CN1185180A - 哺乳动物细胞中的基因表达 - Google Patents

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Abstract

通过培养携带核酸序列的哺乳动物细胞制备诸如人β－干扰素或人促红细胞生成素这类蛋白质,所述核酸序列包含:(i)一个编码目的蛋白质的编码序列,此序列与一个能在重金属离子存在时指导此编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接;(ii)包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列,此序列与一个能在重金属离子存在时指导此金属硫蛋白基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接;及可任选地含有(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列,与能指导neo基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接。

Description

哺乳动物细胞中的基因表达
本发明涉及哺乳动物细胞中的基因表达，特别是那些体内生物活性受包括特定糖基化的各种因素影响的蛋白质的基因。这类基因的例子有人β干扰素(IFNβ)、人促红细胞生成素(EPO)，人绒毛膜促性腺素、各种其它细胞因子和生长因子以及如Dengue病毒蛋白这种特定的病毒抗原，这些抗原的结构可关系到疫苗的开发。
在此之前，基因已经在哺乳动物细胞系中被大规模表达，特别是按Urlaub等人在美国国家科学院院刊77，4216-4220，1980中表明的方法在缺失二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的突变中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达。已使用过多种表达系统。因此在这些细胞中用于基因表达的多种载体是可得的。通常用于分离表达载体转化细胞的筛选方法基于使用氨甲蝶呤筛选dhfr和靶基因被共同扩增的转化株。
dhfr基因，能使细胞耐受氨甲蝶呤，常常与希望表达的基因一起被掺入载体中。然后在增加浓度的氨甲蝶呤条件下进行细胞筛选。这样因为有越多拷贝数目的细胞能耐受越高浓度的氨甲蝶呤，从而会导致细胞群的每个细胞中存在的dhfr基因数量扩增。随着dhfr基因被扩增，目的基因的拷贝数则伴随dhfr基因拷贝数而增加，由此使得目的基因表达增多。
遗憾的是，据报道在没有进行连续筛选时这些被扩增基因常常是不稳定的(Schimke，生物化学杂志263，5989-5992，1988)。这种不稳定性对现存的CHO dhfr细胞这一表达系统而言是固有的。
多年来，一直使用几个启动子驱动靶基因的表达，如SV40早期启动子、CMV早期启动子和SRα启动子。据称CMV和SRα启动子是最强的(Wenger等，分析生物化学221，416-418，1994)。
在一篇报道中，还使用β-干扰素启动子驱动β-干扰素基因在突变的CHO dhfr细胞中的表达(US-A-5376567)。但是在该系统中，必须通过Tan等人的方法(Tan等，美国国家科学院院刊67，464-471，1970；Tan等人，US-A-3773924)对所筛选的CHO dhfr细胞进行超诱导，以实现较高水平的β-干扰素的生产。在该系统中由CHO dhfr细胞生产的占显著百分量的超诱导β-干扰素没有被糖基化。
小鼠金属硫蛋白基因(mMT1)启动子也曾被用于CHO细胞、BHK和LTK-小鼠细胞(Reiser等，1987，药物研究，37，4，482-485)中β-干扰素基因表达。但是使用这种启动子进行的β-干扰素表达不如用SV40早期启动子在CHO细胞中表达得那么好。并且，由mMT1启动子介导的这些细胞中β-干扰素的表达被重金属诱导。然而重金属对细胞极其有毒，因此放弃了使用该系统。取而代之的方法是，Reiser等人使用CHO dhfr表达系统与SV40早期启动子结合(Reiser等，药物研究，37，4，482-485(1987)和EP-A-0529300)以在由Urlaub等人的方法(1980)衍生的CHO dhfr细胞中生产β-干扰素。
我们现在已在野生型CHO细胞中表达了β-干扰素。使用一载体转染野生型CHO细胞，此载体包含一个在小鼠肉瘤病毒增强子和小鼠金属硫蛋白启动子(MSV-mMT1)控制下的β-干扰素基因、能驱动neo基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的启动子控制下的neo基因和一个具有其自身启动子的人金属硫蛋白基因。首先将细胞暴露于遗传霉素(抗菌素G418)中由此除去缺失neo基因的细胞，然后再将存活细胞暴露于浓度增大的重金属离子中，通过这种方法筛选出能表达β-干扰素的转染细胞。
重金属离子增强β-干扰素基因的MSV-mMT1启动子，由此增加β-干扰素的表达。重金属离子也诱导人金属硫蛋白基因启动子，导致人金属硫蛋白的表达。人金属硫蛋白保护细胞不受重金属离子的毒性影响。重金属离子的存在确保了对细胞的连续筛选，这些细胞含有被整合入其基因组的转染载体，或至少含有β-干扰素基因和人金属硫蛋白基因及其各自的启动子。
已被成功转染的筛选出的细胞表达β-干扰素。当细胞培养于Zn2+存在条件下时，表达水平惊人地提高。与原有的β-干扰素相比，这种β-干扰素具有改善的性质，特别是具有较高的生物利用度。
这些发现具有普遍的适用性。因此，本发明提供了
-一种核酸载体，包含：
(i)一个编码目的蛋白质的编码序列，它与一个能在重金属离子存在下指导该编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
(ii)包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列，它与一个能在重金属离子存在下指导该金属硫蛋白基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；以及
(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列，它与一个能指导neo基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
-携带核酸序列的哺乳动物细胞，该核酸序列包含：
(i)一个编码目的蛋白质的编码序列，它与一个能在重金属离子存在下指导该编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
(ii)包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列，它与一个能在重金属离子存在下指导该金属硫蛋白基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；以及任选地
(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列，它与一个能指导neo基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
