CN114292866A - 一种生产木聚糖酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，所述基因工程藻株是通过将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中而获得的一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSXC9，所述木聚糖酶xynLc9基因序列为SEQ ID NO.13。本发明通过同源重组技术将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中，应用此方法获得的集胞藻PCC6803藻株SPSXC9藻株可生产木聚糖酶，在相同培养条件下，该藻株所生产的木聚糖酶酶活明显优于野生型藻株。本发明SPSXC9藻株对构建生产木聚糖酶的基因工程菌具有重要的理论和实际意义。

Description

一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株、方法及 应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，尤其是一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株、方法及应用。

背景技术

木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物质资源。它存在于陆生植物的细胞壁中，几乎植株的所有部位都含有它。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。侧链上连着多种不同大小的短的取代基，主要有O-乙酰基、4-O-甲基-D-葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其它几种结构性多糖(如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等)以共价或非共价键连接，组成植物细胞重要的结构-细胞壁。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中，处于木质素及其它多聚糖之间，起着连接作用。也正由于这些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大，从仅由β-1，4-糖苷键连接的多聚木糖线性分子到高度分枝的异质多糖。而木聚糖酶则是降解该物质的最主要酶之一，木聚糖酶是一组可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。一个木聚糖分子的完全酶解需要几步酶促反应。作用于主链的有两种酶：β-1，4-木聚糖酶(1，4-β-D-xylanohydrolase：EC3.1.2.8)和β-木糖苷酶(1，4-β-D-xylanxylohydrolase：EC3.2.1.37)。一般而言，前者从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成低聚糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖。木聚糖酶((1，4-β-D-xylanohydrolase，EC3.2.1.8)催化木聚糖中-1，4键的水解，广泛应用于生物燃料、食品以及纸浆工业的各种工业应用。近年来，木聚糖酶因其可能应用于工业生产木低聚糖(XOS)而引起了相当大的研究兴趣。木低聚糖是由2-7个木糖单位组成的低聚糖，被认为是功能性食品、化妆品、药品和植物生长调节剂的成分。由于重要的工业应用，许多木低聚糖酶基因已经在细菌和真菌中被发现。

目前，虽然产生木聚糖酶的生物种类很多，如霉菌、细菌、真菌、放线菌等。但是生产方法多采用固体发酵法生产，这些方法都是以异养微生物利用有机碳源如麸皮、玉米杆、稻草等有机碳源为原料进行生产，在酶生产过程中消耗了大量有机碳源，这就使得生物质转化为生物能源过程效率以及碳的利用率很低，从能量转化角度是不利的，严重限制了利用生物质进行生物能源转化的效率和可行性。如能通过改造光合生物，依靠光合作用，利用二氧化碳和简单无机盐为主的培养基来产木聚糖酶，就可以减少木聚糖酶生产过程中的碳源和能源消耗，提高生物质转化的效率，不仅可以降低生物质转化过程的能源和碳源消耗，而且还可以实现对温室气体的有效利用。

蓝藻是一类能进行产氧光合作用的原核生物，集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)是一种具有自然转化系统的单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不生产毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，它能利用光能进行自养生长，是光合作用分子生物学研究的重要模式生物之一。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化，不需要有机碳源，藻细胞培养成本低等的优点，因此，近年来利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产脂肪酸、药物等高附加值产品成为研究的热点。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株、方法及应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，所述基因工程藻株是通过将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中而获得的一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSXC9，所述木聚糖酶xynLc9基因序列为SEQ ID NO.13。

进一步地，所述木聚糖酶xynLc9基因来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9中，其Gene ID为939861。

进一步地，所述木聚糖酶xynLc9基因整合过程中采用的载体为表达载体PSXC9。

进一步地，所述表达载体PSXC9的构建方法如下：

(1)利用PCR技术，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、下游臂片段downstream；以大肠杆菌K12基因组为模板，获得终止子T1T2基因片段，具体步骤为：

以序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒，回收获得Kana抗性基因片段，其基因序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9。

