CN100432230C - 一种金属硫蛋白融合表达方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物工程技术领域，所述一种利用金属硫蛋白作为融合标签，和外源基因一起进行融合表达的新方法，其特点在于：能够可溶性地、高产地稳定表达目标产物；能够通过金属螯合亲和层析方便地进行目的蛋白的分离纯化。该融合表达体系适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。融合表达载体pT7MT，是一个能够在大肠杆菌中可溶的、高产的稳定表达目标产物的金属硫蛋白高效融合表达载体。
Description
一、技术领域
本发明属生物工程技术领域。
二、背景技术
利用基因工程技术生产重组蛋白质已成为生物工程制药业及基因工程、生物化学和分子生物学研究中广泛应用的方法。为了便于重组蛋白质的高效表达及下游的分离纯化，目前，已开发很多融合表达载体用以在大肠杆菌中表达融合蛋白。研究表明，和非融合表达相比，融合表达的策略可以增加目的蛋白的产量、可溶性和均一性。而且，融合在氨基端的融合标签往往还能提高目标蛋白在表达体系中的稳定性。另外，由于融合标签的亲和性，可以通过亲和层析的方法很方便地纯化获得高纯度的目标融合蛋白。此外，将外源基因和能在大肠杆菌中高水平表达、且产物溶解性很好的蛋白质(如金黄色葡萄球菌蛋白A，谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白malE，大肠杆菌硫氧还蛋白等)构建成融合蛋白的形式，借助于溶解性能好，高水平表达的融合伙伴蛋白使所需要的目标蛋白质(即外源基因产物)亦获得可溶性的大量表达，从而避免包涵体产物的生成。以上这些方法都为国外科学家所发现和建立、并都获得了发明专利。其中，当前使用最广泛的两种亲和标签是谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和His6-标签，很多商业化载体被开发用来表达具有GST或His6-标签的融合形式的目的蛋白，进而使用谷胱甘肽亲和层析或Ni柱亲和层析得到纯化。
金属硫蛋白(metallothione，MT)是一种小分子量的、30％的氨基酸为半胱氨酸残基的细胞内蛋白，它的生理作用可能是通过清除氢氧根离子和结合金属离子而起到抗氧化的作用。金属硫蛋白富含半胱氨酸残基，在生理条件下可以结合多个锌离子和铜离子。在单细胞的真核生物中，金属硫蛋白优先结合铜离子；而在哺乳动物细胞中则优先结合锌离子，而锌离子也可能被铜离子或钙离子所取代。
三、发明内容
本发明的目的在于发明一种基于金属硫蛋白融合标签的融合表达载体，丰富和增强人类通过基因工程技术表达、纯化重组目标产物的手段和能力，类似方法在国内外从未见过报道。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
将金属硫蛋白基因置于常用启动子的控制下，在金属硫蛋白基因编码序列之后插入多克隆位点。将目标蛋白基因克隆在多克隆位点中，在金属硫蛋白和目的蛋白质之间设计有常见的蛋白酶位点，以便将目标产物从融合蛋白中释放出来。当金属硫蛋白-目标产物融合蛋白在常用的基因工程表达体系中表达之后，利用金属硫蛋白与二价金属离子的螯合作用，可以采取金属螫合层析的方法对融合蛋白进行纯化，然后利用常见的蛋白酶将目标产物释放和分离。金属硫蛋白也可以作为融合蛋白标签融合在目标产物的羧基端(及目标产物的下游)进行表达，融合表达产物可以利用金属螯合层析方法进行纯化，然后利用常见的蛋白酶将目标产物释放和分离。
本发明的特色在于将金属硫蛋白作为融合标签引入到常用的基因工程表达载体中，其结果可以使得目标蛋白得到了稳定的、可溶的高效表达；而且由于金属硫蛋白本身具有结合金属离子的能力，因此可以作为一种亲和标签用来表达和纯化目标蛋白，并且增加了目标蛋白的稳定性和可溶性，提高了有生物活性的表达产物的产率。
本发明的用途是能够将金属硫蛋白作为一个通用、有效、简便的融合标签应用于常用的基因工程表达体系，提高有生物活性的重组蛋白质的产量，方便了目标产物的分离纯化，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
四、附图说明
图1.重组表达质粒pT7MT示意图。
1：colE1质粒复制起始点；2：Lac I基因；3：T7启动子；4：Ω序列；5：核糖体结合位点及SD序列；6：金属硫蛋白2A基因；7：多克隆位点；8：f1复制起始点；9：氨苄青霉素抗性基因。
图2.重组MT-GST融合蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析。
(A)MT-GST重组蛋白的表达和纯化
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31kDa；
2.经IPTG诱导的pT7MT-GST/BL21(DE3)细胞裂解上清；
3.Ni2+亲和层析纯化的穿过峰；
4.250mM咪唑的洗脱峰。
(B)GST-MT重组蛋白的表达和纯化
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31，17kDa；
2.经IPTG诱导的pTORG-MT/BL21(DE3)细胞裂解上清；
3.谷胱甘肽亲和层析10mM GSH的洗脱峰；