-生产这种细胞的方法，该方法包含：
(a)用本发明的载体转染哺乳动物细胞；
(b)将被转染的细胞暴露于遗传霉素中由此除去缺失neo基因的细胞；并且
(c)将承受步骤(a)存活的细胞暴露于浓度逐渐增大的重金属离子中，由此选择所需细胞。
-neo基因和金属硫蛋白基因在单一载体中作为选择性标记的用途；及
-制备目的蛋白质的方法，该方法包含在允许目的蛋白质表达的条件下培养本发明哺乳动物细胞，并回收由此表达的目的蛋白质。
通过将neo基因和金属硫蛋白基因用作一个载体中的两个选择性标记，有可能选择已转化的哺乳动物细胞，如野生型CHO细胞，它们含有被稳定整合入其基因组的表达载体多个拷贝。因此这种筛选系统便于制备和鉴别稳定转化的哺乳动物细胞如野生型CHO细胞，并且避免了对dhfr细胞的需求。转化的细胞能使基因如人β-干扰素基因稳定表达，因为它们含有被稳定整合入其基因组的这些基因的多个拷贝，通常至少20-100个拷贝或更多。
另外，在筛选步骤中使用相对高浓度的Cd2+(达200μM)能除去无意产生的微生物污染物如支原体，它们可能会在组织培养步骤中与转染细胞结合。因此，本发明使转染细胞中含微生物污染物的可能性减到最小。
而且，与过去曾使用的强启动子系统相比，本发明的一个特殊的启动子/增强子系统表达水平出人意料地显著提高。这一启动子/增强子为MSV-mMT1，它包含在小鼠肉瘤病毒(MSV)增强子上游侧翼小鼠金属硫蛋白基因1(mMT1)。
金属硫蛋白基因启动子，特别是结合的MSV-mMT1启动子/增强子系统能与目的基因如人β-干扰素基因或人促红细胞生成素基因可操纵连接。包含这种排列的载体能在野生型CHO细胞中获得基因产物的高水平表达。因此，本发明人已经鉴别出一个新的、意料不到的强大的表达系统，适于应用在哺乳动物细胞，特别是野生型哺乳动物细胞中。表达产物如人β-干扰素和人促红细胞生成素可具有出人意料的/新的生物学性质，如较高的生物利用度。这些性质能使产物具有较高的效力/其它用途。
因此，根据本发明，在野生型哺乳动物细胞中如野生型CHO细胞中大量表达基因如β-干扰素基因及其它基因并且以稳定方式进行表达，无需进行连续筛选和依赖于CHO dhfr-氨甲蝶呤选择系统，这是可能的。本发明能应用于多种哺乳动物细胞。这种方式能使合适靶基因的表达具有糖基化形式和对所用细胞类型特有的细胞环境。
本发明的载体是一个表达载体。它包含三个能在哺乳动物细胞中表达的序列。因此本发明载体包含：
(i)一个包含要表达的目的基因，如人β-干扰素基因的编码序列；
(ii)一个包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列，金属硫蛋白基因赋予了表达目的基因的哺乳动物细胞对重金属离子如镉、铜和锌的抗性；和
(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列，neo基因赋予了表达基因的转化的细菌细胞对抗菌素卡那霉素的抗性，并赋予了表达基因的哺乳动物细胞对遗传霉素的抗性(抗菌素G418)。
这三个序列中每个序列一般都与控制它们表达的其它元件相结合。关于每个序列，通常存在下列元件，从5′至3′排列：指导序列表达的启动子和启动子的调节子或无此调节子、翻译起始密码子、编码/标记序列、聚腺苷酸信号和转录终止子。并且，编码序列和/或每个标记序列或两个标记序列可以与增强子可操纵连接或不连接，增强子使启动子控制下所得的表达增强。合适的增强子包括Rous肉瘤病毒(RSV)增强子和小鼠肉瘤病毒(MSV)增强子。
另外，本发明的载体一般包含一个或多个复制起点，例如细菌复制起点，象pBR322起点，它允许在细菌细胞中的复制。或者，在载体中可包括一种或多种真核细胞复制起点，这样便可能在酵母细胞和/或哺乳动物细胞这类细胞中进行复制。
此载体还可以包含一个或多个内含子或编码序列3′或5′端的非编码序列或一个或多个标记序列。这种非编码序列可以来自任何一种生物体或可以在自然界合成的。因此它们可具有任意序列。只要这些序列能增强或不损伤编码序列或标记序列的正确表达，即可包括这些序列。
在本发明载体中，编码序列和标记序列均可与能指导它们在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接。或者，一个或多个这些启动子也可在其它细胞中指导表达，例如非哺乳动物真核细胞，如酵母细胞或昆虫细胞和/或原核细胞。“可操纵连接”是指一种并列位置，其中启动子和编码/标记序列间的关系使编码/标记序列在启动子控制下被表达。因此，在启动子和编码/标记序列间可以存在如5′非编码序列这类元件。如果这类序列增强或不损害启动子对编码/标记序列的正确控制，那么它们可被包含在构建物中。
在重金属离子如Cd2+、Cu2+和Zn2+存在下能在哺乳动物细胞中增强表达的任意启动子与编码序列可操纵连接。合适的启动子为金属硫蛋白基因启动子。优选小鼠金属硫蛋白基因I(mMT1)启动子。
编码序列的合适的启动子/增强子结合物包括上游与MSV增强子相接的mMT1启动子(MSV-mMT1)和RSV增强子与MMTV启动子的结合物。优选MSV-mMT1。
类似地，在重金属离子如Cd2+、Cu2+和Zn2+存在下能增强哺乳动物细胞中表达的任意启动子可以与金属硫蛋白基因如人金属硫蛋白基因可操纵连接。优选标记基因序列是人金属硫蛋白基因，如人金属硫蛋白基因IIA，它具有自身的启动子。
第二选择性标记基因是neo基因。多于一种类型的这种基因存在于自然界中：任意特定的neo基因均可用在本发明载体中。一种优选的neo基因是大肠杆菌neo基因。
neo基因的启动子能指导基因在哺乳动物细胞中的表达。合适的启动子是巨细胞病毒(CMV)早期启动子、SV40启动子、小鼠乳腺瘤病毒启动子、人延伸因子1α-P启动子(EF-1α-P)、SRα启动子和如mMT1金属硫蛋白基因启动子。启动子还能在细菌如大肠杆菌中表达neo基因，其中可构建本发明载体。
由neo基因赋予的抵御抗生素的这种保护作用从表达的neo基因即会赋予细胞抗生素抗性这种意义上讲是定性的，而由金属硫蛋白基因赋予的抵御重金属的这种保护作用是定量的。细胞中金属硫蛋白基因的表达水平越高，细胞对重金属离子的抗性越强。因此，金属硫蛋白基因拷贝数高的细胞会对重金属具有高抗性。
所以，含有许多拷贝本发明载体的细胞比含有一个或几个拷贝的细胞具有更高的重金属抗性。因此，通过将细胞暴露于浓度逐渐增加的重金属中筛选具有高拷贝数本发明载体(因而具有高拷贝数编码基因如人β-干扰素)的转染细胞，这是可能的。由此，筛选出含本发明载体拷贝数逐渐增多的细胞。
因此，本发明载体中发现的选择性标记的组合允许两步筛选法筛选目的转染细胞。首先，细胞被暴露于遗传霉素(抗菌素G418)中，这样会除去缺失neo基因因而同时也缺乏本发明载体的细胞。此步之后，neo基因不再起作用。
其次，使用水平逐渐提高的重金属离子完成筛选，这样筛选出具有载体多个拷贝的细胞，特别是具有整合入其基因组的多个拷贝的细胞。在该选择法中，经受高浓度重金属离子而存活下来的细胞高度表达金属硫蛋白，例如，因为它们包含大量的本发明载体和/或因为载体或已整合入其基因组的载体处于增强表达的染色体位置上。
