CN115976118B - 一种生物合成诺卡酮的方法及载体 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种生物合成诺卡酮的方法，其包括采用能够表达瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶的重组菌合成诺卡酮；其中，所述瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶来自益智。本申请鉴定出由法尼基焦磷酸合成诺卡酮的全套酶及其编码基因，并提供了利用所述酶生物合成诺卡酮的方法，采用本申请的酶及生物合成方法，有利于获得诺卡酮高产菌株，提高生物合成诺卡酮的产量。

Description

一种生物合成诺卡酮的方法及载体
技术领域
本申请属于诺卡酮生物合成领域，具体涉及一种生物合成诺卡酮的方法及载体。
背景技术
诺卡酮被发现存在于阿拉斯加黄柏、葡萄柚等植物中，其是一种天然的倍半萜酮，具有宜人的葡萄柚香味，因此诺卡酮可以用于制备香料或作为葡萄柚味的调味剂使用。此外人们还发现诺卡酮具有趋避蚊虫的作用，2020年8月美国环境保护署批准了诺卡酮作为驱虫剂或杀虫剂使用，因此诺卡酮也可以制成作驱蚊水和蜱虫趋避剂使用，目前也有相关的研究表明诺卡酮可以刺激人体交感神经分泌相关激素，起到燃脂减肥的作用。以上表明了诺卡酮具有很高的应用价值。
诺卡酮可以从植物中提取获得，但由于植物中诺卡酮含量低，限制了其应用。诺卡酮还可以由瓦伦烯化学合成获得，但反应过程涉及毒性重金属，也影响了此方式的应用。使用微生物细胞工厂全合成诺卡酮是一条具有潜力的方式。
发明内容
本申请的目的在于提供一种生物合成诺卡酮的方法及载体。
本申请为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：
本申请第一方面提供了一种生物合成诺卡酮的方法，其包括采用能够表达瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶的重组菌合成诺卡酮；其中，所述瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶来自益智。
本申请第二方面提供了一种用于诺卡酮合成的酶，其具有与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本申请第三方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第二方面所提供的酶的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。
本申请第四方面提供了一种核酸构建体，其包含权本申请第三方面所提供的多核苷酸分子的至少一种。
本申请第五方面提供了一种重组菌，其包含本申请第三方面的多核苷酸分子，或本申请第四方面的核酸构建体；所述重组菌通过将所述多核苷酸分子或所述核酸构建体导入宿主细胞中获得；优选地，所述宿主细胞为真核细胞；更优选为酿酒酵母。
本申请第六方面提供了采用本申请第二方面的酶、本申请第三方面的多核苷酸分子、本申请第四方面的核酸构建体或本申请第五方面的重组菌生产瓦伦烯、诺卡醇和/或诺卡酮的用途。
本申请鉴定出由法尼基焦磷酸合成诺卡酮的全套酶及其编码基因，并提供了利用所述酶生物合成诺卡酮的方法，采用本申请的酶及生物合成方法，有利于获得诺卡酮高产菌株，提高生物合成诺卡酮的产量。
附图说明
图1为质粒pZY900构建示意图；
图2为质粒pDXYZ3构建示意图；
图3为质粒pDXVS1、pDXVS2构建示意图；
图4为质粒pDXNL1、pDXNL2、pDXNL3、pCK构建示意图；
图5为质粒pDXNT1构建示意图；
图6为JDXYZ3菌株发酵产物中瓦伦烯和瓦伦烯标准品的提取离子流色谱图；
图7为CK菌株、JDXNL1菌株(图中标记为CYP6)，JDXNL2菌株(图中标记为CYP9)和JDXNL3菌株(图中标记为AoKo)摇瓶发酵产物，以及诺卡醇标准品提取离子流色谱图；
图8为JDXNT1菌株(图中标记为CYP6)、JDXNT2菌株(图中标记为CYP9)和JDXNT3菌株(图中标记为AoKo)摇瓶发酵产物，以及诺卡酮标准品提取离子流色谱图。
具体实施方式
本文使用的术语和说明仅仅是为了描述特定的实施方案，而不意在限制本申请。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
定义
如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“约”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语“核酸”或“多核苷酸”还包括含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。
“构建体”是指任何重组多核苷酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体、线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)，其可衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，其可以以可操作的方式连接一个或多个多核苷酸分子。本申请中，构建体通常包含本申请的多核苷酸分子，其可操作地连接至转录起始调节序列，这些序列会导引本申请的多核苷酸分子在宿主细胞中的转录。可使用异源启动子或内源启动子导引本申请的核酸的表达。
“载体”是指任何重组核酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。载体可以包含用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于在生物体中表达目的蛋白质的启动子。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们连接的外源基因的表达。一种类型的载体是“质粒”，其通常是指可以连接入另外的DNA区段(外源基因)的环状双链DNA环，也可以包括线性双链分子，诸如从通过聚合酶链式反应(PCR)的扩增或用限制酶处理环状质粒得到线性双链分子。
质粒载体包括载体骨架(即空载体)与表达框架。
术语“表达框架”是指具有编码蛋白质潜能的序列。
术语"宿主细胞"指的是能够将目的基因导入，并为目的基因克隆和/或表达提供条件的细胞，诸如微生物。
术语“重组菌”指的经过基因工程改造的菌(如细菌、酵母菌、放线菌等)，这意味着它们的菌体中引入了外源基因片段，其中，改造的一种方式包括菌体基因组被引入新的DNA片段后发生了改变，另一种方式包括菌体中引入了经过人工构建或改造过的质粒，从而使菌体获得表达目的基因的能力。
本申请第一方面提供了一种生物合成诺卡酮的方法，其包括采用能够表达瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶的重组菌合成诺卡酮；其中，所述瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶来自益智。
益智(拉丁学名：Alpinia oxyphylla Miq.)，别名：益智仁、益智子。姜科，山姜属多年生草本植物。发明人通过对益智的深入研究，从益智中鉴定出参与诺卡酮合成的全套酶和编码基因，并基于此提供了一种生物合成诺卡酮的方法。其中，实施瓦伦烯合酶能够以法尼基焦磷酸为底物，合成瓦伦烯；瓦伦烯在细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450氧化还原酶的共同作用下生成诺卡醇，再在醇脱氢酶的作用下得到诺卡酮。
在一些实施方式中，所述瓦伦烯合成酶具有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化酶选自细胞色素P450氧化酶CYP6、细胞色素P450氧化酶CYP9和细胞色素P450氧化酶AoKo的至少一种；其中，细胞色素P450氧化酶CYP6具有与SEQID NO.2所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶CYP9具有与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶AoKo具有与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化还原酶具有与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；
所述醇脱氢酶具有与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述瓦伦烯合成酶YZT3的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MEKQSVTLVRDDQGIVRKSTKYHPSVWGDYFIRNSPLNLSEESTQRMIERVEELKVQVKSMFKGTSDVLQIMNLIDSIQLLRLEYHFENEIDGALRLIYEVDDKNYGLYETSLRFRLLRQHGYNVSADTFNKFKDENGSFISILNGDAKGLLSLYNASYLATHGETILDEANNYTKSQLVSLLSELEQPLATQVSLFLEAPLCRRMKSILARKYIPIYEKEAMRSDDILELAKLDFNLLQSLHQEELKKASIWWNDLALAKSLSFTRDRIVEGYYWILSMCYEPQYSRARVMCAKAFCLLSIMDDIYDNYSILEERRLLTEAIKRWNHEAVDSLPEYIKDFYLKLLKAFEEFEAELEFNEKYRVQYLQNEFKAIAISYFEESKWCVERYVPSLDEHLRVSMITSGCSMVVCSMYLGMGEVATKEIFDWCSSFPKAMEASGVIARLLNDIRSHETEQGRDHAASTVESYMKEHGVDVKVARKKLQEIVEKAWKDLNKELLNPTPVARPIIERILNLTMSMEDIYRYIDEYTSPDNKTNGDVSLVLVESIPI*(SEQ ID NO.1)
在一些实施方式中，所述细胞色素P450氧化酶CYP6的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MAEVQLTPLLLIFLLLFLFLFLFLIGTERKLFSNSRGARLPPGPSKLPVIGNLHQLCGGLPHRVLRDLAGIHGPLMLLRLGQVDLAVVSSRNAVLQVTKIHDLNFAHRPQLLAPSKICYGCSDVAFSSYGDYWRQMRRICATDLFTAKRIKSFSAIRAEEVAKLLRDAEAAAAAGQPMNLNYKLTAISNSIVTRASFGFKFDNQHAFIETMKGAILLASGFCAADLFPSLKFVASICGLTSKLKMLHCKVDEILDATIKKHQSSKSEGDEENLLDVLLRLKDDGTLESPITFDNIKAVILDVFTGGTETSSTIVEWTMSELIRNPSAMAKAQGEVREAMMRRQSRDFDEEVIGELHYLKLVIKESLRLHPPLPLLVPRVAKEACQVLDYEVPAGTRVVINAWALGRDPLYWGADAERFRPERFEDGEVDYKGGHLEFIPFGAGRRICPGMRFGMATVELVLAQLLFHFDWELPGGGEGNTAAEELDMAEAFGATVVRKEELRLVPVLRYPLPPAA*(SEQ IDNO.2)
在一些实施方式中，所述细胞色素P450氧化酶CYP9的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MEAFTLKLIILFFAPLLLFLLFLRRSHGRRRGHGKPLPPGPFNLPVIGSLHHLLGPLLHQTLASMSQRYGPAILLKFGHVTTLVISSVEAAAEIMKTHDVSFATRPVIHSAKMIAYGGDGIVFAPYGTSWRELRKMSMVELLSAKRVQYFRYIREDEVLKFMRSITLAPQSVNLSSSFKVLANDIAARAIIGSKCQYQQEFLRLIMKGLQEAGGFNLADLYPSSPLLGLLSRLLSSKMQQLHLEVDAILDGIIKEHRQRSKTFAEQSAEEDMVDTLLKVQAEGSLPFPLTDLSIKAMIFDLFAAASETTSTTMEWAMSELMKNPVAMKQAQEEVRRVVGSKGKVTEDHVGEMSYLKQAVRESLRLHPPLPLLLPRECQEAMEVMGYWIPAKTRVLVNAWALARDPRYWDDATEFKPERFAAGGRSCGVDMKGTNLELIPFGAGRRMCPGSTFGMASVELVLACLLYYFDWEMPVPGDGGAAKKPTELDMEEQFILACHKKTQLRLRAIPRI*(SEQ ID NO.3)
在一些实施方式中，所述细胞色素P450氧化酶AoKo的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MISTAFASVAAAIFTVFILIRFRRRSRVSNLPPAVPGLPLIGNLLQLKDKKPHQTFTKWAQIYGPIYTIKTGASTMVVLNSTEVAKEAMVAKYSSISNRKLSKALTLLTSNKRMVAMSDYGEFHKMVKRYILTSLLGANAQKQNYGIRETLINNVVKFLYSDLSDNPNDAVNLRKSFQPELFRLAMKQALNLEPESIYVEELGRELSKEEIFNVLVVDPMMGAIEVDWRDFFPYLRWVPNRSFENKLKRMLMRRAAVMQVLITKRKNSKQSKEEISCYLDFLLSQGTLTDEEIISLVWEAVIESSDTTLVTTEWAMFELSKNPNKQERLYQEIQQVCGSENVTDEHLSRMPYLNCVFHETLRRHSPVPIVPLRYAHEDTQIGGFNILAGSEIAINLYGCNMDKMQWDEPNEWKPERFIDSKYEQMDSYKTMAFGAGKRICAGSLQASSIACTAIGRLVQEFEWRLKEGEEANVVTVQLTNLKLEPLLAYIKPRSTNDACL*(SEQ ID NO.4)
