CN117568323A - 白木香倍半萜类合酶及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了白木香倍半萜类合酶及其编码基因和应用。所述白木香倍半萜类合酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码基因的CDS的多核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明将白木香倍半萜类合酶基因通过原核或真核表达后得到的重组倍半萜类合酶具有多种催化活性，将其作为催化酶在以法尼基焦磷酸为底物进行酶促反应，可高产量地生物合成获得杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯和摩勒烯等倍半萜类化合物，本发明在倍半萜类化合物的生物合成或者培育高表达倍半萜类合酶的植物品种等方面具有应用前景。

Description

白木香倍半萜类合酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及植物来源的萜类合酶，尤其涉及一种白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)来源的倍半萜类合酶及其编码基因，还涉及其在催化杜松烯、大根香叶烯、摩勒烯、荜澄茄油烯等化合物合成中的应用，属于倍半萜类合酶及其应用领域。
背景技术
沉香为热带常绿乔木沉香属植物含树脂的木材，为名贵中药和香料，宗教用途极广。沉香的应用有着悠久的历史，广泛传播于中国、日本、印度、东南亚、中东和许多其他国家。
白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg是中国药典所列沉香的唯一基原植物，也是中国特有的珍贵药用植物，分布在中国广东、广西、海南、福建等地。然而，由于沉香的高价值和高需求，其资源日益枯竭。在《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录II中，所有沉香物种都被列为濒危物种。因此，研究沉香木的形成机理，改进结香工艺，缓解沉香木资源的现状已迫在眉睫。
现代研究表明，沉香的有效成分为倍半萜类化合物和2-(2-苯乙基)色酮，含量达到90％以上。它们是白木香防御反应过程中次级代谢网络发生变化后产生的具有抑菌活性的防御性物质。白木香树受到物理、化学伤害或真菌侵染的刺激时，由这些防御物质和细胞的其他成分形成的主动防御结构-侵填体和树胶，阻碍伤害扩展，最终形成沉香。截至2021年3月，国内外学者已从沉香中分离并鉴定出210个倍半萜类化合物。倍半萜类化合物是分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，含有三个异戊二烯单元。大多倍半萜类化合物具有挥发性芳香气味，被广泛应用于高级香料中。现代药理研究表明，倍半萜类化合物大多具有抑菌、镇静等作用。
杜松烯是一种常见的倍半萜烯，具有木香气。现代药理研究表明，杜松烯具有抗菌、抗氧化、消炎，抑制黑色素生成和保湿作用，这些作用使得杜松烯在医药和美容领域具有广泛的应用价值；大根香叶烯存在于各种精油中，是薄荷、加拿大一枝黄花、生姜、香蜂草等挥发油的成分，具有抗菌抗氧化、驱虫作用以及信息传递特性；摩勒烯是一种具有挥发性的倍半萜类化合物，具有木香气，广泛存在于茶树精油、香茅草精油等各种精油和挥发性风味物质中；荜澄茄油烯存在于多种花、草、柄叶、果实的精油中，如艾叶油、牡蒿油、荜澄茄油、辛夷油、杉木油、大血藤油、鼠尾草油、罗勒油、苦橙叶油、高良姜油、白兰花油、肉桂油、茶树油等。
倍半萜类化合物在植物体内通过位于细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径和位于质体中的甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)两种途径合成，经过一系列酶促反应，生成共同的底物法尼基焦磷酸(FPP)。在萜类合酶(TPSs)的催化下，通过异构化、离子化、重排等反应过程形成结构各异的倍半萜骨架。随后，在后修饰酶的作用下，骨架结构经过重排、羟基化、酰化或糖基化等形成各种萜类化合物。在倍半萜类生物合成过程中TPSs起着至关重要的作用，是关键酶基因。
随着生物酶催化合成技术的发展，人们已经实现利用大肠杆菌、酿酒酵母等宿主微生物体内高效合成诺卡酮、紫穗槐二烯等倍半萜类物质。相对于植物提取和化学合成，这种方法合成目标产物的效率更高，相应的，构建沉香生物合成体系有助于缓解资源短缺问题，但目前白木香中倍半萜生物合成关键酶功能研究有待深入，沉香形成分子机制尚未完全解析。
发明内容
本发明的目的之一是提供白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)来源的倍半萜类合酶及其编码基因；
本发明的目的之二是提供含有所述白木香来源的倍半萜类合酶编码基因的重组表达载体或重组宿主菌；
本发明的目的之三将所述的白木香来源的倍半萜类合酶应用于催化合成倍半萜类化合物。
为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：
本发明的一方面是提供白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)来源的倍半萜类合酶(TPS27)，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明另一方面是提供了白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因，其CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：
(a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；
或(c)与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性。
将本发明的SEQ ID No.2所示的基因与其他基因相嵌合或连接得到的嵌合基因或表达盒均属于本发明的保护范畴；含有所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体同样也属于本发明的保护范围之内。