可以使用任意合适重金属离子。由此，可以使用对本发明细胞有毒的任意重金属离子，其中表达的金属硫蛋白基因赋予了该细胞保护作用。例如，可使用锌离子(Zn2+)、铜离子(Cu2+)或优选镉离子(Cd2+)。为完成筛选，可使用重金属离子的浓度从5至100、甚至达200μM。浓度为130至170μM、优选约150μM Zn2+是合适的。
为使用重金属离子完成筛选，这些离子可以盐的形式提供，即与任意合适平衡离子结合如硫酸盐或氯化物。
因为被选择的细胞对重金属毒性具有抗性，抗性发生时重金属离子是编码序列启动子的诱导剂，所以通过重金属离子如作为启动子诱导剂的130至170μM Zn2+能使目的蛋白质的表达最大化。
除neo和金属硫蛋白基因外，载体还可含有一个或多个其它选择性标记基因，如用于鉴别细菌转化体的氨苄青霉素抗性基因。
在本发明载体中，核酸可以是DNA或RNA，优选DNA。载体可以是任意类型的表达载体。当然载体必须与要转染的哺乳动物细胞相容。载体可以呈线性或环形。例如，载体可以是质粒载体，通常为DNA质粒。优选的质粒载体是pMMTC(实施例2；图2)。
本领域技术人员能够从广泛可得的载体开始制备合适的载体，起始载体一般是通过基因工程技术如按Sambrook等人所述的方法，(分子克隆：实验指南；1989)进行修饰的。至于考虑到质粒载体，合适的起始载体是pRSN质粒(Low等(1991)：JBC 266；19710-19716)，可广泛获取该质粒。另外一个合适的质粒起始载体是pBR322。
本发明的载体可以将其部分核苷酸序列或全部核酸序列整合入宿主细胞基因组中或它们的核酸序列在宿主细胞中可以是游离的。优选整合型载体。这是因为它们能给出编码序列如人β-干扰素基因的稳定表达。
转染哺乳动物细胞可以是BHK、COS、VERO、人成纤维细胞样细胞如C10、Hela或人淋巴母细胞样细胞或人肿瘤细胞系细胞。但是优选这些细胞是CHO细胞，尤其是野生型CHO细胞。
所需要的是，转染细胞将具有被整合入其基因组的一个完整的本发明载体或载体的一部分。这类细胞是优选的，因为它们使包含在载体中的编码序列稳定表达。优选完整载体的一个或多个拷贝是被整合的，同时具有多个整合的载体拷贝如20至100个拷贝或更多拷贝的细胞是特别优选的，因为这些细胞使包含在载体中的编码序列高水平稳定表达。但是，本发明也包括在其基因组中整合有本发明载体不完全部分的细胞，条件是，整合的载体部分能使细胞表达编码序列并根据上述方法通过使用重金属能筛选细胞，从这个意义上讲，如果这些细胞的功能等同于在其基因组中整合有完整载体的细胞。因此，如果被整合的一个元件或多个元件包括可操纵连接有其相关启动子的编码序列和可操纵连接着其相关启动子的金属硫蛋白标记序列，那么本发明包括整合有本发明载体一部分的细胞。
可通过任意合适的方法转染细胞，如Sambrook等人描述的方法分子克隆实验室指南，1989。例如含有本发明核酸序列的载体可被包装入感染性病毒颗粒，如逆转录病毒颗粒。可以通过电穿孔、磷酸钙沉淀或通过将裸核苷酸载体在溶液中与细胞接触将载体导入。优选的转染方法包括Low等人描述的方法(生物化学杂志266；19710-19716；1991)。
本发明还提供了由本发明载体中编码序列编码的蛋白质的制备方法。该方法包括将本发明载体转染的细胞培养于允许编码序列表达的条件下，并回收由此生产的蛋白质。可由这种方法生产的蛋白质优选包括干扰素，如人干扰素。优选β-干扰素，更优选人β-干扰素。其它蛋白质有白细胞介素(如白介素-12)、人绒毛膜促性腺激素、生长因子、人生长激素和人促红细胞生成素、细胞膜成分、病毒蛋白以及其它生物医学相关的蛋白质。
被筛选的细胞可以培养在本领域所知的任意合适的条件下，依据细胞类型和被生产的蛋白质类型这些条件可以各不相同。用于编码序列的启动子可以是组成型启动子，这样由编码序列编码的蛋白质在重金属离子不存在时被表达。但可以在重金属离子存在时，特别是重金属离子量对细胞无毒时培养细胞。这样可得到所需蛋白质的较高水平的表达。
培养基中重金属离子的浓度通常为100至200μM。因此可在100至200μM选自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金属离子存在下如130至170μM重金属离子存在下培养细胞。使用浓度约150μM，特别是重金属离子为Zn2+时。Zn2+的使用对β-干扰素和促红细胞生成素的生产产率具有有益的效果。我们出人意料地发现人β-干扰素的生产被提高了2至3倍，人促红细胞生成素的生产被提高了3至5倍。
可通过本领域任意已知方法回收所生产的蛋白质，并且依据使用细胞的类型、培养条件和生产的蛋白质类型，回收方法可以各不相同。回收后需要将生产的蛋白质纯化。由此可获得基本纯的蛋白质。
本发明能提供新型人β-干扰素。此β-干扰素高度唾液酸(Sialylation)化。正如由原代二倍体人成纤维细胞生产的天然人β-干扰素一样，它被很好地糖基化。然而它比天然β-干扰素或在大肠杆菌生产的重组β-干扰素(betaseron)具有更高的生物利用度。
β-干扰素的较高的生物利用度可被特征化。当在约2kg的家兔背部皮下注射1.5×106国际单位(I.U.)的干扰素时：(a)1小时后在家兔血清中可检测出≥128 I.U./ml的干扰素，和/或(b)5小时后在家兔血清中可检测出≥64I.U./ml的干扰素。
通常在1小时后观察到干扰素的最高水平。因此，根据(a)，1小时后在家兔血清中可检测出128至256 I.U./ml如140至190I.U./ml的干扰素。根据(b)5小时后，在家兔血清中检测出≥70I.U./ml如≥80I.U./ml的干扰素。通常根据(b)，可检测量为60至120I.U./ml如80至110I.U./ml范围内的干扰素。
另外或者，可用比活性描述干扰素特征。它具有的比活性是4.8×108至6.4×109I.U.每毫克当量的牛血清白蛋白。比活性可以从5×108至6×108如5.2×108至5.8×108如5.3×108至5.5×108I.U.每mg当量牛血清白蛋白。
可将比活性参照一标准，特别是美国NIH的过敏及传染病国家研究院颁布的Gb23-902-531标准。根据改进的Armstrong法(1971)确定比活性，其中在病毒激发中包括0.2μg/ml的放线菌素D，并直接读数病毒诱导的C.P.E.。分析细胞为MRC-5成纤维细胞。
还可用下述一种或多种性质描述此β-干扰素特征：
1.通过15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的本发明β-干扰素表观分子量一般为26,300。
2.当以一个干净的静脉内丸注射家兔，干扰素的半衰期通常在12至15分钟，如约13分。将丸注入家兔耳静脉，从家兔耳动脉取血样，根据改进的Armstrong法(1971)分析兔血清抗病毒活性。
3.在人肝胚细胞瘤细胞系(HepG2)中该干扰素抗病毒活性至少等于且通常约为1.5倍的来自原代二倍体人成纤维细胞的天然β-干扰素活性。在保护Hep2细胞不被病毒激发中，此干扰素还比betaseron效力多2.2倍。根据改性的Armstrong(1971)法再次确定抗病毒活性。在HepG2细胞内抗病毒活性的确定中省去放线菌素D。
与本发明β-干扰素结合的寡糖也可以是β-干扰素的特征。β-干扰素带有可用下述一个或多个特点描述的寡糖。
1.中性(无酸性取代基)：5至15％，优选约10％。
酸性：95至85％，优选约90％。