在一些实施方式中，所述细胞色素P450氧化还原酶AoCPR的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MQTDSGKASPLDLLSAVVASLSGGDGLDLGAGNPSVEYRRLIAVLSTVVAVLVGCAAIFFFRRSSGKKPAEPPKPLAVKTQLDAEEDQGKKKVTVFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYPNAIFKVVDIDEYATEDDEYEENLKKESLVLFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGKERVTWLENLQFSVFGLGNRQYEHFNKVAKVVDELLQEQGAKRIVQVGLGDDDQCIEDDFSAWRELLWPELDKLLQDENETGASTPYTAAVPEYRVVFVKPEEVPYLDKSLSFANGHAIHDIQHPCRANVAVRRELHTSASDRSCIHLEFDIDGTGLVYGTGDHVGVFADNCSEIVEEAAKLLGYSPDTYFSIHTDKEDGTPLGGSLSPPFPSPCTLKTALTRYSDVLNSPKKSALLALAAHATDLSDAERLKFLASPIGKDEYSQWIVANQRSLLEVMAEFPSAKPPLGVFFAAIAPRLQPRYYSISSSPRMAPSRIHVTCALVYEKTPTGRIHKGVCSTWMKNSISLEENQECSWAPIFVRQSNFKLPVDPSVPVIMIGPGTGLAPFRGFLQERLALKKEGLELGHSILFFGCRNRKMDFIYEDELNNFVETGVLSEFIVAFSREGPTKQYVQHKMTEKASELWNIISQGGYVYVCGDAKGMARDVHRVLHTIVQEQGGMDSSKTESFVKSLQMEGRYSRDVW*(SEQ ID NO.5)
在一些实施方式中，所述醇脱氢酶AoADH的氨基酸序列如下所示(氨基末端至羧基末端)：
MASSFVLSSVAKRLEGKVTLITGGASGLGECTAKLFARLGARVVVADIQDDKGRALCDSLGPDTASYVHCDVTKEPDVASAVDAAVARHGKLDVMFSNAGVGEVLQKSLPDCEVADFQRLMSVNVTGVFLATKHAARVMTPARRGSIVITGSTTSTIGGLGPHAYTCSKHAVVGLMRSAAVELGRHGVRVNCVSPHGMATPMTMAAFDLDKEGVEAMFERSANLKGVRLEAEDVAEAVAYLAGDESRYVSGVNLLVDGGFTIAKGLA*(SEQ ID NO.6)
在一些实施方式中，所述重组菌能够合成法尼基焦磷酸。
在一些实施方式中，所述重组菌能够表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的至少一种。
在一些实施方式中，所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶为截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，其截去了内质网定位序列，增强了酶在细胞质中的稳定性。
发明人发现，乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶属于甲羟戊酸途径中的酶，甲羟戊酸途径可以合成异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，二者可以作为前体，在法尼基焦磷酸合酶的催化下合成法尼基焦磷酸(FPP)，而FPP是生物合成诺卡酮的底物，因此，当所述重组菌能够表达甲羟戊酸途径中的酶和法尼基焦磷酸合酶的至少一种时，有利于FPP的合成，进而有利于诺卡酮的生物合成。
本申请第二方面提供了一种用于诺卡酮合成的酶，其具有与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本申请第三方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第二方面的酶的核苷酸序列或其互补序列的至少一种。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码瓦伦烯合成酶YZT3(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atggagaaacaatcagtaactctcgtgcgtgatgaccaagggatagttcgtaagtcgacaaaatatcatccaagcgtttggggtgattatttcatccgaaactcgcctctcaatctatcagaggagtccactcaaaggatgatagagagagtagaagaattaaaggtgcaagtaaagagcatgttcaagggcaccagtgacgtattgcagattatgaacttgattgattcaattcaacttctaagactagaatatcattttgagaatgaaatagatggtgcactaagattgatctatgaggtcgacgacaagaactatggactttatgaaacttctcttagatttcgattgcttaggcaacatggatataatgtttctgcagatacctttaacaagttcaaagatgagaatggaagctttatatctatcttgaatggagatgcaaagggattactaagcttatataatgcatcttaccttgcaacgcatggagagactatacttgatgaagccaataattatacaaagtctcagctagtatccttattgagtgaacttgaacaacctttagcgacacaagtatcacttttccttgaagcgcccctatgtcgaagaatgaaaagtatcttggcaagaaaatatatacctatttatgaaaaggaagcaatgcgaagtgatgacatattagaacttgcaaaattggatttcaatctactgcaatctcttcatcaagaggagttgaagaaagcttcgatatggtggaatgatttagcccttgctaaatctctaagttttactcgtgatcgaatcgtggaaggttattattggattcttagtatgtgttatgagcctcaatattctcgtgcacgagtgatgtgcgccaaagcattttgtcttctatcaattatggatgatatttatgacaactatagcatattggaagagcgcagattattaactgaggcaataaagaggtggaatcatgaagctgttgattctttaccagaatatataaaagatttttatctgaagctattaaaggcttttgaagaatttgaagcggaattggaatttaatgagaagtatcgtgtgcaataccttcaaaatgaatttaaagctatagccatatcatattttgaagaatccaagtggtgtgtggaaagatatgtgccgtcactcgacgaacacttgcgtgtttctatgatcacctctggatgttctatggtcgtttgttctatgtatcttggtatgggagaagtggcaacaaaagagattttcgattggtgttctagttttcccaaggcaatggaagcaagcggtgtaattgctagactcctcaatgatataagatcacacgagactgagcaagggagagaccatgctgcctctacagtggaaagttacatgaaagagcacggcgtagatgtaaaagttgcacgcaagaagctacaagagatagtggagaaagcgtggaaggatctaaataaggaacttctcaaccccacaccagtagctcgacctataattgaaagaatactcaaccttacaatgtcaatggaagacatatataggtacattgacgagtacaccagtcctgataataagacgaacggtgatgtctccttggtgttggttgaatctattcctatatga(SEQ IDNO.7)
在一些实施方式中，通过对野生型瓦伦烯合成酶YZT3的核苷酸序列按照酿酒酵母密码子偏好性优化后，得到瓦伦烯合酶的编码基因AoVS的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atggaaaagcaatctgttacattggttagagatgatcaaggtattgttagaaaatctacaaagtaccatccatctgtttggggtgattattttattagaaactctccattgaacctgtctgaagaatctactcaaagaatgattgaaagagttgaagaattgaaggttcaagttaaatctatgttcaagggtacatctgatgttttgcaaattatgaatctgatcgattctatccaattgttaagattagagtaccatttcgaaaacgaaattgatggtgctttaagattaatctacgaagttgatgataagaactacggtttgtatgaaacatctttaagattcagactgttgagacaacatggttataatgtttctgctgatacttttaacaagttcaaagatgaaaacggttcttttatctctatcttaaacggtgatgctaaaggtttgttatctttatataacgcttcctatctggctacacatggtgaaacaattttagatgaagctaataactacaccaagtctcaattagtttctttgttgtctgaattggaacaaccattagctactcaagtttctttatttttggaggctccattatgtagaagaatgaaatctattctggctagaaaatacatcccaatttatgaaaaggaggctatgagatctgatgatattttggaattggctaaattggatttcaacttattgcaatctctgcatcaagaagaattaaaaaaggcttctatctggtggaatgatttggctttagctaaatctttgtcttttacaagagacagaatcgttgaaggttattattggattttgtctatgtgttacgagccacaatattctagagctagagttatgtgtgctaaagctttttgtttattgtctatcatggacgatatctatgataattactctatcttggaggaaagaagattgttaacagaagctattaagagatggaatcatgaagctgttgattctttgccagaatatattaaagacttctacttgaagctgttgaaagcttttgaagaatttgaagctgaattggaattcaatgaaaagtatagagtccaatacttgcaaaatgaattcaaagctatcgctatttcttactttgaagaatctaagtggtgtgttgaaagatatgttccatctttggatgaacatttgagagtttctatgattacttctggttgttctatggttgtttgttctatgtatttgggtatgggtgaagttgctacaaaagaaatttttgattggtgttcttccttcccaaaagctatggaagcttctggtgttattgctagattattaaatgacatcaggtcacatgaaacagaacaaggtagagatcatgctgcttctacagttgaatcttatatgaaagaacacggtgttgatgttaaagttgctagaaaaaaactgcaagaaatcgttgaaaaggcttggaaagatttgaataaagaattgttgaaccccacaccagttgctagaccaattattgaaagaattttgaacctgactatgtctatggaagatatttatagatacatcgacgaatacacatctccagataataaaacaaacggtgatgtttctttggttttggttgaatctatcccaatttaa(SEQ IDNO.13)
