CN117866987A - β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株及其应用 - Google Patents
β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种β‑1,3‑葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株及其应用，本发明在β‑1,3‑磷酸化酶基因上设计基因编辑靶位点(LDP1基因核苷酸序列287‑306bp位置)，该位点能被Cas9核酸内切酶特异性识别，从而介导双链断裂。得到的工程藻株中纤细裸藻β‑1,3‑葡聚糖占细胞干重75％以上，为提高纤细裸藻中高产β‑1，3‑葡聚糖提供新策略。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种β-1，3-葡聚糖的纤细裸藻工程株的其制备方法和应用。
背景技术
纤细裸藻(Euglena gracilis)是裸藻门最典型的代表藻种，广泛分布在中国的水生环境中。纤细裸藻能够通过光合作用为自身细胞的生长提供能量。此外，在缺乏光照的环境中，裸藻也能够利用丰富的营养物进行呼吸作用，消耗氧气并产生二氧化碳。裸藻具有动物和植物双重性的生长特性，这使得它能够采用光合自养、异养以及光异养等不同方式进行培养，这种多样的生长方式使其具有应用驱动研究和商业化的潜力。纤细裸藻富含蛋白质、维生素、脂质和仅在类绿藻中发现的β-1，3-葡聚糖，并且在2013年通过了新资源食品认证，它在功能食品、功能饵料等方面具有巨大的经济价值及广阔的应用前景。
裸藻β-1，3-葡聚糖也称为裸藻副淀粉，含量占细胞干重的30％以上。可通过简单的提取方式进行提取。裸藻β-1，3-葡聚糖是水不溶性贮藏多糖，只由β-1，3连接的葡萄糖亚单位组成，分子间排列形成三螺旋结构，X射线衍射和光密度测定显示其在天然状态下具有非常高的结晶度(～90％)。裸藻β-1，3-葡聚糖已经通过了美国FDA的公认为安全的认证。研究表明裸藻β-1，3-葡聚糖可以免疫增强、清除毒素、抗辐射、细胞修复和降脂等生物活性。易于分离纯化和具有生物活性的β-1，3-葡聚糖的裸藻产品面具有巨大的经济价值及广阔的应用前景。
β-1，3-葡聚糖的合成通常起始于UDP-葡萄糖，通过一系列酶催化反应，最终形成具有特定结构的聚合物。在光照和营养充足的生长过程中，线粒体和叶绿体发育一种形成副淀粉颗粒的囊泡的共同网络。裸藻β-1，3-葡聚糖在细胞内迅速分解以适应环境的变化。例如，当纤细裸藻暴露于缺氧条件下时，β-1，3-葡聚糖迅速降解产生蜡酯，分别在糖苷水解酶和磷酸化酶的协同作用下降解为葡萄糖和葡萄糖1-P，并产生ATP。通过鉴定可知，葡聚糖代谢通过内β-1，3-葡聚糖(EC 3.2.1.6和EC 3.2.1.39)和外水解酶(EC 3.2.1.58)以及β-1，3-葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.97)进行降解。β-1，3-葡聚糖磷酸化酶催化β-1，3葡聚糖的可逆性磷酸化，生成葡萄糖1-P。在磷酸化反应中，磷酸化酶通过添加Pi来切割β-1，3-寡聚糖中的β-1，3-键，从而产生葡萄糖1-P。已知LDP1是一种磷酸化酶，通过CRISPR/Cas9技术，对纤细裸藻LDP1基因进行完全性基因敲除，可培育出高产β-1，3-葡聚糖的工程株，扩大纤细裸藻产业规模，解决生物量生产的能效问题，从而实现β-1，3-葡聚糖的高效制备。
基于此，本发明的目的在于提供一个可高效敲除β-1，3-葡聚糖磷酸化酶基因(LDP1)的编辑位点以及培育高产β-1，3-葡聚糖的工程株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可高效敲除β-1，3-葡聚糖磷酸化酶基因(LDP1)的编辑位点，以及创建高效合成β-1，3-葡聚糖工程株。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种纤细裸藻LDP1基因编辑位点，所述纤细裸藻LDP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，基因编辑位点为LDP1基因核苷酸序列287-306bp位置。该编辑位点可用于Cas9介导的纤细裸藻的LDP1基因打靶，将抑制β-1，3-葡聚糖酶解，创建高效合成β-1，3-葡聚糖工程株。
进一步的，本发明提供了上述纤细裸藻LDP1基因编辑位点在编辑LDP1基因中的应用。
本发明还提供一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，具体包括如下步骤：
S1：构建含有编辑sgRNA的基因编辑载体，所述sgRNA靶向上述基因编辑位点(LDP1基因核苷酸序列287-306bp位置)；
S2：将步骤S1得到的基因编辑载体进行纤细裸藻遗传转化，获得工程藻株；
S3：取步骤S2得到的工程藻株，提取DNA进行PCR扩增，扩增产物测序，验证基因编辑情况。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述sgRNA包括sgRNA-F、sgRNA-R；
所述sgRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA-R的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤S1具体包括如下步骤：
S1.1：在基因库中调出纤细裸藻LDP1基因的序列，将序列输入网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，预测基因编辑的靶位点序列，并设计sgRNA；
S1.2：根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；
S1.3：将PREGB32使用限制性内切酶切成线性，获得线性化载体；