2.总的去唾液酸化(desialylated)寡糖收集池为异质的，收集池中至少有6个不同结构的成分。
3.基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱和高分辨凝胶渗透色谱数据总结如下：
  实测质量         组成   计算质量    gμ当量
    1786.2     5Hex4HexNAc，12AB，Na     1782     11.1
    1929.9     5Hex，1dHex，4HexNAc，1  2AB，Na     1928     12.2
    2295.5     6Hex1dHex，5HexNAc1  2AB，Na     2293     14.5
    2660.1     7Hex1dHex，6HexNAc1  2AB，Na     2658     17.6
    3019.1     8Hex1dHex，7HexNAc1  2AB，Na     3023     20.7
本发明β-干扰素的糖基由二、三或四触角复合物型(artennarycomplex)N-连接的寡糖组成。这些寡糖包含(多个)重复的乳糖胺。约30至80％如35至60％或35至50％的寡糖是二触角寡糖(bi-antennary oligo saccharides)。约15至65％如25至60％或25至40％的寡糖是三触角寡糖。约5至55％如15至45％或20至40％的寡糖是四触角寡糖。
本发明β-干扰素显示出抗病毒活性、细胞生长调节剂活性和调节胞内酶生产及其它由细胞产生的物质的能力。因此，β-干扰素可被用于治疗各种病毒和肿瘤疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性脑炎、病毒性肺炎、病毒性疣、AIDS/鼻咽癌、肺癌、黑素瘤、CML肾细胞癌和脑肿瘤以及如多发性硬化、血管瘤、颈上皮肉瘤形成。
根据使用的特殊给药形式，含本发明β-干扰素作为主要活性成分的药物组合物通常用合适的药学上可接受载体或稀释剂配制。例如，非肠道制剂一般是可注射的液体，使用药学上和生理学上可接受的液体如生理盐水、平衡盐溶液等作为载体。另一方面，口服制剂可以是如片剂和胶囊这种固体或液体溶液或悬浮液。本发明干扰素一般被配制为单位剂量形式，每剂含104至109I.U.，更常见的含106至107I.U.。
可以各种形式给人服用干扰素，如以口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮内和皮下形式给药。治疗医生通过考虑病人的详细情况，所患疾病及病况，选择出给药的具体方式和剂量制度：例如治疗病毒性感染通常使用一日量或二日量，治几天至几周；而肿瘤或癌症的治疗则包括一日量或多日量，治数月或数年。
此干扰素可以与其它治疗方法结合，可以与其它化学治疗药物或化学预防药物结合或相连使用，以提供对病毒感染、肿瘤或其它疾病有效的疗法。例如，在治疗疱疹病毒角膜炎中，已在热烙术，清创术和三氟胸苷疗中补充了干扰素疗法。
下面的实施例说明本发明。附图中：
图1显示了用各种不同启动子控制下的DPPIV序列转染的CHO细胞进行的免疫印迹分析结果；
图2至4是载体质粒pMMTN、pMMTC和pBPV的图谱；
图5(a)是纯化的GS38-IFNβ的SDS-PAGE(15％)分析结果。分子量标记来自BioRad(California)以kda表示标记的分子量。泳道1、2和3中的GS38-IFNβ分别为0.8×106I.U.0.2×106I.U.和1.1×106I.U.。泳道a、b、c、d、e和f中牛血清白蛋白的量为5μg、3.5μg、2.5μg、1.5μg、0.5μg和0.25μg。
图5(b)是纯化的GS38-IFNβ的Western印迹结果。将原代人二倍体成纤维细胞生产的纯化IFNβ(泳道1和2)和GS38-IFNβ(泳道3和4)进行SDS-PAGE(15％)。然后将蛋白质在硝酸纤维素膜上印迹，并以抗-IFNβ单克隆抗体(Accurate Chem，New York)探测。各泳道中IFNβ活性值即在1、2、3和4泳道为0.1×105、0.05×106、0.14×106和0.56×106I.U.。以kda表示的分子量示于图中，
图6是与GS38-IFNβ结合的寡糖的hplc阴离子交换色谱图；
图7是GS38-IFNβ结合寡糖在用神经氨酸酶处理后的hplc阴离子交换色谱图；
图8是GS38-IFNβ结合寡糖的高分辨凝胶渗透色谱图；
图9是通过MALDI-TOF质谱释放出的脱酸聚糖的分子量分布。
图10(a)是家兔经皮下注射由GS38细胞(◆)、原代人二倍体成纤维细胞(■)或大肠杆菌〔betaseron(▲)〕生产的IFNβ0.7×106I.U.后，IFNβ的血清水平。被注射家兔的体重约1.5kg。
图10(b)是家兔经皮下注射由GS38细胞(◆)、原代人二倍体成纤维细胞(■)或大肠杆菌〔betaseron(▲)〕生产的IFNβ1.5×106I.U.后，IFNβ的血清水平。被注射家兔体重约2.0kg。
图11是家兔(约2kg)经静脉注射由GS38细胞(◆)、原代人二倍体成纤维细胞(■)或大肠杆菌〔betaseron(▲)〕生产的三种不同IFNβ0.7×106I.U.后，IFNβ的血清水平的衰减。
图12是皮下注射GS38-IFNβ的剂量对循环GS38/IFNβ的血清水平的剂量效应。皮下注射1.2×106I.U.(◆)、2.5×106I.U.(■)和10.1×106I.U.(▲)的GS38 IFNβ，家兔(2kg)中GS38产IFNβ的血清水平。
图13为含EPO而非IFNβ基因的新载体转染野生型CHO细胞中人促红细胞生成素的表达。已表明克隆的细胞(泳道1至14)接种于35mm(直径)的培养皿中。汇合时，向每一个培养皿中均加入1ml培养基并培养24小时。收集培养基，每种取10μl与对照样50ng的人促红细胞生成素(泳道15)一起通过SDS-PAGE进行分离，使用Amersham ECL探测系统通过Western印迹分析。实施例1
MSV-mMT1作为用于野生型CHO细胞中强启动子的鉴定
对比了5个启动子/增强子系统的强度。它们是：
-在小鼠肉瘤病毒增强子上游侧翼的小鼠金属硫蛋白基因1启动子(MSV-mMT1：mMT1由Glanville等人(1981)于自然292，267-269中描述；MSV由Dhar等人在美国国家科学院院刊77，3937-3941中描述)；
-巨细胞病毒早期启动子(CMV)；
-RSV-SV40(Rous肉瘤病毒〔RSV〕增强子和SV40早期启动子的融合基因)；
-RSV-小鼠乳腺瘤病毒长末端增强子/启动子(RSV-MMTV)；和
-SR-α启动子(Yutaka Takebe等人(1988)，分子细胞生物学8，466-472)。
为进行上述对比，在各自的表达载体中克隆入编码全长二肽基肽酶IV(DPPIV)的EcoRI-XhoI cDNA(Hong和Doyle(1988)，生物化学杂志263，16892-16898)，这样DPPIV的表达分别受控于MSV-mMT1，CMV、RSV-SV40、RSV-MMTV或SR-α。