本发明还公开了含有所述白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核表达载体。
本发明进一步公开了含有所述白木香来源的倍半萜类合酶的酶编码基因的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌或重组真核细胞；所述的重组真核细胞包括但不限于重组真菌、重组植物细胞或重组动物细胞，更优选的，所述的重组真核细胞是重组酵母细胞。
本发明的再一方面提供了一种制备重组倍半萜类合酶的方法，该方法包括：(1)将白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因可操作的与原核表达载体或真核表达载体连接构建得到重组原核表达载体或重组真核表达载体；将所构建的重组原核表达载体或重组真核表达载体转化原核细胞或真核细胞得到重组宿主菌；(2)诱导重组宿主菌表达重组倍半萜类合酶，收集所表达的重组倍半萜类合酶，纯化，即得。
通过采用本领域的常规技术手段，将白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因通过常规的原核表达或真核表达的方法获得重组倍半萜类合酶，采用该重组倍半萜类合酶就可通过体外转化或催化的方法，催化法尼基焦磷酸生物合成得到倍半萜类化合物。
本发明的再一方面提供了将所提供的白木香来源的倍半萜类合酶应用于催化合成倍半萜类化合物；其中，所述的倍半萜类化合物优选是杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯等倍半萜类化合物中的任何一种。作为本发明的一种优选的具体实施方案，包括：制备重组倍半萜类合酶；以倍半萜类合酶为催化酶，以法尼基焦磷酸(FPP)为底物进行酶促生物合成反应，生物合成包括杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯在内的倍半萜类化合物。
采用本发明制备的重组白木香萜类合酶在底物FPP存在下，能高产量地获得杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯，其各自占总产量的24.26％、18.94％、12.35％和11.35％。
另外，还可将本发明提供的的白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因应用于培育高表达倍半萜类合酶的转基因白木香品种的方法，包括：
(1)将白木香来源的倍半萜类合酶的编码基因可操作的与植物表达连接构建得到重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化白木香植物组织或细胞；(3)筛选得到倍半萜类合酶的表达水平提高的转基因白木香新品种。
在本发明中，可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等。
本发明提供了白木香来源的倍半萜类合酶及其编码基因，将所述编码基因通过原核或真核表达后得到的重组倍半萜类合酶具有多种催化活性，将其作为催化酶在以法尼基焦磷酸为底物进行酶促反应，可高产量地生物合成获得杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯等倍半萜类化合物，在倍半萜类化合物的生物合成或者培育高表达倍半萜类合酶的植物新品种等方面具有应用前景。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％ SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％ SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％ SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。
术语“转化”在此指的是用于将异源DNA引入到植物细胞、植物组织、或植物中的过程。转化植物细胞、植物组织、或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，也包括其子代。
术语“转化”、“转基因”、和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。
附图说明
图1为重组TPS27蛋白纯化结果；1-pET28a-BL21(DE3)蛋白；2-TPS27-pET28a-BL21(DE3)蛋白；3-过滤后上清；4-250mM咪唑洗脱液1；5-洗脱液2；6-洗脱液3。
图2为重组TPS27蛋白为催化酶的催化反应产物的GC-MS结果；A-空载体诱导蛋白催化产物；B-TPS27蛋白催化产物；1-13是不同的产物峰。
图3为重组TPS27蛋白为催化酶的催化反应产物的质谱图；A：峰1、4,a-荜澄茄油烯5.58％；B：峰2、8，a-古巴烯7.66％；C：峰3、5，β-荜澄茄油烯6.41％；D：峰6，γ-摩勒烯8.37％；E：峰7，大根香叶烯24.21％；F：峰9，γ-杜松烯16％；G：峰10，Δ-杜松烯15.01％；H：峰11，Cadine-1,4-diene 1.88％；I：峰12，a-杜松烯4.34％；J：峰13，Germacrene D-4-ol10.54％。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1白木香来源的倍半萜合酶(TPS27)的重组表达
(1)通过全基因合成的方式合成SEQ ID No.2所示的倍半萜合酶基因，将其连接到pET-28a载体，经测序及双酶切鉴定为正确的克隆提取质粒备用。
(2)鉴定为阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，同时将pET-28a空载质粒也转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞作为对照。
(3)挑菌活化后，进行转接大量摇菌，使其初始OD值低于0.1，并用紫外分光光度计测定OD值。37℃，200rpm摇菌2.5h，使其OD值升至0.5左右时加入0.5mM IPTG，然后20℃，200rpm,诱导16h后，12000rpm，离心15min，收集菌体。
