CN1357007A - 肝素结合蛋白在重组哺乳动物细胞中的表达 - Google Patents

肝素结合蛋白在重组哺乳动物细胞中的表达 Download PDF

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Abstract

本发明涉及将编码肝素结合蛋白的核酸导入可在厌氧条件下培养的哺乳动物细胞中从而在该细胞内生产肝素结合蛋白(HBP)的方法,该方法包括(a)将编码肝素结合蛋白的核酸导入上述细胞;(b)在能诱导所述HBP表达的情况下培养步骤(a)的细胞;以及(c)从该培养液回收所述HBP。本发明还涉及用于所述方法的重组哺乳动物细胞。

Description

肝素结合蛋白在重组哺乳动物细胞中的表达
                        发明领域
本发明涉及用编码肝素结合蛋白的核酸转染可在厌氧条件下培养的重组哺乳动物细胞后在所述细胞中生产肝素结合蛋白(HBP)的方法。本发明还涉及所述重组哺乳动物细胞。
                        发明背景
由人源和猪源的外周血中性粒细胞分离的两种密切相关蛋白的共价结构最近已确定(参见H.Flodgaard等，1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)197：535-547；J.Pohl等，1990，FEBS Lett.272：200等)。这两种蛋白与嗜中性粒细胞弹性蛋白酶有高度相似性，但通过选择性将第195位的活性丝氨酸和第57位的活性组氨酸(胰凝乳蛋白酶编号(B.S.Hartley，1970，Phil.Trans.Roy.Soc.Series 257：77 ff))突变后，其蛋白酶活性丧失。这两种蛋白由于对肝素具有高亲和性，分别命名为人肝素结合蛋白(hHBP)和猪肝素结合蛋白(pHBP)。Schafer等因发现所述蛋白具有抗微生物活性(W.M.Schafer等，1986，感染与免疫(Infect.Immun.)53：651等)，故称之为阳离子抗微生物蛋白(CAP37)。发现所述蛋白能调节单核细胞/巨噬细胞功能，如趋化、存活力增强、和分化(参见Pereira，1995年的综述(J.Leuk.Biol.57：805-812)和美国专利号5,458,874和5,484,885)，但关于能否抑制微生物对单核细胞/巨噬细胞的感染未见报道。
此外，HBP加入内皮细胞和成纤维细胞的单层细胞培养时还可介导所述细胞脱壁和收缩作用。HBP还可刺激单核细胞存活和血小板反应蛋白的分泌(E.Ostergaard和H.Flodgaad，1992，J.Leukocyte Biol.51：316等)。
已从嗜天青颗粒中分离现一种称为azurocidin的蛋白，其N末端头20个氨基酸残基与hHBP和CAP37的相应残基相同(J.E.Gabay等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5610 ff；C.G.Wilde等，1990，J.Biol.Chem.265：2038ff.)，关于其抗微生物特性已有报道(D.Campanelli等，1990，J.Clin.Invest.85：904 ff.)。
hHBP在嗜中性粒细胞中的存在，以及当所述粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)时释放89％的CAP37(其等同于hHBP)(H.A.Pereira等，见上)的事实，都提示hHBP的功能很可能涉及炎症的过程，因为在嗜中性粒细胞激活时hHBP明显释放。Pereira等，出处同上指出CAP37的功能是在炎症部位特异地吸引单核细胞，并因此导致在炎症的第二阶段使单核细胞不断聚集。Ostergaard和H.Flodgaad，出处同上指出除了对单核细胞的补充的重要性外，HBP可能在嗜中性粒细胞和单核细胞的外渗机制中起关键作用。
HBP的结构见美国专利号5,814,602和H.Flodgaad等，出处同上。HBP还被称为CAP37(见WO 91/00907，US 5,458,874和US5,484,885)以及azurocidin(C.G.Wilde等，J.Biol.Chem.265，1990，p2038)。
HBP曾由嗜中性粒细胞中分离(Flodgaard等，1991，Eur.J.Biochem.197：535-547)，但产率很低。此外，HBP也已通过重组DNA方法在昆虫细胞中生产(Rasmussen等，1996，FEBS Lett.390：109-112)。
重组HBP(该文献中称为CAP37)也已在人肾293细胞系中生产(R.Alberdi等，1997，FASEB J.11：1915)。使用了RSV-PL4表达载体，该载体包含用于分泌的运铁蛋白信号肽，用于免疫亲和纯化的HPC4表位，用于G418筛选的Xa因子切割位点和新霉素抗性基因，有功能的肝素结合蛋白只能通过用牛的Xa因子在所述重组蛋白的Xa因子切割位点进行体外切割，从而使该融合肽与重组肝素结合蛋白分离，而得到。
此外，重组HBP可在网状白细胞(RBL)中产生(PCT/DK98/00275)，但获得了具有不同糖基化程度的HBP不均一群体。
如果能以简单、但有效的方式以高产率产生肝素结合蛋白将较为有利。因此本发明的目的是获得以简单、有效的方式高产量获得成熟肝素结合蛋白。
                        发明简述
本发明涉及将编码肝素结合蛋白的核酸导入可在厌氧条件下培养的哺乳动物细胞中而生产哺乳动物肝素结合蛋白的方法，包括(a)将编码所述肝素结合蛋白的核酸导入可在厌氧条件下培养的哺乳动物宿主细胞；(b)在能诱导所述HBP表达的条件下培养步骤(a)的细胞；以及(c)从该培养液中收集HBP。在一个具体实施方案中，在步骤(b)的细胞培养时使用缓激肽B-2受体拮抗剂。
“肝素结合蛋白”(HBP)是(i)蛋白水解后失活；(ii)储存于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒内；(iii)作为单核细胞的化学趋化物并任选具有分子量为27-31kD的糖基化形式的蛋白。其可以是人源或猪源。
本发明的另一实施方案涉及产生上述哺乳动物HBP的方法，其包括：(a)将编码所述肝素结合蛋白的核酸导入可在导入核酸后于厌氧条件下培养的哺乳动物宿主细胞；(b)选择步骤a)的哺乳动物宿主细胞包括编码所述肝素结合蛋白的核酸的那些细胞；(c)在无血清并任选无蛋白质的培养基中培养所述宿主细胞；以及(d)分离上述肝素结合蛋白。该方法进一步包括纯化上述HBP。
本发明进一步涉及重组哺乳动物宿主细胞，这种哺乳动物宿主细胞在将编码哺乳动物肝素结合蛋白的核酸导入后可在厌氧条件下培养，其包含为编码肝素结合蛋白的核酸序列。
                        发明详述
肝素结合蛋白可由与下述核酸序列具有如琼脂糖凝胶电泳所测定的至少80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，最优选至少约97％同一性的核酸序列编码：SEQ ID NO：3(其编码如SEQ ID NO：1所示的成熟人HBP)，SEQ ID NO：5(其编码如SEQ ID NO：6所示的人HBP，该蛋白包括信号序列和成熟蛋白的序列)，SEQ ID NO：7(其编码如SEQ IDNO：8所示的人HBP，该蛋白包括信号序列、原序列和成熟蛋白的序列)或SEQ ID NO：4(其编码如SEQ ID NO：2所示的猪HBP)，SEQ ID NO：9(其编码如SEQ ID NO：10所示的猪HBP，该蛋白包括信号序列和成熟蛋白的序列)，SEQ ID NO：11(其编码如SEQ ID NO：12所示的猪HBP，该蛋白包括信号序列、原序列和成熟蛋白的序列)。这些核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。lle Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly ArgHis Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln SerGln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln SerArg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn AspLeu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu ProLeu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser GlyGly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg ProAsn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly Thr ProLeu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly ProAsp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly ProGly Pro Ala (SEQ ID NO：1)Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Lys Gln GlyArg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe ArgGly Lys Asn Ser Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu Gln SerArg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn AspVal Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu ProPro Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Glu Ala Gly Trp Gly Thr Gln ArgLeu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asn Val Thr Val Thr Ser Asn Pro CysLeu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg GlyThr Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Phe Arg ArgSer Ser Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn ProPro Ala(SEQ ID NO：2)ATCGTTGGCGGC CGGAAGGCGA GGCCCCGCCA GTTCCCGTTCCTGGCCTCCA TTCAGAATCA AGGCAGGCAC TTCTGCGGGG GTGCCCTGATCCATGCCCGC