CN105853859A - 益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用，属于医药领域。本发明通过对益智仁提取物的萃取；益智仁醇提物各部位的配制，得到益智仁醇提各部位药液。本发明所述益智仁提取物对炎症性肠病有一定的疗效，且治疗效果与柳氮磺吡啶相似。

Description

益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。
背景技术
益智仁为姜科植物益智的干燥成熟果实，主产于海南和广东，喜温暖、湿润气候，生长于林下阴湿处。自古以来，益智仁就是中医临床上的常用药材，在我国许多药材古典专著上均有记载，海南岛热带药用植物生长的环境极为优越，与岛外相比，益智药材质量明显优越。
Kuho M等报道益智仁50％乙醇提取液有抗溃疡作用(冯淑香，刘耀明，董俊兴.中药益智仁化学成分与药理研究进展[J].现代中药研究与实践，2003，17(5):58-60)。Yamahara J等报道益智仁果实的丙酮提取物(口服给药量50mg/kg)能明显抑制盐酸/乙醇引起的大鼠胃损伤,抑制率57％,经柱层析分得活性成分诺卡酮(nootkatone),口服给药剂量50mg/kg即能显著抑制胃损伤(Yamahara J,Li YH,Tamai Y.Anti-ulcer effect in rats of bitter cardamom constituents[J].Chem Pharm Bull,1990,38(11):3053)。Sakai K等报道益智仁提取物能影响鼠小肠中胺咪(sulfaguanidine)的吸收，有止泻作用(冯淑香，刘耀明，董俊兴.中药益智仁化学成分与药理研究进展[J].现代中药研究与实践，2003，17(5):58-60)。
但是对于其单独应用于炎症性肠病是否有功效及其机制未见报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。所述技术方案如下：
一方面，提供了一种益智仁提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)益智仁提取物的萃取；
(2)益智仁醇提物各部位的配制，得到益智仁醇提各部位药液。
优选地，所述步骤(1)益智仁提取物的萃取具体为：
取益智仁，粉碎，过10目筛，置圆底烧瓶中，加乙醇回流提取两次，每次0.5-1.5h，纱布滤过，合并两次滤液，45-75℃以下减压回收溶剂，得到益智仁醇提物浸膏；从提取好的浸膏中称取醇提物浸膏于烧杯中，再往烧杯中加水，用玻璃棒搅拌成乳浊液，再将乳浊液通过漏斗加入分液漏斗中，依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯进行萃取，重复此操作直至醇提物浸膏全部被萃取；分别回收溶剂，减压干燥，得到石油醚浸膏、三氯甲烷浸膏、正丁醇浸膏、乙酸乙酯浸膏。
优选地，所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:3-1:10。
优选地，所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:6。
优选地，所述乙醇浓度为70％。
优选地，所述乙醇回流提取每次1h。
优选地，所述减压回收溶剂时温度为60℃。
优选地，所述醇提物浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:10。
优选地，所述步骤(2)益智仁醇提物各部位的配制具体为：
取乙酸乙酯浸膏，加入研钵当中，往研钵中慢慢滴加吐温-80，直至浸膏乳化，再加水，继续研磨至乳浊液状态，得到乙酸乙酯药液；正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液的配制与乙酸乙酯药液方法相同。
优选地，其特征在于，所述步骤(2)乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:1-1:3。
优选地，其特征在于，所述步骤(2)乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:2。
优选地，其特征在于，所述步骤(2)吐温-80最多加入不超过5ml。
优选地，所述步骤(2)乙酸乙酯药液、正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液为6.6-20g/ml。
优选地，所述步骤(2)乙酸乙酯药液、正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液质量浓度为10g/ml。
另一方面，提供了一种所述的提取方法提取得到的益智仁提取物。
本发明还提供了一种所述的提取方法提取得到的益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。
有益效果：实验证明本发明所述益智仁提取物对炎症性肠病有一定的疗效，且治疗效果与柳氮磺吡啶相似。
附图说明