4.Sephadex G-15去除咪唑后的收集峰。
(C)重组MT-GST蛋白和重组GST-MT蛋白表达的比较
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31，17kDa；
2.经IPTG诱导表达的GST-MT细胞裂解上清；
3.经IPTG诱导表达的MT-GST细胞裂解上清。
图3.pET28a-Tn I和pT7MT-Tn I表达的比较和MT-Tn I的纯化
(A)Tn I-His6重组蛋白的表达
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31，17kDa；
2.经IPTG诱导的pET32a-Tn I/BL21(DE3)细胞的总蛋白质；
3.经IPTG诱导的pET32a-Tn I/BL21(DE3)细胞的超声裂解上清；
4.经IPTG诱导的pET32a-Tn I/BL21(DE3)细胞的超声裂解后的包涵体。
(B)MT-Tn I重组蛋白的表达
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31kDa；
2.经IPTG诱导的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)细胞的总蛋白质；
3.经IPTG诱导的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)细胞的超声裂解上清；
4.经IPTG诱导的pT7MT-Tn I/BL21(DE3)细胞的超声裂解后的包涵体。
(C)MT-Tn I重组蛋白的纯化
1.分子量标准蛋白质：自上而下分别为97，66，43，31kDa；
2.重组MT-Tn I蛋白诱导表达后的细胞裂解上清；
3.Ni2+亲和层析纯化获得的重组MT-Tn I。
五、具体实施方式
1.pT7MT的构建：
pT7MT是在pTORG(中国发明专利：ZL01127171.X)原核表达载体的基础上构建的。通过NcoI和BamH1双酶切，原先pTORG载体中的GST编码序列被去除，进而被MT2A的编码序列所取代。通过PCR方法，原来载体中的thrombin酶切位点被factor Xa所取代。
MT2A的PCR模板为人心脏文库(Clontech公司)为模板，PCR引物如下：上游引物：5’-CAT GCC ATG GAC TGC TCC TGC GCC GCC-3’，下游引物：5’-CGGGAT CCC ACG ACC TTC GAT GGC GCA GCA G-3’。扩增获得的MT2A基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收，然后进行Nco I和BamH I双酶切，再与经同样处理后的pTORG连接后，经转化和筛选获得表达载体pT7MT，如图1所示，其序列为：
T7启动子-Lac0-TCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACACAAACAACAAACAACATTACA
Ω前导序列
起始密码子
ATTACTATTTACAATAACAATGGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAA
核糖体结合位点及SD序列
ACAGTATTC-MT2A编码基因-
GGGATCCCCGGGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC
因子Xa识别位点编码序列 多克隆位点
TTGCGGCCGCACTCGAG 
---T7终止子
终止密码子
2.融合表达载体pT7MT-GST和pT7MT-Tn I的构建：
通过PCR扩增得到GST和人肌钙蛋白(Troponin I，Tn I)的编码序列，插入到pT7MT中得到相应的融合表达载体pT7MT-GST和pT7MT-Tn I。GST基因的PCR引物如下：上游引物：5’-CGCGGATCCATGGCCAGCTACCGAC-3’，下游引物：5’-TCCCTCGAGTTATACGACAAAGCGGG-3’；Tn I的PCR引物如下：上游引物：5’-CGCGGATCCAAATGGGAGATGAGGA-3’，下游引物：5’-GCCCTCGAGCTATTGTGAGGTCGGAGA-3’。获得的PCR片段经过BamH I和Xho I双酶切后插入到pT7MT中，经筛选获得MT-GST和MT-Tn I融合表达载体pT7MT-GST和pT7MT-Tn I。同时，我们构建了GST-MT/pTORG表达载体。以人心脏文库(Clontech)为模板扩增得到MT2A基因，引物如下：上游引物：5’-CCGGGATCC TCA TAT GGC CAT GGA-3’，下游引物：5’-CGG CTC GAG TCA CAT TAT TTC ATA GA-3’。将MT2A基因经过BamH I和Xho I处理后、插入到pTORG中获得pTORG-MT。另外一个非融合表达载体pET28a-Tn I由本实验室早先构建并保存[东南大学学报(医学版)，24(1)：36-38，2005]。
3.MT-GST、MT-Tn I和GST-MT重组蛋白的表达：
