CN1527721A - 含治疗性蛋白混合物的组合物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了由过度表达细胞因子调节因子的细胞产生的人细胞因子混合物及其生产方法。该混合物通过以下步骤制备：在细胞因子调节因子过度表达的条件下培养人细胞因子生成细胞，处理细胞以诱导细胞因子产生，分离由该细胞产生的细胞因子混合物。

Description

含治疗性蛋白混合物的组合物及其生产方法
技术领域
本发明涉及由人细胞系产生的组合物，它包括用于治疗病毒感染、癌症、炎症性疾病、其它细胞因子反应性疾病的选择的细胞因子混合物，以及制造该组合物的方法。
参考文献
Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990.
Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997.
Ausubel FM等人，分子生物学现代工具(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1989.
Barber，G.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，4278-4282，1994.
Clemens MJ和Bommer UA，Int J Biochem CellBiol， 31(1)：1-23，1999.
Cohen，J.J.，Immunol Today  14(3)：126-130，1993.
Der，D.，和Lau，A.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  92，8841-8845，(1995).
Donze，O.，等人，Virol  256：322-329，1999.
Galabru，J.，和
Hovanessian，A.，J.Biol.Chem. 262：15538-15544，1987.
Hershey，J.W.B.，Ann.Rev.Biochem. 60：717-755，1991.
Hopp等人，Biotechnology  6：1204-1210，1988.
Hovanessian，Biochimie  62：775-778，1980.
Huang等人，Oncogene  14：405-414，1997.
Inoue I等人，(Neurol Med Chir(Tokyo)31(8)：484-489，1991).
Jagus R.等人，Int J Biochem Cell Biol.31(1)：123-38，1999.
Koromilas等人，Science  257：1685，1992.
Kumar，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  91，6288-6292，1994.
Larrick，J.W.，和Wright，S.C.，FASEB J  4：3215-3223，1990.
Liddil，J.D.，等人，Cancer Res  49：2722-2728，1989.
Meurs，E.，等人，Cell  62：379-390，1990.
Mulligan和Berg，1980.
Orrenius，S.，J Intern Med  237：529-536，1995.
Patel，R.C.和Sen，G.C.EMBO J.，17，4379-4390，1998.
Rubin，B.Y.，等人，Cancer Res  48：6006-6010，1988.
Sambrook J等人，见分子克隆：实验室指南.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，Vol.2，1989.
Southern和Berg，J Mol Appl Genet.1(4)：327-41，1982.
Srivastave，S.，等人，J.Biol.Chem. 273：2416-2423，1998.
Stellar，H.，Science  267：1445-1449，1995.
Sugden等人，Mol.Cell.Biol.，5：410-413，1985.
Vaux，D.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90：786-789，1993.
Wek RC，Trends Biochem Sci；19：491-496.1994.
Williams BR，Oncogene 18(45)：61 12-20，1999.
Yeung，M.C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  93，12451-12455，1996.
Yeung，M.C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(21)：11860-5，1999.
背景技术
细胞因子被用于治疗许多人类病态，包括癌症、病毒感染和炎症。典型地，细胞因子治疗涉及给予单一的、分离的且通常是重组的细胞因子，如干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)或组织坏死因子(TNF)等。尽管观察到了一些治疗效果，但改善的程度不是最满意的，且细胞因子通常与一个或多个另外的治疗方法联合用药。
体内产生细胞因子的细胞，如单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树状细胞、TH1和TH2、肥大细胞、NK细胞和骨髓基质细胞，通常产生细胞因子的复合混合物。因而，当单独给予单一细胞因子时没有最佳的效果是不奇怪的。
因此可能需要制备临床使用的含有细胞因子混合物的细胞因子组合物，它与体内产生的天然细胞因子混合物相似。在产生和分泌高水平细胞因子的细胞培养系统中生产这种细胞因子混合物将是特别需要的。
母案申请序列号09/595,338和其临时先前申请公开了一种产生高水平细胞因子的细胞培养方法，通过在细胞因子调节因子过度表达和细胞因子诱导条件下生长产生细胞因子的人细胞。本申请涉及通过相关方法产生的细胞因子混合物，这些方法是获得改善的细胞因子组合物的方法、以及应用含细胞因子混合物组合物的方法。
发明概述
本发明提供了含有人细胞因子混合物的组合物，它通过以下步骤制备：培养能够产生细胞因子混合物并以细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白过度表达为特征的人细胞系，处理细胞系以有效增强细胞因子混合物的产生，并收集由该细胞产生的细胞因子。细胞系可通过激发或激发和诱导来处理。
可以用编码细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白的核酸序列转化、或通过亚克隆和选择来产生细胞因子调节因子过度表达细胞系。
在一种方法中，细胞因子通过选择的细胞因子的共纯化而被收集。
在本发明一个用于癌症治疗的方面，细胞因子混合物包括选自以下的两种或更多种细胞因子：白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、自然杀伤增强因子(NKEF)、自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)、TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在本发明另一个用于病毒感染治疗的方面，细胞因子混合物包括选自以下的两种或更多种细胞因子：干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、转化生长因子-β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在本发明另一个用于炎症状态治疗的方面，细胞因子混合物包括选自以下的两种或更多种细胞因子：白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)和转化生长因子-β(TGF-β)。
本发明进一步提供了在细胞培养中生产人细胞因子混合物的方法，它包括以下步骤：培养能够产生细胞因子混合物并以细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白过度表达为特征的人细胞系，处理细胞系以有效增强细胞因子混合物的产生，并收集由该细胞产生的细胞因子。细胞系可通过激发或激发和诱导来处理。
在本发明的实施过程中，可以使用此方法生产上面列出的选择的细胞因子混合物以用于癌症的治疗、病毒感染的治疗和/或炎症状态的治疗。
从以下发明的详细描述中，本发明的这些和其它目的和特征将更明显。
附图描述
图1显示了亲代野生型(WT)和表达CrmA的(Crma-#2)MG-63细胞在超诱导和用仙台病毒诱导后，检测细胞活力的碘化丙啶测定的结果。
图2显示了亲代野生型(WT)和表达CrmA的(Crma-#2)MG-63细胞在超诱导和仙台病毒处理后干扰素-β的产生。
图3显示了0、2mM、4mM和8mM 2-氨基嘌呤(2-AP；PKR抑制剂)对超诱导后表达CrmA的(Crma-#2)MG-63细胞中干扰素-β产生的影响。
图4A和4B显示分别被仙台病毒(4A)和polyIC(4B)细胞因子诱导后，6A、A9和WT细胞系的存活百分比。
图5A和5B显示分别用仙台病毒(5A)和polyIC(5B)处理后，Namalwa细胞转化体6A、A9和WT细胞系中产生的IFN-α的水平。
图6显示了Namalwa野生型(WT)和Namalwa PKR-过度表达细胞系Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9.的细胞培养中，TNF-β、IL-6和IL-8细胞因子的共表达。
发明的详细说明
I.定义
除非另有所指，这里所用的所有技术和科学术语具有对本发明领域内的技术人员而言相同的含意。从业人员对于本领域的定义和术语，特别指定Sambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993。可以理解，本发明不限于描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。
在此所用，术语“载体”指被设计用于在不同宿主细胞间传递的核酸构建物。“表达载体”指能够在外源细胞中掺入并表达异种DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体可从商业渠道获得。对合适表达载体的选择在本领域专业技术人员知识范围内。克隆或表达载体可含有另外的组成部分，如表达载体可有两个复制系统，因而使其被保留在两个生物体中，如在人细胞中表达，而在原核宿主中克隆和扩增。克隆和表达载体典型地还含有一个可筛选的标记。
在此所用，术语“编码可筛选标记的核苷酸序列”指能够在哺乳动物细胞中表达的核苷酸编码序列，其中可筛选标记的表达使含有表达基因的细胞具有在筛选试剂存在的情况下生长的能力。
在此所用，术语“启动子”指具有引导下游基因转录功能的核酸序列。启动子通常会适合于要表达靶基因的宿主细胞。对于表达特定的基因，启动子与其它转录和翻译调节核酸序列(“调控序列”)结合在一起是必要的。通常，转录和翻译调节序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录启始和终止序列、翻译启始和终止序列、和增强子或活化子序列。启动子可是构成性的或可诱导的，可以是天然存在的、生物工程的或杂交的启动子。杂交启动子结合多个启动子的元件，通常为本领域已知，并被用于实施本发明。
术语“调控序列”指在特定宿主有机体中，对于表达可有效连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核细胞的调控序列典型地包括启动子，任选地是操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷信号和增强子。
“异源”核酸构建体或序列包括在其表达的细胞中的非本身具有的序列部分。对于调控序列而言，异源指对其目前调节的相同的基因表达实质上没有作用的调控序列(即启动子或增强子)。通常，异源核酸序列不是它们所存在的细胞或部分基因组的内源性序列，并已经通过感染、转染、微注射、电穿孔等被加入细胞中。“异种”核酸构建物可含有调控序列/DNA编码序列联合，与天然细胞中发现的调控序列/DNA编码序列联合相同或不同。
在此所用，相对于重组DNA构建物或载体，术语“可有效连接的”指为有效的控制所选择的编码序列，直接相互连接的重组DNA构建物或载体的核苷酸组分。通常，“可有效连接的”DNA序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况下，是相邻的并在阅读框架内。但是，增强子不是一定要相邻的。连接是通过在合适的限制性位点的连接实现的。如果这种位点不存在，根据惯例使用合成的寡核苷酸接头或连接子。