图1是本发明实施例提供的益智仁提取物对炎症小鼠结肠组织病理变化的影响图，其中①为(l)乙酸乙酯组；(2)正丁醇组；(3)三氯甲烷组；(4)石油醚组；(5)阳性药物组；(6)模型组；(7)空白对照组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的阐明，以便更好的理解本发明。
实施例1
(1)益智仁提取物的萃取
取益智仁1.5kg，粉碎，过10目筛，置10L圆底烧瓶中，加70％乙醇9L回流提取两次，每次1h，其中所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:6，纱布滤过，合并两次滤液，60℃以下减压回收溶剂，得到益智仁醇提物浸膏108g。从提取好的浸膏中称取20g醇提物浸膏于500ml烧杯中，再往烧杯中加水200ml，其中所述醇提物浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:10，用玻璃棒搅拌成乳浊液，再将乳浊液通过漏斗加入1L分液漏斗中，依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯进行萃取，重复此操作直至108g浸膏全部被萃取。分别回收溶剂，减压干燥，得到石油醚浸膏21.8g，三氯甲烷浸膏21.7g，正丁醇浸膏22.0g，乙酸乙酯浸膏21.6g。
(2)益智仁醇提物各部位的配制
取乙酸乙酯萃取液浸膏16.2g，加入研钵当中，往研钵中慢慢滴加吐温-80(吐温-80最多加入不超过5ml)，直至浸膏乳化，再加入32.4ml的水，其中乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:2，继续研磨至乳浊液状态，得到32.4ml(浓度为10g/ml)的乙酸乙酯药液(益智仁该部位提取物)。正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液的配制与乙酸乙酯药液方法相同。
实施例2
(1)益智仁提取物的萃取
取益智仁1.5kg，粉碎，过10目筛，置10L圆底烧瓶中，加70％乙醇4.5L回流提取两次，每次1.5h，其中所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:3，纱布滤过，合并两次滤液，45℃以下减压回收溶剂，得到益智仁醇提物浸膏100g。从提取好的浸膏中称取20g醇提物浸膏于500ml烧杯中，再往烧杯中加水200ml，其中所述醇提物浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:10，用玻璃棒搅拌成乳浊液，再将乳浊液通过漏斗加入1L分液漏斗中，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，重复此操作直至100g浸膏全部被萃取。分别回收溶剂，减压干燥，得到石油醚浸膏19.2g、三氯甲烷浸膏18.9g、乙酸乙酯浸膏20.1g、正丁醇浸膏20.4g。
(2)益智仁醇提物各部位的配制
取乙酸乙酯萃取液浸膏20.1g，加入研钵当中，往研钵中慢慢滴加吐温-80(吐温-80最多加入不超过5ml)，直至浸膏乳化，再加入20.1ml的水，其中乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:1，继续研磨至乳浊液状态，得到20.1ml(浓度为20g/ml)的乙酸乙酯药液(益智仁该部位提取物)。正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液的配制与乙酸乙酯药液方法相同。
实施例3
(1)益智仁提取物的萃取
取益智仁1.5kg，粉碎，过10目筛，置10L圆底烧瓶中，加70％乙醇15L回流提取两次，每次0.5h，其中所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:10，纱布滤过，合并两次滤液，75℃以下减压回收溶剂，得到益智仁 醇提物浸膏106g。从提取好的浸膏中称取20g醇提物浸膏于500ml烧杯中，再往烧杯中加水200ml，其中所述醇提物浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:10，用玻璃棒搅拌成乳浊液，再将乳浊液通过漏斗加入1L分液漏斗中，依次用石油醚、三氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯进行萃取，重复此操作直至106g浸膏全部被萃取。分别回收溶剂，减压干燥，得到石油醚浸膏20.9g、三氯甲烷浸膏21.1g、乙酸乙酯浸膏21.2g、正丁醇浸膏21.6g。
(2)益智仁醇提物各部位的配制
取乙酸乙酯萃取液浸膏10.8g，加入研钵当中，往研钵中慢慢滴加吐温-80(吐温-80最多加入不超过5ml)，直至浸膏乳化，再加入32.4ml的水，其中乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:3，继续研磨至乳浊液状态，得到32.4ml(浓度为6.6g/ml)的乙酸乙酯药液(益智仁该部位提取物)。正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液的配制与乙酸乙酯药液方法相同。
试验例
1、材料