TTCGTGATGA CCGCGGCCAG CTGCTTCCAA AGCCAGAACCCCGGGGTTAG CACCGTGGTG CTGGGTGCCT ATGACCTGAG GCGGCGGGAGAGGCAGTCCC GCCAGACGTT TTCCATCAGC AGCATGAGCG AGAATGGCTACGACCCCCAG CAGAACCTGA ACGACCTGAT GCTGCTTCAG CTGGACCGTGAGGCCAACCT CACCAGCAGC GTGACGATAC TGCCACTGCCTCTGCAGAAC GCCACGGTGG AAGCCGGCAC CAGATGCCAG GTGGCCGGCTGGGGGAGCCA GCGCAGTGGG GGGCGTCTCT CCCGTTTTCC CAGGTTCGTCAACGTGACTG TGACCCCCGA GGACCAGTGT CGCCCCAACA ACGTGTGCACCGGTGTGCTC ACCCGCCGCG GTGGCATCTG CAATGGGGAC GGGGGCACCCCCCTCGTCTG CGAGGGCCTG GCCCACGGCG TGGCCTCCTTTTCCCTGGGG CCCTGTGGCC GAGGCCCTGA CTTCTTCACC CGAGTGGCGCTCTTCCGAGA CTGGATCGAT GGCGTTTTAA ACAATCCGGG ACCGGGGCCA GCCTAG(SEQ ID NO：3)ATTGTGGGCGGC AGGAGGGCCC AGCCGCAGGA GTTCCCGTTT CTGGCCTCCATTCAGAAACA AGGGAGGCCC TTTtGCGCCG GAGCCCTGGT CCATCCCCGCTTCGTCCTGA CAGCGGCCAG CTGCTTCCGT GGCAAGAACA GCGGAAGTGCCTCTGTGGTG CTGGGGGCCT ATGACCTGAG GCAGCAGGAG CAGTCCCGGCAGACATTCTC CATCAGGAGC ATCAGCCAGA ACGGCTATGA YCCCCGGCAGAATCTGAACG ATGTGCTGCT GCTGCAGCTG GACCGTGAGG CCAGACTCACCCCCAGTGTG GCCCTGGTAC CGCTGCCCCC GCAGAATGCC ACAGTGGAAGCTGGCACCAA CTGCCAAGTT GCGGGCTGGG GGACCCAGCG GCTTAGGAGGCTTTTCTCCC GCTTCCCAAG GGTGCTCAAT GTCACCGTGA CCTCAAACCCGTGTCTCCCC AGAGACATGT GCATTGGTGT CTTCAGCCGC CGGGGCCGCATCAGCCAGGG AGACAGAGGC ACCCCCCTCG TCTGCAACGG CCTGGCGCAGGGCGTGGCCT CCTTCCTCCG GAGGCGTTTC CGCAGGAGCT CCGGCTTCTTCACCCGCGTG GCGCTCTTCA GAAATTGGAT TGATTCAGTT CTCAACAACCCGCCGGCCTGA(SEQ ID NO：4)ATGACCCGGC TGACAGTCCT GGCCCTGCTG GCTGGTCTGC TGGCGTCCTCGAGGGCC ATCGTTGGCGGC CGGAAGGCGA GGCCCCGCCA GTTCCCGTTCCTGGCCTCCA TTCAGAATCA AGGCAGGCAC TTCTGCGGGG GTGCCCTGATCCATGCCCGC TTCGTGATGA CCGCGGCCAG CTGCTTCCAA AGCCAGAACCCCGGGGTTAG CACCGTGGTG CTGGGTGCCT ATGACCTGAG GCGGCGGGAGAGGCAGTCCC GCCAGACGTT TTCCATCAGCAGCATGAGCG AGAATGGCTACGACCCCCAG CAGAACCTGA ACGACCTGAT GCTGCTTCAG CTGGACCGTGAGGCCAACCT CACCAGCAGC GTGACGATAC TGCCACTGCCTCTGCAGAAC GCCACGGTGG AAGCCGGCAC CAGATGCCAG GTGGCCGGCTGGGGGAGCCA GCGCAGTGGG GGGCGTCTCT CCCGTTTTCC CAGGTTCGTCAACGTGACTG TGACCCCCGA GGACCAGTGTCGCCCCAACA ACGTGTGCACCGGTGTGCTC ACCCGCCGCG GTGGCATCTG CAATGGGGAC GGGGGCACCCCCCTCGTCTG CGAGGGCCTG GCCCACGGCG TGGCCTCCTTTTCCCTGGGGCCCTGTGGCC GAGGCCCTGA CTTCTTCACC CGAGTGGCGCTCTTCCGAGA CTGGATCGAT GGCGTTTTAA ACAATCCGGG ACCGGGGCCA GCCTAG(SEQ ID NO：5)Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser Ser Arg Ala Ile Val GlyGly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His PheCys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln AsnPro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg GlnThr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu MetLeu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro L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两个核酸序列之间的同一性程度可用本领域已知的计算机程序如GCG程序包中的GAP软件(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定。本发明用于计算两个核酸序列之间同一性的设定为：GAP创建罚分5.0，GAP延伸罚分0.3。
对编码HBP的核酸序列的修饰是合成与HBP基本类似的多肽序列所必需。与HBP“基本类似”是指HBP的非自然产生形式，这些多肽序列经工程改良后可能不同于HBP天然来源分离的序列。例如，可通过如定点诱变来合成下述HBP变异体，其比活性、热稳定性、最佳pH值等方面有差异。可构建类似序列，如根据SEQ ID NO：1或2中编码HBP的部分，如其亚序列的核酸序列来构建；和/或通过导入下述核苷酸取代来构建，这种取代不使该核酸序列编码的HBP的氨基酸序列发生改变，但其应符合用于产生所述酶的宿主生物的密码子使用特点；或通过导入能产生另一种氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对核苷酸取代的一般描述见Ford等，1991，ProteinExpression和Purification 2：95-107。
对本领域技术人员显而易见的是，可在该分子的功能非关键区进行所述取代并仍能产生活性多肽序列。由本发明分离的核酸序列编码的多肽活性所必需，并因此优选不被取代的氨基酸残基可根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(参见Cunningham和Wells，1989，科学244：1081-1085)来鉴定。在后一种技术中，可在分子中每一残基处进行突变，然后检验所得突变分子的HBP活性，从而鉴定出对该分子的活性很关键的氨基酸残基。
肝素结合蛋白也可由在低度至高度严谨条件下与SEQ ID NOS：3，4，5，7，9或11所示核酸序列杂交的核酸序列编码。将低度至高度严谨条件定义为在42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA，和分别对应于低、中、高严谨度的25％、35％、50％甲酰胺中进行预杂交和杂交。载体物质用2×SSC，0.2％SDS洗3次，每次30分钟，洗涤温度优选至少50℃(极低严谨度)，更优选至少55℃(低严谨度)，更优选至少60℃(中严谨度)，更优选至少65℃(中高严谨度)，甚至更优选至少70℃(高严谨度)，更优选至少75℃(极高严谨度)。
HBP的制备
编码HBP的核酸序列可用成熟的标准方法合成，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，四面体通讯(Tetrahedron Letters)22，1981，pp1859-1869所述亚磷酰胺(phosphoamidite)法，或Matthes等，EMBO J.3，1984，pp801-805所述方法。根据亚磷酰胺法，寡核苷酸可在诸如DNA自动合成仪中合成，纯化，退火，连接并克隆至适当载体。
对用于本发明方法中的肝素结合蛋白的核酸序列进行分离或克隆所用技术为领域内已知，包括从基因组DNA中分离，从cDNA开始制备，或两者结合。从这种基因组DNA中克隆本发明的核酸序列可通过，如利用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或对表达文库进行抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆化DNA片段来实现。参见例如Innis等，1990，方法和应用指南，Academic Press，new York。其它核酸扩增技术如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)也可采用。
然后可将所述核酸序列插入重组表达载体，该载体可以是通常能方便地接受重组DNA操作的任何载体。对载体的选择通常取决于该载体所要导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自我复制载体，即，以染色体外实体形式存在，但其复制与染色体复制不相关的一种载体，如质粒。或者，该载体可以是，当导入宿主细胞后，能整合至该宿主细胞基因组并与整合的染色体一起复制的一种载体。
在该载体中，编码HBP的核酸序列应与适当启动子序列可操作相连。启动子可以是在所选宿主细胞中具有转录活性的任何核酸序列，其可来源于该宿主细胞的同源或异源蛋白的编码基因。用于指导编码HBP的核酸序列在哺乳动物细胞中转录的适当启动子实例有SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1，1981，pp854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，科学222，1983，pp809-814)或腺病毒2主要晚期启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(Boshart等，1981，Cell 41：521-530)以及牛多瘤病毒启动子(BPV)。适于在昆虫细胞中使用的启动子有多角体蛋白启动子(Vasuvedan等，FEBS Lett.311，1992，pp7-11)。