在一些实施方式中，编码细胞色素P450氧化酶CYP6(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atggcggaggtccaactcactcccctcctcttaatcttcctcctcctcttcctgttcctcttcctcttcctcatcggcacagagaggaagcttttctccaactccagaggagctcgcctcccgcccggtccgtcgaagctacccgtcattggcaacctgcaccaactttgcggcggcctaccccaccgtgtcctgcgcgacctcgccggcatccacggccccctcatgctcctccgccttggccaggtcgacctcgccgtcgtatcctcccgaaatgccgtcctgcaggtcaccaagatccacgacctcaacttcgcccatcgcccccagctcctggccccttccaaaatctgctacggctgctccgacgtcgccttctcttcctacggagactactggcgccagatgcgcaggatctgcgcaaccgatctcttcaccgccaagcgcatcaagtcattctctgccatccgcgcagaagaggtcgccaagctcctccgcgacgccgaggcggcagcggctgccggccagccgatgaacttgaactacaagctcacggcgatctcgaacagcatcgtgacccgcgcctctttcggtttcaaattcgataaccagcacgcgttcatcgagaccatgaagggggcgatactgctcgcgtcggggttttgcgccgcggatctgttcccgtctttgaagttcgtggcctcgatctgcggcctcacctccaagctgaagatgcttcactgcaaagtggatgaaattctcgacgcgaccatcaaaaagcaccaatcgagcaagagcgaaggggacgaagagaatctcctcgacgttctacttcgtctaaaagacgacggaaccctggaatccccaatcacattcgacaacatcaaagctgtgattttggacgtcttcacgggagggacggagacctcgtcgacgattgtagaatggacgatgtcggagctcatcaggaaccctagcgcgatggcgaaggcacaaggggaagtgcgagaagcgatgatgcgaaggcaaagcagggatttcgacgaggaagtcatcggcgagctccattacctgaagctagtgatcaaggagagtctgaggctacacccgccgctaccactgttggtgccgagggtggcgaaggaggcgtgccaggtgctggactacgaggtgccggcgggcacgagggtggtgatcaacgcctgggccctagggagggacccgctctactggggcgccgacgccgagcggttccggcccgagaggttcgaggacggtgaggtggactacaaggggggccacctggagttcattccattcggcgccgggaggaggatatgccccgggatgagattcgggatggcgacggtggaactcgtattggcgcagctgctgttccacttcgactgggagctaccaggaggaggagaagggaatacggcggcggaggaactggacatggcggaggcattcggggcgaccgtggtgaggaaggaggagctccgcctggttccggtgcttcgatatcccctgccgcccgctgcttag(SEQ ID NO.8)
在一些实施方式中，编码细胞色素P450氧化酶CYP9(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atggaagcttttaccttgaagcttatcattctcttcttcgcccccctcctcctcttcctcctcttcctcaggcgcagccatggccgacggcggggccacggcaagcctctccctcctggcccattcaacctccccgtcatcggcagcctgcaccacctcctcggcccgttgctgcaccagacgctcgcgtctatgtcccagcgatacggccccgccatcctcctcaagttcggccatgtcaccaccctcgtcatctcctccgttgaggccgccgcagagatcatgaagacccatgacgtcagcttcgccacgcgtcccgtcatccattcagccaagatgatcgcctacggcggcgacggtattgtcttcgcgccatacggcaccagctggcgcgagctccgcaaaatgagcatggtggagctcctcagtgccaagcgcgtccagtacttccgctatatccgcgaggatgaggtgcttaaatttatgcgctccattacgttggcaccccaaagcgtgaatcttagtagcagttttaaggtgctcgcgaacgacatcgcggcgagggccatcattgggagcaagtgccagtatcagcaggagttcctgcggctgataatgaaggggctccaagaagcggggggattcaacttggccgacttgtacccgtcgtcgccgctcctcgggttgctcagccgcttgttgtcttccaagatgcagcagctgcacctcgaggtggatgccatcttggatggcatcatcaaggagcacagacagaggagtaaaacgttcgcagagcagagtgcagaggaggacatggtggataccctgctcaaggttcaagcggaaggcagccttccgttccccctcacggacttgtccatcaaagctatgatttttgatctttttgcagcggcgagcgagaccacctctacgaccatggaatgggcgatgtcggagctgatgaagaatccggtggcgatgaagcaggcgcaggaggaagtgaggcgggtggtgggaagcaaggggaaagtcaccgaagatcacgtcggcgagatgagttacctcaagcaggcggtaagggagtcgctgaggcttcaccctcccctgcctctgttgctgccgcgggagtgccaggaagcgatggaggtgatgggctactggattccggcgaagacgagggtgctggtgaacgcgtgggcgctggcgagagacccaaggtattgggacgacgccacggagttcaagccagagaggttcgccgctggtgggaggagctgcggggtggacatgaaaggcaccaacttggagctcataccgttcggggcgggtagaaggatgtgccctggtagcacgttcggaatggcgagcgtggagctggtgcttgcttgccttctctattactttgactgggagatgccggtcccgggcgacggaggagcggcgaagaaaccgacggagttggacatggaagaacagttcatactggcgtgtcataagaagacgcagcttcgcttgcgcgcgatccctcgtatatag(SEQ ID NO.9)
在一些实施方式中，编码细胞色素P450氧化酶AoKo(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atgatttccacggccttcgcaagtgtcgctgccgccatcttcacggttttcatcctcatcaggttccgacgccgcagtcgcgtttccaatcttccgccggctgtccccgggcttcccttgattgggaatttgctccagctgaaggacaagaaacctcaccagacattcacgaaatgggcgcagatatatggcccgatttataccatcaagacgggcgcttccactatggtagtcctgaattctactgaggttgccaaagaggcaatggtggctaagtattcatccatctcaaatcggaaattgtcaaaggcattgacattgctcacttcaaataaacgtatggttgctatgagtgactatggagagttccacaaaatggtgaaacggtacatattgactagtttgttaggtgcaaatgctcagaagcaaaactatggtatcagggagacgttgattaataatgtcgtcaaatttctatattcggatttaagcgataaccctaatgatgcagtaaacctcagaaagtcatttcaacctgagttattccgattagccatgaagcaagctttgaacctggaacctgaatccatttatgtagaggaacttgggagggaactttcaaaggaagaaatattcaatgtgttggtggtagaccctatgatgggcgccattgaggtggactggagggactttttcccttacttgagatgggtccctaatcgaagctttgaaaataagctaaagagaatgctcatgcgcagggcggcagtgatgcaggttctgattacaaaaagaaagaacagtaaacaatccaaagaggagataagctgctatttggactttctgctatcccagggcactttgactgacgaagagataatatcgttagtatgggaagcggtaattgagtcatcggatacaactttagtcacaacagaatgggctatgtttgagctatctaagaatccaaataaacaggaacgtctttaccaagaaattcaacaagtatgtggatctgaaaacgtcaccgatgagcatttgtcacggatgccctacttgaactgtgtgttccatgagaccctaagacgtcattcccctgttcctatagtacctctcaggtatgcccatgaagatacccagatcggaggattcaacatccttgcggggtctgagattgccatcaatctttatggatgcaatatggacaagatgcagtgggatgaacctaatgaatggaagcctgagagattcatagacagcaaatatgagcaaatggactcgtataagactatggcctttggagctggaaagaggatttgtgccggatctctgcaggcatcgtcgattgcatgcactgccatcgggcgtttagtgcaagagttcgagtggaggctgaaggaaggagaagaggctaatgtcgtcactgttcagctcacaaaccttaagcttgaacctctgcttgcatacataaagcccagaagcaccaacgatgcatgcctttga(SEQ IDNO.10)
在一些实施方式中，编码细胞色素P450氧化还原酶AoCPR(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atgcagacggattccgggaaggcttcgccgctcgatctcttgtcggctgtcgtcgcctcgctatccggtggagatgggctcgatttaggcgccgggaatccctcggtggagtaccggcggctgatcgccgtcctgagtactgtcgtcgccgtgctagttggctgcgcggcgatattcttcttccggagatcgagcggaaagaagccggccgagccgccgaagccgctggcggttaagactcagctggatgcggaggaggaccaagggaagaagaaggtcaccgtcttcttcggcacgcagaccgggacggccgaggggtttgcgaaggcgctggctgaggaggccaaggcacggtaccctaatgccatatttaaagtcgtggatatcgacgaatatgctactgaggacgatgagtacgaggagaacctgaaaaaggagagcttggttttgttcttcttggctacgtatggagatggcgagcctactgataatgctgcccggttctacaaatggtttacagaggggaaagagagagtaacctggttggaaaatcttcaattttctgtgtttggtttgggcaatcggcaatatgaacattttaataaggttgctaaggtagttgatgaactgcttcaagagcaaggtgccaaacgcattgtccaagtgggattgggagatgatgatcagtgtattgaggatgacttctctgcatggagggaacttctttggccggagttggataagttgcttcaggacgaaaatgagacaggtgcatctactccttatacagctgctgttcctgaataccgggttgtatttgtcaagccagaagaagttccatatctggataaaagtttgagttttgcaaatggccatgctattcatgacatacaacatccatgcagggctaatgtggctgtgagacgagagcttcatacttcagcttcagaccgatcctgcatccacttggagtttgacatagatggcactggccttgtgtacggaacaggagaccatgttggtgtattcgcggacaactgttctgagattgtagaggaggctgcaaagttgttaggttattcacctgacacatatttctctattcatactgacaaggaggatggcacgccacttggaggctctttgtcacctcctttcccatctccatgcactctcaaaaccgctcttactcgatactctgatgttctaaattcacctaaaaagagtgcattacttgcccttgccgcacacgcaacagatcttagtgatgctgagcgacttaaatttttggcttctcctattggaaaggatgaatattctcaatggattgttgctaatcagaggagtcttcttgaagtcatggccgaatttccctctgcaaagcctcctctaggagtcttctttgccgcaatagccccacgtttgcagccaagatattattcaatttcctcttctccgaggatggcacctagtagaattcatgtgacttgtgcattagtttatgaaaagacaccaactggcaggattcataaaggggtttgttccacctggatgaagaattccatttcgctcgaagagaaccaagaatgcagctgggctcctatttttgtgaggcagtctaactttaaactccctgttgatccttcggtacctgtcatcatgattggaccgggcacagggttggcacctttcaggggcttcttacaggaaaggttggcattgaaaaaggaagggttggaacttggtcattctattctcttcttcggatgcagaaaccgcaaaatggacttcatctacgaggatgagttgaacaactttgtcgaaacaggcgtgctttccgagtttattgtggccttctcccgtgagggtccaactaaacaatatgtgcaacacaaaatgaccgagaaagcatcagaactttggaatatcatctcccaaggtggatatgtatacgtgtgtggagatgctaagggcatggctagagatgttcacagagttcttcatactattgttcaagagcagggaggtatggatagctccaaaacagaaagcttcgtcaagagcttgcaaatggaagggagatattcaagggatgtatggtga(SEQ ID NO.11)