实验动物
健康昆明种小鼠，SPF级，雄性，体重15-22g，长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2009-0012。适应性饲养一周后，无不良反应即进入实验。
实验药品
益智仁(购于海南省海口市国瑞堂医药公司，批号20140520)，经海 南医学院王勇研究员鉴定为Alpinia Oxyphylla Miq.的真品。
柳氮磺吡啶肠溶片(SASP,上海中西三维有限公司，批号H31020450)。
实验试剂
正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140325)，三氯甲烷(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140322)，乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140321)，石油醚(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140327)，乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20140328)，2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS,成都西亚试剂，批号1028235)，大便隐血检测试剂盒(上海凯创生物技术有限公司，批号S20040021)。
小鼠实验性炎症性肠病模型的建立:
取小鼠80只，禁食24h，自由饮水，轻度乙醚麻醉，用直径2mm的橡胶软管插入肛门约4cm，注入100uL含1.0mg 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的50％乙醇溶液，24h后，予以0.5mgTNBs的50％乙醇溶液100ul，单次操作的整个过程在30秒内完成，导管保留在肠道几秒钟，轻轻取出，倒立30秒，使药液达全结肠，然后动物放回笼内饲养。
2、试验分组及给药
取小鼠70只，成模者随机分为6组，(l)乙酸乙酯组；(2)正丁醇组；(3)三氯甲烷组；(4)石油醚组；(5)阳性药物组；(6)模型组，以及(7)另选10只健康雄性小鼠作为空白对照组，即每组10只。造模后24h，乙酸乙酯组给予乙酸乙酯药液(10g/ml)灌胃；正丁醇组给予正丁醇药液(10g/kg)灌胃；三氯甲烷组给予三氯甲烷药液(10g/kg)灌胃；石油醚组给予石油醚药液(10g/kg)灌胃；阳性药物组给予柳氮磺胺吡(SASP)520mg/kg灌胃。给药体积均为0.2ml/10g体重，1次/d。正常对照组动物和模型组均予以等体积 生理盐水灌胃，1次/d，连续9天。
3、观察指标及测定分析方法
每日观察各组小鼠的大便出血、大便性状、体重变化等，并依据临床检验基础相关规定，对大便潜血情况(联苯胺法)，严格观察并做记录，进行疾病活动指数(Diseaseactivityindex，DAI)评分，见表1。给药9天后(即造模10天后)处死动物，进行指标测定。取部分结肠组织，常规伊红染色法(简称HE染色法)，镜下观察结肠黏膜损伤，进行结肠组织学损伤评分，指标包括溃疡炎症肉芽肿、纤维化及病变深度，见表2。同时取结肠组织一小段，加入冰生理盐水，在组织匀浆器中配成10％的结肠组织匀浆，按照MPO检测试剂盒说明书测定MPO酶的活性。余下的大鼠结肠组织液氮-70℃保存备用。
所得数据用表示，均用SPSS 17.0软件进行统计。两两比较采用t检验和单因素方差分析；方差不齐时采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
表1 DAI积分评分表
表2 病理组织学评分标准
4、试验结果
4.1小鼠存活情况
70只小鼠共死亡18只：麻醉意外3只，脱水致循环衰竭5只、喂养过程中灌胃死亡8只。最后存活小鼠数量为：模型组6只，益智仁提取物各部位治疗组分别为8，8，7,6只，SASP组8只，正常对照组9只。为后续实验方便 比较，则择优选取各组小鼠均为6只(X)。
4.2小鼠体重变化情况
在体重变化方面，与空白组比较，其余各组小鼠体重显著降低(P<0.01)。随着时间延长，与模型组相比，各药物组体重有明显回升(P<0.01)，见表3。
表3各组小鼠体重下降百分率比较(％)
注：与空白对照组相比，各组体重显著降低，*P<0.01；与模型组比较，各组体重明显回升，#P<0.05。
4.3小鼠疾病活动指数评分(DAI)
大便出血情况方面，乙酸乙酯组、正丁醇组、三氯甲烷组、石油醚组 在造模3天后出现大便显血，4-7天显血转为隐血，第9天时已经观察不到出血状况。阳性组在造模3天后出现大便显血，3-6天转为隐血，第七天开始就观察不到出血。DAI评分为分数越高，患病越严重，治疗效果越差，从结果可以看出，模型组的评分最高，阳性组在治疗之后评分与空白组一致，说明阳性组炎症性肠炎基本完全治愈，而乙酸乙酯组、正丁醇组、三氯甲烷组、石油醚组评分低于模型组，高于空白组，说明益智仁醇提萃取部位对炎症性肠炎有疗效，其中乙酸乙酯组和正丁醇组疗效最好，三氯甲烷组和石油醚组次之，益智仁水提组最差。按表1评分，结果见表4。
表4各组小鼠DAI评分