如上所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，步骤如下：

(1)以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒回收获得Kana抗性基因片段，其序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9；

(8)将步骤(7)所得的重组表达载体质粒PSXC9自然转化至集胞藻PCC6803，经抗性筛选，培养，得到转基因集胞藻，命名为SPSXC9藻株，即得生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株。

进一步地，所述步骤(6)、(7)中扩增体系如下：

正反向引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH₂O9.5μL，总体系共25μL；

所述步骤(1)、(4)中，扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

DNA3μL，内切酶1μL，10×Buffer1μL，ddH₂O5μL，总体系共10μL。

如上所述的基因工程藻株在生产木聚糖酶方面中的应用。

利用如上所述的基因工程藻株生产木聚糖酶的方法，步骤如下：

将工程藻株SPSXC9接种于BG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下150rpm振荡培养至对数生长期，取处于对数期的藻液，6000rpm离心7min，去上清，用50mmol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液，即得木聚糖酶。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明通过同源重组技术将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中，应用此方法获得的集胞藻PCC6803藻株SPSXC9藻株可生产木聚糖酶，在相同培养条件下，该藻株所生产的木聚糖酶酶活明显优于野生型藻株。本发明所得到的可生产木聚糖酶的SPSXC9藻株对构建生产木聚糖酶的基因工程菌具有重要的理论和实际意义。

2、本发明将从枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9(GeneID:939861)中获得的外源基因木聚糖酶xynLc9基因通过基因重组技术重组至集胞藻PCC6803基因组中，获得一种生产木聚糖酶xynLc9的集胞藻工程藻株SPSXC9，该藻可在光照和简单无机盐为主培养基中生长并表达木聚糖酶xynLc9，实现了一种光合蓝藻表达外源木聚糖酶的方法。

3、本发明藻株可依靠光合作用，利用无机盐和二氧化碳生产木聚糖酶。

附图说明

图1为本发明中同源重组质粒P5ST1T2npt的结构图；

图2为本发明中重组表达载体PSXC9的结构图；

图3为本发明中工程藻株SPSXC9的PCR检测图；

图4为本发明中木聚糖酶酶活试剂盒检测野生藻株与工程藻株的酶活活性比对图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，所述基因工程藻株是通过将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中而获得的一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSXC9，所述木聚糖酶xynLc9基因序列为SEQ ID NO.13。

较优地，所述木聚糖酶xynLc9基因来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9中，其GeneID为939861。

较优地，所述木聚糖酶xynLc9基因整合过程中采用的载体为表达载体PSXC9。

较优地，所述表达载体PSXC9的构建方法如下：

(1)利用PCR技术，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、下游臂片段downstream；以大肠杆菌K12基因组为模板，获得终止子T1T2基因片段，具体步骤为：

以序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒，回收获得Kana抗性基因片段，其基因序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9。

如上所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，步骤如下：

(1)以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒回收获得Kana抗性基因片段，其序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9；

(8)将步骤(7)所得的重组表达载体质粒PSXC9自然转化至集胞藻PCC6803，经抗性筛选，培养，得到转基因集胞藻，命名为SPSXC9藻株，即得生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株。

较优地，所述步骤(6)、(7)中扩增体系如下：

正反向引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH₂O9.5μL，总体系共25μL；

所述步骤(1)、(4)中，扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

DNA3μL，内切酶1μL，10×Buffer1μL，ddH₂O5μL，总体系共10μL。

如上所述的基因工程藻株在生产木聚糖酶方面中的应用。

利用如上所述的基因工程藻株生产木聚糖酶的方法，步骤如下：

将工程藻株SPSXC9接种于50mLBG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下150rpm振荡培养至对数生长期，取30mL处于对数期的藻液，6000rpm离心7min，去上清，用20mL50mmol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液，即得木聚糖酶。

具体地，相关的制备及检测如下：

实施例1

同源重组质粒P5ST1T2npt的构建：

(1)利用PCR技术以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、下游臂片段downstream；以大肠杆菌K12基因组为模板，获得终止子T1T2基因片段，具体步骤如下：