编码HBP的核酸序列也可与适当终止子序列，如人生长激素终止子(Palmiter等，见上)可操作相连。
所述载体还可包括如多聚腺苷化信号(如来源于SV40或腺病毒5Elb区的信号)、转录增强子序列(如SV40增强子)和翻译增强子序列(如编码腺病毒VA RNA者)。
重组表达载体还可包括能使该载体在目标宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列(当宿主细胞为哺乳动物细胞时)有SV40或多瘤病毒的复制起始序列。
表达载体还可包括选择性标记，如一种基因，其产物可弥补宿主细胞中的缺陷，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或赋予对药物，如新霉素、遗传霉素、氨苄青霉素，或潮霉素抗性的基因。
在一个具体实施方案中，本发明涉及产生HBP的方法，其中将含有编码成熟HBP的DNA(其以N末端延伸为先导)的宿主细胞在适当的培养基中，于允许HBP表达的条件下进行培养，从该培养基中回收所得HBP，其为N末端延伸型HBP。
N末端延伸可以是约5-25个氨基酸残基的一段序列，优选约8-15个氨基酸残基。N末端序列中氨基酸残基的特征并不是关键的。优选N末端延伸为具有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Asp(SEQ ID NO：13)的HBP原肽或原肽Met-Thr-Arg-Leu-Thr-Val-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ala-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp(SEQ ID NO：14)。
为有利于成熟HBP的产生，通常优选编码N末端延伸型HBP的DNA序列包括编码蛋白酶切割位点的DNA序列，所述位点位于编码该N末端延伸的DNA序列与编码成熟HBP的DNA序列之间。适当的蛋白酶切割位点实例包括具有所述氨基酸序列的肠激酶切割位点或Xa因子切割位点。
或者，可将编码信号序列和成熟HBP的核酸序列用上述方法插入载体。其结果是，HBP可以从培养基中分离。
用于分别连接编码HBP或N末端延伸型HBP的核酸序列，启动子和终止子的方法，以及用于将它们插入含复制所必需信息的适当载体的方法为本领域技术人员所熟知(参见例如Sambrook等，见上)。
哺乳动物细胞是可在用编码哺乳动物肝素结合蛋白的核酸转染后在厌氧条件下培养的细胞。在一个更优选的实施方案中，哺乳动物细胞为被腺病毒转染的细胞或衍生自胚细胞的细胞。如本文所限定，衍生自胚细胞的细胞是从胚细胞的原代培养物获得的细胞或从胚细胞的原代培养物最初传代的细胞系。所述被腺病毒转染的细胞或衍生自胚细胞的细胞实例如人胚肾(HEK)细胞，由其HEK 293细胞。
转染哺乳动物以及使导入细胞中的DNA序列表达的方法可参见如Kaufman和Sharp，1982，分子生物学杂志159：601-621；Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet，1：327-341；Loyter等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等，1978，Cell 14：725；Corsaro和Pearson，1981，体细胞遗传7：603；Graham和van der Eb，1973，病毒学52：456，Fraley等，1980，JBC 225：10431；Capecchi，1980，细胞22：479；Wiberg等，1983，NAR 11：7287；Neumann等，1982，EMBO J.1：841-845。昆虫细胞可优选用如美国专利4,745,051所述的杆状病毒转染。
用于细胞培养的培养基可以是适于培养哺乳动物细胞的任何常规培养基，如含血清或不含血清的含适当添加物的培养基，或适于培养昆虫细胞的培养基。相应培养基可从供应商处购买或根据已公开的配方(如在美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。然后筛选细胞的抗生素抗性。随后，对所选出的克隆进一步用本领域已知的试验如趋化试验和单核细胞的细胞因子释放试验分析其HBP活性(例如参见美国专利5,814,602)。
筛选出的克隆可进一步在无血清并任选无蛋白的培养基中培养。此外可在有缓激肽B-2受体拮抗剂存在的情况下培养。实例包括但不限于缓激肽B-2受体抗体(见例如，Haasemann等，1991，免疫学杂志147：3882-3992)或缓激肽受体基因的反义多核酸序列。
由所述细胞产生的HBP可用常规方法从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，利用盐(如硫酸铵)沉淀上清或过滤物中的蛋白成分，用多种层析方法(如离子交换层析、亲和层析)纯化等。在一个具体实施方案中，N末端延伸型HBP在偶联抑蛋白酶肽的琼脂糖层析柱中纯化。
如果HBP为N末端延伸型HBP，则在从培养基回收后，优选用适当蛋白酶切割该N末端延伸型HBP，以便产生成熟(和有活性)的HBP。适当酶的实例包括但不限于肠激酶和Xa因子。
                       实施例
实施例1：原HBP在昆虫细胞中的表达
用于构建pSX556的方法如Rasmussen等，1996，FEBS Lett.390：109-112所述。制备以下PCR引物：MHJ 2087：5′-AAA AAG GAT CCA CCA TGA CCC GGC TGA CAG TCC TGG CCC TGCTGG CTG GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCG GCT CCA GCC CCC TTT TGG ACATCG TTG GCG GCC GGA AGG C-3′((SEQ ID NO：15)MHJ 2089：5′-AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC CCC GGT CCC GGA TTG TTT AAAACG CCA TC-3′(SEQ ID NO：16)
MHJ 2087编码了BamHI位点，人cDNA(Morgan，J.G.等，1991，J.Immun.，147：3210-3214)的起始密码子和前原部分，其后为该基因成熟部分的最初20个核苷酸。
MHJ 2089互补于上文引用的cDNA序列中HBP基因编码部分的最后8个密码子外加两个密码子。其末端为一个HindIII位点。
用以下方案进行PCR：
3个循环   95℃60秒，50℃120秒，72℃120秒
12个循环  95℃30秒，65℃60秒，72℃90秒
将760bp的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，用BamHI和HindIII酶切，插入用此两种酶切割的pSX221中。(pSX221是pUC19的衍生物(Yannisch-Perron，C.等，1985，基因(Gene)33：103-119)。测序证实克隆的DNA，切下BamHI-HindIII酶切片段，分离，插入到pBlueBacIII(InvitrogenCorporation)以在昆虫细胞中表达。此片段包括HBP的完整编码区，该区包括19个残基的信号肽，7个氨基酸的前肽，222个氨基酸的成熟部分和3个氨基酸的C-末端延伸。得到的质粒命名为pSX556。
为产生表达HBP的重组杆状病毒，使用Introgen公司(San Diego，CA)的MAXBAC试剂盒，所有的操作按照其中的杆状病毒表达系统手册(版本1.5.5)进行。简要地说，用1μg og线性化AcMNPV DNA和3μg pSX556共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)昆虫细胞(60mm培养皿中2×106个细胞)。7天后收获培养上清。用不同稀释度的病毒上清感染100mm平板中SF9细胞的新鲜单层细胞，然后用含有150μg/ml X-gal的TNM-FH完全培养基(1.5％琼脂糖)覆盖。8天后，将6个表现出蓝色环的噬斑假定为重组噬斑，并用于感染6孔板上的SF9细胞。5天后，纯化相应的病毒DNA，并采用对应于病毒DNA重组位点两侧的正向和反向引物进行PCR反应。在琼脂糖凝胶上鉴定PCR产物后，对相应的最纯的重组病毒进行又一轮的噬斑纯化以确保最终的重组病毒原种不含有野生型病毒。在无血清SF900-II培养基(Gibco BRL/Life-Technologies)中生长的昆虫细胞(SF9和SF21)中进行重组HBP的生产。通常，以MOI为1的病毒感染5L旋转培养物或10L发酵培养物(细胞密度均为1×106/ml)，感染三天后收获培养基。按照美国专利5814602所述纯化HBP。
在SDS-PAGE上检验用重组杆状病毒感染的昆虫细胞所得的HBP。此HBP分子量稍大于纯化自人血的天然HBP。当确定了N-末端序列后发现，几乎100％的产物在成熟部分的前部包含7个氨基酸的前肽，这表明所述昆虫细胞不能以与人骨髓中髓样嗜中性粒细胞前体细胞同样的方式对型(pro-HBP)进行加工。
实施例2：昆虫细胞中Δpro-HBP的表达
制备一种寡肽接头(见下面)，使其覆盖HBP序列的前99bp(从BamHI到EagI)，该片段覆盖信号肽和成熟HBP的头4个氨基酸，但不包括覆盖前区(从73到87)的部分，这一部分被替代为pSX556中的原始BamHI-Eagl以产生pSX559。
接头由4个寡肽组成，它们成对地退火为下列的双链：MHJ2568/LWN5746：5′-GATCCACCATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC-3′(SEQ ID NO：17)3′-GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC-5′(SEQ ID NO：18)LWN5745/MHJ2566：5′-P-TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC-3′(SEQ ID NO：19)3′-GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG-5′(SEQ ID NO：20)
用重组杆状病毒转染SF9细胞，表达的HBP依实施例1所述纯化。在确定N-末端序列后，证实从Ile1开始有90％已得到正确处理。其余10％从Arg5开始作进一步处理。
为对比pro-HBP和HBP的表达，进行时间进程实验。在感染后的开始6天(减第5天)取培养基的每日等份样品，在HBP-特异性ELISA中检测。设最大pro-HBP产量(在第4天)的平均值(n＝3)为100％。发现HBP的表达效率比pro-HBP低2-3倍。在四天中得到了pro-HBP的最佳产量，而HBP的产量从第3到第4天几乎保持不变。
重组HBP的电喷射质谱学分析(ESMS)显示分子量为27.237±3。225个氨基酸的HBP形式(成熟部分加上3个C-末端延伸的氨基酸)的计算值是24.268.6。由于HBP包含三个潜在的糖基化位点(Asn100，Asn114，Asn145)。这对应于质量为2.968的聚糖部分。它本身与两个Man3-[Fuc]GlcNAc2单位和一个Man3GlcNAc2单位的理论值一致。