注：a:与空白对照组比较，P<0.05。b：与模型组比较，P<0.05。
4.4小鼠结肠组织损伤评分情况
结肠标本HE染色显示：正常组小鼠结肠病理切片下结肠结构清晰，上皮完整，固有层分布少量淋巴细胞，无炎细胞浸润。模型组结肠结构破坏，粘膜及粘膜下层高度充血、水肿，毛细血管增生，大量炎性细胞浸润。益智仁提取物组及阳性药物组治疗后各小鼠结肠粘膜情况好转，轻度充血水肿，少量炎性细胞浸润，未见明显糜烂及溃疡灶。小鼠结肠组织评分见表5，病理情况见附图1。
表5各组小鼠结肠组织评分情况
注：n：与空白对照组比较，P<0.05。m：与模型组比较，P<0.05。
5、结论
益智仁乙酸乙酯组、正丁醇组、三氯甲烷组、石油醚组中，小鼠的体重都有一定程度的回升；对于大便性状方面，乙酸乙酯组、正丁醇组、三 氯甲烷组、石油醚组全部变为干燥状态，出血情况都由患病时的显性出血转变为不出血；DAI评分显著降低，并且降低MPO活性，减少中性粒细胞浸润，从而改善或减轻结肠炎症，说明益智仁的醇提萃取部位对炎症性肠炎有疗效。相比较而言，益智仁醇提萃取部位乙酸乙酯组和正丁醇组疗效最好，三氯甲烷组和石油醚组次之，其作用机制有待进一步研究。
以上所述仅是本发明较佳的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，本发明不仅限于此，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种益智仁提取物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)益智仁提取物的萃取；
(2)益智仁醇提物各部位的配制，得到益智仁醇提各部位药液。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)益智仁提取物的萃取具体为：
取益智仁，粉碎，过10目筛，置圆底烧瓶中，加乙醇回流提取两次，每次0.5-1.5h，纱布滤过，合并两次滤液，45-75℃以下减压回收溶剂，得到益智仁醇提物浸膏；从提取好的浸膏中称取醇提物浸膏于烧杯中，再往烧杯中加水，用玻璃棒搅拌成乳浊液，再将乳浊液通过漏斗加入分液漏斗中，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，重复此操作直至醇提物浸膏全部被萃取；分别回收溶剂，减压干燥，得到石油醚浸膏、三氯甲烷浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:3-1:10。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述益智仁与乙醇的质量体积比为(g/ml)为1:6。
5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇浓度为70％。
6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述乙醇回流提取每次1h。
7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述减压回收溶剂时温度为60℃。
8.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述醇提物浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:10。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)益智仁醇提物各部位的配制具体为：
取乙酸乙酯浸膏，加入研钵当中，往研钵中慢慢滴加吐温-80，直至浸膏乳化，再加水，继续研磨至乳浊液状态，得到乙酸乙酯药液；正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液的配制与乙酸乙酯药液方法相同。
10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:1-1:3。
11.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸乙酯浸膏与水的质量体积比为(g/ml)为1:2。
12.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述吐温-80最多加入不超过5ml。
13.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸乙酯药液、正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液为6.6-20g/ml。
14.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸乙酯药液、正丁醇药液、三氯甲烷药液、石油醚药液质量浓度为10g/ml。
15.一种如权利要求1所述的提取方法提取得到的益智仁提取物。
16.一种如权利要求1所述的提取方法提取得到的益智仁提取物在制备治疗炎症性肠病的药物的应用。
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