在此所用，术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段，它可以包括或不包括编码区的前导和后续区，如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“尾”序列，以及在各个编码片段(外显子)间的插入序列(内含子)。
“用载体转染的细胞”指已经与载体接触并已吸收载体的细胞，或者作为自我复制的基因组分或通过整合进细胞基因组，以这种方式使载体编码的蛋白表达。表达可在载体中构成性启动子控制之下，此时蛋白在没有诱导剂存在的情况下发生表达，或在可诱导的启动子的控制之下，为获得载体基因的表达或高水平表达需要在培养基中存在诱导剂。
在此所用，“重组”包括细胞或载体，它们已经通过导入异种核酸序列而被修饰，或该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，作为故意的人为干预的结果，重组细胞具有修饰的基因表达，如在天然(非重组)细胞中未发现相同形式的基因表达，或表达了另外异常表达的、低表达的或完全不表达的天然基因。
在此所用，术语“转化的”、“稳定地转化的”或“转基因的”，就哺乳动物细胞而言是指在其基因组中整合进了非本身的(异源的)核酸序列的哺乳动物细胞，此基因组保持2或多代。
在此所用，术语“表达”指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程典型地包括转录和翻译，但在某些情况下可指没有翻译的转录。
术语“细胞因子调节因子表达”指细胞因子调节因子基因的转录和翻译，其产物包括RNA前体、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽、及其衍生物，并包括来自其它种属的细胞因子调节因子如鼠或猿的酶类。
由此得出结论，术语“PKR表达”指编码PKR的核酸序列的转录和翻译，其产物包括RNA前体、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽、及其衍生物，并包括来自其它种属的PKRs如鼠或猿的酶类。
在此所用，术语“生物学活性”和“生物学活性的”指由培养的细胞系中特定蛋白引起的活性。应当理解，这种蛋白的“生物学活性”可依培养条件而有些不同并通常报告为活动的范围。因此，“生物学无活性”形式的蛋白指一种以干扰蛋白已知活性的方式已经修饰了的蛋白形式。
在此所用，术语“细胞因子调节因子的生物学活性”和“生物学活性的细胞因子调节因子”指与特定细胞因子调节因子或其任何片断、衍生物或类似物相关的任何生物学活性，如酶活性，等。
在此所用，术语“细胞因子调节因子活性的正常水平”和“细胞因子调节因子表达的正常水平”指细胞因子调节因子活性或表达的水平，是在存在的未修饰的、未诱导的、非激发的或未感染的特定类型细胞，如特定类型的亲代细胞系中测定的。应当理解，这种“正常的”细胞因子调节因子活性或表达被报告为细胞因子调节因子活性或表达的范围，它通常是对特定类型细胞的观察，该细胞尚未通过导入编码细胞因子调节因子的核酸序列而被修饰或因细胞因子调节因子过度表达而被筛选。
由此得出结论，术语“PKR的生物学活性”和“PKR的生物学活动”指与PKR或PKR的片断、衍生物或类似物相关的任何生物学活性，如酶活性，特别包括自动磷酸化和涉及底物磷酸化的激酶活性，底物例如真核细胞翻译启动因子2(eIF-2)和转录因子如NF-κB。
“正常”细胞因子调节因子活性或表达的范围可依培养条件而有些不同。例如，U937细胞系可以有与Namalwa细胞系的细胞因子调节因子活性正常范围不同的细胞因子调节因子活性正常范围。由此得出结论，细胞因子调节因子的过度表达是指高于通常对特定类型细胞所观察到的细胞因子调节因子表达正常范围的表达水平，该种细胞未通过导入编码细胞因子调节因子的核酸序列而被修饰或因细胞因子调节因子过度表达而被筛选，是未刺激的(没有激发或诱导的)和非感染的。
因此，细胞因子调节因子的“过度表达”是指细胞因子调节因子的活性、表达或产生的范围超过通常对特定类型细胞所观察的范围，该细胞未通过导入含有PKR编码序列的载体而被修饰或因PKR的过度表达而被筛选，是未刺激的(没有激发或诱导的)和非感染的。
在一个优选的方面，细胞因子调节因子过度表达是指，在使用的特定培养条件下，细胞因子调节因子活性、表达或产生的水平比相同细胞系的细胞因子调节因子活性、表达或产生的正常水平至少超过125％(1.25倍或1.25×)，优选地至少150％、200％、300％或400％、或500％或以上。换言之，过度表达细胞因子调节因子的细胞系典型地具有一定的细胞因子调节因子产生或表达水平，该水平超过相同类型细胞所通常具有的细胞因子调节因子表达或产生水平至少1.25-倍，并优选1.5-倍(1.5×)、2倍(2×)、3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更高水平，该细胞未被以有效导致细胞因子调节因子过度表达的方法选择、修饰、激发或处理。
在某些情况下，过度表达细胞因子调节因子如PKR的细胞系具有的细胞因子调节因子表达或产生水平超过相同类型细胞所通常具有的细胞因子调节因子表达或产生水平10倍(10×)或以上，后者在所用的特定培养条件下并未被以有效导致细胞因子调节因子过度表达的方法选择、修饰、激发或处理。
在此所用，就活性、表达和产生而言时，术语“细胞因子的正常水平”和“蛋白的正常水平”，指在特定类型亲代细胞中存在的细胞因子或其它蛋白活性、表达或产生的水平，该亲代细胞未被以有效导致细胞因子调节因子过度表达的方法选择、修饰、激发或处理。实例包括，未被以导致细胞因子调节因子活性、表达或产生增加的方法选择、激发或处理的野生型(“亲代”)细胞系，和不含导入的细胞因子调节因子编码序列的细胞系。应当理解，这种“正常的”细胞因子或其它蛋白活性、表达或产生被报告为活性、表达或产生的范围，通常是对特定类型细胞的观察并可依培养条件不同而有些变化。
相对于细胞因子或蛋白活性、表达和产生而言时，术语“增加的水平”和“超过正常水平”可以互换使用。该术语指细胞因子或蛋白活性、表达或产生的水平，在使用的特定培养条件下，比相同细胞系的亲代细胞所具有的细胞因子或蛋白活性、表达或产生水平至少超过125％(1.25倍或1.25×)，优选地至少150％、200％、300％或400％、或500％或以上，该亲代细胞未被以有效导致细胞因子或蛋白活性、表达、或产生增加的方法选择、修饰、激发或处理。在某些情况下，细胞因子或蛋白活性、表达、或产生，比亲代细胞系增加10倍(10×)或以上。
在此所用，术语“抑制凋亡的细胞死亡”是指在以细胞因子或其它蛋白表达或产生为目的的细胞系培养期内部分或完全地抑制细胞死亡过程。这种抑制通常是指凋亡细胞死亡的数量相对于未以有效抑制凋亡的方法修饰的细胞系中所观察到的凋亡细胞死亡数量至少下降20％，优选地至少50％，更优选地80％或以上。
术语“抑制凋亡的蛋白”指，当在细胞中表达时抑制凋亡的蛋白，特别是与细胞因子调节因子过度表达和/或细胞因子诱导相关的凋亡。有效抑制凋亡的蛋白实例包括但不限于CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL、真核细胞翻译起始因子2α(eIF-2α)和真核细胞翻译起始因子3(eIF-3)的修饰形式、Fas相关死亡功能区(FADD)的修饰形式、Bcl-Xs的修饰形式、Bcl-2-同源拮抗剂/扼杀剂(BAK)的修饰形式和BAX的修饰形式，优选地Bcl-2a或Bcl-XL。
CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的“过度表达”分别是指，CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的活性或表达范围超过通常在特定类型细胞中所观察到的范围，后者没有用编码CrmA、Bcl-2a或Bcl-XL的载体转染，并被刺激以经历凋亡。
“细胞因子”指一组低分子量调节蛋白，它们通过对淋巴细胞和其它免疫细胞发挥的各种作用调节免疫反应的密度和时间。
“产生细胞因子的细胞”指在体内、也在细胞培养中分泌细胞因子的细胞，典型地是血液细胞。这种细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树状细胞、B细胞、内皮细胞、上皮细胞、TH1和TH2(T-辅助细胞)、NK(自然杀伤)细胞、嗜酸性肥大细胞、骨髓细胞、纤维母细胞、角化细胞、成骨细胞衍生的细胞、黑素细胞、血小板、各种其它免疫系统细胞、胰腺基质细胞、胶质细胞和来源自这些细胞类型的肿瘤细胞。
在此所用，术语“修饰”和术语“细胞系修饰”就培养的人细胞系而言时，指在亲代人细胞系中导入编码细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白的异源核酸序列。在异源核酸构建物中的编码序列可以是异源的或自体来源的。
“选择”细胞因子调节因子过度表达的细胞通常指亚克隆、筛选和选择过度表达一种或多种细胞因子调节因子的细胞，并培养细胞以产生细胞因子调节因子过度表达的细胞系。
如下面进一步描述的，筛选通常包括生物学活性的功能检测、蛋白检测和细胞因子调节因子mRNA检测。
在此所用，就细胞因子调节因子过度表达细胞系而言时，术语“激发”典型地指将细胞与多种试剂中的任意一种接触，如佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯(PMA)或干扰素-β。
术语“诱导”或“诱发”在此所用就细胞因子调节因子过度表达细胞系而言时，典型地指将细胞与微生物诱导剂接触，如仙台病毒、脑心肌炎病毒、单纯疱疹病毒或新城疫病毒；或将细胞与至少一种选自如下非微生物诱导剂接触：poly(I)：poly(C)(polyIC)、或polyr(I)：poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、环己酰胺、放线菌素D、丁酸钠、钙离子载体、植物血凝素(PHA)、脂多糖(LPS)及其衍生物，如3-脱酰LPS和硫酸软骨素。诱导剂的特殊实施例包括诱导前列腺素E2的表面粗糙度、诱导TGF-β的钛颗粒、诱导TNF-α的四氮化三硅、诱导EPO和VEGF的低氧、以及诱导osteoprotegerin的IL-1-α、TNF-α和TNF-β。
在此所用，就细胞因子调节因子过度表达细胞系而言时，术语“处理”和“处理的”通常指诱导，但可用于关于激发和/或诱导和/或与附加试剂接触，如DEAE葡聚糖。
在此所用，术语“细胞因子混合物”指由人细胞系产生的、含有两种或更多种细胞因子的组合物。
在此所用，就人受试者或患者而言时，术语“处理的”、“处理”和“治疗”指医疗性治疗、防治性治疗和预防性治疗。
II. 细胞因子调节因子
已知许多因子参与诱导和/或增加细胞，如人细胞内细胞因子的表达。这些因子包括细胞因子-和其它蛋白-特异的转录调节因子，如干扰素调节因子(IRF-1、IRF-3和IRF-7)、细胞因子受体、核因子κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)、核因子IL-6(NF-IL6)，及特别是PKR。
这些因子中任何因子的表达或活性增加通常会引起一种或多种编码细胞因子的基因高于正常的表达。在此所用，PKR作为能够调节细胞因子或其它蛋白表达的一个蛋白实例；但是，应当理解，本发明考虑多种细胞因子和蛋白增强因子(在这里定义为“细胞因子调节因子”或“CRF”)中的任何一种，如蛋白激酶C(PKC)诱导剂、TNF-α、GM-CSF、EGF和PDGF、G-CSF、TGF、TNF-α或TNF-β、IL-1、IFNs(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)或细胞因子(IL-8、巨噬细胞炎症蛋白[MIP-1a & -1b]和单核细胞趋化蛋白[MCPs])；其它细胞信号传导因子如PMA、钙离子载体、丁酸钠或内毒素；polyI：C、双链RNA或病毒类似物；PHA，能够激活PKR的细胞应激信号，包括热休克、病原体感染如病毒感染；以及增强引起细胞因子产生增加的细胞因子调节因子表达的任何因子。
通过增加人细胞中细胞因子调节因子的表达/活性，可以增加细胞因子的产生。因此，表达细胞因子调节因子较高构建物水平的人细胞培养，或其中细胞因子调节因子的表达可被诱导到较高水平者，被用于细胞因子混合物的生产。
本发明的方法依赖于使用过度表达细胞因子调节因子的细胞，而不需要细胞因子调节因子过度表达的特殊方法。
各种功能已被认为是PKR所有，包括真核细胞启动因子-2(eIF-2α)的磷酸化，它一旦磷酸化就引起蛋白合成的抑制(Hershey等人，1991)。PKR的此特殊功能被认为是解释IFN-α和IFN-β介导抗病毒和抗增殖活性的机制之一。PKR的另外生物学功能是其假定的作为信号转换器的作用，例如通过IκB的磷酸化引起核因子κB(NF-κB)的释放和活化(Kumar A等人，1994)。
以前已经显示，PKR介导IFN表达的转录活化(Der D和Lau AS，1995)。与此观察一致，通过用反义PKR转染U937细胞或表达PKR缺陷突变体，抑制内源性PKR的活性，导致了对病毒感染反应的IFN诱导作用减少(Der D和Lau AS，1995)。