实施例3：HEK293细胞中pro-HBP的表达
采用下列步骤构建转染HEK293细胞的表达载体。首先，依实施例1所述方法构建质粒pSX556。
在使用pSX556为模板的PCR中采用下列引物PBRa 246 5′-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3′(SEQ ID NO：21)PBRa 247(5′-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3′(SEQ ID NO：22)依照生产商说明书(Stratagene)使用Pfu聚合酶。用BamHI酶切PCR反应产物后，所得片段以正确的方向连接至哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen)，用BamHI线性化，得到pcDNA3-HBP。
采用下列步骤转染HEK293细胞。在转染的前一天，将5×105HEK293细胞接种于10cmm培养皿中，该培养皿中有10ml DMEM+10％FCS+青霉素/链霉素。通过改进的磷酸钙方法(Chen和Okayama，1987，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)7；2745-2752)用20g pcDNA3-HBP转染HEK293细胞。在600g/ml遗传霉素(Life Technologies)中筛选转染体。原代(primary)转染的群体长满后，用特异性HBP夹心-ELISA测定为HBP表达阳性。转染细胞的形态近似于未转染的HEK293细胞。通过有限稀释方法再克隆所述转染群，最佳克隆(1/E-11)在T-25烧瓶规模可以产生11.5gHBP/ml/天。特定地，在5×96孔板上接种300个细胞，检测源自一个细胞的细胞克隆(亚克隆)的表达。
为检定产生的HBP物质，使克隆1/E-11在无血清单层培养物上生长6天，每天更换培养基。通过对HPLC的面积积分测定HBP上清浓度为8mg/l(以杆状病毒HBP为标准)。用连接了抑酶肽的琼脂糖进行纯化，用1M NaCl洗脱。所述一步纯化得到由HPLC分析判断的99％纯度的样品。当N-末端序列确定后，显示几乎100％的产物在成熟部分的前部包含7个氨基酸的前肽，这指示HEK293细胞不能以人骨髓中髓样嗜中性粒细胞前体细胞同样的方式处理pro-型(pro-HBP)。如实施例1所述，当HBP在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达时，可得到同样的观察结果。经MALDI测定Mr为31693，这样所述聚糖部分分子量为6755。假设占有此质量的所有3个N-连接糖基化位点能对应于三个二-唾液酸化、半乳糖基化双触角结构，则还存在其它多种天然可能性，但是，在所有的情况下，HEK293细胞中的HBP似乎具有复合型天然N-连接的寡糖。
实施例4：HBP在HEK293细胞中的表达
下列步骤用于构建转染至HEK293细胞的表达载体。首先，按照实施例2所述方法构建质粒pSX559。
以pSX559为模板，用Pfu聚合酶(Stratagene)按照生产商指导手册进行PCR反应，其中使用引物：PBRa 246 5′-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3′(SEQ ID NO：21)PBRa 247(5′-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3′(SEQ ID NO：22)在BamHI酶切PCR反应产物之后，所得片段以正确的方向连接至哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen)，BamHI线性化，得到pcDNA3-HBPΔpro。
将pcDNA3-HBPΔpro转染进入HEK293细胞，用HBP-ELISA测定长满的转染群体为HBP表达阳性。用以下方法转染HEK 293细胞。在转染的前一天，将5×105HEK293细胞接种于10cm培养皿中，该皿中有10mlDMEM+10％ FCS+青霉素/链霉素。通过改进的磷酸钙方法(Chen和Okayama，1987，分子和细胞生物学7；2745-2752)将20g pcDNA3-HBPΔpro转染至HEK293细胞。在600g/ml遗传霉素(Life Technologies)中筛选转染体。用特异性HBP夹心-ELISA测定原代转染群体为HBP表达阳性。转染细胞的形态近似于未转染的HEK293细胞。通过有限稀释方法亚克隆该转染群。特定地，在5个96孔板上接种300个细胞，检测源自一个细胞的细胞克隆(亚克隆)的表达。通过有限稀释方法分离得到一个最佳克隆3/E-4(3.25gHBP/ml/天)。
为检定产生的HBP，使克隆3/E-4在无血清单层培养物上生长，每天更换培养基。培养基用Sartorius滤器过滤，如前所述在CM-Sepharose快速流动柱上纯化。分离得到0.2mg纯HBP。借助小规模制备型HPLC进一步纯化10μg用于N-末端测序和质量测定。95％的纯化HBP具有正确的N-末端序列(IVGGRKARPRQFPFL，SEQ ID NO：23)，但是其余的5％显示为始于第5个氨基酸的截短形式(RKARPRQFPFLASIQN，SEQ ID NO：24)，此N-末端截短形式与实施例1所述杆状病毒/昆虫细胞HBP中发现的一致。MALDI(矩阵辅助的激光解吸电离(matrix assisted laser desorptionionization))和ESMS(电喷射质谱)质量检测都得到宽峰，其平均质量(Mw)为30550。这使聚糖部分质量约为6300。
实施例5：HEK293产生的成熟HBP的生物学活性
为对比HEK293产生的成熟HBP和由昆虫细胞得到的成熟HBP的生物学活性，用单核细胞/IL6试验测定这两种重组型式：人单核细胞分离自正常血液的血沉棕黄层。在24孔板上，每孔2×105细胞接种在1ml的DMEM培养基中，该培养基含有2mM Glutamax，1％非必需氨基酸，1mg/ml BSA。如表1所示加入LPS(来自大肠杆菌，Sigma)和重组HBP。37℃(5％CO2)孵育24小时后，收集细胞上清，离心澄清，-20℃储存以备分析它们的IL-6含量。借助Biotrek ELISA系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行II-6鉴定。
如表1所示，由于昆虫-HBP量的增加使LPS诱导的IL-6释放增加。但是，在只有2g HEK293-HBP存在下，LPS诱导的IL-6释放几乎与10g昆虫-HBP存在下的相同。这表明HEK293成熟HBP的比活性比得自昆虫的成熟HBP的比活性高约5倍。这种比活性的增长最有可能是因为哺乳动物HEK293细胞进行的更复杂型N-连接糖基化方式。
                           表1
    +/-10ng LPS     IL-6(pg/ml)
仅有单核细胞     -+     9203575
+2g昆虫-HBP     -+     8904200
+5g昆虫-HBP     -+     11208050
+10g昆虫-HBP     -+     157511800
+2g HEK 293-HBP     -+     100012550
实施例6：在产生HBP的HEK293细胞系中葡萄糖的消耗和乳酸的产生
为检测产生HBP的HEK293稳定转染体的代谢如何受HBP产物自身的影响，使用KODAK EKTACHEM DT 60II设备测定在3种不同HEK293细胞系中葡萄糖的消耗和乳酸的产生：1)HEK293细胞系(对照)；2)1/C-6(克隆，以实施例3中1/E-11完全同样的方式产生，它可产生pro-HBP；3)3/E-4(克隆，实施例4所述，它可产生成熟HBP)。用到两种培养基：含4500mg/l葡萄糖(Life Technologies)和10％FCS的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)，无蛋白的合成培养基。
结果如表II所示：
表II
                     葡萄糖(mg/l)          乳酸(mg/l)新鲜DMEM培养基           3690                  153培养20小时后：HEK 293                  2358                  12151/C-6                    1836                  16203/E-4                    1296                  1935新鲜的无蛋白培养基       4158            63培养4小时后：HEK 293                  3888            4501/C-6                    3654            5403/E-4                    3258            855培养18小时后：HEK 293                  2448            14401/C-63/E-4                    1926            1305
如表II所示，生产HBP的HEK293细胞系在两种培养基中葡萄糖的消耗和乳酸的产生都提高了。同样可观察到产生成熟HBP的3/E-4细胞系在DMEM培养基无蛋白培养基中培养4小时后有最高的葡萄糖消耗和乳酸生产。在18小时后，3/E-4无蛋白培养基中乳酸浓度由于乳酸降解而为最低。
表2中结果显示，当HBP定位于生产HBP的HEK293细胞中的线粒体附近时，HBP以某种方式关闭氧依赖性线粒体ATP的产生。如此一来，ATP只通过厌氧糖酵解途径产生，HEK293细胞由于是胚胎来源而可以发生这种作用。
实施例7：pDC312-HBPΔpro的构建
下列步骤用于构建pDC312-HBPΔpro。首先，通过实施例2所述步骤构建质粒pSX559。以pSX559作模板进行PCR反应，所用引物为：ViLi118 5′-CCGGGATCCTAGTCCCACCATGACCCGGCTGACA-3′(SEQ ID NO：25)ViLi119 5′-GCGCGCGGCCGCCTAGGCTGGCCCCGG-3′(SEQ ID NO：26)依照生产商说明书(Life Technologies)使用PfX聚合酶。产生的PCR片段用限制酶BamHI和NotI消化，经凝胶纯化，按正确的方向连接进入也用BamHI和NotI消化的哺乳动物表达载体pDC312(Immunex)，得到pDC312-HBPΔpro。