对于MSV-mMT1，DPPIV片段被插入到pMMTN载体(图2)的XhoI-NotI位点；对于CMV此片段被插入到pXJ41neo载体(Zheng和Pallen(1992)；自然，359，336-339)的EcoRI和XhoI位点；对于RSV-SV40，参见Low等人(1991)的生物化学杂志，266，19710-19716；对于RSV-MMTV，此片段被插入到pMAMneo载体(来自Clontech：目录号6104-1；由Lee等人(1981)，自然，294，228和Sardet等人(1989)；细胞杂志，56，271中描述)的NhoI-XhoI位点；对于SR-α，此片段被插入到pSRalpha/neo载体(YutakaTakebe等人(1988)分子细胞生物学8，466-472；Nilsson等人细胞生物学杂志120，5-13，1993)的XhoI-BamHI位点。
将每个表达载体转染入CHO细胞，且收集稳定转染的细胞用于每个载体。然后利用免疫印迹分析，通过DPPIV蛋白质水平测量每一个表达载体的长度，所探测DPPIV的量表示出每个表达系统的长度。
根据Hong等人(1989)生物化学28，8474-8479所述方法，进行这些转染细胞中探测DPPIV的免疫印迹分析。简单来说，用Tris缓冲盐水(TBS)(20mM Tris，pH 7.2，150mM NaCl)洗涤细胞，然后用有1mM PMSF的TBS中1％的Triton X-100进行提取。离心清除提取物中细胞碎片。用BSA盒(Pierce Chemical Co.)确定提取物中蛋白质浓度。
用SDS-PAGE分离从各个转染细胞提取的约100μg的蛋白质，然后根据上述方法(Hong等人(1989)生物化学28，8474-8479)通过免疫印迹进行分析。示于图1的结果表明，MSV-mMT1表达系统(泳道2)比现存的广泛使用的系统强得多。实施例2描述质粒pMMTC
根据上述方法，使用MSV-mMT1构建一个强力表达载体pMMTC，以驱动结合两个选择性标记(用于转染细胞的neo基因和用于细胞的人金属硫蛋白基因，已在细胞基因组中整合有多个拷贝载体)的外源基因的表达。
pMMTC(图3)是哺乳动物细胞表达载体。被表达基因被克隆入XhoI和/或NotI位点，由此，基因的表达受含小鼠肉瘤病毒增强子(MSV)和小鼠金属硫蛋白基因1启动子的控制区(MSV-mMT1)驱动。SV40剪接区和聚腺苷酸化位点，用来终止转录，并确保转录后事件的正确控制。
细菌的neo基因上游与SV40复制起点和SV40早期启动子连接，下游与SV40剪接区和聚腺苷酸位点连接。此neo表达单元赋予了转染的哺乳动物细胞对遗传霉素(G418)的抗性，也赋予了被转染的大肠杆菌对卡那霉素的抗性。
pSR322复制起点(Ori)用作大肠杆菌中质粒DNA的自主复制的起点。赋予哺乳动物细胞重金属离子如Cd2+抗性的人金属硫蛋白结构基因IIA被用来筛选含整合的质粒多拷贝的哺乳动物转染株。哺乳动物表达载体pMMTC的构建
用限制酶BamHI切割质粒pRSN(Low等，生物化学杂志266，19710-19716，1991)，并用琼脂糖凝胶电泳分离。约2685bp的DNA片段被凝胶纯化。此BamHI片段包含用于哺乳动物细胞和大肠杆菌中的大肠杆菌neo基因的表达单元。
用限制酶BamHI切割质粒pBPV(Phamacia：产品号27-4390；见图4及以下的详细描述)，然后用小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)处理。在用琼脂糖凝胶电泳分离后，约4570bp的BamHI片段被凝胶纯化。该4570bp片段包含大肠杆菌中pBR322复制起点、氨苄青霉素(Amp)抗性基因及一个由小鼠肉瘤病毒增强子和小鼠金属硫蛋白基因1启动子、随后是多克隆位点和SV40剪接接头和聚腺苷酸化信号组成的表达盒。
此4570bp片段与上述2685bp BamHI片段相连接。所得质粒称为pMMTC(图2)。用Hind III切割质粒phMT(Karih等(1982)：自然299，797-802)，并用DNA聚合酶I的Klenow片段使末端平齐，含人金属硫蛋白基因IIA的3100bp片段被凝胶纯化。用ScaI(它在氨苄青霉素抗性基因内)切割质粒pMMTN，用CIAP处理，然后与获自phMT的3100bp片段连接。
这样连接的产品被转化入大肠杆菌。进行卡那霉素抗性(由neo基因赋予)和氨苄青霉素敏感性(由于3100bp片段插入氨苄青霉素抗性的结构基因)的筛选。通过限制酶消化确定最终的质粒构建物，并称之为pMMTC。pMMTC长度约10350bp。
基因学(Geneology)：pBPV(12516bp)
(核苷酸编号参照参考文献中编号)
·MSV增强子(388bp)
Dhar.R.等，美国国家科学院院刊77，3937(1980)，
Nuc529-142
·BamHI/BglII接头CCGGATCTG
·金属硫蛋白启动子的5′末端(295bp)
Nuc1-295
·金属硫蛋白启动子的3′末端(368bp)
Glanville，N.等，自然292
267(1981)
Nuc300-68
·多克隆位点和来自构建物CTCGAGCCGCGGCCGCTTCAGG的附
加核苷酸
·SV40小T-抗原剪接(612专利公报号)及聚腺苷酸化(235
专利公报号)信号Buchman，A.R.等DNA Tumor Viruses
(DNA肿瘤病毒)，Cold Spring Habour Laboratory(冷泉
港实验室)，pg799(1980)，
Nuc4713-4102和2772-2538
·BPV基因组(7945bp)
Chen E.Y.等，自然299，529(1982)
Nuc4451-7945和1-4450
·pML2：pBR322衍生物，缺失1095至2485间(2632bp)的碱
基
(1)Balbas，P.，等基因50.3(1986)
(2)Sarvor.N.等美国国家科学院院刊79，7147(1982)
Nuc376-1095，2485-4363和1-33
·BgIII/BamHI接头GAGATCCGG实施例3
在pMMTC中人β-干扰素表达DNA的插入
通过PCR用两个寡核苷酸从人基因组DNA中钓出β-干扰素编码序列。5′寡(GGGGTACCATGACCAACAAGTGTCTCCTC)以此种方式修饰，使得含起始ATG密码子的序列(CCACCATG)利于高效的翻译起始(Kozak(1984)：NAR12，857-872)。3′寡序列为GGAATTCTTCAGTTTCGGAGGTAACCTGT。将这种修饰的)β干扰素表达序列插入到pMMTC XhoI和NotI位点。通过限制图谱，PCR或测序来确定插入和正确的方向。所得质粒称为pMMTC/IFNβ。实施例4
组成性分泌高水平的功能人β-干扰素的CHO细胞克隆的建立
根据所述方法(Low等，生物化学杂志266；19710-19716，1991)用pMMTC/IFNβ转染CHO细胞。在G418(800μg/ml)中筛选细胞7-10天，以使稳定转染的细胞生长。然后，细胞在含50-100μMZn2+离子的培养基中温育24至48小时，以诱导人金属硫蛋白的表达，接着在具有逐步增强浓度的Cd2+(终浓度200μM)培养基中温育。将单个菌落克隆并扩大培养。克隆细胞的培养基中积累β-干扰素，至浓度为106I.U./ml或更多，106个细胞在近24小时内分泌了106I.U.或更多的β-干扰素。实施例5
在CHO细胞中生产人β-干扰素