还已显示，用编码PKR的核酸序列转染的细胞干扰素产生增加，如共有的美国专利No.6,159,712中所描述的。
还已提示，PKR可作为肿瘤抑制剂和凋亡诱导剂而起作用(见如，Clemens MJ等人，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)。最近的结果表明，PKR活性形式的表达可能通过上调Fas受体引发凋亡(Donze O等人，1999)。
本发明使用过度产生细胞因子调节因子如PKR的产生细胞因子的细胞，在产生正常水平的上述一种或多种内源性细胞因子调节因子的条件下，通过导入编码细胞因子调节因子的核酸序列，或通过培养未转化的细胞，或仅用抑制凋亡的基因转化细胞。这可以通过选择、激发和/或进一步处理如诱导来完成。
关于PKR，增强产生/表达的另外方法包括，失活或降低PKR抑制因子p58的水平，p58一般抑制PKR活性。突变、修饰或基因靶向地切除p58已经显示引起PKR活性增强(Barber，G.N.等人，1994)。进一步，可以使用能够增加PKR表达的天然、合成或重组的PKR激活剂，如PKR活化蛋白、PACT(Patel，R.C.和Sen，G.C.，1998)。
III. 本发明的方法和组合物
A.细胞因子的联合
细胞因子通过与其关联的受体结合，随后通过引起刺激各种生物化学过程的信号转导而发挥其生物学活性。在某些情况下，这种受体的表达是被特异的信号调节的。细胞因子可涉及正性或负性反馈环，并因此调节相同或不同细胞因子受体的表达。这种受体可以是产生该细胞因子的同一类型细胞，或者是不同类型的细胞。细胞因子用来介导和调节免疫和炎症反应。
应当理解，细胞因子的细胞来源对每一个独立的细胞因子具有区别的特征，且一个独立的细胞因子可以由多种不同类型的细胞产生。此外，特定的细胞因子(1)可对多个类型的细胞起作用，(2)对同一细胞可有多种作用，(3)可与另一个细胞因子具有一种活性，和(4)可影响其它细胞因子的合成或作用，如通过拮抗、或协同其作用。
这里描述的方法在生产治疗用两种或更多种细胞因子的混合物中是有用的，特别是用于治疗癌症、病毒感染、或炎症的细胞因子混合物，如共有的美国申请序列号09/660,468中所细述的，在此特别合并为参考文献。
用本发明方法可以增加其表达的细胞因子的实例包括但不限于，干扰素类(α、β和γ)、白介素类(IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2和IL-4至13)、肿瘤坏死因子α和β(TNF-β)及其各自的可溶性受体(sTNF-R)、集落刺激因子类(粒细胞集落刺激因子，G-CSF；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，GM-CSF；和IL-3)、血管生成因子类(成纤维细胞生长因子，FGF；血管内皮细胞生长因子，VEGF；和血小板衍生的生长因子1和2(PDGF-1和-2)和抗血管生成因子类(血管生成抑素和血管抑素)。
总之，本发明提供了由细胞系产生的一个细胞因子混合物，该细胞系的特征在于表达细胞因子调节因子和/或表达抗凋亡蛋白，在合适的条件下培养，可以有效地引起两种或更多种细胞因子产生的方式被修饰、选择、激发和/或处理。本发明进一步提供了由这种细胞系产生的细胞因子类的混合物。在一个优选的方法中，细胞因子由细胞系产生，分泌进培养基中并被分离(从也存在于细胞培养基中的不需要的成分中纯化)。
优选的混合物包括但不限于，(1)干扰素α(IFN-α)和干扰素β(IFN-β)；(2)干扰素α、干扰素β和干扰素γ(IFN-γ)；(3)干扰素α和干扰素γ；(4)干扰素β和干扰素γ；(5)干扰素α、干扰素β和干扰素γ之一加肿瘤坏死因子α(TNF-α)；(6)干扰素α、干扰素β和干扰素γ之一加肿瘤坏死因子β(TNF-β)；(5)干扰素α、干扰素β和干扰素γ之一加白介素-2(IL-2)；(6)干扰素γ和白介素-1b(IL-1b)；(7)干扰素γ和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；(8)干扰素γ、白介素-4和肿瘤坏死因子α；(9)白介素-2和白介素-12；(10)白介素-2、白介素-4或白介素-6之一和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；(11)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白介素-2和干扰素α或干扰素β。
一个优选的抗癌症或抗肿瘤组合物包括选自下列的两种或更多种细胞因子：IL-1-α、IL-1-β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、制瘤素、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、G-CSF、NKEF、NKSF、TRAIL和M-CSF，更优选的选自下列因子：IL-2、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、TNF-α、自然杀伤细胞增强因子(NKEF)、自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)、TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)和GM-CSF。组合物被优选地处理以去除下列细胞因子：IL-3、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1 1、IL-1和TGF-β。为用于治疗病毒感染，组合物优选地包括选自下列的两种或更多种细胞因子：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-12和GM-CSF，更优选地选自IFN-α、IFN-β、TGF-β、IL-8、IL-12和GM-CSF。组合物被优选地处理以去除下列细胞因子：IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-11、IL-13、TNF-α、TNF-β和制瘤素。
为用于治疗炎症状态，组合物优选地包括选自下列的两种或更多种细胞因子：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IL-1i、IFN-β、TGF-β和IFN-γ，并优选地选自IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-β、IFN-γ和TGF-β。组合物被优选地处理以从组合物中去除下列细胞因子：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、TNF-α、TNF-β、TGF-β和制瘤素。
本发明的细胞因子混合物或组合物在治疗癌症、病毒感染或炎症中有用途。一般地，要调整给予的总细胞因子剂量以使任何一个细胞因子成分以较低的剂量用药，如该细胞因子单独给予时正常剂量的10％-50％。
B、生产细胞因子混合物的细胞和培养条件
本发明依赖于产生人细胞因子的细胞，它们因其产生所需的细胞因子混合物的能力而被选择，如适于癌症治疗、病毒感染治疗或炎症治疗的混合物。
因此，本发明提供了由这样的细胞组成的细胞系，相对于相应的亲代细胞系(未修饰的、非选择的、未激发的和非诱导的)，它们已被以有效引起细胞因子混合物产生增加的方式被选择、修饰、激发，和/或激发和诱导。
用于产生细胞因子混合物的亲代细胞系实例包括但不限于B细胞类(例如Namalwa、293、CCRF-SB或Raji细胞)、单核细胞类(U937、THP-1)、流式1000细胞、流式4000细胞、纤维母细胞类(MRC-5、WI-38、FS-4、FS-7、T98G和MG-63细胞)、T细胞类(CCRF-CEM和Jurkat细胞)和其它细胞。
用于产生细胞因子混合物的亲代细胞系实例包括但不限于，单核细胞/巨噬细胞系细胞、淋巴细胞系细胞包括T-和B-细胞、肥大细胞、纤维母细胞、骨髓细胞、角化细胞、造骨细胞衍生的细胞、黑素细胞，内皮细胞，血小板，多种其他的免疫系统细胞，肺上皮细胞，胰腺基质细胞、胶质细胞和从这些细胞类型衍生的肿瘤细胞。各种细胞因子的主要细胞来源在下面的表1中提供。衍生自这些细胞的细胞系是应用这里描述的方法生产细胞因子混合物的合适的候补者。
      表1. 各种细胞因子的细胞来源
  细胞因子   分子量(kD)   主要细胞来源
  干扰素类
  IFN-α(＞12亚型)   16-20   巨噬细胞，纤维母细胞，淋巴样干细胞
  IFN-β   20   纤维母细胞，巨噬细胞，上皮细胞
  IFN-γ   20-25   T-细胞，NK细胞，树状细胞
  肿瘤坏死因子类
  TNF-α   17   单核细胞/巨噬细胞，纤维母细胞，T-细胞
  TNF-β(淋巴毒素)   25   T-细胞，B-细胞
  白介素类
  IL-1α & IL-1β   17.5   单核细胞/巨噬细胞，内皮细胞，纤维母细胞，角化细胞
  IL-2   15-17   T-细胞
  IL-4   15-19   T-细胞，肥大细胞
  IL-5   50-60   T-细胞，肥大细胞
  IL-6   26   单核细胞/巨噬细胞，纤维母细胞，T-细胞
  IL-7   25   骨髓细胞
  IL-8   6-8   单核细胞，纤维母细胞，软骨细胞，内皮细胞，角化细胞
  IL-9   32-39   T-细胞
  IL-10   19   T-细胞
  IL-11   23   骨髓细胞
  IL-12 p35 & p40   35，40   B-细胞，淋巴样干细胞
  集落刺激因子类
  IL-3   20-26   T-细胞，肥大细胞
  G-CSF   20   单核细胞/巨噬细胞，纤维母细胞，内皮细胞
  GM-CSF   22   T-细胞，纤维母细胞，内皮细胞
  M-CSF   70-90   单核细胞，纤维母细胞，内皮细胞
  生长因子类
  表皮生长因子   6   巨噬细胞
  成纤维细胞生长因子(酸性&碱性)   14-18   血小板，巨噬细胞，内皮细胞
  血小板衍生生长因子1&2   14-18   血小板，单核细胞/巨噬细胞，内皮细胞
  TGF-α   5-8   巨噬细胞
  TGF-β   25   血小板，单核细胞/巨噬细胞，T-细胞，纤维母细胞，内皮细胞
  趋化因子类
  巨噬细胞炎症蛋白1α，1β   8   单核细胞，纤维母细胞，T-细胞
  RANTES   9.5   T-细胞
适合产生细胞因子混合物用于治疗癌症(包括实体肿瘤、黑素瘤、白血病、和其它类型的癌症或新生物)的人细胞包括B-淋巴细胞(B-细胞)、单核细胞、和T辅助细胞。适合体外培养的分离的B-细胞亲代细胞系实例是Namalwa、293和Raji细胞。适合的单核细胞亲代细胞系是U937和THP-1细胞。可用于体外培养的T细胞，含T辅助细胞1和2(TH1，TH2)，包括Jurkat和CEM细胞。
适合产生细胞因子混合物用于治疗病毒感染(包括HIV、肝炎病毒如HBV和HCV病毒、和其它人类致病病毒的感染)的人细胞一般包括B-淋巴细胞(B-细胞)和纤维母细胞系。适合体外培养的分离的B-细胞亲代细胞系实例在上面给出。适合的纤维母细胞亲代细胞系是MRC5、HFF和WI-38细胞。
适合产生细胞因子混合物用于治疗炎症(包括哮喘、过敏症和风湿性关节炎)的人细胞因子产生一般是T-细胞，包括T-辅助细胞，如上面举例的。
一般地，U937细胞优选用于产生FGF和sTNF-R；Jurkat细胞优选用于产生IL-3和TNF-β；纤维母细胞优选用于产生FGF和血管生成抑素；U937细胞优选于产生TNF-α、IFN-α、IL-6及其同源物；表达CD4的细胞包括Jurkat和HUT，优选用于产生TNF-β；及包括Jurkat和Namalwa的T和B细胞优选用于产生IL-8及其同源物。
因此，本发明提供了含有这样的细胞的细胞系，与相应的亲代细胞系相比，它们已以有效地引起细胞因子混合物产生增加的方式被选择、修饰、激发，和/或激发和诱导。
选择的细胞在细胞因子调节因子和细胞因子过度表达的条件下被培养。用于产生细胞因子混合物的细胞在典型地用于培养亲代细胞系的条件下培养。通常，细胞在含有生理的盐分和营养素的标准培养基中培养，如标准细胞培养基RPMI、MEM、IMEM DMED，或可以添加0.1-10％血清，如胎牛血清的F12。可选择地，可以使用不含血清和/或不含动物来源的蛋白或不含蛋白的培养基，它们的许多实例在市场上获得，例如Pro293。培养条件也是标准的，如培养物在固定或滚动培养器中37℃孵育，直至获得所需要的细胞因子生产水平。对于大规模生产，可以使用发酵罐，细胞以成批或灌注方式生长。从Namalwa细胞中产生细胞因子的培养基和培养条件实例在实施例3中描述。