将pDC312-HBPΔpro转染进入HEK293细胞，长满的转染群体经HBP-ELISA检验为HBP表达阳性。用下述方法转染HEK293细胞。在转染的前一天，将5×105HEK 293细胞接种于含有10ml DMEM+10％FCS+青霉素/链霉素的10cm培养皿中。通过改进的磷酸钙方法(Chen和Okayama，1987，分子和细胞生物学7；2745-2752)将20g pcDNA3-HBPΔpro转染至HEK293细胞。在0.25M氨甲蝶呤(MTX)(Life Technologies)中筛选转染体。铺满后，原代转染群经特异性HBP夹心-ELISA测定为HBP表达阳性。转染细胞的形态与未转染的HEK 293细胞相似。该转染群经有限稀释法而再克隆。具体为，将300个细胞接种在5个96孔板上，检测源自一个细胞的细胞克隆(亚克隆)的表达。通过有限稀释法分离得到一个最佳克隆3/E-4(9.4g HBP/ml/天)。
为鉴定产生的HBP，使克隆子3/E-4在无血清单层培养物上生长，每天更换培养基。培养基用Sartorius滤器过滤，如前所述在CM-Sepharose快速流动柱上纯化。分离得到0.2mg纯HBP。取10μg用小规模制备型HPLC进一步纯化以备N-末端测序和质量测定。95％的纯化HBP具有正确的N-末端序列(IVGGRKARPRQFPFL，SEQ ID NO：27)，但其余5％显示为始于第5号氨基酸的截短形式(RKARPRQFPFLASIQN，SEQ ID NO：28)，这种N-末端截短形式与实施例1所述杆状病毒/昆虫细胞HBP中发现的一致。MALDI(矩阵辅助的激光解吸电离)和ESMS(电喷射质谱)质量检测都得到平均质量(MW)为30550的宽峰。这使聚糖部分的质量约为6300。
实施例8：中空纤维细胞培养系统
将293细胞(4.037×102)，HBP293 3/B-5#/0在Spinner瓶(Techne，Cambridge，UK)中培养，然后接种至自动细胞培养系统(AcuSyst Maximaizer，CELLEX Biosciences，Inc.，Minneapolis，USA)中的中空纤维管(两个生物反应器，10Kd截留分子量，1.5m2)的毛细管外部(EC)空间。该细胞系经检验不含支原体(GEN-PROBE，GEN-Probe Incorporated，San Diego，USA)。起始控制参数是：温度＝36.5℃；pH＝7.10；pO2＝120Hg/mm。添加了3.5mM谷氨酰胺(Life Technologies，Paisley，UK)的293 SFM II培养基(Life Technologies，Paisley，UK)连同其中所含溶解气体一起，以250ml/min泵送(循环泵(Circulation pump))经过纤维内部，跨膜进入EC空间。培养基流量(mediaflow)(培养基泵(media pump))为50ml/hr，培养一天后提高到100ml/hr，2-20：08天(两天，20小时，8分钟)后到200ml/hr，3-19：40天(3天，19小时，40分钟)后到250ml/hr，4-20：39天(4天，20小时，39分钟)后到300ml/hr，8-23：15天(8天，23小时，15分钟)后到400ml/hr，19-18：41天后到450ml/hr，22-01：16天后到500ml/hr，24-18：46天后到550ml/hr，24-19：06天后到600ml/hr，30-20：43天后到650ml/hr，33-01：03天后到700ml/hr。从8-22：59天后开始，以2ml/hr在EC室中连续收获和流加。34-23：01天后过程完成，总共收获1529ml。
用下述步骤从HEK293悬浮液中纯化HBP。该悬浮液用1M NaOH调pH为8.5，随后用GF/A滤器过滤。层析柱(SP 16/10)在30mM Tris pH8.5中以4ml/min的流速平衡。上柱，用平衡缓冲液洗柱。HBP用NaCl梯度洗脱。在约0.9M NaCl时洗出HBP。汇集并用C4分析柱定量。结果如表III。
                                 表III
  批号   悬液体积/ml   悬液浓度/g/l  悬液中总量/mg 汇集液中总量/mg 回收率/％
 000301     260     0.3     78     65   83
 8/3-2000     155     0.4     62     50   81
 8/3-2000     200     0.4     80     60   75
 000314     150     0.3     45     80   177
 000314     130     0.3     39     55   141
 000315     34     -     -     Ca.5   -
 000317     150     0.3     45     50   111
 000320     165     0.3     50     50   100
总共收集得到约400mg。HBP浓度为0.3-0.4g/l。所有这些批次在制备型纯化和分析型HPLC上看起来都相似。还对第一批进行了MS和序列分析。鉴定质量为30.5kD，也发现有某些弱信号(dimmer)。序列与预期的HBP(15轮)相关。在SDS上，36kD处有一条深带，在10-20kD还可见两条浅带。
在此所述并要求权利的发明不应受在此公开的具体实施方案的限制，因为这些实施方案旨在举例说明本发明的几个方面。任何等效实施方案应视为在本发明范围之内。事实上，除在此所示和所述之外，对本发明的各种改变都是本领域技术人员根据此前描述显而易见。这些改变也应视为在所附权利要求的范围之内。
在此引用了多种参考文献，它们的公开内容全文引入作为参考。
                        序列表
<110>诺沃挪第克公司(NOVO NORDISK A/S)
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<170>适用于Windows 3.0的FastSEQ
<210>1
<211>225
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala1               5                  10                  15Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His
        20                  25                  30Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro
    35                  40                  45Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu
50                  55                  60Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly65                  70                  75                  80Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp
            85                  90                  95Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu
        100                 105                 110Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp
   115                  120                 125Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val
130                 135                 140Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys145                 150                 155                 160Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly
            165                 170                 175Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser
        180                 185                 190Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu
    195                 200                 205Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro
210                 215                 220Ala225
<210>2
<211>221
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>2Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala1               5                  10                  15Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His
         20                 25                  30Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser
     35                  40                  45Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu
 50                  55                  60Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr65                  70                  75                  80Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg
             85                  90                  95Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln
        100                105                  110Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Glu Ala Gly Trp