在一些实施方式中，编码醇脱氢酶AoADH(野生型)的核苷酸序列如下所示(5’末端至3’末端)：
atggcaagctcctttgttctctcctctgtagcaaaaaggctcgaagggaaggtgacattgatcaccggcggggcgagcgggctcggcgagtgcaccgccaagctgttcgcccgcctcggcgcccgagtagtcgtcgcagacatccaagacgacaaaggccgcgccctgtgcgactcactcggccccgacaccgcctcctacgtccactgcgacgtcaccaaggagcccgacgtggcaagcgccgtcgacgccgccgtcgcccgacacgggaagctcgacgtcatgttcagcaacgccggagtcggggaagtgttgcagaagtcgttgcccgactgcgaggtggctgacttccagcgattgatgtcggtgaacgtgacgggggtgttcctggccaccaagcacgcggcgcgggtgatgacgccggcgaggcgggggagcatcgtgatcacggggagcaccacgtcgactattgggggactagggccgcacgcatacacgtgctcaaagcacgcggtggtggggctaatgaggagcgcggcggtcgagctgggcaggcacggtgttcgggtcaactgcgtgtcgccgcacgggatggcaacgccgatgacgatggcagcgtttgacttagacaaggagggggttgaggccatgtttgagaggtcggccaacctgaaaggtgtgaggctcgaagcggaggacgtggcggaggcagtggcgtacctcgccggcgacgagtccaggtatgtgagcggcgtcaatctgctggtggacggaggcttcaccattgccaagggattggcgtag(SEQ ID NO.12)
本申请第四方面提供了一种核酸构建体，其包含本申请第三方面的多核苷酸分子的至少一种。本申请中，将连接入所述核酸构建体的多核苷酸分子称为目的基因，将所述多核苷酸分子编码的酶称为目标蛋白。
在一些实施方式中，所述核酸构建体中还包含调控编码目的基因表达的调控元件，例如启动子、终止子等，示例性的，所述启动子可以为组成型启动子如PTEF1、PTDH3、PGPM1、PTPI1等，诱导型启动子如PHXT1(高浓度葡萄糖诱导)、PCUP1(铜离子诱导)、PGAL1、PGAL2、PGAL7、PGAL10(半乳糖诱导)等，本领域技术人员可根据需要选择，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述核酸构建体中还包含用于筛选包含目的基因或目标蛋白的重组菌的标记基因，例如亮氨酸筛选标记、组氨酸筛选标记、色氨酸筛选标记、尿嘧啶筛选标记等，本领域技术人员可根据需要具体选择，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列位于两个插入元件之间，所述插入元件用于将所述核苷酸序列整合入宿主细胞的基因组中。
在一些实施方式中，两端连接有插入元件的核苷酸序列连接于核酸构建体，例如质粒载体的质粒骨架中，所述核酸构建体用于向宿主细胞导入目的基因时，可以通过限制性内切酶等工具，将所述核酸构建体酶切，从而获得两端连接有插入元件的线性化的目的基因片段，通过将所述线性化的目的基因片段导入宿主细胞中，使其通过两端的插入元件插入宿主细胞基因组的相应位置，从而获得本申请的重组菌。
本领域技术人员可采用常规的方法将线性化的目的基因片段导入宿主细胞中，例如对于酵母菌，可采用醋酸锂法，对于大肠杆菌，可采用钙转法等，此为本领域的常规操作，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述两个插入元件成对出现，例如可以是leu2的左右同源臂、Ura3的左右同源臂、YPRCdelta15左右同源臂等，不同基因的同源臂可以将目的基因整合入宿主细胞基因组的不同位置，本领域技术人员可根据希望整合入宿主细胞基因组的位置具体选择同源臂的种类，本申请在此不做限定。
在一些实施方式中，所述两个插入元件之间还包括用于调控目的基因表达的启动子、终止子等调控元件。本申请对所述启动子和终止子的种类不做限定。
在一些实施方式中，所述核酸构建体还包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶(ERG10)、羟甲基戊二酰辅酶A合酶(ERG13)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG1)、截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)、甲羟戊酸激酶(ERG12)、甲羟戊酸-5-磷酸激酶(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)、异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI1)、法尼基焦磷酸合酶(ERG20)的核苷酸序列的至少一种；其中括号中显示了编码这些酶的基因名称。
编码以上酶的基因的示例性而非限制性的公开如下：
ERG10(Accession/GENE ID:856079)、ERG13(Accession/GENE ID:854913)、tHMG1(Accession/GENE ID:854900，截去4-1659bp)、ERG12(Accession/GENE ID:NM_001182715.1)、ERG8(Accession/GENE ID:CP046093.1，689693..691048)、MVD1(Accession/GENE ID:NM_001183220.1)、IDI1(Accession/GENE ID:NM_001183931.1)、ERG20(Accession/GENE ID:853272)。
在一些实施方式中，所述核酸构建体为质粒载体；优选地，所述质粒载体为真核表达载体。
在一些实施方式中，所述的核酸构建体包括pRS426质粒骨架。发明人发现，pRS426质粒骨架中包含适用于大肠杆菌的AmpR筛选标记，适用于酿酒酵母的URA3筛选标记，以及适用于大肠杆菌的复制子和酿酒酵母的多拷贝复制子，采用所述pRS426质粒骨架有利于含有目的基因的质粒在导入酿酒酵母中后维持质粒的高拷贝。
在一些实施方式中，所述pRS426质粒骨架中存在的突变，所述突变消除了pRS426质粒骨架中的酶切位点BsaI，从而可以在使用Goldengate方法构建载体时，以BsaI作为限制性内切酶。
在一些实施方式中，所述的核酸构建体包括pESC-TRP质粒骨架。发明人发现，pESC-TRP质粒骨架中包含适用于大肠杆菌的AmpR筛选标记，适用于酿酒酵母的TRP1筛选标记，以及适用于大肠杆菌的复制子和酿酒酵母的多拷贝复制子，采用所述pESC-TRP质粒骨架有利于含有目的基因的质粒在导入酿酒酵母中后维持质粒的高拷贝。
在一些实施方式中，所述质粒载体为pDXYZ3、pDXVS1、pDXVS2、pDXNL1、pDXNL2、pDXNL3、pDXNT1的至少一种，所述质粒载体的构建示意图如图2、图3、图4或图5所示；其中，质粒pDXYZ3的构建示意图如图2所示，质粒pDXVS1、pDXVS2的构建示意图如图3所示，质粒pDXNL1、pDXNL2、pDXNL3的构建示意图如图4所示，质粒pDXNT1的构建示意图如图5所示。
在一些实施方式中，可以将所述质粒载体直接导入宿主细胞中，也可以通过酶切所述质粒载体，获得包含插入元件的目的基因片段，进一步将所述基因片段整合入所述宿主细胞的基因组中。
本申请第五方面提供了一种重组菌，其包含本申请第三方面的多核苷酸分子，或本申请第四方面的核酸构建体；所述重组菌通过将所述多核苷酸分子或所述核酸构建体导入宿主细胞中获得；优选地，所述宿主细胞为真核细胞；更优选为酿酒酵母。
在一些实施方式中，所述重组菌中可以直接包含所述核酸构建体，例如，所述核酸构建体以质粒的形式单独存在于宿主细胞中，表达合成诺卡酮所需的酶。
在另一些实施方式中，所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中。所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中，有利于所述目的基因的长期稳定表达，从而获得能够稳定遗传的重组菌。
本领域技术人员可采用常规的方法将多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中，本申请在此不做限定，例如可以将目的基因连接于两个插入元件之间，通过插入元件将所述目的基因插入宿主细胞的基因组中，示例性的，所述插入元件可以为leu2的左右同源臂、Ura3的左右同源臂、YPRCdelta15左右同源臂，不同基因的同源臂用于将目的基因插入宿主细胞基因组的不同位置，发明人发现，将目的基因插入不干扰宿主细胞正常生理代谢的位点，均能够获得本申请的重组菌。
在一些实施方式中，所述多核苷酸分子在所述重组菌的基因组中的拷贝数至少1个，优选至少2个，更优选至少3个。增加所述多核苷酸分子的拷贝数，有利于其编码的酶的高表达。
在一些实施方式中，所述重组菌能够表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的至少一种。
发明人发现，酿酒酵母可以内源合成FPP，因此在一些优选地实施方式中，采用酿酒酵母作为宿主细胞，有利于获得高效合成诺卡酮的重组菌。
本申请第六方面提供了本申请第二方面的酶、本申请第三方面的多核苷酸分子、本申请第四方面的核酸构建体或本申请第五方面的重组菌生产瓦伦烯、诺卡醇和/或诺卡酮的用途。
下面通过具体实施例来说明本申请的生物合成诺卡酮的方法及载体。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的质粒均为本领域技术人员公知质粒。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达载体和菌株构建
1.1酵母表达通用载体的构建
质粒pZY900具体构建过程：以酿酒酵母S288c基因组(提取方法见：李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.2.3.6酵母基因组DNA提取方法)为模板，用引物900-1F/1R、900-2F/2R、900-6F/6R、900-7F/7R分别扩增获得片段9001(Leu2的左同源臂)、9002(终止子tTDH2)、9006(基因ERG20与终止子tERG20)、9007(Leu2右同源臂)；以酿酒酵母CEN.PK2-1D的基因组(提取方法见：李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.2.3.6酵母基因组DNA提取方法)为模板，用引物900-3F/3R、900-5F/5R分别扩增获得片段9003(终止子tCYC1)和9005(启动子pGAL1和pGAL10)；用引物900-4F/4R以pCAS(见文献Zhang,Yueping et al.“A gRNA-tRNA arrayfor CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.”Nature communications vol.10,1 1053.5Mar.2019,doi:10.1038/s41467-019-09005-3)为模板扩增获得片段9004(无义基因lacZ，用于目的基因的替换)；以pRS426为模板，用引物900-8F/8R、900-9F/9R、900-10F/10R扩增获得质粒骨架(引入MssI酶切位点，筛选标记(AmpR、URA3等))。通过DNA assemble(又称酵母组装，李晓伟.工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D].武汉大学,2015.)的方法将以上片段在酿酒酵母体内重组构建pZY900，然后在大肠杆菌内扩增，酶切验证以及测序正确后，得到pZY900。质粒pZY900构建示意图见图1，其中，片段9001(HA)、9002(T)、9003(T)、9004、9005、9006、9007(HA)从左至右依次连接，其余部分来自pRS426的质粒骨架。
构建质粒pZY900所用引物的序列见下表1。