一般地，特定细胞系的培养条件可以在科技文献中和/或从细胞系来源处如美国典型培养物保藏中心发现。对原代细胞系如纤维母细胞、B-细胞、T-细胞、内皮细胞、树状细胞和单核细胞的优选培养条件也通常可在科技文献中得到。在细胞生长已经确定后，细胞接受有效导致或允许一种或更多种细胞因子调节因子过度表达的培养条件，被激发和/或激发和诱导以增加细胞因子混合物的产生。
当外源提供的编码细胞因子调节因子的核酸序列在可诱导启动子的控制下时，适合的诱导剂，如金属盐或抗生素，以有效诱导细胞因子表达/产生的浓度被加入培养基中。
IV. 增加的细胞因子产生
A.增加的细胞因子调节因子表达
通过增加人细胞中细胞因子调节因子如PKR的表达/活性，可以增加人细胞因子混合物的产生。因此，表达较高的细胞因子调节因子构成水平，或其中细胞因子调节因子的表达可以被诱导到较高的水平的人细胞培养物用于生产细胞因子混合物。
一旦获得了过度表达或过度产生细胞因子调节因子的细胞系，该细胞系可进一步以有效引起细胞因子增加的方式被激发和/或诱导。
在一个优选的方法中，步骤包括(a)培养能够过度表达细胞因子调节因子的人细胞，(b)在足以过度表达细胞因子调节因子的条件下，将含细胞因子调节因子编码序列的异源核酸构建物，或其类似物或同源物，导入细胞中；选择或筛选已经整合了异源核酸的细胞，并(c)激发；和(d)处理细胞以适合于诱导细胞因子基因的表达。
在一个优选的实施例中，细胞因子调节因子是PKR，细胞被诱导以过度表达PKR。在优选的方面，能够过度表达PKR的细胞以导致较高水平PKR表达或产生的方式被激发和/或被诱导。
本发明提供的细胞系选择、修饰、培养条件、激发或激发和诱导的结合导致特定细胞系的细胞因子产生显著增加，如相对于在相同培养条件下，没有选择、修饰、激发和诱导的同一细胞系所具有的细胞因子生成和表达水平，此细胞因子生成或表达的增加相当于增加至少200％(2倍或2×)、250％(2.5倍或2.5×)、300％(3倍或3×)、400％(4倍或4×)、500％(5倍或5×)，优选地1000％(10倍或10×)，或更多，如这里描述的。在某些情况下，本发明方法引起的细胞因子产生增加为100倍(100×)至1000倍(1000×)或更多。
因此，本发明的一个方面与分离的细胞群有关，即表达或产生细胞因子混合物的细胞系。在此所用，术语“群”指两个或更多细胞的组，它们已衍生自一个单一的亲代细胞。
典型地与细胞培养中细胞因子产生相关的问题在本发明方法中被消除，如非重组哺乳动物系统的低产量、不适当的糖基化、缺少合适的翻译后修饰或微生物系统中产生的蛋白质的错误折叠。
B.凋亡的抑制
凋亡或程序化细胞死亡是细胞内在的自杀过程，其中不需要的单个细胞经历遗传学决定的程序，以染色体DNA碎裂、RNA降解和最终的细胞死亡为终点(综述于Orrenius 1995；Stellar 1995；Vaux 1993)。一旦进入凋亡，细胞经历新的蛋白合成周期和各种形态学/生理学改变，包括胞浆浓缩、核染色质浓缩、膜空泡、以及最终DNA降解，检测为特征性的微核体阶梯。
TNFs作为原型前炎症细胞因子，是由活化的免疫细胞在病原清除、抗病毒活动和肿瘤破坏过程中产生的细胞毒蛋白。但是，体内高水平的TNF-α可以是有害的，因为TNF-α引起代谢紊乱、消耗和血细胞生成抑制。在细胞水平，TNF-α导致超氧化物基团的产生、溶酶体酶类激活(Larrick，等人，1990；Liddil，等人，1989)，并通过激活核酸内切酶活性碎裂DNA(Rubin，等人，1988)，导致凋亡。
已知PKR在TNF-α信号传导通路及诱导凋亡中起作用。已经显示，过度表达PKR的U937细胞也存在凋亡增加(见，如，Yeung MC，等人，1996和Yeung MC，等人，1999.)。
与凋亡相关联的个别原癌基因可能在进行凋亡的细胞中表达，且已经观察到，调节个别原癌基因的表达影响此过程。原癌基因的实例包括c-myc、Fas(APO-1)、p53和Bcl-2以及其它基因如ced-3、ced-4、ced-9和lce(Stellar，1995；Cohen，1993)。
通过抑制凋亡，这里描述的细胞系在培养中具有较长的生存期，并显示细胞因子生物合成的增加和/或产生细胞因子的细胞功能时间延长。
因此，在本发明的一个优选的方面，能够抑制凋亡的选择的基因蛋白，如CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其同源物，在宿主细胞中被过度表达，导致凋亡细胞的死亡抑制或延迟。
在其它情况下，“修饰形式的”凋亡相关蛋白在细胞中被表达。编码凋亡相关蛋白的基因的表达抑制可引起凋亡细胞死亡的抑制或延迟，并可以受下列方法的影响，包括但不限于，内源基因的突变、同源物重组或位点定向的诱变、基因缺失或基因切除或有效引起凋亡相关蛋白编码基因的表达消除或改变的任何方法。
与凋亡相关的蛋白包括但不限于，eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK、BAX，等。“修饰形式的”蛋白是指天然蛋白的衍生或变异形式，它通常具有含至少一个氨基酸取代、缺失或插入的衍生多肽序列，特别优选的是氨基酸取代。氨基酸取代、插入或缺失可发生在多肽序列中的任何残基上，它干扰蛋白的生物学活性。编码变异或衍生蛋白的相应核酸序列被认为是“突变的”或“修饰形式的”基因或其编码序列，并包括在本发明的范围内。
作为举例，人细胞培养中凋亡细胞死亡过程的抑制可以按如下获得：(1)能够抑制凋亡的蛋白过度表达，其实例包括但不限于CrmA、Bcl-2a和Bcl-XL或其同源物；(2)eIF2-α磷酸化的抑制(GenBank登记号A457497)，例如通过突变形式的eIF2-α或真核细胞翻译启动因子(eIF-3)的过度表达，它们采用同源物重组或位点定向诱变(从而抑制PKR的下游底物)的各自内源性基因的突变而制备；(3)内源性FADD活性的抑制，例如通过突变形式FADD的过度表达，它通过内源性FADD基因采用同源物重组或位点定向诱变的突变而制备；或(4)应用跨显性突变，通过Bcl-2a的一个或多个原凋亡配体的内源性基因的突变，例如BAX(GenBank登记号L22473)、BAK(GenBank登记号BE221666)和/或Bcl-Xs(GenBank登记号L20122)，通过同源物重组或位点定向诱变，或通过一个或多个BAX、BAK和Bcl-Xs的基因腐蚀或基因缺失。
细胞死亡可以通过用碘化丙啶(PI)染色细胞来检测，或通过使用对凋亡细胞死亡特异的实验，例如通过用annexin V染色(Vermes，等人，1995)。细胞活力实验与显微镜观察的相关细胞的形态学联合，通过对其结果的评价，可以区别坏死性细胞死亡和凋亡细胞死亡。
在一个方法中，提供了细胞因子调节因子过度表达的细胞系，并用含抗凋亡基因的载体转染，使抗凋亡功能的细胞选择和转染得以采用在细胞因子调节因子过度表达方面已经“稳定”的细胞来进行。在此情况下，细胞因子调节因子过度表达的细胞系可以通过亚克隆和选择，或通过导入和表达编码细胞因子调节因子的核酸序列而制备。
在一个可选择的方法中，细胞首先用含抗凋亡基因的载体转染，然后成功的转化体可用含细胞因子调节因子编码核酸序列的载体进一步转染。这使得可以用已经“稳定的”具有抗凋亡功能的细胞进行二次转染和选择。可选择地，已经“稳定的”具有抗凋亡功能的细胞可以被亚克隆和选择细胞因子调节因子过度表达。
在细胞培养中，通过抑制与细胞因子合成相关的凋亡，特别是在细胞因子调节因子过度表达的条件下，增加细胞因子产生的方法进一步在共有的美国申请序列号09/772,109中描述，在此特别合并为参考文献。
V. 增加内源性细胞因子调节因子活性、表达和/或产生
根据本发明，已经发现，能够表达一种或更多种细胞因子调节因子和细胞因子混合物的细胞系可接受有限稀释克隆(这里提作“亚克隆”)，筛选增强的细胞因子调节因子活性和/或mRNA和/或蛋白表达，进一步亚克隆和选择增强的细胞因子活性和/或表达，如下面进一步描述的。可以用作细胞因子调节因子过度表达的标记物的细胞因子实例包括但不限于，TNF-α和β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF和IFNs。
在实施本方法中，能够表达一种或更多种细胞因子调节因子和一种或更多种细胞因子的细胞系(在此指定为“亲代细胞系)，采用本领域技术人员常规使用的标准方法被鉴定并进行单个细胞的有限稀释克隆。通常，亚克隆步骤至少进行1次，典型地在96孔板上接连3至5次。采用典型地用于培养亲代细胞系的培养条件，培养亚克隆以获得大约0.3至0.5百万细胞/ml的群体。然后检测亚克隆的细胞因子调节因子和细胞因子表达。
细胞因子调节因子表达和/或产生的检测实例包括，生物学活性的功能试验、蛋白检测如Western印迹、及细胞因子调节因子mRNA检测如RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)和Northern印迹、点印迹、或原位杂交，采用根据细胞因子调节因子编码核酸序列的合适的标记探针。
选择细胞因子调节因子表达或产生水平超过亲代细胞系至少2倍(2×)，优选地3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更多倍的亚克隆。在某些情况下，这种选择的亚克隆具有的细胞因子调节因子表达或产生水平是亲代细胞系的细胞因子调节因子表达或产生水平的10倍(10×)或更多。
典型地，选择的亚克隆在用有效引起细胞因子调节因子和细胞因子产生增加的方式处理之前，通过与激发剂接触而被激发。激发剂的实例在下面进一步描述。然后，选择的亚克隆被以有效引起细胞因子调节因子表达增加和细胞因子混合物产生增加的方式诱导。
VI. 通过在细胞内表达异源核酸构建物增加细胞因子调节因子
本发明还提供了已经用含编码细胞因子调节因子核酸序列的载体转导、转化或转染的宿主细胞。培养条件，如温度、pH等，是在转导、转化或转染前预先用于亲代宿主细胞的，并为本领域技术人员所理解。
在一个方法中，人细胞系用表达载体转染，后者具有启动子或有生物学活性的启动子片段，或一个或更多(如一系列)在宿主细胞系中起作用的增强子，与编码一种或多种细胞因子调节因子的DNA片段可有效地连接，使得一种或多种细胞因子调节因子在细胞系中过度表达。
在一个方法中，亲代细胞在结构性或可诱导启动子的控制下，用含细胞因子调节因子编码核酸序列的表达载体转染，使得在合适生长培养基中培养细胞导致细胞因子调节因子核酸序列的过度表达。细胞也可以用第二个载体转染，该载体在细胞因子调节因子过度表达和/或细胞因子产生的条件下，在细胞中表达抑制凋亡的蛋白。
实施例描述了举例的载体和转染方法，以获得适用于本发明中的生产人细胞因子细胞。用含细胞因子调节因子和抗凋亡基因的载体继续转染细胞，在二次转染之前选择成功的转化体。这使得可以用已经“稳定的”表达细胞因子调节因子或抗凋亡基因的细胞进行第二次转染和选择。载体构建和转染条件是常规的，为本领域技术人员已知。特别是，在这种载体构建物中，获得能够被导入并在选择的人细胞中复制的适合质粒或其它载体是熟知的，如从商业途径，其中质粒也可以配备可选择的标记物、插入位点和适合的调控元件如终止序列。细胞因子调节因子、PKR基因和抗凋亡基因Bcl-XL编码序列的实例在实施例1中注明，并可以如所引用的从GenBank中获得。
用于人细胞的合适克隆和表达载体被描述于，Sambrook等人.(1989)分子克隆：实验室指南(第二版)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Planview，N.Y.和Ausubel FM等人.(1989)分子生物学现代工具，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，在此特别合并为参考文献。启动子的例子包括结构性启动子和可诱导启动子，其实例包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、含反应元件(TRE)的启动子和金属硫蛋白启动子。
A. 载体
编码一种或更多种细胞因子调节因子的天然或合成多核苷酸片段(“编码细胞因子调节因子的核酸序列”)或抗凋亡基因，可被合并进能够在人细胞中导入并复制的异源核酸构建物或载体中。这里公开的载体和方法适合用在表达一种或更多种细胞因子调节因子或抗凋亡基因的宿主细胞中。只要在其导入的人细胞中复制并可能存活，任何载体均可使用。大量适合的载体和启动子为本领域技术人员所知并可从商业上获得。
载体是递送DNA到靶细胞的工具。本领域已知的递送核酸构建物进入哺乳动物细胞的方法包括，采用腺病毒载体、逆转录酶病毒载体或腺相关病毒载体的病毒方法。通常，病毒载体，如逆转录酶病毒载体和腺病毒载体的基因转移效率高于非病毒载体。逆转录酶病毒载体，包括最广泛使用的兼性营养鼠白血病病毒(MuLV)载体，只能感染复制中的细胞，其转导速率通常低于腺病毒载体。然而，由于逆转录病毒载体整合进宿主基因组，所以转基因的表达是持久的。最近，逆转录酶病毒载体已被发展，其中携带治疗基因的载体构建物被导入携带两个独立构建物的包装细胞系中，该细胞系表达包装结构蛋白，从而解决了围绕有复制能力的感受态逆转录酶病毒传代的安全问题(Salmons和Gunzburg，1997)。