(4)菌体经1×PBS缓冲液重悬，反复冻融4-5次充分裂解菌体，沸水煮10min使蛋白变性后，10％ SDS-PAGE电泳检测。发现诱导出了目的条带(图1)。
实施例2白木香来源的倍半萜合酶(TPS27)的纯化
按照确定的诱导条件进行蛋白大量表达。
(1)5000rpm离心20min，收集细胞，用于下一步的亲和纯化。
(2)用30mL结合缓冲液(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞，超声处理。4℃,5000r/min离心30min，上清用0.45μm过滤器过滤，沉淀置于冰上备用。(3)取1mL Ni-NTA His Bind树脂，用结合缓冲液平衡后加到过滤后的上清中，将过滤后的上清与1mL Ni2+树脂匀浆混匀，冰上结合1h。
(4)将上述混合物上柱子，让溶液流出。
(5)用洗涤缓冲液洗涤树脂，每次10mL，重复3次。
(6)用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，每次1mL，重复3次，收集洗脱液。(7)每管取少许样品进行SDS-PAGE，检测蛋白纯化情况。
优选的，在步骤(6)中设置三个不同洗脱浓度：100，180，250mmol/L。所述目的蛋白为纯化后的pET28a-TPS27-His-tag融合蛋白，经SDS-PAGE检测。
实验例1重组倍半萜合酶(TPS27)的体外酶促反应以及反应产物的检测和分析实验
1实验方法
仪器：气相色谱-质谱联用仪(7890B GC System-5977 MSD，美国安捷伦科技有限公司)，配备HP-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm内径；薄膜厚度，0.25m)；固相微萃取(SolidPhase Micro Extraction，SPME)纤维束(50/30umDVB/CAR/PDMS，美国色谱科公司)；
酶促反应体系：反应体系中包含25mM Tris-HCl(pH 7.0)，10％甘油，100mMMg2SO4，5mM DTT，46uM FPP(购自Sigma公司)，纯化蛋白(实施例2所纯化)50uL，ddH2O补足至200μL。以等量对照组破碎后的上清代替TPS27蛋白，其他组成不变，作为对照组。
将上述溶液混匀后，放入30℃金属浴恒温孵育1h，随后用经GC老化过的固相微萃取SPME纤维头萃取样品中的挥发性物质1h，萃取过程在65℃水浴锅内进行。
用SPME吸附蛋白催化产生的挥发性物质，以等量对照组破碎后的上清代替倍半萜合酶蛋白，其他组成不变，作为对照，对催化产物进行GC-MS检测。
反应程序：电离方式EI，电子能量70eV,载气为氦气，流速为1mL/min,进样口温度为250℃，起始温度为80℃，以5℃/min升至180℃，保存15min,再以20℃/min升至250℃，保持10min。扫描质量范围50-500amu。
2实验结果
实验结果见表1和图2-3。
表1酶促反应产物的气相色谱-质谱联用检测结果
根据表1和图2-3可见，以SEQ ID No.2所述的编码基因所表达的重组倍半萜合酶以FPP为底物的催化产物主要有四种，分别为杜松烯(Cadinene,24.26％)、大根香叶烯(Germacrene,18.94％)、荜澄茄油烯(Cubebene,12.35％)、摩勒烯(Muurolene,11.35％)。

Claims (10)

1.白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)来源的倍半萜类合酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的倍半萜类合酶的编码基因，其特征在于，其CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：
(a)SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.2的互补核苷酸序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；
或(c)与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有倍半萜类合酶的功能或活性。
3.含有权利要求2所述编码基因的嵌合基因或表达盒。
4.含有权利要求2所述编码基因或者含有权利要求3所述的嵌合基因或表达盒的重组表达载体。
5.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
6.一种制备重组倍半萜类合酶的方法，其特征在于，包括：(1)将权利要求2所述的编码基因可操作的与原核表达载体或真核表达载体连接构建得到重组原核表达载体或重组真核表达载体；将所构建的重组原核表达载体或重组真核表达载体转化原核细胞或真核细胞得到重组宿主细胞；(2)诱导重组宿主细胞表达重组倍半萜类合酶，收集所表达的重组倍半萜类合酶，纯化，即得。
7.权利要求1所述的倍半萜类合酶在作为催化酶生物合成倍半萜类化合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：制备重组倍半萜类合酶；以倍半萜类合酶为催化酶，以法尼基焦磷酸为底物进行酶促生物合成反应，生物合成包括杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯在内的倍半萜类化合物。
9.权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的嵌合基因或表达盒在生物合成倍半萜类化合物中的应用；优选的，所述的倍半萜类化合物包括但不限于杜松烯、大根香叶烯、荜澄茄油烯或摩勒烯。
10.权利要求2所述的编码基因、或者权利要求3所述的嵌合基因或表达盒在培育高表达倍半萜类合酶的转基因白木香品种中的应用，优选的，包括：(1)将所述的编码基因、嵌合基因或表达盒可操作的与植物表达连接构建得到重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化白木香植物组织或细胞；(3)筛选得到倍半萜类合酶的表达水平提高的转基因白木香品种。
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