CN113430218B - 倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法，并提供了一种经修饰的倍半萜合酶的基因，通过基因工程技术使常用宿主微生物高效表达：催化合成目标产物效率高的、可溶性好的倍半萜类化合物的合成酶，以此来促进倍半萜类化合物的生物酶催化合成技术的进步和发展。

Description

倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法

技术领域

本发明涉及倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

倍半萜类化合物是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，多数倍半萜类化合物具有令人愉悦的挥发性芳香气味，被广泛应用于高级香料中。此外，倍半萜类化合物还具有多种药理作用，并用于临床治疗，如环状倍半萜青蒿素可用于疟疾症状的控制与治疗等。

柏木醇是一种倍半萜类化合物，其广泛用于木香、辛香和东方型香精中，也大量用作消毒剂和卫生用品的增香剂。同时，柏木醇还具有多种药理作用，如抗炎、抗菌、镇静、解痉挛、抗心血管疾病、抗衰老及抗肿瘤等。柏木醇大多由柏木油经分馏、冷冻、结晶而制得，而我国的柏木提油率约为5％，因此，柏木醇的产量不理想。

沉香螺旋醇也是一种倍半萜类化合物，是沉香的主要成分，能够对中枢神经系统产生正面效应，有很好的镇定作用，能帮助人们消除紧张和焦虑情绪，对睡眠质量有很强的改善功效，能提高自身免疫力，同时，沉香螺旋醇还有很好的止痛效果。沉香螺旋醇可经沉香挥发油中提取分离，但费时费力，产率不高。

香叶醇也是一种倍半萜类化合物，是玫瑰系香精的主剂，也是各种花香香精中不可缺少的调香原料，还可用于配制食品的增甜剂、香皂、日用化妆品、香精等。香叶醇可自天然精油单离制取,也可用半合成或全合成的方法制取，但一般来说这些制法都会或多或少地含有橙花醇。

目前，倍半萜类化合物主要通过植物提取或化学合成，但杂质较多，而倍半萜类化合物的生物合成工艺还没有达到工业化生产的要求，还停留在实验室的基础研究阶段。随着生物酶催化合成技术的快速发展，人们希望利用大肠杆菌、酿酒酵母等常用宿主微生物高效表达一些催化合成目标产物效率高的、同时可溶性表达好的倍半萜类化合物的合成酶，以此来促进倍半萜类化合物的生物酶催化合成技术的进步和发展。

发明内容

为了解决上述发明问题，本发明提供一种倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法。

在一种实施方式中，本发明首先提供了一种倍半萜合酶的基因，其经序列修饰后，核酸序列如SEQ ID No.1所示。所述修饰的目的之一是使该半倍萜合酶催化底物产生具体目标产物的含量尽量高(例如为主产物或次主产物)；另一目的是使该基因在大肠杆菌中可溶性表达，尽量避免形成包涵体。

在一种实施方式中，本发明提供了一种催化合成萜类化合物的方法，包括如下步骤：重组表达SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因，纯化该倍半萜合酶，使其与法尼基焦磷酸(FPP)或牻牛儿基焦磷酸(GPP)(底物)在酶促反应条件下接触，收集产物中的萜类化合物。

在一种实施方式中，本发明提供了一种柏木醇的生物酶催化合成方法，包括如下步骤：重组表达SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因，纯化该倍半萜合酶，使其与FPP(底物)在酶促反应条件下接触，收集产物中的柏木醇。

在一种实施方式中，本发明还提供了一种沉香螺旋醇的生物酶催化合成方法，包括如下步骤：重组表达SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因，纯化该倍半萜合酶，使其与FPP(底物)在酶促反应条件下接触，收集产物中的沉香螺旋醇。

在一种实施方式中，本发明提供了一种酶催化同时生成柏木醇和沉香螺旋醇的方法，包括如下步骤：重组表达SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因，纯化该倍半萜合酶，使其与FPP(底物)在酶促反应条件下接触，分别收集产物中的柏木醇和沉香螺旋醇。

在一种实施方式中，本发明还提供了一种香叶醇的生物酶催化合成方法，包括如下步骤：重组表达SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因，纯化该倍半萜合酶，使其与GPP(底物)在酶促反应条件下接触，收集产物中的香叶醇。