    115                 120                 125Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu
130                 135                 140Asn Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile145                 150                 155                 160Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr
            165                 170                 175Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg
        180                 185                 190Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe
    195                 200                 205Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro Ala
210                 215                 220
<210>3
<211>678
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3atcgttggcg gccggaaggc gaggccccgc cagttcccgt tcctggcctc cattcagaat      60caaggcaggc acttctgcgg gggtgccctg atccatgccc gcttcgtgat gaccgcggcc     120agctgcttcc aaagccagaa ccccggggtt agcaccgtgg tgctgggtgc ctatgacctg     180aggcggcggg agaggcagtc ccgccagacg ttttccatca gcagcatgag cgagaatggc     240tacgaccccc agcagaacct gaacgacctg atgctgcttc agctggaccg tgaggccaac     300ctcaccagca gcgtgacgat actgccactg cctctgcaga acgccacggt ggaagccggc     360accagatgcc aggtggccgg ctgggggagc cagcgcagtg gggggcgtct ctcccgtttt     420cccaggttcg tcaacgtgac tgtgaccccc gaggaccagt gtcgccccaa caacgtgtgc     480accggtgtgc tcacccgccg cggtggcatc tgcaatgggg acgggggcac ccccctcgtc     540tgcgagggcc tggcccacgg cgtggcctcc ttttccctgg ggccctgtgg ccgaggccct     600gacttcttca cccgagtggc gctcttccga gactggatcg atggcgtttt aaacaatccg     660ggaccggggc cagcctag                                                   678
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<212>DNA
<213>Sus scrofa
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<210>5
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5atgacccggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggccatc      60gttggcggcc ggaaggcgag gccccgccag ttcccgttcc tggcctccat tcagaatcaa     120ggcaggcact tctgcggggg tgccctgatc catgcccgct tcgtgatgac cgcggccagc     180tgcttccaaa gccagaaccc cggggttagc accgtggtgc tgggtgccta tgacctgagg     240cggcgggaga ggcagtcccg ccagacgttt tccatcagca gcatgagcga gaatggctac     300gacccccagc agaacctgaa cgacctgatg ctgcttcagc tggaccgtga ggccaacctc     360accagcagcg tgacgatact gccactgcct ctgcagaacg ccacggtgga agccggcacc     420agatgccagg tggccggctg ggggagccag cgcagtgggg ggcgtctctc ccgttttccc     480aggttcgtca acgtgactgt gacccccgag gaccagtgtc gccccaacaa cgtgtgcacc     540ggtgtgctca cccgccgcgg tggcatctgc aatggggacg ggggcacccc cctcgtctgc     600gagggcctgg cccacggcgt ggcctccttt tccctggggc cctgtggccg aggccctgac     660ttcttcaccc gagtggcgct cttccgagac tggatcgatg gcgttttaaa caatccggga     720 ccggggccag cctag                                                        735
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser1               5                  10                  15Ser Arg Ala Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro
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50                  55                  60Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg65                  70                  75                  80Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser
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        100                 105                 110Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro
   115                  120                 125Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val
130                 135                 140Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro145                 150                 155                 160Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn
            165                 170                 175Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly
        180                 185                 190Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala
    195                 200                 205Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg
210                 215                 220Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly225                 230                 235                 240Pro Gly Pro Ala
<210>7
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<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>7atgacccggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggccggc      60tccagccccc ttttggacat cgttggcggc cggaaggcga ggccccgcca gttcccgttc     120ctggcctcca ttcagaatca aggcaggcac ttctgcgggg gtgccctgat ccatgcccgc    180ttcgtgatga ccgcggccag ctgcttccaa agccagaacc ccggggttag caccgtggtg    240ctgggtgcct atgacctgag gcggcgggag aggcagtccc gccagacgtt ttccatcagc    300agcatgagcg agaatggcta cgacccccag cagaacctga acgacctgat gctgcttcag    360ctggaccgtg aggccaacct caccagcagc gtgacgatac tgccactgcc tctgcagaac    420gccacggtgg aagccggcac cagatgccag gtggccggct gggggagcca gcgcagtggg    480gggcgtctct cccgttttcc caggttcgtc aacgtgactg tgacccccga ggaccagtgt    540cgccccaaca acgtgtgcac cggtgtgctc acccgccgcg gtggcatctg caatggggac    600gggggcaccc ccctcgtctg cgagggcctg gcccacggcg tggcctcctt ttccctgggg    660ccctgtggcc gaggccctga cttcttcacc cgagtggcgc tcttccgaga ctggatcgat    720ggcgttttaa acaatccggg accggggcca gcctag                              756