野生型中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1系(ATCC CCL-61)在含10％胎牛血清的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中增殖。细胞生长于37℃5％二氧化碳的空气中。用pMMTC/IFNβ质粒转染这些细胞以组成分泌高水平的功能人β-干扰素。根据上述实施例4的方法筛选细胞。
在用Cd2+筛选过程中，测量转染细胞克隆的β-干扰素抗病毒活性，以显示它们组成性分泌高水平的功能性人β-干扰素。根据改进的Armstrong法(Armstrong应用微生物学21，723，1971)，通过在病毒激发中加入0.2μg/ml的放线菌素D并与病毒诱导的C.P.E.直接反应，测量抗病毒活性。通过这些测量，分离出单个菌落并扩大培养。事实上，发现几个细胞系生长于塑料瓶中时能产生106I.U./ml至107I.U./ml的β-干扰素。
将这些细胞系中的一个GS38保持培养12个月，以测试其保持生产一致的高水平β-干扰素的能力。将GS38细胞系保持在塑料培养瓶(80cm2)中的DMEM中，DMEM含10％胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2.5μg/ml两性霉素和150μM硫酸锌(“正规培养基”)。通过向一个1700cm2滚瓶中加入一烧瓶GS38细胞培养物进行滚瓶接种，且细胞保持在200ml正规培养基中。
在第2天和第4天弃去滚瓶中的培养基，并且每次补充200ml新鲜的正规培养基。第6天，将此正规培养基弃去，在滚瓶中补充300ml无血清DMEM培养基，它含2.5mg/ml人血清白蛋白，所述人血清白蛋白中含表1所列的一系列附加成份(“无血清培养基”)。表  1
成份                                  浓度
青霉素                              100μg/ml
链霉素                              100μg/ml
兼性霉素B                           2.5μg/ml
ZnSO4                              150μM
EX-CYTE(商标)*                     1∶1000
转铁蛋白                            2.5-5.0μg/ml
胰岛素                              5μg/ml
* EX-CYTE是一种来自人血清的水溶液补充液体，由Bayer，Illinois USA出售。
第7天，弃去无血清培养基，重新补充300ml无血清培养基。第8天，再将无血清培养基弃去，并重新补充300ml无血清培养基。第9天，收集无血清培养基(300ml)，并又补充300ml无血清培养基，每天重复这一收集步骤，再进行14天。
从每一滚瓶中收集总量约4.2升的GS38产β-干扰素(或GS38-IFNβ)。从每ml来自GS38细胞的粗收集物获得24×106至3.6×106I.U.的β-干扰素。这相当于每天从一滚瓶GS38细胞中获得1.35mg至2mg的GS38-IFNβ，每天从1升粗收集物中获得5mg至6.7mg GS38-IFNβ。以Gb23-902-531标准(由国立过敏与传染病研究所，NIH，USA颁布的NIH参考标准)为准，此粗GS38-IFNβ，当纯化至均一时，比活性为5.37×108I.U./ml蛋白(牛血清白蛋白)。
合并GS38-IFNβ粗收集物，并结合使用亲和柱和离子交换柱将此收集物进行色谱纯化(Tan等，生物化学杂志，254，8067-8073，1979；Edy等，252，5934-5935，1977；Knight等美国国家科学院院刊73，520-523，1976)。得到纯的GS38-IFNβ，回收约70-80％。按下述均一性标准，经分析发现此纯的GS38-IFNβ是均一的：
-在SDS-PAGE(15％)上发现表观分子量为26,300的单一分子物质(图5a)。这与Tan等人(1970和1973)利用原代人二倍体包皮成纤维细胞在超诱导步骤后生产的天然β-干扰素的分子量相似(见图5b)。注意，从BIO-RAD获得的宽范围分子量标记与我们及他人先前报道所用的标记稍有不同。由Western印迹证明这些β-干扰素(GS38-IFNβ和人成纤维细胞产β-干扰素)的性质属于平均分子量为26,300的单一物质。
-当进行phlc(Hewlett Packard 1090)C18柱色谱时，物质的蛋白质峰与干扰素抗病毒活性直接相关。
-进行氨基酸测序时，物质具有β干扰素序列。
发现培养12个月的GS38细胞生产的GS38-IFNβ量没有很大变化。在整个过程中，细胞生产GS38-IFNβ量为2.35至3.6×106I.U./ml。
分析了GS38-IFNβ的五种生物活性。按Tan等人(1970)的超诱导法另外在超诱导前用100I.U.的β-干扰素激活细胞16小时，从早期至中等传代的初级人包皮成纤维细胞生产出来自下述初级人成纤维细胞的β-干扰素。所得β-干扰素用亲和层析纯化。分析测定的5种活性为：
1.在改进的Armstrong(1971)法后的人MRC5成纤维细胞或人肝胚细胞瘤细胞系(hepG2)上分析β-干扰素的抗病毒活性。据在MRC5人成纤维细胞上进行分析，参照NIH β-干扰素标准，GS38-IFNβ的比活性为5.37×108I.U./mg蛋白质。HepG2细胞中GS38-IFNβ的抗病毒活性与来自人成纤维细胞的天然β干扰素的活性至少相等或高1.5倍。GS38-IFNβ在保护HepG2细胞免受病毒VSV激发中有效性比betaseron(产自大肠杆菌的重组人β-干扰素)也高约2.2倍。
2.根据用于初级人细胞所述但是是应用于HepG2细胞上的方法进行人肝胚细胞瘤细胞上β-干扰素的细胞生长抑制分析(Tan，自然260，141-143，1976)。但是，在含1ml正规培养基和初始HepG2细胞数为3至5×104细胞/孔的2cm2孔中进行此项分析。因此，GS38-IFNβ与使用相同方法体外测量的天然原代人二倍体成纤维细胞β-干扰素在抑制HepGI细胞生长中的效果一样。
3.在家兔身上进行皮下注射β-干扰素的药代动力学实验。将来自GS38或初级人成纤维细胞纯化的β干扰素或来自大肠杆菌的betaseron分别重新置于pH 7.0含20mg海藻糖的1ml磷酸缓冲盐水(0.15MNaCl)4mg人血清白蛋白中。分别在体重为约1.5kg和约2kg的患白化病的家兔背部皮下注射0.7×106或1.5×106I.U.的干扰素。
在15分钟、30分、1h、2h、3h、4h和5h从家兔上取全血。然后根据改进的Armstrong法(1971)分析取血血清的β-干扰素抗病毒活性。图10(a)和(b)中所示结果表明GS38-IFNβ比初级人成纤维细胞生产的β干扰素和betaseron具有更高的生物利用度。
在家兔中注射1.5×106I.U.的GS38-IFNβ，1小时后观察到血清中GS38-IFNβ的最高水平(128-256 I.U./ml)，观察到GS38-IFNβ的显著水平(64-128I.U./ml)至少5小时。这是出人意料的。通常已知皮下或静脉注射人β干扰素会导致无血清水平或低血清水平的循环人β干扰素。