所述重组表达的宿主为原核生物，例如，细菌，具体的，如大肠杆菌。

所述重组表达的宿主为真核生物，例如，真菌、植物细胞或动物细胞，具体的，如酵母。

一种核酸，其序列如SEQ ID No.1所示。

含有所述核酸的生物材料，为下述A1)至A4)中的任一种：

A1)含有权利要求1所述核酸的表达盒；

A2)含有权利要求1所述核酸的重组载体；

A3)含有权利要求1所述核酸的重组微生物；

A4)含有权利要求1所述核酸的转基因植物细胞系。

所述的核酸或所述的生物材料在制备倍半萜类化合物中的应用。

优选的，所述倍半萜类化合物为柏木醇、沉香螺旋醇和/或香叶醇。

一种制备倍半萜类化合物的方法，其特征在于，包括将含有所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物在酶促条件下发生反应，然后分离出倍半萜类化合物即可。

优选的，所述宿主是用含有所述核酸的重组表达载体修饰的，所述宿主选自原核生物、真菌、植物细胞或动物细胞。

优选的，所述倍半萜类化合物为柏木醇、沉香螺旋醇和/或香叶醇。

一种制备柏木醇和/或沉香螺旋醇的方法，其特征在于，包括将含有所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物FPP在酶促条件下发生反应，然后分离出柏木醇和/或沉香螺旋醇即可。

一种制备香叶醇的方法，其特征在于，包括将含有所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物GPP在酶促条件下发生反应，然后分离出香叶醇即可。

优选的，所述宿主是用含有所述核酸的重组表达载体修饰的，所述宿主选自原核生物、真菌、植物细胞或动物细胞。

一种催化合成萜类化合物的方法，其特征在于，将SEQ ID No.1所示的倍半萜合酶基因构建成为pET21a-倍半萜合酶融合表达载体，转化到大肠杆菌E.coli Transetta(DE3)中，经卡纳霉素筛选获得阳性克隆；阳性克隆经液体培养后，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中(转速110rpm/min)诱导蛋白表达20h。

本发明优于现有技术的方面在于：

一、本发明提供了一种能在原核细胞中可溶性表达极好的倍半萜合成酶序列。

二、本发明提供了一种高效的柏木醇的生物合成方法，采用本发明的倍半萜合成酶在底物FPP存在下，能高产量地获得柏木醇，占总产量的64.3％。

三、本发明提供了一种高效的沉香螺醇的生物合成方法，采用本发明的倍半萜合成酶在底物FPP存在下，能高产量地获得沉香螺醇，占总产量的38.1％。

四、本发明提供了一种高效的香叶醇的生物合成方法，采用本发明的倍半萜合成酶在底物GPP存在下，能高产量地获得香叶醇，占总产量的47.8％。

本发明十分难得地兼顾了倍半萜合成酶的原核可溶性表达和对目标产物特异的、高效的催化活性，显著超出了现有技术的水平。同时，对于柏木醇、沉香螺醇、香叶醇的生物合成方法而言，本发明取得的对应产率均较高，因而具有广阔的工业实用前景。

附图说明

图1PET-21a-倍半萜合酶质粒的双酶切鉴定。

图2融合蛋白的诱导表达SDS-PAGE。其中：

M：蛋白Marker；

1,2分别为37℃，200rpm,6h不加和加1mM IPTG诱导的PET-21a空载转化大肠杆菌得到的总蛋白条带；

3,4分别为37℃，200rpm,4h不加和加1mM IPTG诱导PET-21a--倍半萜合酶重组质粒质粒转化大肠杆菌得到的总蛋白条带；

5,6分别为37℃，200rpm,6h不加和加1mM IPTG诱导PET-21a--倍半萜合酶重组质粒质粒转化大肠杆菌得到的总蛋白条带；

7,8分别为加1mM IPTG 16℃，150rpm,18h诱导后离心分离得到的在上清液和沉淀蛋白条带。

图3融合蛋白的纯化洗脱。其中：

M：蛋白Marker；

1为用200mM的NEB洗脱得到的蛋白条带；

2为用250mM的NEB洗脱得到的蛋白条带。

3分别为用300mM的NEB洗脱得到的蛋白条带。

图4AsTPS13以FPP为底物催化产物的总离子流图。

图5倍半萜产物柏木醇MS谱图。

图6倍半萜产物沉香螺旋醇MS谱图。

图7AsTPS13以GPP为底物催化产物的总离子流图。

图8倍半萜产物香叶醇MS谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、倍半萜合酶的重组表达

步骤一、通过全基因合成的方式合成SEQ ID No.1所示的修饰后的倍半萜合酶基因，将其连接到pET-28a载体，经测序及双酶切鉴定为正确的克隆提取质粒备用。

步骤二、鉴定为阳性的重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞，同时将PET-21a空载质粒也转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞作为对照。