腺病毒载体可以高效感染许多静息的或复制中的细胞类型。最近，杂交的腺/逆转录酶病毒载体已经得到描述(见，如Bilbao，等人，1997)。腺相关病毒载体也加速转基因整合进宿主染色体及转基因的结构表达，而没有引起强烈的宿主免疫反应。
人工染色体如酵母人工染色体(YAC)载体，也可用来引导异源核酸构建物进入细胞。
用于人细胞的合适克隆和表达载体也被描述于Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人，1989中，在此特别合并为参考文献。DNA编码序列可以通过各种方法插入质粒或载体(这里总起来提作“载体”)。一般地，DNA序列通过标准的方法被插入合适的限制性核酸内切酶位点。这种方法和相关的亚克隆方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。
这种载体典型地配备有可选择的标记物、插入位点、和适合的调控元件，如终止序列。载体可含有对编码序列在宿主细胞中(和/或在载体或宿主细胞环境中，通常编码修饰的可溶性蛋白抗原的序列不在其中表达)的表达有作用的调节序列，包括例如，非编码序列如内含子和调控元件，即启动子和终止子元件或5’和/或3’非翻译区，可有效地连接到编码序列上。大量适合的载体和启动子为本领域技术人员所知，且许多可从商业上获得。
启动子实例包括结构性启动子和可诱导的启动子，其实例包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、如所描述的(ClonTech和BASF)在tet-开或tet-关系统中含tet反应元件(TRE)的启动子、β肌动蛋白启动子和可以通过添加某些金属盐而上调的金属硫蛋白启动子。大量适合的载体和启动子为本领域技术人员所知并可从商业上获得，且被Sambrook，等人，(见上)描述。联合超过一个启动子元件的杂交启动子也在本发明方法中应用。杂交启动子的构建方法为本领域所熟知。
用于这种表达载体中的可选择标记物一般为本领域所知，对适当的可选择标记物的选择依赖于宿主细胞。典型的可选择标记物基因编码使之对抗生素或其它毒素具有抗性的蛋白，例如氨苄青霉素、甲氨喋呤、四环素、新霉素(Southern和Berg，J.，1982)、霉酚酸(Mulligan和Berg，1980)、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素(Sugden等人，1985)。
在本发明的一个优选实施方案中，采用含有外源性分别编码细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白的核酸序列的细胞，在适合的结构性或可诱导启动子的控制下，在适于细胞培养中表达的情况下，获得细胞因子调节因子的过度表达和/或抗凋亡基因的表达。
B. 核酸编码序列
含细胞因子调节因子编码核酸序列的载体可被导入细胞中，引起细胞过度表达一种或更多种细胞因子调节因子。
用于这种载体中的编码核酸实例包括但不限于，来自人p68 PKR基因、鼠PKR基因和其它包括eIF-2-α激酶的酵母GCN2和氯高铁血红素调节的抑制剂(Wek RC，Trends Biochem Sci 1994；19：491-496)的编码序列，人p68 PKR基因在GenBank登记号M35663上找到。用于实施本发明的细胞因子调节因子包括但不限于，ISG(2-5A合成酶GenBank登记号NM_006187，ISGγ3 GenBank登记号NM_002038，MxA GenBank登记号30817，MxB GenBank登记号30818)，IRF-1 GenBank登记号NM_002198，IRF-3 GenBank登记号NM_001571，IRF-7A GenBank登记号U53830，IRF-7B GenBank登记号U53831，IRF-7C GenBank登记号U53832，细胞因子受体，NF-κB GenBank登记号NM_003998，AP-1GenBank登记号J04111，NF-IL6 GenBank登记号X52560，PKC诱导剂，p38 MAPK GenBank登记号AF015256，Jak3 GenBank登记号NM_000215，STAT GenBank登记号NM_007315，IFN-γ GenBank登记号J00219，IFN-β GenBank登记号V00534，IFN-α GenBank登记号J00207，TNF-αGenBank登记号X02910，TNF-β GenBank登记号M16441，GM-CSF GenBank登记号NM_00758，G-CSF GenBank登记号X03655，EGF GenBank登记号NM_001963，PDGFα GenBank登记号NM_002607，PDGFβ GenBank登记号NM_002609，TGF-β GenBank登记号M60316，IL-1，趋化因子(IL8GenBank登记号M28130，MIP-1a GenBank登记号，NM_002983 MIP-1bGenBank登记号J04130)，单核细胞趋化蛋白(MCP1 GenBank登记号NM_002982)，PMA，钙离子载体，丁酸钠或内毒素，polyI：C，dsRNA，病毒类似物，激活PKR的细胞应激信号，(热休克，致病原感染)，与控制PKR表达的启动子相互作用的因子，转导和转录信号(STAT)和任何影响细胞因子产生增加的因子。
此外，编码突变或变异形式的细胞因子调节因子的核酸序列可以包括在载体构建物中，用于细胞因子调节因子的过度表达。用于本发明实施中的多核苷酸包括剪接变异体、与自身核酸编码序列互补的序列及其新的片段。多核苷酸的形式可以是RNA或DNA，并包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链，可以是编码链或非编码(反义，互补)链。在表达时，这些细胞因子调节因子的突变或变异形式可具有升高或降低的活性。
在一个方法中，用转化子位点定向诱变试剂盒(ClonTech)产生突变的细胞因子调节因子编码序列。Cai和Williams(J Biol Chem1998；273：11274-11280)描述了一系列PKR突变体，它们具有底物结合(就eIF-α而言)与激酶活性(底物磷酸化)分离。虽然在底物结合上有效性较少或激酶活性较低，但这些PKR活性下降的突变体可被用于细胞转染以产生表PKR的细胞。
根据熟知的重组技术，选择的细胞因子调节因子编码序列可被插入合适的载体，并用于转化能够过度表达细胞因子调节因子的细胞系。
按照本发明，编码细胞因子调节因子和抗凋亡蛋白的多核苷酸序列或基因包括，剪接变异体、全长基因的片段、融合蛋白的编码序列、天然或全长基因或其功能等价物的修饰形式，这里总起来分别称作“编码细胞因子调节因子的核酸序列”和“编码抗凋亡蛋白的核酸序列”。
由于遗传密码固有的简并性，编码实质上一致或功能上相等的氨基酸序列的其它核酸序列可被用于克隆和表达编码CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列。因此，对于特定的编码CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列，可理解的是，作为遗传密码简并性的结果，可以产生编码同样氨基酸序列的数种编码序列。例如，三联体CGT编码精氨酸。精氨酸可选择地由CGA、CGC、CGG、AGA和AGG编码。因此，应当理解，编码区内的这种取代属于本发明涵盖的序列变异体中。这些序列变异的任一或全部，可以按这里描述的、天然形式CRF-或抗凋亡蛋白编码核酸序列同样的方式被使用。
编码“变异体”CRF-或抗凋亡蛋白的核酸序列可编码“变异体”CRF-或抗凋亡氨基酸序列，它们的改变来自于天然多肽序列的一个或多个氨基酸，两者都包含在发明的范围之内。类似地，涉及CRF-或抗凋亡蛋白时，术语“修饰形式的”是指衍生或变异形式的天然CRF-或抗凋亡蛋白编码核酸序列或天然CRF-或抗凋亡氨基酸序列。典型地，“修饰形式”的天然CRF-或抗凋亡蛋白或蛋白的编码序列分别具有含至少一个氨基酸或核酸取代、缺失或插入的衍生序列。
在实施本发明过程中使用的多核苷酸包括编码天然CRF-或抗凋亡蛋白和其剪接变异体的序列，与编码序列和CRF-或抗凋亡蛋白编码多核苷酸的新片段互补的序列。多核苷酸可能是RNA或DNA形式，包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可能是双链的或单链的，如果是单链则可能是编码链或非编码(反义、互补)链。
如本领域中那些专业技术人员所理解的，在某些情况下产生具有非天然存在密码子的核苷酸序列是有益的。可以选择特定真核细胞宿主所优选的密码子(Murray，E.等人，1989)，例如，用来增加CRF-或抗凋亡蛋白表达的速率或产生具有期望特性的重组RNA转录物，这些特性如较采用天然存在序列产生的转录物具有更长的半衰期。
天然CRF-或抗凋亡蛋白编码核酸序列可被进行基因工程以便为了多种原因而改变编码序列，包括但不限于，对细胞的克隆、处理和/或表达进行修饰的改变。
在一种方法中，用于实施本发明的异源核酸构建物或表达载体包括编码蛋白的序列，该蛋白的活性形式是需要的，如编码细胞因子调节因子(CRF)的序列，在此以PKR为例，或编码抗凋亡蛋白的序列，在此以CrmA、Bcl-2或Bcl-XL为例。
在本发明的一个常规实施方案中，CRF编码核酸序列与天然编码序列之间至少有70％，优选地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。例如，用来表达人PKR的编码序列与发现于GenBank登记号M35663的序列至少有70％，优选地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。
对于细胞因子调节因子编码核酸序列，取代、插入或缺失可发生在序列中的任何残基上，只要编码的氨基酸序列仍然保持天然细胞因子调节因子的生物学活性。
在另一个常规实施方案中，本发明提供了CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其类似物的核酸编码序列，该类似物与GenBank中发现的天然编码序列至少有70％，优选地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。例如，用于表达人p68 PKR基因的编码序列与发现于GenBank登记号M35663的序列至少有70％，优选地80％、85％、90％或95％或更多的序列同源性。
当将CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL或其类似物的核酸编码序列的变异体形式引入人细胞内时，取代、插入或缺失可能发生在序列中的任何残基上，只要编码的氨基酸序列仍然保持天然抗凋亡蛋白的生物学活性。
在一个相关的实施方案中，可以通过引入一个与凋亡相关的蛋白如eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK、BAX等的修饰编码序列而抑制凋亡。在这个实施方案中，修饰的eIF-2a或eIF-2α、eIF-3、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX编码序列编码天然蛋白的衍生体或变异体形式，它们一般含有至少包含一个氨基酸取代、缺失或插入的衍生多肽序列，这些修饰作用可在多肽序列中的任何残基上插入，这样干扰了蛋白的生物学活性。
可用来在两个序列间确定同源性，从而分析变异体编码序列的计算机程序实例包括但不限于，一套BLAST程序，如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，可在互联网的NIH站点上公开获得。也见，Altschul，S.F.等人，1990和Altschul，S.F.等人，1997。当将核酸序列与GenBank DNA序列和其他公共数据库中的核酸序列进行比较时，序列研究典型地采用BLASTN程序来进行。BLASTX程序优选用来搜索核酸序列，该序列已经被翻译成与GenBank蛋白序列和其他公共数据库中的氨基酸序列相对的所有阅读框架。BLASTN和BLASTX都可采用默认的参数运行，开放缺口损失(open gap penalty)为11.0，延伸缺口损失(extended gap penalty)为1.0，并使用BLOSUM-62矩阵(见Altschul等人，1997)。
在变异体编码序列的分析中，两个或多个序列之间的同源性程度一般采用序列分析程序来执行，如CLUSTAL-W程序(Thompson，J.D.等人，Nucleic Acids Research，22：4673-4680.1994)MacVector 6.5版，以默认的参数运行，包括开放缺口损失为10.0，延伸缺口损失为0.1，以及BLOSUM 30相似性矩阵。这些序列分析程序中的每一个都可在互联网的许多站点上获得。