重组蛋白的表达：挑取单克隆于LB培养基中，37℃，250rpm振摇过夜。第二天按1∶100转接到加有100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃，250rpm振摇3-4小时，直到OD600约1.0左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，总诱导时间4小时，6000rpm离心5分钟收获菌体。
4.MT-GST、MT-Tn I和GST-MT重组蛋白的纯化：
对于MT-GST和MT-Tn I两个蛋白质，将来自1升培养基的总菌体重新悬浮于50ml 50mM PBS，pH8.0，超声30分钟破碎细胞。12000g离心20分钟，分离超声上清。纯化根据His-Select TM HC Ni2+亲和介质(Sigma公司)的使用说明进行。首先将Ni2+亲和介质用平衡缓冲液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)进行平衡，然后将超声上清上样。上样后再用平衡缓冲液(50mM PBS，pH8.0，10mM咪唑)洗至基线，最后用洗脱缓冲液(50mM PBS，pH8.0，250mM咪唑)进行洗脱。洗脱峰组分中的咪唑通过Sephadex G-15凝胶过滤得以去除。最后纯化得到的蛋白冻存于-70℃。
按照GST亲和层析介质的使用方法进行纯化，得到纯化的GST-MT蛋白。来自1升培养基的总菌体重新悬浮于50ml PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4and 2mM KH2PO4；pH 7.4)，超声30分钟破碎细胞。12000g离心20分钟，分离超声上清。然后将超声上清上亲和层析柱。上样后再用平衡缓冲液PBS洗至基线，最后用洗脱缓冲液10mM谷胱甘肽(用50mM Tris-HCl，pH 8.0配制)进行洗脱。
纯化过程中所有组分的蛋白浓度采用BSA为标准品作为参照、用BCA试剂盒进行定量，同时用考马斯亮蓝染色的12％SDS-PAGE进行分析。
我们通过PCR获得了MT2A基因，并将之克隆到pTORG载体中，取代原来的GST得到一个新的表达载体pT7MT(图1)。使用这个载体，我们构建了pT7MT-GST和pT7MT-Tn I表达载体，并表达了MT-GST和MT-Tn I蛋白。转化了pT7MT-GST质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导以后，在分子量34kDa的位置出现一条明显的MT-GST蛋白诱导条带(图2)。经过Ni2+柱亲和层析以后，得到了稳定的、纯度达到87％的MT-GST融合蛋白，产量达到30mg/L培养液。为了便于比较，我们同时也表达并纯化了GST-MT蛋白。诱导表达后的GST-MT在用GST柱亲和层析进行纯化的过程中发生了严重的降解，最后几乎完全降解只剩下GST，因此产量只有1mg/L培养液。通过这两个蛋白的比较表明，放在C端表达很不稳定的MT蛋白，置于N端以后稳定性大大提高，不但没有出现蛋白的降解(图2A)，而且可能由于MT蛋白本身内部结构的稳定性，其表达水平和可溶性都大大提高了(图2C)。
为了表明pT7MT对于其它蛋白的表达同样有效，我们尝试了Tn I的融合表达。根据以前的报道和我们先前的研究表明，Tn I蛋白在大肠杆菌中表达时容易聚集而形成包涵体。我们之前的研究表明，在Tn I蛋白的羧基端加上一个His6-标签进行表达时，蛋白的可溶性仅占全部表达量的10％(图3A)；大量有活性的Tn I蛋白的制备最后是通过体外包涵体变复性的方法获得的(中国发明专利申请号：200410014859.4)。而当我们在Tn I的氨基端加上了MT2A的融合标签后，融合蛋白的可溶性达到了60％(图3B)，通过Ni2+柱亲和层析一步纯化后的产量达到28mg/L培养液(图3C)。这表明MT2A可以作为一种替代的融合表达伴侣提高目的蛋白表达的可溶性和产量，同时还能够方便其纯化。
从上述实例中可以清楚看出，我们以MT2A蛋白为伴侣分子和亲和标签构建了一个新的融合表达载体pT7MT，外源基因在该表达载体中表达时可以得到可溶的、高产的稳定表达。MT2A因为其本身内在的金属离子结合能力，可以作为一种金属螯合亲和层析的融合标签帮助目的蛋白的纯化。
Claims (6)
1.一种基因工程金属硫蛋白融合表达的方法，其特征在于利用金属硫蛋白作为融合标签，和外源基因一起进行融合表达。
2.根据权利要求1所述的一种基因工程金属硫蛋白融合表达的方法，其特征是能够可溶性地、高产地稳定表达目标产物。
3.根据权利要求1所述的一种基因工程金属硫蛋白融合表达的方法，其特征是能够利用金属硫蛋白与金属螯合亲和介质的结合能力、通过金属螯合亲和层析方便地进行目的蛋白的分离纯化。
4.根据权利要求1所述的一种基因工程金属硫蛋白融合表达的方法在基因工程制备、生产重组蛋白质中的应用。
5.一种大肠杆菌基因工程金属硫蛋白融合表达载体pT7MT，其特征在于利用金属硫蛋白作为融合标签，和外源目标基因一起进行融合表达，从而在大肠杆菌中高产、稳定表达可溶性的目标产物，表达的目标产物能够通过金属螯合亲和层析方便地进行分离纯化。
6.一种大肠杆菌基因工程金属硫蛋白融合表达载体pT7MT在基因工程表达和纯化重组蛋白质中的应用。
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