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<211>251
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser1               5                  10                  15Ser Arg Ala Gly Ser Ser Pro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys
        20                  25                  30Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly
    35                  40                  45Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr
50                  55                  60Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val65                  70                  75                  80Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr
            85                  90                  95Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn
        100                 105                 110Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr
   115                  120                 125Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly145                 150                 155                 160Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro
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        180                 185                 190Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu
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210                 215                 220Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp225                 230                 235                 240Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro Ala
               245                   250
<210>9
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<212>DNA
<213>Sus scrofa
<400>9atgccagcac tcagattcct ggccctgctg gccagcctgc tggcaacctc cagggttatt      60gtgggcggca ggagggccca gccgcaggag ttcccgtttc tggcctccat tcagaaacaa     120gggaggccct tttgcgccgg agccctggtc catccccgct tcgtcctgac agcggccagc     180tgcttccgtg gcaagaacag cggaagtgcc tctgtggtgc tgggggccta tgacctgagg     240cagcaggagc agtcccggca gacattctcc atcaggagca tcagccagaa cggctatgac     300cccggcagaa tctgaacgat gtgctgctgc tgcagctgga ccgtgaggcc agactcaccc     360ccagtgtggc cctggtaccg ctgcccccgc agaatgccac agtggaagct ggcaccaact     420gccaagttgc gggctggggg acccagcggc ttaggaggct tttctcccgc ttcccaaggg     480tgctcaatgt caccgtgacc tcaaacccgt gtctccccag agacatgtgc attggtgtct     540tcagccgccg gggccgcatc agccagggag acagaggcac ccccctcgtc tgcaacggcc     600tggcgcaggg cgtggcctcc ttcctccgga ggcgtttccg caggagctcc ggcttcttca     660cccgcgtggc gctcttcaga aattggattg attcagttct caacaacccg ccggcctga      7l9
<210>10
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<212>PRT
<213>Sus scrofa
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        20                  25                  30Phe Leu Ala Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala
    35                  40                  45Leu Val His Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly
50                  55                  60Lys Asn Ser Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg65                  70                  75                  80Gln Gln Glu Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln
            85                  90                  95Asn Gly Tyr Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln
        100                 105                 110Leu Asp Arg Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu
    115                 120                 125Pro Pro Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala
130                 135                 140Gly Trp Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg145                 150                 155                 160Val Leu Asn Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met
            165                 170                 175Cys Ile Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg
        180                 185                 190Gly Thr Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe
    195                 200                 205Leu Arg Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala
210                 215                 220Leu Phe Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro Ala225                 230                 235
<210>11
<211>741
<212>DNA
<213>Sus scrofa