步骤三、挑菌活化后，进行转接大量摇菌，使其初始OD值低于0.1，并用紫外分光光度计测定OD值。37℃，200rpm摇菌2h 40min，其OD值升至0.5左右时加入0.5mM IPTG，然后16℃，150rpm,诱导16h后，12000rpm，离心15min，收集菌体。

步骤四、菌体经1×PBS缓冲液重悬，反复冻融4～5次充分裂解菌体，沸水煮5min使蛋白变性后，10％SDS-PAGE电泳检测。发现诱导出了目的条带(图2)。

实施例2、倍半萜合酶的纯化

按照确定的诱导条件进行蛋白大量表达。

步骤一、5000rpm离心20min，收集细胞，用于下一步的亲和纯化。

步骤二、用40mL结合缓冲液(含蛋白酶抑制剂)重悬细胞，超声波处理。4℃ 8000r/min离心30min，上清用0.45μm滤器过滤，沉淀置于冰上备用。

步骤三、取1mL Ni-NTA His Bind树脂，用结合缓冲液平衡后加到过滤后的上清中，将过滤后的上清与1mL Ni²⁺树脂匀浆混匀，冰上结合4h。

步骤四、将上述混合物上柱子，让溶液流出。

步骤五、用洗涤缓冲液洗涤树脂，每次10mL，重复3次。

步骤六、用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，每次1mL，重复3次，收集洗脱液。

步骤七、每管取少许样品进行SDS-PAGE，检测蛋白纯化情况。

优选的，在步骤六中设置三个不同洗脱浓度(200，150，300mmol/L)。

步骤六中的目的蛋白为：纯化后的pET-21a-倍半萜合酶His-tag融合蛋白。

如图3所示，经过200,250，300mmol/L三轮不同浓度的NEB洗脱，发现用300mmol/LNEB洗脱的pET-21a-倍半萜合酶融合蛋白基本无杂带，纯化结果最好(图3)。

实施例3、倍半萜合酶的体外酶促反应

反应体系中包含25mM Tris-HCl(pH7.0)，10％甘油，100mM Mg₂SO4,5mMDTT，46uMFPP或GPP(购自sigma公司)，纯化蛋白50uL，ddH₂O补足至200μL。将上述溶液混匀后，放入30℃金属浴温浴1h。

实施例4、产物检测与分离

用经GC老化过的固相微萃取SPME纤维头插入到吸附瓶中，缓缓推动手柄，使得具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中吸收挥发物质80min，萃取过程在80℃水浴锅内进行。

采用安捷伦气质联用仪(购自美国安捷伦/德国SYNTECH公司，型号7890B-5977A)对催化产物进行检测分析。

气质联用仪程序为：电离方式E1，电子能量70eV,载气为氦气，流速为1mL/min,进样口温度为250℃，起始温度为80℃，以5℃/min升至220℃，保存10min,再以10℃/min升至240℃，保持3min。扫描质量范围50～500amu。

用SPME吸附蛋白催化产生的挥发性物质，以250mmol/L NEB代替倍半萜合酶蛋白，其他组成不变，作为对照，对催化产物进行GC-MS检测。

结果显示：

以FPP为底物的催化产物主要有两种，分别为柏木醇(Cedrol)和沉香螺醇(agarospirol),各占总产量的64.3％和38.1％(见图4-6)。

以GPP为底物的催化产物主要是香叶醇(Geraniol)，占47.8％(见图7-8)。

综上，本发明无论在倍半萜合成酶的原核可溶性表达方面，还是在生物合成柏木醇、沉香螺醇、香叶醇的产率方面，都取得了实质性地突破。

本发明已经尽力阐述了全部关键的技术细节，实施例仅仅为了示例本发明的构思，不应当反而成为限制本发明保护范围的理由。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 倍半萜类化合物的生物酶催化合成方法