表1
引物 序列(5’-3’)
900-1F actaaagggaacaaaagctggagctctagtagtttaaacataacgagaacacacagggg(SEQ ID NO.14)
900-1R cattaaagtaacttaaggagttaaatttaagcaaggattttcttaacttcttc(SEQ ID NO.15)
900-2F gaagttaagaaaatccttgcttaaatttaactccttaagttactttaatgatttag(SEQ ID NO.16)
900-2R tcgaaggctttaatttgcgcgaaaagccaattagtgtgata(SEQ ID NO.17)
900-3F tagtatcacactaattggcttttcgcgcaaattaaagccttcgagc(SEQ ID NO.18)
900-3R gggacgcgccctgtagcggctgaggtctcaacaggccccttttcctttg(SEQ ID NO.19)
900-4F catgatatcgacaaaggaaaaggggcctgttgagacctcagccgctacagggcgc(SEQ ID NO.20)
900-4R gaatttttgaaaattcaatataaatgtgagaccaccatgattacgccaagcg(SEQ ID NO.21)
900-5F taatcatggtggtctcacatttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttg(SEQ ID NO.22)
900-5R atctctctctcctaatttctttttctgaagccattatagttttttctccttgacgttaaagt(SEQ ID NO.23)
900-6F ttaacgtcaaggagaaaaaactataatggcttcagaaaaagaaattagga(SEQ ID NO.24)
900-6R atgtacaaatatcataaaaaaagagaatctttttaaaaaaaatccttggactagtcacg(SEQ ID NO.25)
900-7F actagtccaaggattttttttaaaaagattctctttttttatgatatttgtacataaac(SEQ ID NO.26)
900-7R gcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgtttaaacgacaacgaccaagctcaca(SEQ ID NO.27)
900-8F gatgtgagcttggtcgttgtcgtttaaacaacagttgcgcagcctgaatg(SEQ ID NO.28)
900-8R tcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtttctacaggatctgacattattattgttg(SEQ ID NO.29)
900-9F atagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagaaaccacatcatccacggtt(SEQ ID NO.30)
900-9R agggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgcgacccacgctcaccggct(SEQ ID NO.31)
900-10F tgataaatctggagccggtgagcgtgggtcgcgcggtatcattgcagcactggggccag(SEQ ID NO.32)
900-10R cgatagcgcccctgtgtgttctcgttatgtttaaactactagagctccagcttttgttc(SEQ ID NO.33)
1.2不同基因表达载体构建
以益智果的cDNA(采用TIANGEN公司RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(货号DP441)提取益智果实组织RNA，使用Vazyme的HiScript II 1st Strand cDNA SynthesisKit(+gDNA wiper)试剂盒(货号R212)对RNA进行反转录获得cDNA)为模板，以引物对P5/P6为引物，利用Takara公司的Prime STAR高保真酶通过PCR扩增益智的cDNA获得基因片段命名为YZT3，经天根胶回收试剂盒胶回收后，通过翊圣公司同源重组试剂盒，采用同源重组的方法连接到BsaI切后的酵母表达通用载体pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有YZT3基因的酵母表达载体，命名为pDXYZ3，其质粒构建示意图见图2，其中，以YZT3基因替代了pZY900中的lacZ基因。
引物对P5/P6序列如下表2所示：
表2
使用引物对P7/P8，以合成的AoVS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)为模板扩增得到AoVS基因片段。采用翊圣公司同源重组试剂盒，将扩增得到的AoVS基因片段连接到BsaI切后的pZY900中，经过测序确认无误后，获得含有AoVS基因的酵母表达载体，命名为pDXVS1，其质粒构建示意图见图3中的pDXVS1，其中，以AoVS基因替代了pZY900中的lacZ基因。
引物对P7/P8序列如下表3所示：
表3
使用引物对P9/P10，以合成的AoVS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)为模板扩增得到AoVS基因片段。使用引物P11/P12，以质粒pHM001(pHM001的构建见文献Deng etal.“Systematic identification of Ocimum sanctum sesquiterpenoid synthases and(-)-eremophilene overproduction in engineered yeast”.Metabolic Engineering,2022,69:122-133)为模板，扩增包含PKG1终止子(T)、URA同源臂(HA)、载体骨架、HIS3标签、CYC1终止子(T)、tHMG1与pGAL1-pGAL10启动子(PGAL10和PGAL1)的载体片段。采用翊圣公司同源重组试剂盒，通过同源重组的方式将AoVS基因片段和载体片段进行连接，得到质粒pDXVS2，其质粒构建示意图见图3中的pDXVS2。
引物序列如下表4所示：
表4
使用引物对P13/P14，利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到CYP6基因；使用引物对P15/P16，利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到AoCPR基因；使用引物对P17/P18，利用Prime STAR高保真酶从pESC-TRP质粒中克隆得到pGAL1-pGAL10启动子片段；使用SacI/XhoI双酶切pESC-TRP质粒得到载体骨架。采用翊圣公司同源重组试剂盒，将上述四个片段连接，获得质粒pDXNL1，其质粒构建示意图见图4中的pDXNL1。
引物序列如下表5所示：
表5
使用引物对P19/P20，利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到CYP9基因；使用引物对P15/P16利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到AoCPR基因；使用引物对P17/P18利用Prime STAR高保真酶从pESC-TRP质粒中克隆得到pGAL1-pGAL10启动子片段；使用SacI/XhoI双酶切pESC-TRP质粒得到载体骨架。采用翊圣公司同源重组试剂盒，将上述四个片段连接，获得质粒pDXNL2，其质粒构建示意图见图4中的pDXNL2。
引物序列如下表6所示：
表6
使用引物对P21/P22，利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到AoKo基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)；使用引物对P15/P16，利用Prime STAR高保真酶从益智果cDNA模板中克隆得到AoCPR基因；使用引物对P17/P18，利用Prime STAR高保真酶从pESC-TRP质粒中克隆得到pGAL1-pGAL10启动子片段；使用SacI/XhoI双酶切pESC-TRP质粒得到载体骨架。采用翊圣公司同源重组试剂盒，将上述四个片段连接，获得质粒pDXNL3，其质粒构建示意图见图4中的pDXNL3。
引物序列如下表7所示：
表7
使用引物对P23/P24，从益智果cDNA模板中克隆得到AoADH基因片段，通过BamHI/XhoI双酶切获得切后片段，随后与BamHI/XhoI双酶切后的pESC-URA质粒载体利用T4 DNA连接酶进行连接，获得的质粒命名为pDXNT1，其质粒构建示意图见图5。
引物序列如下表8所示：
表8
将使用引物对P15/P16克隆得到的AoCPR基因片段与经EcoRI/SacI双酶切pESC-TRP质粒回收的载体片段进行同源重组，得到pCK质粒，其质粒构建示意图见图4中的pCK。
1.3菌株构建
通过醋酸锂转化法方法将pDXYZ3质粒转化至酵母YZL141菌株中(YZL141菌株的构建见Bian,G.,Hou,A.,Yuan,Y.,Hu,B.,Cheng,S.,Ye,Z.,Di,Y.,Deng,Z.,&Liu,T.(2018).Metabolic Engineering-Based Rapid Characterization of a SesquiterpeneCyclase and the Skeletons of Fusariumdiene and Fusagramineol from Fusariumgraminearum.Organic letters,20(6),1626–1629.https://doi.org/10.1021/acs.orglett.8b00366)，涂布于SD-URA筛选平板上，挑取单克隆获得突变菌株命名为JDXYZ3。
利用MssI内切酶酶切pDXVS1质粒，回收含有AoVS的基因片段，通过醋酸锂方法将该片段导入酵母菌株JCR27中(JCR27的构建见Siemon,T.,Wang,Z.,Bian,G.,Seitz,T.,Ye,Z.,Lu,Y.,Cheng,S.,Ding,Y.,Huang,Y.,Deng,Z.,Liu,T.,&Christmann,M.(2020).Semisynthesis of Plant-Derived Englerin A Enabled by Microbe Engineering ofGuaia-6,10(14)-diene as Building Block.Journal of the American ChemicalSociety,142(6),2760–2765.https://doi.org/10.1021/jacs.9b12940)，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JDXVS1。进一步的，利用PmeI内切酶酶切pDXVS2质粒，回收含有AoVS的基因片段，通过醋酸锂方法将该片段导入JDXVS1中，进行酵母菌落PCR验证后，将阳性菌命名为JDXVS2。
利用醋酸锂方法分别将pCK，pDXNL1,pDXNL2和pDXNL3质粒转化JDXVS2中，获得CK对照菌株，JDXNL1，JDXNL2和JDXNL3突变体菌株。将pDXNT1质粒分别与pDXNL1,pDXNL2和pDXNL3质粒共转化入JDXVS2中，分别获得JDXNT1，JDXNT2和JDXNT3突变体菌株。
实施例2基因功能鉴定
2.1瓦伦烯合成基因功能鉴定
将JDXYZ3菌株接种于Sc-Ura液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至45毫升YPDHG液体培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，10g/L葡萄糖，10g/L半乳糖)中，加入5毫升肉豆蔻酸异丙酯，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集油层，使用正己烷稀释至合适的浓度，使用GC-MS检测产物，检测条件如下：
Thermo Fisher Scientific配备AS 3000自动进样，分流/不分流进样器的TRACEGC ULTRA气相色谱，以及配备三重四极杆检测器的TSQ QUANTUM XLS MS。
色谱柱为TR-5MS column(30m×0.25mm×0.25um)。载气为高纯氦气，流速1mL/min。丙酮作为洗针液。进样量1uL，分流比50。进样口温度240℃，离子传输管温度270℃。
检测程序：起始柱温为50℃，保持1min；按15℃/min升温至280℃，保持1min；按20℃/min升温至300℃，保持2min。
JDXYZ3发酵产物(图中标记为YZT3)和瓦伦烯标准品(Valencene，Sigma(#75056,CAS:4630-07-3))提取离子流色谱图如图6所示，通过和瓦伦烯标准品进行色谱图保留时间比对，可以确定菌株JDXYZ3可以合成瓦伦烯。此结果表明YZT3基因所编码的蛋白为瓦伦烯合成酶。
2.2细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶功能鉴定