两个序列之间的关系也可通过杂交来定性。如果两个序列在中度至高度严格的杂交和洗脱条件下可特异地与另一个杂交，该核酸序列就被认为是与参考核酸序列“选择性可杂交的”。杂交条件是根据核酸结合复合体或探针的解链温度(Tm)而定的。“最高严格性”一般发生在大约Tm-5℃(探针的Tm之下5)；“高度严格性”为大约Tm之下5-10；“中度严格性”为大约探针的Tm之下10-20；和“低严格性”为Tm之下大约20-25。从作用上说，最严格条件可用来鉴定具有严格同源性或近似严格同源性的序列；而高度严格条件可用来鉴定具有大约80％或更高序列同源性的序列。
中度和高度严格的杂交条件在本领域中是为人熟知的(见，如Sambrook，等人，1989，第9章和11章，和Ausubel，F.M.等人，1993，在此特别地合并作为参考文献)。高度严格条件的实例包括在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS和100g/ml变性载体DNA中大约42℃下的杂交，然后在2×SSC和0.5％SDS中室温下冲洗2次，在0.1×SSC和0.5％SDS中42℃另外冲洗两次。
细胞因子调节因子的核酸编码序列可因为许多原因而被改变，包括但不限于，对细胞的克隆、处理和/或细胞因子调节因子的表达进行修饰的改变。
异源核酸构建物可包含一种或多种细胞因子调节因子单独的编码序列或结合一种或多种抗凋亡蛋白的编码序列、其变异体、片段或剪接变异体：(i)以分离的形式；(ii)结合其他的编码序列；如编码融合蛋白或信号肽的序列；(iii)结合非编码序列，如内含子和调控元件，如启动子和终止元件或5’和/或3’非翻译区，其对编码序列在合适宿主中的表达有效；和/或(iv)在编码序列是异源基因的载体或宿主环境中。
本发明也可以单独使用包含编码一种或多种细胞因子调节因子的核酸序列或结合一种或多种抗凋亡蛋白编码序列的重组核酸构建物，如上所述。构建物一般采用载体的形式，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向的方向已经插入了编码序列。
C. 宿主细胞的选择和转化
包含核酸编码序列的载体，如上所述，与合适的启动子和调控序列一起，被用来转化人类细胞，以使细胞单独过度表达一种或多种细胞因子调节因子，或结合一种或多种抗凋亡蛋白的编码序列，因此增加细胞因子混合物的产生。
在本发明的一个方面中，采用已经建立的优选细胞系，异源核酸构建物被用来在体外将核酸编码序列转移进细胞中。为了长期、高产量的生产细胞因子混合物，也优选稳定的表达。因此可以断定，在执行本发明的过程中可以使用任何能有效产生稳定转化体的方法。
除非另有指示，本发明的实践可使用本领域技术范围内的常规分子生物学技术、微生物学技术、重组DNA技术和免疫学技术。这些技术在文献中已经有详尽的解释。见例如，“分子克隆：实验室指南”，第二版，(Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989)，“动物细胞培养”(R.I.Freshney，主编，1987)；“现代分子生物学方法”(F.M.Ausubel等人，主编，1987)；和“现代免疫学方法”(J.E.Coligan等人，主编，1991)，在此特别地合并作为参考文献。
亲代细胞或细胞系可用克隆载体或表达载体进行基因修饰(即，转导、转化或转染)。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。
将核酸引入细胞以表达异源核酸序列的大量方法对普通的专业技术人员也是已知的，包括但不限于，电穿孔；细胞一细胞融合；核微注射或直接微注射进单个细胞中；细菌原生质体与昆虫细胞融合；使用多聚阳离子，如聚凝胺或聚鸟氨酸；与脂质体进行膜融合，Lipofectamine或脂质转染介导的转染；用DNA包被的微发射体的高速轰击；与磷酸钙-DNA沉淀物孵育；DEAE-葡聚糖介导的转染；用修饰的病毒核酸感染；等。(见，如Davis，L.，Dibner，M.，和Battey，I.分子生物学基本方法，1986。)
基因修饰的细胞在常规的营养基中培养，该营养基进行了调整以适合激活启动子、选择转化物或扩增一条或多条被导入细胞内的核酸编码序列的表达。培养条件，如温度、pH等，是以前对选择的宿主细胞表达所使用的，为本领域专业技术人员所理解。已经导入一条或多条核酸编码序列的细胞的后代一般被认为含有导入的序列。
D. 增强细胞因子调节因子和细胞因子的表达
通常来说，一旦产生了单独过度表达一种或多种细胞因子调节因子或结合一种或多种抗凋亡蛋白的细胞系，就要采取其他的步骤来增加细胞因子混合物的产量，和/或促进从细胞培养物中回收细胞因子。这样的步骤包括以下一个或多个：(1)在有效增强一种或多种细胞因子调节因子表达的条件下培养细胞；(2)在有效促进细胞因子回收的条件下培养细胞；(3)激发细胞；和(4)处理细胞以诱导一种或多种细胞因子调节因子和一种或多种细胞因子的产生(诱导)。
在有效增强一种或多种细胞因子调节因子表达的条件下培养细胞包括在含有促进表达的因子，如金属盐或抗生素，的培养基中进行培养，这些因子以有效激活诱导型启动子的浓度加入到培养基中。
在有效促进细胞因子回收的条件下培养细胞包括在无血清和/或无蛋白培养基中进行培养。
激发是一种熟知的现象，将细胞与激发剂接触导致一种或多种细胞因子的产生增加，一般在诱导之后。激发剂的实例包括但不限于，醋酸佛波豆蔻酯(PMA)和其他佛波醇酯、钙离子载体、干扰素-α、干扰素-γ、干扰素-β、G-CSF、GM-CSF、PDGF、TGF、EGF或趋化因子(Il-8、MCP或MIP)、丁酸钠、内毒素、PHA、LPS及其衍生物如3-脱酰LPS、病毒如新城疫病毒、激酶激活物(如PKR、PACT的蛋白激活物)、或转录激活物(NF-KB、IRFs包括IRF-3和IRF-7)。对PKR抑制剂p53的抑制，也已被证明导致PKR活性增强(Tan SL，Gale MJ Jr，Katze MG，MolCell Biol 18(5)：2431-43，1998)。可以选择的是，去除血清和生长因子如IL-3可用来在细胞中诱导PKR活性。在科技文献中可查到适合的激发剂浓度。
例如，5-50nM范围内的PMA浓度，一般大约10nM是适合的。应该理解的是，最佳的激发剂浓度和激发剂、诱导剂的组合，以及为产生特异的细胞因子混合物在特定类型细胞中这种激发和诱导作用的条件是不同的。但是，这些条件可以由本领域的专业技术人员确定，而不须进行大量的试验。
诱导或处理是指添加微生物(病毒、细菌或真菌)诱导剂或非微生物诱导剂至细胞培养物中，前者是能够作为诱导剂的微生物提取物(如，内毒素或含细菌细胞壁的提取物)。非微生物诱导剂的实例包括但不限于，双链RNA(dsRNA)如poly(I)：poly(C)或poly r(I)：poly r(C)(polyIC)、或病毒dsRNA如仙台病毒RNA、小分子如聚阴离子、硫酸肝素葡聚糖、硫酸软骨素和细胞因子。
病毒诱导方法的实例包括但不限于，(1)与活病毒(如仙台病毒、脑心肌炎病毒或单纯疱疹病毒)接触；(2)与上面提到的灭活病毒接触；或(3)与分离的双链病毒RNA接触。另外，通过添加已知刺激某种细胞中细胞因子产生的特定细胞因子可产生或增强细胞因子诱导。在添加诱导剂后，细胞一般继续孵育，直至获得所需的细胞因子诱导和分泌水平。在37℃孵育至少12-48小时，直至72-96小时一般是足够的。
有效量的诱导剂加入一段时间可诱导细胞因子的产生，如在培养基中能够有效获得细胞因子混合物的产生，如大约0.001-100μg/ml。
在本方法的一个应用实例中，细胞用IFN-β激发大约24小时，然后置于含poly I：C和放线菌酮的培养基中大约5小时，在最后一个小时中加入放线菌素D。
在本方法的另一个应用实例中，细胞用IFN-β激发大约24小时，然后用病毒诱导剂如仙台病毒(SV)处理大约1小时进行诱导，接着置于含poly I：C和放线菌酮的培养基中大约5小时，在最后一个小时中加入放线菌素D。
实例1描述了表达CrmA细胞系的产生和细胞的超诱导或病毒诱导。
实例2描述了载体的实例、转染的方法和过度表达细胞因子调节因子的细胞系的产生，该细胞系还表达抗凋亡蛋白、Bcl-XL，适合用于本发明的实施。实例3通过过度表达细胞因子调节因子，以及还表达抗凋亡蛋白的过度表达细胞因子调节因子的细胞系的实例，描述了细胞因子的产生。
在一个优选的方法中，用DEAE葡聚糖进一步处理细胞影响了细胞因子调节因子的过度表达和一种或多种细胞因子的产生。在另一种方法中，细胞因子调节因子的表达可被另一个调节因子增强，后者可与控制细胞因子调节因子编码核酸序列表达的启动子相互作用。内源性PKR编码核酸序列的表达可被调节因子调控，包括干扰素诱导型GAS元件、IL-6敏感的NF-IL-6和APRF元件和NF-κB元件(见，如JagusR等人，1999和Williams BR，1999)。
典型地，在培养、激发和处理(即诱导)后的不同时间点，检测培养基中一种或多种所选择的细胞因子的存在。根据为人熟知的生物学测定方法，检测所选择的细胞因子的存在可通过直接测定，如采用抗体结合试验，或通过培养基对多种细胞因子反应细胞活性的效应间接测定。
在一个举例的方法中，培养步骤在含有血清的培养基中进行，诱导步骤在基本上为无血清和/或无蛋白的培养基中进行。这种方法的益处是从中获取细胞因子混合物的最终细胞培养基中加入的血清蛋白最少，因此使之需要较简单的纯化方法来获得适合用于人的细胞因子组合物。
在另一个举例的方法中，用醋酸佛波豆蔻酯(PMA)激发过度表达PKR的Namalwa 41027细胞系，然后用poly I：C诱导，有效地诱导了较野生型Namalwa细胞中所观察到的更多的PKR表达。图6*显示了与野生型Namalwa细胞产生的TNF-β、IL-6和IL-8相比，Namalwa PKR+41027细胞在poly I：C诱导后产生的TNF-β、IL-6和IL-8增加。这些结果表明通过亚克隆和选择得到的过度表达PKR的细胞系产生了细胞因子混合物，如在实例3中所进一步描述的。
VII. 评价细胞因子调节因子和细胞因子表达的方法
细胞因子调节因子和细胞因子的活性、表达和/或产生可通过本领域已知的方法来确定。实例包括生物学活性的功能性试验和Northern印迹或mRNA的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。免疫测定可用来检测表达的蛋白。
可以选择的是，可以通过免疫学方法来测定表达，如细胞或组织切片的免疫组织化学染色以直接评价表达(如，间接免疫荧光试验)、ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、Western印迹等。用于免疫组织化学染色和/或液体样品测定的抗体可以是单克隆或多克隆的，并可在任何哺乳动物中制备。
作为实例，内源性或外源性提供的PKR编码核酸序列的存在、扩增和/或表达可在样品中直接测定，例如通过测定PKR活性、表达和/或产生。这样的测定包括自体磷酸化测定，eIF2α磷酸化测定，一种激酶测定实验；Northern印迹法定量mRNA的转录，点印迹法(DNA或RNA分析)，RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)，或原位杂交，根据编码PKR的核酸序列，使用合适的标记探针；和常规的Sounthern印迹法。
这些方法的详细细节是本领域专业技术人员已知的，实施这些方法的许多试剂可从商业渠道购得。一般来说，细胞因子分析试剂盒可从市场上购得，可用于已知细胞因子或其他蛋白表达水平的定量免疫测定(如，从R&D系统获得的细胞因子检测试剂盒)。
VIII. 细胞因子产生
从过度表达细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白的细胞中产生的细胞因子分泌至培养基中，并可被纯化或分离，如通过从细胞培养基中去除不需要的成分。一般来说，细胞因子被分馏以分离含有选定特性的细胞因子，如与特殊结合媒介物如抗体或受体的结合亲和性；或具有选定的分子量范围，或等电点范围。
A. 细胞因子的纯化和/或分离
一种或多种细胞系经过适当时间的选择、修饰、激发和处理(即诱导)的组合处理后，可产生细胞因子的混合物。然后含有细胞产生的细胞因子混合物的培养基被回收，细胞因子从细胞培养物中分离和/或纯化。就回收培养基中含有的悬浮细胞，培养基可以较低的速度离心、过滤、或用其他的方式处理去除细胞和细胞碎片。培养基继续被处理，如通过透滤法或分子筛色谱去除低分子量成分，如致热原，和超出细胞因子分子量范围的高分子量成分，典型的为10-40kD。
为获得所需的细胞因子混合物，产生细胞因子的细胞的培养基接受多种蛋白分离方法，这些方法利用了每种细胞因子与如抗体或受体等结合媒介物的结合亲和性、其分子量或等电点。这些方法的实例包括抗体亲和柱色谱、离子交换色谱；乙醇沉淀；反向HPLC；硅色谱或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；或使用，例如Sephadex G-75的凝胶过滤。可以采用多种蛋白质纯化的方法，这些方法在本领域是已知的并有所描述，如在Deutscher，酶学方法，182，1990；Scopes，蛋白质纯化：原理和实践，Springer-Verlag，纽约，1982。选择的纯化步骤取决于所使用的生产过程和所生产的特定细胞因子混合物的特性。