以序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacⅡ双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒回收获得Kana抗性基因片段，其基因序列为SEQ ID NO.12；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(4)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，制得质粒载体P5ST1T2npt。

本实施例中所用酶切体系如下：DNA3μL，内切酶1μL，10×Buffer1μL，ddH₂O5μL，酶切温度为30℃，酶切时间为2h；

PCR体系如下：上下游引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH₂O9.5μL，总体系共25μL，将反应组分加入PCR管中进行PCR扩增，扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，每扩增1kbDNA需1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；

连接体系如下：回收获得的基因片段0.5μL，内切酶处理后的质粒片段2.5μL，T4连接酶1μL，10×Buffer1μL，ddH₂O5μL，总体系10μL，反应温度为16℃，连接10h。

经过以上实施例获得同源重组质粒P5ST1T2npt(如图1所示)。

实施例2

重组表达载体PSXC9的构建：

以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13。用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，获得P5ST1T2npt载体片段，在重组酶的作用下进行同源重组，然后转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行测序，获得重组表达载体PSXC9。

PCR体系如下：上下游引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH2O9.5μL，总体系共25μL，将反应组分加入PCR管中进行PCR扩增，扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，每扩增1kbDNA需1min；循环

重组连接体系如下：回收获得的木聚糖酶xynLc9基因1μL，回收获得的Promoter-up0.5μL，ApaⅠ处理后的P5ST1T2npt质粒2.5μL，重组酶2μL，10×Buffer4μL，ddH2O10μL，总体系20μL，反应温度37℃，反应时间2h。

经过以上实施例获得重组表达载体PSXC9(结构图如图2所示)，将PSXC9转化至大肠杆菌DH5α中进行保藏。

实施例3

可生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803基因工程藻株的获得。

(1)质粒转化

将PSXC9质粒用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，装入2mL无菌离心管中。向其中加入一定量BG11培养基(已加入HEPES缓冲液)，使质粒终浓度约为10ng/μL。取30mL处于对数期的野生型PCC6803，6000rpm离心7min，去上清。用20mL新鲜BG11培养基重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清。用含质粒的培养基把藻泥重悬，将重悬的藻液在29℃，150rpm，1400Lux连续光照培养6h。将藻液涂于铺有混合纤维滤膜的固体培养基中光照培养1天(正置培养)后，将膜转移至含有10μg/mLKana抗生素的固体培养基中，光照培养数天至膜表面长出单藻落，最后，将长出的藻落转移至含有相同浓度Kana抗生素的20mLBG11小瓶培养基中培养，待长至对数期后转接。

(2)藻株筛选

将(1)中得到的藻液进行转接培养，培养条件为29℃，150rpm，1400Lux连续光照。转接时，将BG11培养基中抗生素浓度提高到20μg/mL。待长至对数期再进行转接，以后每次转接培养基中抗生素的浓度提10μg/mL。当培养基中的抗生素浓度达到50μg/mL时，将藻液平板划线。待平板上长出单藻落后，挑取单藻落至含有相应抗生素浓度的BG11培养基中培养。当藻长至对数期后，提取该藻的基因组。以此基因组为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：4为引物进行PCR。本发明中PCR反应体系和程序与实施例2中相同。将PCR产物进行琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶检测图如图3所示。筛选出的菌株为基因工程藻株SPSXC9。

实施例4

集胞藻PCC6803基因工程藻株SPSXC9的扩大培养：

将野生型集胞藻PCC6803和工程藻株SPSXC9接种于50mLBG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下振荡培养(150rpm)7day。

实施例5

(1)粗酶液的制备

野生集胞藻PCC6803藻株与工程藻株SPSXC9的木聚糖酶的酶活测定：

将野生型集胞藻PCC6803和工程藻株SPSXC9接种于50mLBG-11液体培养基中，调节OD730＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下振荡培养(150rpm)至对数生长期，取30mL处于对数期的藻液，6000rpm离心7min，去上清，用20mL50mmol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液。