将仅转入含AoCPR基因载体的菌株CK，以及同时包含细胞色素P450氧化酶和细胞色素P450氧化还原酶基因载体的菌株JDXNL1、JDXNL2和JDXNL3分别接种于Sc-Trp液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至50毫升含10g/L葡萄糖和10g/L半乳糖的Sc-Trp液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集菌体，加入10mL正己烷萃取菌体。萃取液经GC-MS检测产物，检测仪器与2.1相同，检测程序如下：起始柱温为80℃，保持1min；按8℃/min升温至280℃，保持5min；按20℃/min升温至300℃，保持2min。
CK菌株、JDXNL1菌株(图中标记为CYP6)，JDXNL2菌株(图中标记为CYP9)和JDXNL3菌株(图中标记为AoKo)摇瓶发酵产物，以及诺卡醇标准品(Nootkatol使用源叶的诺卡酮由氢化铝锂还原后获得)提取离子流色谱图如图7所示。通过和诺卡醇标准品进行色谱图保留时间比对可以看出，对照菌株CK不能合成获得诺卡醇，菌株JDXNL1，JDXNL2和JDXNL3可以合成诺卡醇。此结果表明了在细胞色素P450氧化还原酶AoCPR和细胞色素P450氧化酶CYP6、CYP9和AoKO的至少一种同时存在时，能够氧化瓦伦烯生成诺卡醇。
2.3醇脱氢酶功能鉴定
将JDXNT1、JDXNT2和JDXNT3菌株分别接种于Sc-Ura-Trp液体培养基，30℃，200rpm摇床培养过夜；次日按照初始OD600＝0.1转接至50毫升Sc-Ura-Trp液体培养基(含10g/L葡萄糖，10g/L半乳糖)中，30℃，200rpm摇床培养72小时，收集菌体，加入10mL正己烷萃取菌体。萃取液经GC-MS检测产物，检测条件与2.2相同。
JDXNT1菌株(图中标记为CYP6)、JDXNT2菌株(图中标记为CYP9)和JDXNT3菌株(图中标记为AoKo)摇瓶发酵产物，以及诺卡酮标准品(Nootkatone，源叶B20925)提取离子流色谱图如图8所示，通过和诺卡酮标准品进行色谱图保留时间比对，可以确定菌株JDXNT1，JDXNT2和JDXNT3可以合成诺卡酮。此结果表明了AoADH编码的醇脱氢酶能够将诺卡醇进一步氧化生成终产物诺卡酮。
实施例3发酵罐发酵合成诺卡酮
参照文献(SIEMON T,WANG Z,BIAN G,et al.2020.Semisynthesis of Plant-Derived Englerin A Enabled by Microbe Engineering of Guaia-6,10(14)-diene asBuilding Block.Journal of the American Chemical Society[J],142:2760-2765.)中所记载的发酵罐培养基和发酵方法，对所构建的菌株JDXNT1、JDXNT2、JDXNT3进行分批补料发酵，在发酵过程中添加覆盖剂以实现原位萃取，覆盖剂为肉豆蔻酸异丙酯。发酵过程控制溶氧在20％以上，pH为5，葡萄糖浓度为1-2g/L，乙醇浓度为5g/L以下。最终在7L发酵罐上，菌株JDXNT1中瓦伦烯、诺卡醇、诺卡酮的产量分别达到了500mg/L、30mg/L、1.2g/L；菌株JDXNT2中瓦伦烯、诺卡醇、诺卡酮的产量分别达到了350mg/L、25mg/L、1.5g/L；菌株JDXNT3中瓦伦烯、诺卡醇、诺卡酮的产量分别达到了500mg/L、60mg/L、1.9g/L。
序列表
<110> 武汉合生科技有限公司
<120> 一种生物合成诺卡酮的方法及载体
<130> MTI220210
<160> 53
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 550
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical protein
<400> 1
Met Glu Lys Gln Ser Val Thr Leu Val Arg Asp Asp Gln Gly Ile Val
1 5 10 15
Arg Lys Ser Thr Lys Tyr His Pro Ser Val Trp Gly Asp Tyr Phe Ile
20 25 30
Arg Asn Ser Pro Leu Asn Leu Ser Glu Glu Ser Thr Gln Arg Met Ile
35 40 45
Glu Arg Val Glu Glu Leu Lys Val Gln Val Lys Ser Met Phe Lys Gly
50 55 60
Thr Ser Asp Val Leu Gln Ile Met Asn Leu Ile Asp Ser Ile Gln Leu
65 70 75 80
Leu Arg Leu Glu Tyr His Phe Glu Asn Glu Ile Asp Gly Ala Leu Arg
85 90 95
Leu Ile Tyr Glu Val Asp Asp Lys Asn Tyr Gly Leu Tyr Glu Thr Ser
100 105 110
Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Asn Val Ser Ala Asp
115 120 125
Thr Phe Asn Lys Phe Lys Asp Glu Asn Gly Ser Phe Ile Ser Ile Leu
130 135 140
Asn Gly Asp Ala Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Asn Ala Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Ala Thr His Gly Glu Thr Ile Leu Asp Glu Ala Asn Asn Tyr Thr Lys
165 170 175
Ser Gln Leu Val Ser Leu Leu Ser Glu Leu Glu Gln Pro Leu Ala Thr
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Gln Val Ser Leu Phe Leu Glu Ala Pro Leu Cys Arg Arg Met Lys Ser
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Ile Leu Ala Arg Lys Tyr Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Glu Ala Met Arg
210 215 220
Ser Asp Asp Ile Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Leu Leu Gln
225 230 235 240
Ser Leu His Gln Glu Glu Leu Lys Lys Ala Ser Ile Trp Trp Asn Asp
245 250 255
Leu Ala Leu Ala Lys Ser Leu Ser Phe Thr Arg Asp Arg Ile Val Glu
260 265 270
Gly Tyr Tyr Trp Ile Leu Ser Met Cys Tyr Glu Pro Gln Tyr Ser Arg
275 280 285
Ala Arg Val Met Cys Ala Lys Ala Phe Cys Leu Leu Ser Ile Met Asp
290 295 300
Asp Ile Tyr Asp Asn Tyr Ser Ile Leu Glu Glu Arg Arg Leu Leu Thr
305 310 315 320
Glu Ala Ile Lys Arg Trp Asn His Glu Ala Val Asp Ser Leu Pro Glu
325 330 335
Tyr Ile Lys Asp Phe Tyr Leu Lys Leu Leu Lys Ala Phe Glu Glu Phe
340 345 350
Glu Ala Glu Leu Glu Phe Asn Glu Lys Tyr Arg Val Gln Tyr Leu Gln
355 360 365
Asn Glu Phe Lys Ala Ile Ala Ile Ser Tyr Phe Glu Glu Ser Lys Trp
370 375 380
Cys Val Glu Arg Tyr Val Pro Ser Leu Asp Glu His Leu Arg Val Ser
385 390 395 400
Met Ile Thr Ser Gly Cys Ser Met Val Val Cys Ser Met Tyr Leu Gly
405 410 415
Met Gly Glu Val Ala Thr Lys Glu Ile Phe Asp Trp Cys Ser Ser Phe
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Pro Lys Ala Met Glu Ala Ser Gly Val Ile Ala Arg Leu Leu Asn Asp
435 440 445
Ile Arg Ser His Glu Thr Glu Gln Gly Arg Asp His Ala Ala Ser Thr
450 455 460
Val Glu Ser Tyr Met Lys Glu His Gly Val Asp Val Lys Val Ala Arg
465 470 475 480
Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Glu Lys Ala Trp Lys Asp Leu Asn Lys
485 490 495
Glu Leu Leu Asn Pro Thr Pro Val Ala Arg Pro Ile Ile Glu Arg Ile
500 505 510
Leu Asn Leu Thr Met Ser Met Glu Asp Ile Tyr Arg Tyr Ile Asp Glu
515 520 525
Tyr Thr Ser Pro Asp Asn Lys Thr Asn Gly Asp Val Ser Leu Val Leu
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Val Glu Ser Ile Pro Ile
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<210> 2
<211> 515
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical protein
<400> 2
Met Ala Glu Val Gln Leu Thr Pro Leu Leu Leu Ile Phe Leu Leu Leu
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Phe Leu Phe Leu Phe Leu Phe Leu Ile Gly Thr Glu Arg Lys Leu Phe
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Ser Asn Ser Arg Gly Ala Arg Leu Pro Pro Gly Pro Ser Lys Leu Pro
35 40 45
Val Ile Gly Asn Leu His Gln Leu Cys Gly Gly Leu Pro His Arg Val
50 55 60
Leu Arg Asp Leu Ala Gly Ile His Gly Pro Leu Met Leu Leu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Gln Val Asp Leu Ala Val Val Ser Ser Arg Asn Ala Val Leu Gln
85 90 95
Val Thr Lys Ile His Asp Leu Asn Phe Ala His Arg Pro Gln Leu Leu
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Phe Thr Ala Lys Arg Ile Lys Ser Phe Ser Ala Ile Arg Ala Glu Glu
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Val Ala Lys Leu Leu Arg Asp Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
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Tyr Gly Ile Arg Glu Thr Leu Ile Asn Asn Val Val Lys Phe Leu Tyr
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Ser Asp Leu Ser Asp Asn Pro Asn Asp Ala Val Asn Leu Arg Lys Ser
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Glu Pro Glu Ser Ile Tyr Val Glu Glu Leu Gly Arg Glu Leu Ser Lys
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Glu Glu Ile Phe Asn Val Leu Val Val Asp Pro Met Met Gly Ala Ile
210 215 220