S1.4：用连接酶连接步骤S1.3回收的线性化载体和退火的步骤S1.1设计的sgRNA，获得重组质粒；
S1.5：对步骤S1.4获得的重组质粒的靶点序列进行测序，测序正确的重组质粒即为基因编辑载体。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤S2具体包括如下步骤：
S2.1：将纤细裸藻重悬于山梨醇中，取处于对数期纤细裸藻与重组质粒DNA混合放置冰面上10min，通过750V，6ms电击法转化纤细裸藻；
S2.2：用AF-6培养基重悬后黑暗培养24h，接着转移至第一筛选培养基上直至长出藻落，然后使用第二筛选培养基进行再次筛选。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述第一筛选培养基中潮霉素B为20μg/mL；所述第二筛选培养基中潮霉素B为30μg/mL。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤S3中将测序结果与目的基因LDP1序列进行对比，若序列相同则目的基因未被成功编辑，若测序结果显示SNP、Indel或大片段删除，即为基因编辑成功。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤S3中工程藻株目标性状为裸藻β-1，3-葡聚糖含量占干重70％以上。
上述制备方法制得的β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株可应用于裸藻β-1，3-葡聚糖的生产中。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一个可高效敲除β-1，3-葡聚糖磷酸化酶基因(LDP1)的编辑位点(287-306bp)。该编辑位点可用于Cas9介导的纤细裸藻的LDP1基因打靶，将抑制β-1，3-葡聚糖酶解，创建高效合成β-1,3-葡聚糖工程株。得到的工程藻株中纤细裸藻β-1，3-葡聚糖占细胞干重75％以上，为提高纤细裸藻中高产β-1，3-葡聚糖提供新策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见，下面描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下，根据这些实施例获得所有其他的实施例，都属于本发明的保护范围。
图1为PREGB32表达载体序列图；
图2为重组质粒测序图；
图3为敲除基因纤细裸藻测序图；
图4为敲除基因纤细裸藻中裸藻β-1,3-葡聚糖占干重比例；
图5为敲除基因纤细裸藻中裸藻β-1,3-葡聚糖含量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种纤细裸藻LDP1基因编辑位点，纤细裸藻LDP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因编辑位点为LDP1基因核苷酸序列287-306bp位置。该编辑位点可用于Cas9介导的纤细裸藻的LDP1基因打靶，将抑制β-1,3-葡聚糖酶解，创建高效合成β-1,3-葡聚糖工程株。
本发明还提供一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，包括如下步骤：
S1：构建含有编辑sgRNA的基因编辑载体，所述sgRNA靶向上述基因编辑位点(LDP1基因核苷酸序列287-306bp位置)；具体包括如下步骤：
S1.1：在基因库中调出纤细裸藻LDP1基因的序列，将序列输入网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，预测基因编辑的靶位点序列，并设计sgRNA；其中，sgRNA包括sgRNA-F、sgRNA-R；gRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
S1.2：根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；
S1.3：将PREGB32使用限制性内切酶切成线性，获得线性化载体；
S1.4：用连接酶连接步骤S1.3回收的线性化载体和退火的步骤S1.1设计的sgRNA，获得重组质粒；
S1.5：对步骤S1.4获得的重组质粒的靶点序列进行测序，测序正确的重组质粒即为基因编辑载体。
S2：将步骤S1得到的基因编辑载体进行纤细裸藻遗传转化，获得工程藻株；具体包括如下步骤：
S2.1：将纤细裸藻重悬于山梨醇中，取处于对数期纤细裸藻与重组质粒DNA混合放置冰面上10min，通过750V，6ms电击法转化纤细裸藻；
S2.2：用AF-6培养基重悬后黑暗培养24h，接着转移至第一筛选培养基(潮霉素B20μg/mL)上直至长出藻落，然后使用第二筛选培养基(潮霉素B 30μg/mL)进行再次筛选。
S3：取步骤S2得到的工程藻株，提取DNA进行PCR扩增，扩增产物测序，验证基因编辑情况；具体的，将测序结果与目的基因LDP1序列进行对比，若序列相同则目的基因未被成功编辑，若测序结果显示SNP、Indel或大片段删除，即为基因编辑成功。其中，工程藻株目标性状为裸藻β-1，3-葡聚糖含量占干重70％以上。
本发明是以PREGB32载体为骨架构建插入纤细裸藻β-1，3-葡聚糖磷酸化酶基因(LDP1)编辑靶位点，将重组基因编辑载体进行纤细裸藻遗传转化，获得高产β-1，3-葡聚糖转基因纤细裸藻，以下结合实施例和附图对本发明做详细的阐释。需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的权利要求做出限制或限定。
实施例1插入有纤细裸藻β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因(LDP1)编辑靶位点sgRNA的表达载体的构建
1)主要试剂与材料来源