(3)木聚糖酶酶活试剂盒测定野生集胞藻PCC6803藻株与工程藻株SPSXC9的木聚糖酶酶活

具体步骤详见试剂盒说明书，一个酶活力单位定义为50℃，pH9.0条件下每毫升粗酶液每分钟分解木聚糖产生1μmoL还原糖所需要的酶量。

酶活测定结果如图4所示。

由图4可以看出，工程藻株SPSXC9的木聚糖酶酶活为1.38U，野生集胞藻PCC6803藻株为0.40U，相对于野生藻株，工程藻株酶活提高了3.45倍。

通过实施例5说明，本发明通过同源重组技术将木聚糖酶xynLc9基因转化至集胞藻PCC6803中，应用此方法获得的集胞藻PCC6803藻株SPSXC9藻株可生产木聚糖酶，在相同培养条件下，该藻株所生产的木聚糖酶活性明显优于野生型藻株。

本发明中使用的引物序列及基因片段如下：

SEQ ID NO.1：Promotor-F：5'-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；

SEQ ID NO.2：Promotor-R：5'-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3'；

SEQ ID NO.3：TIT2-F：5'-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3'；

SEQ ID NO.4：TIT2-R：5'-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；

SEQ ID NO.5：downstream-F：5'-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；

SEQ ID NO.6：downstream-R：5'-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3'；

SEQ ID NO.7：

xynLc9-F：5'-GCTAGCACAGACTACTGGCAAAAT-3'；

SEQ ID NO.8：

xynLc9-R：5'-TTAACTTAATGATGATGATGATGATGCCA-3'

SEQ ID NO.9：

GCTTTAGCGTTCCAGTGGATATTTGCTGGGGGTTAATGAAACATTGTGGCGGAACCCAGGGACAATGTGACCAAAAAATTCAGGGATATCAATAAGTATTAGGTATATGGATCATAATTGTATGCCCGACTATTGCTTAAACTGACTGACCACTGACCTTAAGAGTAATGGCGTGCAAGGCCCAGTGATCAATTTCATTATTTTTCATTATTTCATCTCCATTGTCCCTGAAAATCAGTTGTGTCGCCCCTCTACACAGCCCAGAACTATGGTAAAGGCGCACGAAAAACCGCCAGGTAAACTCTTCTCAACCCCCAAAACGCCCTCTGTTTACCCATGGAAAAAACGACAATTACAAGAAAGTAAAACTTATGTCATCTATAAGCTTCGTGTATATTAACTTCCTGTTACAAAGCTTTACAAAACTCTCATTAATCCTTTAGACTAAGTTTAGTCAGTTCCAATCTGAACATCGACAAATACATAAGGAATTATAACCAA