<130> 2021.03.03

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggctgaaa ccaaccgtcc gctggctcac ttccaggcta acatctggga agaacacttc 60

atctcttctc cgctgctgca cctggaaacc gaacaggctt ctaaacacca gaaactgaaa 120

gaacaggttc gtgaactgct gctggctggt ctggacaaac cgtgggaaca gctggacctg 180

atcgactcta tccagcgttc tggtgttgct taccacttcg aagacgaaat cgaaaacctg 240

ctgcagcgta tccacaaaaa cctggacacc tgcctggaag aaaacgacaa cctgcacttc 300

atctctctgc tgttccgtct gctgcgtcag tcttctctga ccgtttcttg cgacgttttc 360

aacaaattca aagacgactc tggtaaactg aaagaatctc tgatcgaaga cgttatcggt 420

ctgctgtctc tgcacgaagc tgcttgcatg cgtctgcacg gtgaagacat cctggaacag 480

gctttcgact tcaccaccac ctacctgaaa tctatcgttg aagacacctc ttcttcttct 540

aaactggctg ctcaggcttc tcaggctctg aaatacccgg ttcgtaaaaa catcccgcgt 600

ctggaagcta aatactacat ctctgtttac ccgctgctga acaacccggt tgttctgacc 660

ttcgctaaac tggacttcaa catcctgcag aaactgcacc agaacgaact gcgtgaaatc 720

gttcgttggt ggaaagacct ggacatcccg cgtcgtctgc cgtacgctcg tgaccgtatc 780

accgaactgt tcttctgggc tatcggtgtt tactacgaac cgtgctacgc tctgggtcgt 840

aaaatcctga ccaaagtttt cgctctgacc tctttcctgg acgacatgta cgacgcttac 900

ggtaccatcg aagaactgga actgctgacc caggctatcc agcgttggga ccgtaacgct 960

atggacggtc tgaacaacaa atgctctaaa gaactgtacc agatcctgct ggacgtttac 1020

gacgaaatcg gtgaagacat ggctaaactg ggtaaatctt accgtctgaa ctacgctgtt 1080

gaaatgatga aaggtcaggc tcgtacctac ctgaccgaag ctcgttggtt ctctcagaac 1140

tacaccccga ccttcgaaga atacctgaaa cgtggtatca acacctctgc ttgcccgctg 1200

ctgaccctgt cttctctgct gggtatcggt gacgacatct ctcgtgacgc tttcgaatgg 1260

atcctgtcta ccccgaaatc tctgatcgct tcttctctga ccggtcgtct ggctgacgac 1320

atcatgtctc acgaattcga aaaaaaacgt ggtcacgctg acaccgctgt tgaatgctac 1380

atgaaagaat acggtgctac caaacaggaa accgttaaag aactgtacaa acgtatcgaa 1440

tctgcttgga aagacatgaa cgaagaactg ctgcagccga ccgaagttcc gaaagctgtt 1500

ctgatgcgtg ttctgaactt cacccgttgc aaccaggttg tttacgctga cgctgacgct 1560

tacaccttcc cggactacct gaaagacttc gttgctgctc tgctggttca ccagctgccg 1620

ctggactaa 1629

Claims (8)

1.一种核酸，其序列如SEQ.ID.No.1所示。

2.含有权利要求1所述核酸的生物材料，为下述 A1)至 A3)中的任一种：

A1)含有权利要求1所述核酸的表达盒；

A2)含有权利要求1所述核酸的重组载体；

A3)含有权利要求1所述核酸的重组微生物。

3.权利要求1所述的核酸或权利要求2所述的生物材料在制备倍半萜类化合物中的应用，所述倍半萜类化合物为柏木醇、沉香螺旋醇和/或香叶醇。

4.一种制备倍半萜类化合物的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物在酶促条件下发生反应，然后分离出倍半萜类化合物即可，所述倍半萜类化合物为柏木醇、沉香螺旋醇和/或香叶醇。

5.如权利要求4所述的方法，所述宿主是用含有所述核酸的重组表达载体修饰的，所述宿主选自原核生物、真菌、植物细胞或动物细胞。

6.一种制备柏木醇和/或沉香螺旋醇的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物FPP在酶促条件下发生反应，然后分离出柏木醇和/或沉香螺旋醇即可。

7.一种制备香叶醇的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的核酸的宿主在能够产生倍半萜合成酶的条件下进行培养，获得倍半萜合酶，将该倍半萜合酶与底物GPP在酶促条件下发生反应，然后分离出香叶醇即可。

8.如权利要求6或7所述的方法，所述宿主是用含有所述核酸的重组表达载体修饰的，所述宿主选自原核生物、真菌、植物细胞或动物细胞。

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