生物活性片段，其保留(a)蛋白活性。

3.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的核酸是编码权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种生产权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体。

7.一种调节广藿香醇合酶的催化活性或选择性的方法，其特征在于，所述方法包括：将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸，从而促进其催化产生α-广藿香醇；或抑制其产生石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将广藿香醇合酶的第445位突变为半胱氨酸，从而促进其催化产生β-广藿香烯、β-榄香烯、大根香叶烯A、石竹烯、α-人参烯、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯、α-广藿香醇。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将广藿香醇合酶的第445位突变为甘氨酸，从而促进其催化产生法尼醇、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生β-广藿香烯、石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、γ-广藿香烯、4,11-愈创木二烯、α-人参烯、α-广藿香醇。

11.权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体的用途，用于作为催化剂，催化产生α-广藿香醇；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸。

12.一种催化产生α-广藿香醇的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体为催化剂进行反应，催化法尼基焦磷酸环化，获得包含α-广藿香醇的产物；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，广藿香醇合酶突变体催化FPP环化在细胞内或细胞外进行。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。

16.如权利要求13～15任一所述的方法，其特征在于，所述的细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌；所述真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

17.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体，以及工业合成上可接受的载体；或含有权利要求5所述的宿主细胞。

18.一种试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体，或含有权利要求5所述的宿主细胞，或含有权利要求17所述的组合物。