Glu Val Asp Trp Arg Asp Phe Phe Pro Tyr Leu Arg Trp Val Pro Asn
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Arg Ser Phe Glu Asn Lys Leu Lys Arg Met Leu Met Arg Arg Ala Ala
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Val Met Gln Val Leu Ile Thr Lys Arg Lys Asn Ser Lys Gln Ser Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical protein
<400> 5
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Val Val Ala Ser Leu Ser Gly Gly Asp Gly Leu Asp Leu Gly Ala Gly
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<223> synthetical nucleic acid
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetical nucleic acid
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<220>
<223> synthetical nucleic acid
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ggccccgaca ccgcctccta cgtccactgc gacgtcacca aggagcccga cgtggcaagc 240
gccgtcgacg ccgccgtcgc ccgacacggg aagctcgacg tcatgttcag caacgccgga 300
gtcggggaag tgttgcagaa gtcgttgccc gactgcgagg tggctgactt ccagcgattg 360
atgtcggtga acgtgacggg ggtgttcctg gccaccaagc acgcggcgcg ggtgatgacg 420
ccggcgaggc gggggagcat cgtgatcacg gggagcacca cgtcgactat tgggggacta 480
gggccgcacg catacacgtg ctcaaagcac gcggtggtgg ggctaatgag gagcgcggcg 540
gtcgagctgg gcaggcacgg tgttcgggtc aactgcgtgt cgccgcacgg gatggcaacg 600
ccgatgacga tggcagcgtt tgacttagac aaggaggggg ttgaggccat gtttgagagg 660
tcggccaacc tgaaaggtgt gaggctcgaa gcggaggacg tggcggaggc agtggcgtac 720
ctcgccggcg acgagtccag gtatgtgagc ggcgtcaatc tgctggtgga cggaggcttc 780
accattgcca agggattggc gtag 804
<210> 13
<211> 1653
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 13
atggaaaagc aatctgttac attggttaga gatgatcaag gtattgttag aaaatctaca 60
aagtaccatc catctgtttg gggtgattat tttattagaa actctccatt gaacctgtct 120
gaagaatcta ctcaaagaat gattgaaaga gttgaagaat tgaaggttca agttaaatct 180
atgttcaagg gtacatctga tgttttgcaa attatgaatc tgatcgattc tatccaattg 240
ttaagattag agtaccattt cgaaaacgaa attgatggtg ctttaagatt aatctacgaa 300
gttgatgata agaactacgg tttgtatgaa acatctttaa gattcagact gttgagacaa 360
catggttata atgtttctgc tgatactttt aacaagttca aagatgaaaa cggttctttt 420
atctctatct taaacggtga tgctaaaggt ttgttatctt tatataacgc ttcctatctg 480
gctacacatg gtgaaacaat tttagatgaa gctaataact acaccaagtc tcaattagtt 540
tctttgttgt ctgaattgga acaaccatta gctactcaag tttctttatt tttggaggct 600
ccattatgta gaagaatgaa atctattctg gctagaaaat acatcccaat ttatgaaaag 660
gaggctatga gatctgatga tattttggaa ttggctaaat tggatttcaa cttattgcaa 720
tctctgcatc aagaagaatt aaaaaaggct tctatctggt ggaatgattt ggctttagct 780
aaatctttgt cttttacaag agacagaatc gttgaaggtt attattggat tttgtctatg 840
tgttacgagc cacaatattc tagagctaga gttatgtgtg ctaaagcttt ttgtttattg 900
tctatcatgg acgatatcta tgataattac tctatcttgg aggaaagaag attgttaaca 960
gaagctatta agagatggaa tcatgaagct gttgattctt tgccagaata tattaaagac 1020
ttctacttga agctgttgaa agcttttgaa gaatttgaag ctgaattgga attcaatgaa 1080
aagtatagag tccaatactt gcaaaatgaa ttcaaagcta tcgctatttc ttactttgaa 1140
gaatctaagt ggtgtgttga aagatatgtt ccatctttgg atgaacattt gagagtttct 1200
atgattactt ctggttgttc tatggttgtt tgttctatgt atttgggtat gggtgaagtt 1260
gctacaaaag aaatttttga ttggtgttct tccttcccaa aagctatgga agcttctggt 1320
gttattgcta gattattaaa tgacatcagg tcacatgaaa cagaacaagg tagagatcat 1380
gctgcttcta cagttgaatc ttatatgaaa gaacacggtg ttgatgttaa agttgctaga 1440
aaaaaactgc aagaaatcgt tgaaaaggct tggaaagatt tgaataaaga attgttgaac 1500
cccacaccag ttgctagacc aattattgaa agaattttga acctgactat gtctatggaa 1560
gatatttata gatacatcga cgaatacaca tctccagata ataaaacaaa cggtgatgtt 1620
tctttggttt tggttgaatc tatcccaatt taa 1653
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 14
actaaaggga acaaaagctg gagctctagt agtttaaaca taacgagaac acacagggg 59
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
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cattaaagta acttaaggag ttaaatttaa gcaaggattt tcttaacttc ttc 53
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 16
gaagttaaga aaatccttgc ttaaatttaa ctccttaagt tactttaatg atttag 56
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 17
tcgaaggctt taatttgcgc gaaaagccaa ttagtgtgat a 41
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 18
tagtatcaca ctaattggct tttcgcgcaa attaaagcct tcgagc 46
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 19
gggacgcgcc ctgtagcggc tgaggtctca acaggcccct tttcctttg 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 20
catgatatcg acaaaggaaa aggggcctgt tgagacctca gccgctacag ggcgc 55
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 21
gaatttttga aaattcaata taaatgtgag accaccatga ttacgccaag cg 52
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetical nucleic acid
<400> 22
taatcatggt ggtctcacat ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttg 57
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 23
atctctctct cctaatttct ttttctgaag ccattatagt tttttctcct tgacgttaaa 60
gt 62
<210> 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 24
ttaacgtcaa ggagaaaaaa ctataatggc ttcagaaaaa gaaattagga 50
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
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atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct ttttaaaaaa aatccttgga ctagtcacg 59
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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actagtccaa ggattttttt taaaaagatt ctcttttttt atgatatttg tacataaac 59
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gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgtttaaac gacaacgacc aagctcaca 59
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gatgtgagct tggtcgttgt cgtttaaaca acagttgcgc agcctgaatg 50
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tcaacagtat agaaccgtgg atgatgtggt ttctacagga tctgacatta ttattgttg 59
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<223> synthetical nucleic acid
<400> 30
atagtcctct tccaacaata ataatgtcag atcctgtaga aaccacatca tccacggtt 59
<210> 31
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<220>
<223> synthetical nucleic acid
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agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg cgacccacgc tcaccggct 59