4.在家兔身上还进行了β干扰素干净静脉丸的药代动力学。约等于β干扰素0.7×106I.U.的各种β-干扰素1ml(GS38-IFNβ，初级人成纤维细胞生产的干扰素和大肠杆菌betaseron)被注射入家兔耳静脉，在5分、10分、15分、30分和90分取血(500μl)。按Armstrong(1971)的改进方法分析测定血清的β-干扰素抗病毒活性。结果示于图11，与初级人成纤维细胞产的β-干扰素(t1/2＝4.4分)或betaseron(t＝3.8)相比，GS38-IFNβ的半衰期为13.6分钟，按标准方法学，将注射的β-干扰素总量除以血体积评估出β干扰素在0时刻的初始浓度。假设血体积是家兔体重的5％，衰减至此初始浓度50％时的对间为t。
5.我们研究了GS38-IFNβ注射量增加的剂量效应。对约2kg的家兔皮下注射增加量的GS38-IFNβ，具体数值为1.2×106I.U.、2.5×106I.U.和10.1×106I.U.的GS38-IFNβ。图2的结果表明，皮下注射增加剂量的GS38-IFNβ，在被注射的家兔血清中可测水平的GS38-IFNβ成正比例增加。实施例6
与GS38-IFNβ结合的寡糖的分析
GS38-IFNβ是糖蛋白。与GS38-IFNβ结合的寡糖被定量释放、复原。通过无水肼处理释放出N联和O联聚糖。在此步骤中，蛋白质骨架被转化成氨基酸腙。完整的还原聚糖被分离、复原并以2-氨基苯甲酰胺进行了荧光测定标记。
更具体来讲，将一个GS38-IFNβ(1-2mg)样品进行剧烈的样品制备，包括冷冻干燥(＜50mill Torr(毫米汞柱)，＞24小时)。导入Glyo Prep 1000(Oxford Glyco Systems，GB)以及利用“N+O”方案使寡糖释放并复原。通过还原胺化作用使用2-氨基苯甲酰胺对样品进行荧光标记。
将样品置于Whatman 3mm层折纸，并使用1-丁醇/乙醇/水(4∶11)进行上行纸层析。随后用水洗脱保持在原起点的被标记样品。该方法使所有收集样品GS38-IFNβ结合寡糖以2-氨基苯甲酰胺标记的寡糖形式定量(且非选择性)地复原。
将合并的标记寡糖进行分级分离，并按下述方法进行分析：
通过hplc阴离子交换色谱分析标记寡糖的电荷分布。这样，在GlycoSep C柱(Oxford Glyco Systems，GB)对2-氨基苯甲酰胺标记寡糖总收集样中的一等份试样进行hplc阴离子交换色谱，使用乙腈和乙酸胺作洗脱剂。用荧光计在λex ＝356mmλem ＝450mm处探测从柱中洗脱的标记聚糖。所得色谱示于图6。
图6显示出GS38-IFNβ结合寡糖由中性和酸性两种成分组成。为确定酸性取代基的性质，将荧光标记寡糖总收集样的一等份试样与神经氨酸酶(来自产脲节杆菌)一起温育。再将一等份试样进行GlycoSep C色谱。所得色谱示于图7。
在与神经氨酸酶一起温育后，没有检测出酸性寡糖。由此，携带酸性取代基的寡糖之所以呈这种情况，仅仅是因为它们拥有一个共价相连的非还原末端外臂唾液酸残基。通过对色谱峰(图6)积分确定出总收集样中中性和酸性寡糖的相对摩尔含量。结果如下：中性  10％±0.8％(至1s.d.)酸性  90％±0.6％(至1s d.)s.d.＝标准偏差2.由GS38-IFNβ释放的脱酸寡糖总收集样中的大小分布
使用RAAM 2000(Oxford Glyco Systems GB)，对脱酸的2-氨基苯甲酰胺标记寡糖总收集样中的一等份试样进行高分辨凝胶渗透色谱。所得凝胶渗透色谱示于图8。要说明的是，荧光标记的脱酸寡糖被悬浮于葡聚糖部分水解物的水溶液中，并用于RAAM 2000(水为洗脱溶剂，保持于55℃，恒定流速80μl/min，10.6小时)。用序列式(in-line)荧光流式探测仪(探测荧光标记样品)和序列式差示折光计(探测个体葡萄糖寡聚物)进行探测。
图8中的数字上标代表非荧光、其提供(co-applied)的以葡萄糖为单位(gu)的葡萄糖寡聚物的洗脱位置，与同时以折射率检测的结果一样。测量个体2-氨基苯甲酰胺标记寡糖的流体动力学体积，以葡萄糖单元表示，正如在与荧光标记寡糖紧接的两个葡萄糖寡聚物间通过立方仿样内插(spline interpolation)计算出的结果。
明显可见，在葡聚糖标定范围内至少6个分离的寡糖是可辨认的，它们有效流体动力学体积如下：
20.7 gu    14.5％
17.6 gu    23.4％
14.5 gu    29.8％
12.2 gu    26.4％
11.1 gu    2.1％
1.0 gu    3.8％
总体积≤20 gu的流体动力学体积准确度至±0.1gu。聚糖与2-氨基苯甲酰胺(2-AB)的结合使聚糖的流体动力学体积减少了一个恒定值。利用下面等式从未减少的聚糖流体动力学体积(λ)计算出2-AB标记聚糖的流体动力学体积(λf)：
λf＝1.2λ-1.963.从GS38-IFNβ释放的脱酸聚糖的分子量分布
因为是在葡聚糖校准曲线外探测出了峰(图8)特别是在空隙体积中探测出峰，必须获得一个分子量分布以确定存在的糖的种类。在3，5-二羟基苯的基质(matrix)上准备一等份试样的脱酸聚糖收集样。获得基质辅助激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱呈阳离子形式(即，分子离子加钠)。下述离子可被分配给糖(图9)
分子离子钠(Molecular Ion Na)
       1929.9
       2292.5
       2660.1
       3019.14.总结
糖蛋白GS38-IFNβ携带的寡糖具有下列特征：
(i)中性(非酸性取代基)：  10％±0.8％
酸性                     ：90％±0.6％
(ii)脱唾液酸寡糖总收集样是异质的，至少有6个可辩结构成分存在于总收集样中。
(iii)MALDI-TOFL质谱数据和RAAM 2000数据可总结如下：
  实测质量          组成   计算质量     gμ当量
    1786.2     5Hex4HexNAc，12AB，Na     1782     11.1
    1929.9     5Hex，1dHex，4HexNAc，1  2AB，Na     1928     12.2
    2295.5     6Hex1dHex，5HexNAc1  2AB，Na     2293     14.5
    2660.1     7Hex1dHex，6HexNAc1  2AB，Na     2658     17.6
    3019.1     8Hex1dHex，7HexNAc1  2AB，Na     3023     20.7
Hex＝己糖，dHex＝脱氧己糖，HexNAc＝N-乙酰己糖胺，
2AB＝2-氨基苯甲酰胺，Na＝钠离子注意：在1.0 gu洗脱的峰会包含在MALDLI-TOF质谱中的基质(matrix)内，因此检测不出来。实施例7
使用pMMTC在CHO细胞中表达人促红细胞生成素