SEQ ID NO：10：

TAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATGGGGGA

SEQ ID NO.11：

GGATCCTCATCGAGCCCTCCGAGCGAAATGGCCGATTGCCGAACAGAGTTTATAAAAGTCCAGAAATAGATCGGCAATTTGCCTTCTATAGCACCCCACGGCAAACAAAAATACAGCCACCTCCAGACAAGATCAGCGCCGGCGCATGCGCCGCCGGCCAGCCATAACAGCGAGAGGGCTATCCGCAATGAAGACTCAAGTCGCCATCATCGGCGCCGGTCCGTCCGGCCTCCTGCTCGGCCAGTTGCTGCACAAGGCCGGCATCGACAACGTGATCCTCGAACGCCAGACCCCGGACTACGTGCTCGGCCGCATCCGCGCCGGCGTGCTGGAACAGGGTATGGTCGACCTGCTGCGCGAGGCCGGCGTCGACCGGCGCATGGCGCGCGACGGGCTGGTCCACGAAGGCGTGGAGATCGCCTTCGCCGGGCAGCGCCGGCGCATCGACCTGAAGCGCCTGAGCGGCGGCAAGACGGTGACGGTCTACGGCCAGACCGAGGTCACCCGCGACCTCATGGAAGCCCGCGAAGCCTGCGGCGCCACTACCGTCTACCAGGCCGCCGAGGTGCGCCTGCACGACCTGCAAGGTGAGCGCCCCTACGTGACCTTCGAACGCGACGGCGAACGGCTGCGCCTGGATTGCGACTACATCGCCGGCTGCGATGGCTTCCACGGCATCTCGCGGCAATCGATCCCGGCGGAGCGGCTGAAGGTCTTCGAGCGGGTCTATCCGTTCGGCTGGCTCGGCCTGCTCGCCGACACCCCGCCGGTCAGCCACGAACTGATCTACGCCAACCATCCGCGCGGCTTCGCCCTGTGCAGCCAGCGTTCGGCGACCCGCAGCCGCTACTACGTACAGGTGCCATTGACAGAGAAGGTCGAGGACTGGTCCGACGAGCGCTTCTGGACGGAACTGAAAGCGCGCCTCCCGGCCGAGGTGGCGGAGAAACTGGTGACCGGTCCTTCGCTGGAGAAGAGCATCGCGCCGCTGCGCAGCTTCGTGGTCGAGCCGATGCAGCATGGCCGGCTGTTCCTCGCCGGCGACGCCGCGCACATCGTGCCGCCCACCGGCGCCAAGGGACTGAACCTGGCGGCCAGCGACGTCAGCACGCTCTACCGGCTGCTGCTGAAGGCCTACCGCGAAGGGCGGGGCGAACTGCTGGAACGCTACTCGGCAATCTGCCTGCGGCGGATCTGGAAGGCCGAACGCTTCTCCTGGTGGATGACTTCGGTGCTGCATCGCTTCCCCGACACCGACGCGTTCAGCCAGCGCATCCAGCAGACCGAACTGG

SEQ ID NO：12：

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA

SEQ ID NO：13：

GCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGATGGGGGCGGTATAGTAAACGCTGTTAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCTAATACCGGAAATTTTGTTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATAAACTATAATGCCGGAGTTTGGGCACCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGGACGAGATCACCTCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACTGGAACGTATAAAGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACACGTTATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTTCGTCAGACGAAGAGACCAACTGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAACGCATGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTCACCAAGTCATGGCGACAGAAGGATATCAAAGTAGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGG

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株、方法及应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Promotor-F(Unknown)

<400> 1

gatgtcgacg ctttagcgtt ccagtg 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Promotor-R(Unknown)

<400> 2

catttggtta taattcctta tgtat 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> TIT2-F(Unknown)

<400> 3

atactgcagc caagcttggc tgttttggc 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> TIT2-R(Unknown)

<400> 4

ttaggatccc ccattattga agcatttat 29

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> downstream-F(Unknown)

<400> 5

cttcatatgc cgcggatgac aacgactctc caac 34

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> downstream-R(Unknown)

<400> 6

agtgagctct taaccgttga cagcagg 27

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> xynLc9-F(Unknown)

<400> 7

gctagcacag actactggca aaat 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> xynLc9-R(Unknown)

<400> 8

ttaacttaat gatgatgatg atgatgcca 29

<210> 9

<211> 501

<212> DNA

<213> Promoter-up(Unknown)

<400> 9

gctttagcgt tccagtggat atttgctggg ggttaatgaa acattgtggc ggaacccagg 60

gacaatgtga ccaaaaaatt cagggatatc aataagtatt aggtatatgg atcataattg 120

tatgcccgac tattgcttaa actgactgac cactgacctt aagagtaatg gcgtgcaagg 180

cccagtgatc aatttcatta tttttcatta tttcatctcc attgtccctg aaaatcagtt 240

gtgtcgcccc tctacacagc ccagaactat ggtaaaggcg cacgaaaaac cgccaggtaa 300

actcttctca acccccaaaa cgccctctgt ttacccatgg aaaaaacgac aattacaaga 360

aagtaaaact tatgtcatct ataagcttcg tgtatattaa cttcctgtta caaagcttta 420

caaaactctc attaatcctt tagactaagt ttagtcagtt ccaatctgaa catcgacaaa 480

tacataagga attataacca a 501

<210> 10

<211> 540

<212> DNA

<213> T1T2(Unknown)