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tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc gcgcggtatc attgcagcac tggggccag 59
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cgatagcgcc cctgtgtgtt ctcgttatgt ttaaactact agagctccag cttttgttc 59
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gtccatccaa aaaaaaagta agaatttttg aaaattcaat ataaatggag aaacaatcag 60
taactct 67
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<220>
<223> synthetical nucleic acid
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atcgacaaag gaaaaggggc ctgttcatat aggaatagat tcaaccaa 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
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gtccatccaa aaaaaaagta agaatttttg aaaattcaat ataaatggaa aagcaatctg 60
ttacatt 67
<210> 37
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<223> synthetical nucleic acid
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atcgacaaag gaaaaggggc ctgtttaaat tgggatagat tcaaccaaa 49
<210> 38
<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> synthetical nucleic acid
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actttaacgt caaggagaaa aaactataat ggaaaagcaa tctgttacat tg 52
<210> 39
<211> 54
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<213> Artificial Sequence
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gatctatcga tttcaattca attcaattta aattgggata gattcaacca aaac 54
<210> 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 40
tttggttgaa tctatcccaa tttaaattga attgaattga aatcgataga tc 52
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 41
aatgtaacag attgcttttc cattatagtt ttttctcctt gacgttaaag t 51
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 42
gagaaaaaac cccggatcca tggcggaggt ccaactcac 39
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 43
ggtaccaagc ttactcgagc taagcagcgg gcggcagggg 40
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
<400> 44
aattgttaat taagagctct caccatacat cccttgaata tc 42
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atttttgaaa attcgaattc atgcagacgg attccgggaa 40
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<223> synthetical nucleic acid
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gaattcgaat tttcaaaaat tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetical nucleic acid
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ggatccgggg ttttttctcc 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetical nucleic acid
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gagaaaaaac cccggatcca tggaagcttt taccttgaag ctt 43
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<223> synthetical nucleic acid
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gagaaaaaac cccggatcca tgatttccac ggccttc 37
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<223> synthetical nucleic acid
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ggtaccaagc ttactcgagt caaaggcatg catcgttgg 39
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cgggatccat ggcaagctcc tttgttct 28
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetical nucleic acid
<400> 53
cgctcgagct acgccaatcc cttggcaa 28

Claims (16)

1.一种生物合成诺卡酮的方法，其包括采用能够表达瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶的重组菌合成诺卡酮；其中，所述瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶来自益智；
所述瓦伦烯合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化酶选自细胞色素P450氧化酶CYP6、细胞色素P450氧化酶CYP9和细胞色素P450氧化酶AoKo的至少一种；其中，细胞色素P450氧化酶CYP6的氨基酸序列为SEQID NO. 2所示的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶CYP9的氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶AoKo的氨基酸序列为SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；
所述醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组菌能够合成法尼基焦磷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组菌能够表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的至少一种。
4.一种用于诺卡酮合成的酶组合物，其包括：瓦伦烯合成酶、细胞色素P450氧化酶、细胞色素P450氧化还原酶和醇脱氢酶；
所述瓦伦烯合成酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化酶选自细胞色素P450氧化酶CYP6、细胞色素P450氧化酶CYP9和细胞色素P450氧化酶AoKo的至少一种；其中，细胞色素P450氧化酶CYP6的氨基酸序列为SEQID NO. 2所示的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶CYP9的氨基酸序列为SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；细胞色素P450氧化酶AoKo的氨基酸序列为SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列；
所述细胞色素P450氧化还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；
所述醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
5.一种编码权利要求4中所述的酶组合物的多核苷酸分子。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸分子，其包含：
（1）SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列、
（2）选自SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列、SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列中的一种、
（3）SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列、以及
（4）SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
7.一种核酸构建体，其包含权利要求5或6所述的多核苷酸分子。
8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其还包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的核苷酸序列的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的核酸构建体，其为质粒载体；所述质粒载体为真核表达载体。
10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中，所述质粒载体为pDXYZ3、pDXVS1、pDXVS2、pDXNL1、pDXNL2、pDXNL3、pDXNT1的至少一种。
11.一种重组菌，其包含根据权利要求5或6所述的多核苷酸分子，或权利要求7-9中任一项所述的核酸构建体；所述重组菌通过将所述多核苷酸分子或所述核酸构建体导入宿主细胞中获得；所述宿主细胞为真核细胞。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其中，所述宿主细胞为酿酒酵母。
13.根据权利要求11或12所述的重组菌，其中，所述多核苷酸分子整合入所述宿主细胞的基因组中。
14.根据权利要求13所述的重组菌，其中，所述多核苷酸分子在所述重组菌的基因组中的拷贝数至少1个。
15.根据权利要求11或12所述的重组菌，其能够表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊二烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合酶的至少一种。
16.采用权利要求4所述的酶、权利要求5或6所述的多核苷酸分子、权利要求7-9中任一项所述的核酸构建体或权利要求11-15中任一项所述的重组菌生产瓦伦烯、诺卡醇和/或诺卡酮的用途。
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Optimization of a cytochrome P450 oxidation system for enhancing protopanaxadiol production in Saccharomyces cerevisiae;Fanglong Zhao et al.;Biotechnology and Bioengineering;第113卷(第8期);1787-1795 *
Valencene oxidase CYP706M1 from Alaska cedar (Callitropsis nootkatensis);Katarina Cankar et al.;FEBS Letters;第588卷(第6期);1001-1007 *

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