通过PCR，利用pfu聚合酶，从已被逆转录的人肾mRNA得到编码人促红细胞生成素(EPO)的cDNA。5′和3′PCR引物核苷酸序列如下：5′PCR引物5′-GTGGATCCGCCACC/ATG/GGG/GTG/CCAC/GAA/GT/CCT/GCC/TG-3′(设计ATG起始Met密码子前的CCGCCGCCACC序列使所得mRNA能被最佳翻译)；3′PCR引物5′-GATCTAGACAGTTCTTGTCAATGAGGTTGAAG-3′
此PCR产物被凝胶纯化，用限制酶BamHI和XbaI切割，然后连接入已被BamHI和XbaI切割的pGEM-11Z质粒。在确认了EPO编码区的核苷酸序列后，pGEM-11Z质粒通过用XhoI和NotI切割从中查到cDNA。将EPO cDNA用凝胶纯化，并插入pMMTC的XhoI-NotI位点，得到质粒为pMMTC/EPO。
用pMMTC/EPO转染野生型CHO细胞(CHO-K1)，起初用G-418筛选7天，然后再用浓度逐渐增加的Cd(4、8、16、32、64和92μM)筛选。在初始的G418筛选后得到大约几千个菌落。当Cd浓度为64μM时，大约仍存活有100个菌落。在这100个菌落中，将60个单独分离并扩大培养，通过Western印迹分析其培养基中EPO水平，得到8个高表达菌落的鉴定(分别为E15/1、E15/3、E15/8、E15/10、E15/13、E15/18、E15/26和E15/30)。
将存活菌落进一步在92μM Cd的培养基中筛选，此步筛选后，几个菌落存活，其中将6个菌落(分别称之为C5、C10、C11、C12、C14和C15)单独分离并分析测定EPO表达水平。通过Western印迹进一步比较64μM Cd筛选后8个高表达菌落的EPO分泌水平和92μMCd筛选后的6个菌落的EPO分泌水平。
所选菌落的细胞接种于35mm(直径)培养皿中，长至汇合，在每一培养皿中加入1ml培养基，并培养24小时。然后收集培养基，每份10μl与对照样50g EPO(泳道15)一起进行SDS-PAGE分离，利用Amersham ECL探测系统通过Western印迹进行分析。Western印迹B示于图13。

Claims (33)

1.一种核酸载体，包含：
(i)一个编码目的蛋白质的编码序列，它与一个能在重金属离子存在下指导此编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
(ii)包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列，它与一个能在重金属离子存在下指导此金属硫蛋白基因在哺乳动物细胞表达的启动子可操纵连接；和
(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列，它与一个能指导neo基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接。
2.根据权利要求1的载体，其中用于编码序列的启动子是金属硫蛋白基因启动子。
3.根据权利要求2的载体，其中启动子是小鼠金属硫蛋白基因I启动子。
4.根据前述任一项权利要求的载体，其中用于编码序列的启动子还与一增强子可操纵连接。
5.根据权利要求4的载体，其中增强子是小鼠肉瘤病毒增强子。
6.根据前述任意一项权利要求的载体，其中用于第一标记序列的启动子是金属硫蛋白基因启动子。
7.根据前述任意一项权利要求的载体，其中第一标记序列含一个人金属硫蛋白基因。
8.根据权利要求7的载体，其中用于第一标记序列的启动子是用于人金属硫蛋白基因的天然启动子。
9.根据前述任意一项权利要求的载体，它是一个DNA质粒。
10.根据前述任意一项权利要求的载体，其中编码序列编码人β干扰素或人促红细胞生成素。
11.携带有一种核酸序列的哺乳动物细胞，所述序列包含：
(i)一个编码目的蛋白质的编码序列，它与一个能在重金属离子存在下指导此编码序列在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；
(ii)包含金属硫蛋白基因的第一选择性标记序列，它与一个能在重金属离子存在下指导此金属硫蛋白基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接；及可任选地含有；
(iii)包含neo基因的第二选择性标记序列，它与能指导neo基因在哺乳动物细胞中表达的启动子可操纵连接。
12.根据权利要求11的细胞，它们是野生型中国仓鼠卵巢细胞。
13.根据权利要求11或12的细胞，其中用于编码序列的启动子是金属硫蛋白基因启动子。
14.根据权利要求13的细胞，其中启动子是小鼠金属硫蛋白基因I启动子。
15.根据权利要求11至14任意一项的细胞，其中用于编码序列的启动子还与一增强子可操纵连接。
16.根据权利要求15的细胞，其中增强子是小鼠肉瘤病毒增强子。
17.根据权利要求11至16任意一项的细胞，其中用于第一标记序列的启动子是金属硫蛋白基因启动子。
18.根据权利要求11至17任意一项的细胞，其中第一标记序列包含人金属硫蛋白基因。
19.根据权利要求18的细胞，其中用于第一标记序列的启动子是用于人金属硫蛋白基因的天然启动子。
20.根据权利要求11至19任意一项的细胞，其中核酸序列是一个DNA序列。
21.根据权利要求11至20任意一项的细胞，其中编码序列编码人β干扰素或人促红细胞生成素。
22.一种权利要求11所定义的细胞的制备方法，该方法包括：
(a)用权利要求1至10任意一项定义的载体转染哺乳动物细胞；
(b)将被转染的细胞暴露于遗传霉素，由此排除缺失neo基因的细胞；并
(c)将经步骤(a)存活下来的细胞暴露于浓度逐渐增加的重金属离子中，由此筛选出所需要的细胞。
23.根据权利要求22的方法，其中步骤(c)中的细胞被暴露于达200μM的选自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金属离子。
24.neo基因和金属硫蛋白基因在一个载体中用作选择性标记的用途。
25.一种制备目的蛋白质的方法，此方法包括在允许所述蛋白质表达的条件下培养如权利要求11至21任意一项定义的哺乳动物细胞，并回收由此表达的所述蛋白质。
26.根据权利要求25的方法，其中在重金属离子存在时培养细胞。
27.根据权利要求26的方法，其中在100至200μM的选自Cd2+、Cu2+和Zn2+的重金属离子存在下培养细胞。
28.根据权利要求27的方法，其中在约150μM Zn2+存在下培养细胞。
29.人β-干扰素，其特征在于当在重约2kg家兔的背部皮下注射1.5×106I.U.的干扰素时：
(a)1小时后在家兔血清中可检测到≥128I.U./ml的干扰素；和/或
(b)5小时后在家兔血清中可检测到≥64I.U./ml的干扰素。
30.人β-干扰素，其比活性为相对于牛血清白蛋白每毫克当量4.8×108到6.4×108I.U。
31.人β-干扰素，其可根据权利要求25至28任意一项的方法获得。
32.人促红细胞生成素，可根据权利要求25至28任意一项的方法获得。
33.一种药物组合物，包含一种药学上可接受的载体或稀释剂和一种作为主要活性成分的权利要求29至31任意一项中所定义的人β-干扰素。
34.一种药物组合物，包含一种药学上可接受的载体或稀释剂和一种作为主要活性成分的如权利要求32定义的人促红细胞生成素。
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