<400> 10

taagcttgat atcgaattcc tgcagccaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt 60

ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 120

ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 180

agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 240

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 300

cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 360

cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 420

catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac 480

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatggggga 540

<210> 11

<211> 1292

<212> DNA

<213> downstream(Unknown)

<400> 11

ggatcctcat cgagccctcc gagcgaaatg gccgattgcc gaacagagtt tataaaagtc 60

cagaaataga tcggcaattt gccttctata gcaccccacg gcaaacaaaa atacagccac 120

ctccagacaa gatcagcgcc ggcgcatgcg ccgccggcca gccataacag cgagagggct 180

atccgcaatg aagactcaag tcgccatcat cggcgccggt ccgtccggcc tcctgctcgg 240

ccagttgctg cacaaggccg gcatcgacaa cgtgatcctc gaacgccaga ccccggacta 300

cgtgctcggc cgcatccgcg ccggcgtgct ggaacagggt atggtcgacc tgctgcgcga 360

ggccggcgtc gaccggcgca tggcgcgcga cgggctggtc cacgaaggcg tggagatcgc 420

cttcgccggg cagcgccggc gcatcgacct gaagcgcctg agcggcggca agacggtgac 480

ggtctacggc cagaccgagg tcacccgcga cctcatggaa gcccgcgaag cctgcggcgc 540

cactaccgtc taccaggccg ccgaggtgcg cctgcacgac ctgcaaggtg agcgccccta 600

cgtgaccttc gaacgcgacg gcgaacggct gcgcctggat tgcgactaca tcgccggctg 660

cgatggcttc cacggcatct cgcggcaatc gatcccggcg gagcggctga aggtcttcga 720

gcgggtctat ccgttcggct ggctcggcct gctcgccgac accccgccgg tcagccacga 780

actgatctac gccaaccatc cgcgcggctt cgccctgtgc agccagcgtt cggcgacccg 840

cagccgctac tacgtacagg tgccattgac agagaaggtc gaggactggt ccgacgagcg 900

cttctggacg gaactgaaag cgcgcctccc ggccgaggtg gcggagaaac tggtgaccgg 960

tccttcgctg gagaagagca tcgcgccgct gcgcagcttc gtggtcgagc cgatgcagca 1020

tggccggctg ttcctcgccg gcgacgccgc gcacatcgtg ccgcccaccg gcgccaaggg 1080

actgaacctg gcggccagcg acgtcagcac gctctaccgg ctgctgctga aggcctaccg 1140

cgaagggcgg ggcgaactgc tggaacgcta ctcggcaatc tgcctgcggc ggatctggaa 1200

ggccgaacgc ttctcctggt ggatgacttc ggtgctgcat cgcttccccg acaccgacgc 1260

gttcagccag cgcatccagc agaccgaact gg 1292

<210> 12

<211> 816

<212> DNA

<213> Kana抗性基因片段(Unknown)

<400> 12

atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 60

gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120

tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180

gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240

cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300

atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360

gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420

tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480

gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540

gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600

cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660

ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720

ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780

ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816

<210> 13

<211> 555

<212> DNA

<213> 木聚糖酶xynLc9基因(Unknown)