在一个优选的分离方法中，含有所需细胞因子混合物的组合物是采用亲和色谱通过分离所选择的细胞因子而共同纯化的。该方法使用纯化的抗细胞因子抗体或可与所需细胞因子结合的细胞因子特异性受体作为亲和性媒介。许多种细胞因子的特异性抗体可从市场上购得，如从Sigma Chemical Co.，Sigma Catalog2000-2001(St.Louis，MO)。
另外，适合细胞因子-抗体相互作用的亲和柱可从市场经销商处，如Pharmacia购得。根据本发明采用这样的柱来制备细胞因子组合物的过程中，柱采用如Tris缓冲盐水(TBS)的溶液进行平衡，选择的所需细胞因子的抗体装载在预平衡的亲和柱上，使抗体结合在上面。直接从细胞培养中或在部分纯化后获得的含有细胞因子的培养基，冷却至低温度如4℃后，并装载在亲和柱上。然后柱在滚动装置上室温孵育12-18小时，使细胞因子与相应的抗体结合。
孵育后，柱用一种或多种冲洗溶液冲洗，如TBS，然后结合的细胞因子用合适的洗脱液洗脱。见如Sambrook J，等人，分子克隆：实验室指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和美国专利第4,385,991、3,983,001、4,937,200和5,972,599号，每一篇文献在此为使用亲和色谱进行蛋白质纯化提供了详细的内容。
色谱分离可以按如下进行：采用许多不同亲和柱的每一种从所选择的细胞因子混合物中连续地去除每种单独的细胞因子，并将得到的单独纯化的细胞因子组合起来，或优选地，采用亲和柱材料将细胞培养基混合起来，该亲和柱材料含有大量吸附抗体的层析柱，这些抗体针对要在最终细胞因子组合物或混合物中包含的几种细胞因子。根据本发明的另一个方面，细胞因子混合物可被处理以去除一些细胞因子，这些因子对所选择的适应症很少或没有已知的价值，或它们已知或可能对治疗效应有负作用。
本发明的细胞因子组合物或混合物包括由在此所描述的方法制备的产细胞因子细胞所产生的两种或多种细胞因子。混合物中的细胞因子因其单独的或与混合物中其他成分一起的特定生物学活性，以及它们在治疗癌症、病毒感染和炎症中的作用或潜在利益而被选择。这些判断结果建立在已经存在的临床试验数据、体外细胞学研究和科技文献上对多种细胞因子作用的资料的基础上。
IX. 本发明的细胞因子组合物的用途
本发明的细胞因子组合物或混合物可通过以下途径给药，包括但不限于，口服、眼内给药、经皮给药、经皮(TD)注射、肌内(IM)注射、皮下(SC)注射、静脉(IV)注射、腹膜内(IP)注射、和肿瘤旁注射或吸入。优选的给药途径是通过肌内、皮下或静脉途径注射。典型地，治疗持续至达到所需的终点，例如减少肿瘤负荷、清除病毒感染、或减轻炎症的症状。如本领域专业技术人员可以理解的，治疗效应的优选指标将根据在治疗中的疾病状况而不同。如同使用任何治疗方案一样，使用本发明的细胞因子混合物的治疗周期将根据对治疗效应的评价结果而进行调整。这样的评价以适合治疗中的疾病状况的频率有规则地进行。例如，恶性癌症的有效治疗必须防止肿瘤细胞的继续扩散，并降低死亡率，即增加患病患者的存活时间。
合适的细胞因子混合物给药方案是可变化的，但以初始剂量后接着一个或多个间隔的重复剂量的连续给药为代表。
在本发明方法的一个应用实例中，细胞因子是干扰素-α或干扰素-β，其剂量范围是每个患者每次用药总共的细胞因子浓度为从大约3至5百万国际单位至大约15至20百万国际单位，其中患者平均为70kg，典型的细胞因子组合物的特异活性为从大约每毫克1×108IU至每毫克1×109IU。
在本发明方法的另一个应用实例中，细胞因子是IL-2、GM-CSF或IFNγ，其剂量范围是每个患者每次用药的总细胞因子浓度为从大约1至3百万国际单位至大约5至10百万国际单位，其中患者平均为70kg。
在一个典型的治疗方案中，细胞因子混合物在4至6周期间内每周用药1至3次。但是，在某些情况下，细胞因子混合物的用药可以持续几年或更多的不确定时间，例如在给予干扰素-β治疗MS的情况下。
手术、放射治疗和化疗是目前治疗癌症的基本方法。预期，细胞因子混合物的应用可与这些其他的癌症治疗和新出现的治疗形式结合起来，新的治疗形式包括单克隆抗体和癌症疫苗。应当理解，在此描述的这些方法可以协同或附加的方式与手术、放疗和化疗的任何一种相互作用，形成更大的治疗效应。在某些情况下，治疗癌症的改良方法将常规的癌症治疗如化疗或放疗，与细胞因子混合物的用药结合起来。
以上描述的治疗方案是以提供实例为目的的，治疗的方案可根据患者的反应，按需进行调整。
在本书面说明中引用的所有专利和参考文献在此均特别地整体合并作为参考。
下面实例的描述并不打算以任何方式限制本发明。
                          实例1
表达CrmA的转基因细胞系的制备和特征
A. 表达CrmA的转基因细胞系的制备
将CrmA的框内编码序列插入至pEF Bos载体中构建pEFFLAG-crmA-puro表达载体，pEF Bos载体是由Mizushima和Negata(NAR18，5322，1990)所描述的，其基础是Huang等人，1997所描述的载体。pEF FLAG-crmA-puro含有在强延伸因子1α(EF-1α)启动子的控制下编码抗凋亡CrmA蛋白的全长cDNA(GenBank登记号第M14217；牛痘病毒白痘疮变异体(CPV-W2)(CrmA)基因，全部的编码序列)，和在pGK启动子控制下的嘌呤霉素抗性基因。注释的其他特征是N-末端FLAG抗原表位的编码序列(Hopp等人，1988)，它可加入至CrmA核酸序列中以便于表达CrmA的细胞系的检测。
载体也可包括(i)多聚腺苷酸信号和转录终止序列以增强mRNA的稳定性；(ii)游离基因复制的SV40起始点和简单的载体营救；(iii)氨苄青霉素抗性基因和筛选使用的ColE1起始点，并保留在大肠杆菌中；和(iv)嘌呤霉素抗性标记物(Puro)以便保证筛选，并在用pEFFLAG-crmA-puro转染后鉴定含有质粒的真核细胞。
在转染前一天MG-63细胞以每孔5×104的密度接种在6孔板中。2μg pEF FLAG-crmA-puro质粒DNA悬浮在100μl无血清，蛋白或抗生素的Opti-MEM培养基中。Lipofectamine试剂(Gibco，10μl)用Opti-MEM无血清培养基稀释至100μl。在两种溶液轻微混合后，混合物在室温下孵育45分钟使DNA-脂质体复合体形成。在处理MG-63细胞前，600μl Opti-MEM无血清培养基立即加入到含有DNA-脂质体混合物的反应管中，以获得最终的转染溶液。细胞用PBS冲洗，然后添加最终的DNA-脂质体混合物并在37℃孵育4小时。紧接着添加1毫升MEM-5％FBS，并继续孵育16小时。轻轻的吸除培养上清液，并加入新鲜的细胞生长培养基(MEM添加5％FBS)。孵育48小时后，加入含有筛选标记物，geneticin(G418，500μg/ml)的新鲜培养基(MEM添加5％FBS)以筛选采用本领域已知的标准方法学获得的稳定转染体。总之，通过用500μg/ml G418(Gibco-BRL)筛选3-4周可获得大量的稳定转染体。
B. 表达CrmA的转基因细胞系的特性
1. 细胞活力增加
野生型(WT)和表达CrmA(CrmA-#2)的MG-63细胞的处理是用仙台病毒(SV)进行诱导，采用下列的方法超诱导(SI；Inoue I等人，1991)。
细胞以每孔2.5×104的密度接种在24孔板中，然后在37℃5％CO2浓度孵育。孵育后，细胞用IFN-β(100IU/ml)激发24小时。然后向每孔200μl 2％胎牛血清(FBS)MEM培养基中加入1000血细胞凝集素单位的SV诱导细胞，并孵育1小时，然后加入300μl含有polyI：C(100μl/ml)和放线菌酮(5μg/ml)的新鲜培养基，并继续孵育5小时。在最后1小时加入放线菌素D至终浓度4μg/ml。在诱导过程后，处理的细胞用PBS冲洗3次，去除所有诱导物，并重新在含有2％FBS的新鲜MEM中悬浮。
不用仙台病毒(SV)处理±或超诱导(SI)的野生型(WT)和表达CrmA(CrmA-#2)的MG-63细胞作为对照(UT)。每种类型细胞的活力采用标准的碘化丙啶FACS检测法来测量。如在图1中所显示的，CrmA的表达可抑制SV/SI诱导的细胞死亡，在SV诱导和SI处理后在20小时时表达CrmA的细胞活力可达80％。相对比，在同样条件下仅有20％的野生型MG-63细胞在此过程中存活。
2. 细胞因子的产生增加
细胞孵育20小时，然后收集每孔的培养基并通过ELISA测定干扰素-β(IFN-β)的产生。IFN-β ELISA测定根据供应商所描述的方法进行。(人干扰素-β ELISA试剂盒；TFB，Inc.经销，由日本东京的FUJIREBIO，Inc.生产)。如在图2中所显示的，与MG-63野生型对比物相比，CrmA#2 MG-63细胞明显的能产生更多的IFN-β。
表达CrmA(CrmA-#2)的MG-63细胞在含有0，2mM，4mM和8mM一个已知的PKR抑制剂，核苷类似物2-氨基嘌呤(2-AP)的培养基中经受超诱导(SI)处理。
在激发前一天将细胞以每孔2.5×104的密度在24孔板中接种，在37℃5％CO2浓度下进行SI(超诱导)处理。孵育后，细胞用IFN-β(100IU/ml)激发24小时，然后加入含有poly I：C(100μg/ml)和放线菌酮(5μg/ml)的新鲜培养基500μl，细胞继续孵育5小时，在最后一个小时加入放线菌素D至终浓度4μg/ml。在诱导过程后，处理的细胞用PBS冲洗3次，去除所有的诱导物，并重新悬浮在含有2％FBS的新鲜MEM中。
如在图3中所显示的，2-AP可以剂量依赖的方式抑制IFN-β的产生，证实PKR在调节IFN-β的表达中具有重要作用。
3. 通过Western印迹分析Flag-CrmA蛋白的表达
如上所述制备的亲代野生型细胞系(MG-63-WT)的细胞和CrmA转化体(MG-63-CrmA-#2)的细胞，在100毫米培养皿中培养至100％汇合。细胞用冷磷酸缓冲盐水(PBS)冲洗，并用细胞刮收集在1.5毫升的微离心管中。用PBS进一步冲洗后，细胞在裂解缓冲液(10mMTris-HCL[pH7.5]，1％Triton X-100，0.25％SDS，50mM KCL，1mM二硫苏糖醇，2mM MgCl2和1×蛋白抑制剂混合物[Roche])中在冰上孵育10分钟，然后在10,000g离心10分钟。裂解上清液转移至一个新的微离心管中，根据生产商提供的实验方法采用BRL试剂盒测定蛋白浓度。含有100μg蛋白的细胞裂解物装在4-12％NuPAGE Bis-Tris MOPS凝胶上，并进行电泳分离，分离后凝胶印迹在一张PVDF膜上。这张膜进一步印在5％奶-PBS中过夜，并与大鼠抗Flag一抗接触，该抗体由AStrasser博士馈赠(Royal Melbourne医院，维多利亚，澳大利亚)，在1∶500的稀释度下1小时。印迹的膜用PBS-0.1％Tween-20冲洗3次，用抗大鼠HRP结合的二抗(1∶2000)孵育1小时。采用ECL检测试剂(Amersham)可检测到Flag-CrmA蛋白的存在。
每个用CrmA表达质粒转染的细胞的样品显示了Flag-CrmA高水平的表达，相比较亲代野生型对照细胞(MG63-WT)显示没有表达。
                          实例2
单独过度表达PKR或过度表达PKR和抗凋亡蛋白的Namalwa细胞系
A. pEF-FLAG-Bcl-X L 的制备
pEF-FLAG-Bcl-XL载体(Huang等人，1997)含有编码抗凋亡Bcl-XL蛋白的全长cDNA，可有效的与强延伸因子1α(EF-1α)启动子连接。该载体另外突出的特征是N-末端FLAG抗原表位(Hopp等人，1988)，它加入到Bcl-XL蛋白中便于筛选表达高水平Bcl-XL的细胞系。
载体也可包括i)多聚腺苷酸信号和转录终止序列以增强mRNA的稳定性；ii)游离基因复制的SV40起始点和简单的载体营救；iii)氨苄青霉素抗性基因和筛选使用的ColE1起始点，并保留在大肠杆菌中；和iv)嘌呤霉素抗性标记物(Puro)以便保证筛选，并在用Bcl-XL和PKR转染后鉴定含有质粒的真核细胞。
B. pcDNA-FLAG-PKR的制备
pcDNA-FLAG-PKR载体含有编码全长人PKR分子(551个氨基酸；Meurs等人，1990；GenBank登记号第NM002759号)的cDNA，该PKR分子用聚合酶链式反应修饰后包含编码序列MDYKDDDDK的N末端FLAG标记(Hopp等人，1988)，并插入至真核表达载体pcDNA3(Invitrogen)中，这样FLAG-PKR编码序列在CMV启动子的控制下被表达。
称为pcDNA-FLAG-PKR的载体，含有适合PKR转录的多种特征，包括：i)为高水平的表达mRNA来自人CMV极早期基因的启动子序列；ii)多聚腺苷酸信号和来自牛生长激素基因(BGH)的转录终止序列以增强mRNA的稳定性；iii)游离基因复制的SV40起始点和简单的载体营救；iv)氨苄青霉素抗性基因和为筛选使用的ColE1起始点，并保留在大肠杆菌中；和v)G418抗性标记物(Neo)以便保证筛选，并在转染后鉴定含有质粒的真核细胞。