PREGB32载体(如附图1所示)，BsaI限制性核酸内切酶，T4 DNA连接酶，质粒小提试剂盒，DNA割胶回收试剂盒，sgRNA为本实验室自行设计，测序委托擎科生物科技股份有限公司完成。其中，sgRNA包括sgRNA-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)与sgRNA-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
2)操作步骤
sg RNA退火：用TE buffer将引物稀释浓度为100μM，使用pcr仪进行退火，于-80℃保存退火sgRNA溶液，之后通过凝胶电泳观察条带是否退火完成。退火条件如下：
质粒的线性化，反应条件为37℃孵育2小时，80℃孵育20分钟终止反应。通过凝胶电泳观察条带是否将质粒线性化。线性化体系配置如下：
质粒的酶连，T4 DNA连接酶连接回收载体和退火的sgRNA，反应条件为25℃，2h。酶连体系配置如下：
连接后的产物转化大肠杆菌感受态细胞，从长出菌落的抗性平板挑取菌落进行菌落PCR，将正确条带的菌液送擎科生物测序。(重组质粒测序，如附图2所示)
实施例2 3)电穿孔转染后阳性藻株的筛选
3.1)电转化
将以上重组质粒使用电转法转化进入处于对数期的纤细裸藻。取-80℃保存的重组质粒于冰浴中融化，向500μL处于对数期的纤细裸藻(细胞密度为1×107个/ml)中加入30μg重组质粒，轻轻混匀，冰浴10min后，通过750V，6ms电击法转化纤细裸藻。然后黑暗培养24h，放在筛选培养基(潮霉素B 20μg/mL)上直至长出藻落，再次使用筛选培养基(潮霉素B30μg/mL)再次筛选。
取工程藻株(KO)和野生型(WT)纤细裸藻提取DNA，进行目的片段扩增，扩增产物进行测序鉴定。
3.2)PCR测序结果比对
将测序结果与目的基因序列进行比对，获得的测序结果中与目标区域不同的事件即为基因编辑事件(如附图3所示)。
将工程藻株株扩大培养，在1L AF-6培养基溶液中扩培，放置于光照培养箱，光照强度为5000Lux，温度为25±1℃培养，光照时间和黑暗时间为12h：12h，在收获期收集藻液，提取裸藻β-1，3-葡聚糖进行检测。
参照附图4-5所示，从图中可以明显看出，工程藻株(KO)中的β-1,3-葡聚糖含量以及占干重比例均明显高于野生型(WT)纤细裸藻。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种纤细裸藻LDP1基因编辑位点，其特征在于，所述纤细裸藻LDP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因编辑位点为LDP1基因核苷酸序列287-306bp位置。
2.一种如权利要求1所述的纤细裸藻LDP1基因编辑位点在编辑LDP1基因中的应用。
3.一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1：构建含有编辑sgRNA的基因编辑载体，所述sgRNA靶向如权利要求1所述的基因编辑位点；
S2：将步骤S1得到的基因编辑载体进行纤细裸藻遗传转化，获得工程藻株；
S3：取步骤S2得到的工程藻株，提取DNA进行PCR扩增，扩增产物测序，验证基因编辑情况。
4.根据权利要求3所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA-F、sgRNA-R；
所述sgRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
5.根据权利要求4所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括如下步骤：
S1.1：在基因库中调出纤细裸藻LDP1基因的序列，将序列输入网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/，预测基因编辑的靶位点序列，并设计sgRNA；
S1.2：根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；
S1.3：将PREGB32使用限制性内切酶切成线性，获得线性化载体；
S1.4：用连接酶连接步骤S1.3回收的线性化载体和退火的步骤S1.1设计的sgRNA，获得重组质粒；
S1.5：对步骤S1.4获得的重组质粒的靶点序列进行测序，测序正确的重组质粒即为基因编辑载体。
6.根据权利要求3所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括如下步骤：
S2.1：将纤细裸藻重悬于山梨醇中，取处于对数期纤细裸藻与重组质粒DNA混合放置冰面上10min，通过750V，6ms电击法转化纤细裸藻；
S2.2：用AF-6培养基重悬后黑暗培养24h，接着转移至第一筛选培养基上直至长出藻落，然后使用第二筛选培养基进行再次筛选。
7.根据权利要求6所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，所述第一筛选培养基中潮霉素B为20μg/mL；所述第二筛选培养基中潮霉素B为30μg/mL。
8.根据权利要求3所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，步骤S3中将测序结果与目的基因LDP1序列进行对比，若序列相同则目的基因未被成功编辑，若测序结果显示SNP、Indel或大片段删除，即为基因编辑成功。
9.根据权利要求3所述的一种β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株的制备方法，其特征在于，步骤S3中工程藻株目标性状为裸藻β-1，3-葡聚糖含量占干重70％以上。
10.如权利要求3～9任意一项所述的制备方法制得的β-1,3-葡聚糖磷酸化酶基因编辑纤细裸藻工程株在生产裸藻β-1，3-葡聚糖中的应用。
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