<400> 13

gctagcacag actactggca aaattggact gatgggggcg gtatagtaaa cgctgttaat 60

gggtctggcg ggaattacag tgttaattgg tctaataccg gaaattttgt tgttggtaaa 120

ggttggacta caggttcgcc atttaggacg ataaactata atgccggagt ttgggcaccg 180

aatggcaatg gatatttaac tttatatggt tggacgagat cacctctcat agaatattat 240

gtagtggatt catggggtac ttatagacct actggaacgt ataaaggtac tgtaaaaagt 300

gatgggggta catatgacat atatacaact acacgttata acgcaccttc cattgatggc 360

gatcgcacta cttttacgca gtactggagt gttcgtcaga cgaagagacc aactggaagc 420

aacgctacaa tcactttcag caatcatgtg aacgcatgga agagccatgg aatgaatctg 480

ggcagtaatt gggctcacca agtcatggcg acagaaggat atcaaagtag tggaagttct 540

aacgtaacag tgtgg 555

Claims (8)

1.一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述基因工程藻株是通过将木聚糖酶xynLc9基因整合至集胞藻PCC6803基因组中而获得的一种生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株SPSXC9，所述木聚糖酶xynLc9基因序列为SEQ IDNO.13。

2.根据权利要求1所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述木聚糖酶xynLc9基因来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9中，其GeneID为939861。

3.根据权利要求1或2所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述木聚糖酶xynLc9基因整合过程中采用的载体为表达载体PSXC9。

4.根据权利要求3所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株，其特征在于：所述表达载体PSXC9的构建方法如下：

(1)利用PCR技术，以野生集胞藻PCC6803基因组为模板，获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、下游臂片段downstream；以大肠杆菌K12基因组为模板，获得终止子T1T2基因片段，具体步骤为：

以序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒，回收获得Kana抗性基因片段，其基因序列为SEQ ID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9。

5.如权利要求1至4任一项所述的生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(1)以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为上下游引物，并以大肠杆菌K12基因组为模板；以序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为上下游引物，并以野生集胞藻PCC6803基因组为模板；分别通过PCR扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up、终止子T1T2基因片段与下游臂片段downstream，获得的片段的序列依次为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

(2)对步骤(1)中所获得终止子T1T2基因片段进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂片段downstream进行SacⅠ与SacII双酶切；

(3)将pBluescriptSK质粒进行PstⅠ和BamHⅠ双酶切，与步骤(2)制得的终止子T1T2基因片段用T4连接酶连接，得到质粒pBluescriptSKT1T2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用SacⅠ与SacⅡ双酶切后与经相同酶切的质粒pBluescriptSKT1T2连接，得到质粒P5ST1T2-downstream；

(4)以序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为上下游引物，以枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLucky9的基因组为模板，通过PCR扩增技术获得木聚糖酶xynLc9基因片段，序列为SEQ ID NO.13；

(5)用限制性内切酶BamHⅠ处理puc4K质粒回收获得Kana抗性基因片段，其序列为SEQID NO.12；

(6)用限制性内切酶BamHⅠ处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(5)所获得的Kana基因片段在连接酶的作用下连接至回收所得的P5ST1T2-downstream载体上，与步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因片段Promoter-up磷酸化之后，进行同源重组，制得质粒载体P5ST1T2npt；

(7)用限制性内切酶ApaⅠ处理质粒P5ST1T2npt，并将步骤(4)所回收木聚糖酶xynLc9基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒PSXC9；

(8)将步骤(7)所得的重组表达载体质粒PSXC9自然转化至集胞藻PCC6803，经抗性筛选，培养，得到转基因集胞藻，命名为SPSXC9藻株，即得生产木聚糖酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(6)、(7)中扩增体系如下：

正反向引物各1μL，模板1μL，重组酶12.5μL，ddH₂O9.5μL，总体系共25μL；

所述步骤(1)、(4)中，扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

DNA3μL，内切酶1μL，10×Buffer1μL，ddH₂O5μL，总体系共10μL。

7.如权利要求1至4任一项所述的基因工程藻株在生产木聚糖酶方面中的应用。

8.利用如权利要求1至4任一项所述的基因工程藻株生产木聚糖酶的方法，其特征在于：步骤如下：

将工程藻株SPSXC9接种于BG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下150rpm振荡培养至对数生长期，取处于对数期的藻液，6000rpm离心7min，去上清，用50mmol/LpH5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液，即得木聚糖酶。

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