<400>11atgccagcac tcagattcct ggccctgctg gccagcctgc tggcaacctc cagggttggc     60ttggccaccc tggcagacat tgtgggcggc aggagggccc agccgcagga gttcccgttt    120ctggcctcca ttcagaaaca agggaggccc ttttgcgccg gagccctggt ccatccccgc    180ttcgtcctga cagcggccag ctgcttccgt ggcaagaaca gcggaagtgc ctctgtggtg    240ctgggggcct atgacctgag gcagcaggag cagtcccggc agacattctc catcaggagc    300atcagccaga acggctatga cccccggcag aatctgaacg atgtgctgct gctgcagctg    360gaccgtgagg ccagactcac ccccagtgtg gccctggtac cgctgccccc gcagaatgcc    420acagtggaag ctggcaccaa ctgccaagtt gcgggctggg ggacccagcg gcttaggagg    480cttttctccc gcttcccaag ggtgctcaat gtcaccgtga cctcaaaccc gtgtctcccc    540agagacatgt gcattggtgt cttcagccgc cggggccgca tcagccaggg agacagaggc    600acccccctcg tctgcaacgg cctggcgcag ggcgtggcct ccttcctccg gaggcgtttc    660cgcaggagct ccggcttctt cacccgcgtg gcgctcttca gaaattggat tgattcagtt    720ctcaacaacc cgccggcctg a                                              741
<210>12
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<212>PRT
<213>Sus scrofa
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50                  55                  60Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser Gly Ser Ala Ser Val Val65                  70                  75                  80Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu Gln Ser Arg Gln Thr Phe
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    115                 120                 125Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala
130                 135                 140Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg145                 150                 155                 160Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asn Val Thr Val Thr Ser Asn
            165                 170                 175Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly
       180                  185                 190Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu
    195                 200                 205Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser
210                 215                 220Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val225                 230                 235                 240Leu Asn Asn Pro Pro Ala
            245
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<211>6
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
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<220>
<223>pcr引物
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<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<210>19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<210>21
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
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<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
<400>22ccggggatcc gatgacccgg ctgacagtcc tgg                                   33
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu1               5                  10                  15
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn1               5                  10                  15
<210>25
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
<400>25ccgggatcct agtcccacca tgacccggct gaca                                  34
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcr引物
<400>26gcgcgcggcc gcctaggctg gccccgg                                          27

Claims (22)

1、一种在哺乳动物细胞中产生肝素结合蛋白的方法，所述细胞在导入了编码所述肝素结合蛋白的核酸后可在厌养条件下培养，其中所述方法包括
(a)将编码所述肝素结合蛋白的核酸导入上述细胞；
(b)在能诱导所述HBP表达的条件下培养步骤(a)的细胞；以及
(c)从该培养液回收所述HBP。
2、如权利要求1所述的方法，其中哺乳动物肝素结合蛋白是人源或猪源HBP。
3、如权利要求1所述的方法，其中回收自培养基的HBP具有与SEQ IDNO：1或2，或其等位基因变体或天然变体的氨基酸序列至少约80％同一性的氨基酸序列。
4、如权利要求1所述的方法，其中将与SEQ ID NO：3、4、5、7、9或11所示核酸序列；(ii)其互补链，或(iii)(a)或(b)的亚序列杂交的核酸序列导入所述哺乳动物细胞。
5、如权利要求1所述的方法，其中从培养基回收的HBP具有SEQ IDNO：1或2所示氨基酸序列。
6、如权利要求1所述的方法，其中将SEQ ID NO：3、4、5、7、9或11所示核酸序列导入所述哺乳动物细胞。
7、如权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列编码以信号序列为先导的成熟HBP。
8、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的细胞包括编码肝素结合蛋白前序列和成熟的肝素结合蛋白的核酸序列，其中编码N末端延伸的肝素结合蛋白的核酸序列包括编码蛋白酶酶切位点的核酸序列，该位点位于编码N末端延伸的核酸序列与编码成熟的肝素结合蛋白的核酸序列之间。
9、如权利要求7所述的方法，其还包括裂解N末端延伸的HBP以获得成熟的HBP。
10、如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的细胞含有编码肝素结合蛋白信号序列，肝素结合前序列，成熟的肝素结合蛋白的核酸序列以及编码蛋白酶酶切位点的核酸序列，该位点位于编码肝素结合蛋白前序列的核酸序列与编码成熟的肝素结合蛋白的核酸序列之间。
11、如权利要求9所述的方法，其还包括裂解N末端延伸的HBP以获得成熟的HBP。
12、如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞为腺病毒转化型细胞。
13、如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞为胚衍生的细胞。
14、如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞为人胚肾细胞。
15、如权利要求1所述的方法，其中宿主细胞为人胚肾293细胞。
16、如权利要求1所述的方法，进一步包括纯化所述肝素结合蛋白。
17、产生所述哺乳动物HBP的方法，其包括：(a)将编码HBP的核酸导入哺乳动物宿主细胞，这些细胞可在导入了所述核酸后在厌氧条件下培养；(b)选择包含编码所述肝素结合蛋白的核酸的步骤(a)的哺乳动物宿主细胞；(c)在无血清并任选无蛋白的培养基上培养所述宿主细胞；(d)分离所述HBP。
18、如权利要求16所述的方法，其进一步包括纯化所述肝素结合蛋白。
19、一种重组哺乳动物宿主细胞，其在导入了编码哺乳动物肝素结合蛋白的核酸后可在厌氧条件下培养，所述细胞包含编码所述肝素结合蛋白的核酸序列。
20、如权利要求18所述的重组哺乳动物宿主细胞，其中所述核酸序列编码人HBP。
21、如权利要求18所述的重组哺乳动物宿主细胞，其中所述核酸序列编码以信号序列为先导的成熟HBP。
22、如权利要求18所述的重组哺乳动物宿主细胞，其中该重组宿主细胞为人胚肾293细胞。
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