第二个PKR载体，称为pTRE-PKR，其制备是通过将相同的PKR cDNA插入到一个从Clontech获得的pTRE质粒的一个限制性/插入位点中。pTRE质粒类似于在制备所描述的第一个PKR载体中使用的pFLAG，但它含有一个在CMV启动子上游的四环素反应元件用于控制插入的基因。
C. 6A细胞系(Bcl-X L 和PKR阳性)的制备
继续用质粒pEF-FLAG-Bcl-XL和pcDNA-FLAG-PKR转染人B淋巴母细胞系Namalwa(WT)。用15μg pEF-FLAG-Bcl-XL质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脉冲发生仪(Gene Pulserapparatus)(BioRad)设定在800uF，300V通过对4×106对数生长的Namalwa细胞进行电穿孔，得到稳定的转染体。用2μg/ml嘌呤霉素(Gibco-BRL)筛选3-4周获得大量的稳定转化体，并用流式细胞仪如下监测Bcl-XL的表达。冲洗大量的转染体，用丙酮增加膜通透性，然后用2μg/ml鼠抗FLAG M2单克隆抗体(IBI)，藻红蛋白结合的羊抗鼠IgG(1μg/ml；Becton-Dickinson)进行染色。细胞在FACScan中进行分析，根据它们前方和侧向的光散射特性区分活细胞和死细胞，通过荧光密度的水平区分表达Bcl-XL的细胞。然后高水平表达Bcl-XL的转化体(Namalwa-Bcl-XL)用pcDNA-FLAG-PKR转染。
用15μg pcDNA-FLAG-PKR质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脉冲发生仪(Gene Pulser apparatus)(BioRad)设定在800uF，300V通过对4×106对数生长的Namalwa-Bcl-XL细胞进行电穿孔，得到稳定的高水平表达Bcl-XL的转染体。用2mg/ml geneticin(G418，Gibco-BRL)筛选3-4周获得大量的稳定转化体。通过有限稀释克隆获得克隆系，用Western印迹分析(Huang等人，1997)分析Bcl-XL和PKR的表达。采用2μg/ml抗FLAG M2抗体，然后用结合过氧化物酶的羊抗鼠IgG和ECL检测(Amersham)鉴定蛋白。Bcl-XL和PKR阳性细胞系的实例标为6A。
D. A9细胞系(PKR阳性)的制备
用15μg pTRE-PKR质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中采用基因脉冲发生仪(Gene Pulser apparatus)(BioRad)设定在800uF，300V通过对4×106对数生长的Namalwa细胞进行电穿孔，得到稳定的高水平表达PKR的转染体。用2mg/ml geneticin(G418，Gibco-BRL)筛选3-4周获得大量的稳定转化体。通过有限稀释克隆获得克隆系，用Western印迹分析(Huang等人，1997)分析Bcl-XL和PKR的表达。
E. 表达Bcl-X L 和PKR的转基因Namalwa细胞系的特性
1. 细胞活力增加
在PKR过度表达和细胞因子诱导的条件下，在培养物中测定野生型Namalwa细胞(WT)和实例2C和2D中的A9和6A细胞的细胞活力。PKR和Bcl-XL双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代的Namalwa细胞(WT)以2.5×105细胞/ml的密度在加入10％FBS的DMEM/F12培养基中进行培养。细胞用20mM PMA(激发剂)处理20小时，然后用200μg/ml poly r(I)：poly r(C)和10μg/mlDEAE葡聚糖(poly IC诱导)处理72小时或用200HAU/1×106细胞的仙台病毒处理48小时。处理后，在FACScan上通过流式细胞仪测定细胞活力。
图4A显示了在仙台病毒诱导后，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)的活力是相似的，PKR和Bcl-XL双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)可观察到更高的活力。
图4B显示了在poly IC诱导后，PKR和Bcl-XL双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)的细胞活力是相似的，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)观察到较低的活力。
2. 干扰素-α的表达增加
在poly IC和仙台病毒诱导后，均在PKR过度产生的条件下，在三个细胞系中分析IFN-α产生的水平。收集培养上清液，根据ELISA试剂盒(R&D Systems)生产商提供的步骤通过ELISA分析IFN-α的水平。
在图5A中显示的结果表明在仙台病毒诱导后，PKR和Bcl-XL双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)产生的IFN-α明显高于PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)产生的IFN-α。
在图5B中显示的结果表明在poly IC诱导后，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和PKR和Bcl-XL双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)产生的IFN-α明显高于亲代Namalwa细胞(WT)产生的IFN-α。
                              实例3
过度表达PKR的Namalwa细胞系的制备和细胞因子产生
B. 过度表达细胞因子和治疗性蛋白的Namalwa细胞系的制备
从American Type Culture Collection(ATCC)，10801 UniversityBlvd.，Manassas，Va.，U.S.A.中获得的野生型Namalwa细胞。这些细胞如下面的细节进行培养，亚克隆，筛选，激发和诱导。
野生型Namalwa细胞培养在含有胎牛血清浓度范围在0.5至15％之间的DMEM/F12培养基中。使用本领域专业技术人员常规应用的方法，单个细胞通过在96孔板中培养，经过有限稀释克隆(“亚克隆”)。亚克隆的步骤执行1至5次，采用典型地用于培养亲代细胞系的培养条件培养亚克隆至大约0.3至0.5百万细胞/ml。然后用Northern印迹，Western印迹，PKR自磷酸化测定(Der和Lau Proc Natl Acad Sci92：8841-8845，1995)，一种采用已发表的测定eIFα磷酸化(Zamanian-Daryoush，Der，Williams Oncogenes 18：315-326，1999)方法检测组蛋白磷酸化，和一种激酶测定法(通过PKR免疫沉淀法和体外检测激酶活性(Zamanian-Daryoush等人，Molecular and CellularBiology，20：1278-1290，2000)进行测定)分析亚克隆PKR的表达和活性。
筛选较亲代细胞系显示至少两倍以上激酶活性的亚克隆。筛选的亚克隆也通过Western和Northern印迹监测PKR的产生。然后诱导筛选的亚克隆以进一步增强PKR和细胞因子活性，产生和/或表达，在诱导前激发或不激发。
过度表达PKR细胞系的实例，称为Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1. G7.C1.A9，和Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.G3.C1在此用来描述本发明。
C. 过度表达PKR的Namalwa细胞的特性
1. Namalwa PKR++41027亚克隆细胞对TNF-β、IL-6和IL-8的表 达
Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9和WT Namalwa细胞在5.0×105细胞/ml的细胞密度下用20nM醋酸佛波豆蔻酯在6孔板中预处理20小时。然后用200μg/ml poly I：poly C继续处理72小时以诱导细胞因子的表达。在诱导后24小时，48小时和72小时去除处理细胞的培养上清液，采用ELISA(R&D Systems)测定TNF-β，IL-6和IL-8的产生。
图6显示了相对野生型Namalwa细胞产生的TNF-β，IL-6和IL-8，Namalwa PKR++41027，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9细胞经poly I：C诱导后TNF-β，IL-6和IL-8的产生增强。TNF-β产生的水平在诱导后72小时最高，在这个时间点上，Namalwa PKR++41027，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9较野生型Namalwa细胞产生的TNF-β高大约3倍(3×)。类似地，在用poly I：C诱导后72小时，相对亲代对照，NamalwaPKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9诱导产生的IL-6和IL-8超过10倍。
2. 在过度表达细胞因子和治疗性蛋白的细胞系中IFN-γ的产生增 加
Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.G3.C1在5.0×105细胞/ml的细胞密度下用20nM醋酸佛波豆蔻酯在6孔板中37℃预处理20小时以激发细胞因子的表达。然后用100μg/ml poly(I)poly(C)加10μg/ml DEAE葡聚糖继续处理48小时以诱导细胞因子的表达。在诱导后48小时去除处理细胞的培养上清液，采用R&D Systems购得的试剂盒采用ELISA测定IFN-γ的表达和分泌。ELISA根据生产厂商的指导进行(图6)。
3. 在过度表达细胞因子和治疗性蛋白的细胞系中多种细胞因子的 产生增加
在添加10％FBS的DMEM/F12培养基中培养的Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9在7至8×105细胞/ml的细胞密度下用1mM丁酸钠在6孔板中37℃预处理24小时以激发细胞因子的表达。然后用仙台病毒，100HA单位继续处理24至48小时以诱导细胞因子的表达。在诱导后24或48小时去除处理细胞的培养上清液，根据生产厂商的指导，采用R&D Systems购得的试剂盒采用ELISA测定细胞因子或治疗蛋白的表达和分泌。显示检测的细胞因子或治疗蛋白水平的结果在表2提供。
表2.从Namalwa 41：027细胞&中表达的细胞因子或其他治疗性蛋白
&所有蛋白均从Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D.D1.G7.C1.A9中测定
细胞因子/其他治疗性蛋白     蛋白表达的水平1诱导的/未诱导的细胞
IFN-α     180ng/ml/未检测
IFN-β     267IU/ml/＜2.5IU/ml
IFN-γ     1.6ng/ml/＜15pg/ml
IL-1β     ＜4pg/ml＜4pg/ml
IL-2     ＜31pg/ml/＜31pg/ml
IL-4     12pg/ml/8pg/ml
IL-6     31pg/ml/＜3pg/ml
IL-8     322ng/ml/54ng/ml
IL-10     17pg/ml/5pg/ml
GM-CSF     ＜8pg/ml/＜8pg/ml
TNF-α     328pg/ml/2pg/ml
TNF-β     966pg/ml/＜31pg/ml
碱性FGF     ＜10pg/ml/＜10pg/ml
PDGF-BB     ＜31pg/ml/＜31pg/ml
VEGF     394pg/ml/677pg/ml
1在任何特定系列的激发和诱导条件下测定的细胞因子表达水平既不代表给定细胞系能表达的细胞因子的全部补足，也不代表绝对水平。参数包括但不限于，激发和诱导剂的选择和浓度、孵育温度、基质和基质添加剂、pH、细胞密度、培养管结构、通风情况、搅拌情况和其它能影响细胞因子表达最终水平的培养条件。
此外IFN-γ从Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.G3.C1中测定。
                          实例4
如下面进一步所描述的，制备野生型(WT)、CrmA或表达CrmA和PKR的MG-63细胞，并处理以诱导细胞因子的产生
A. 用CrmA或CrmA和PKR转染的MG-63细胞产生细胞因子混合物
从ATCC获得人成骨细胞瘤MG-63细胞，并在5％CO2的存在下37℃，在添加5％FBS的MEM中培养。MG-63细胞的转染采用(1)PEFFlag-CrmA(嘌呤霉素)质粒(Strasser博士馈赠)，其质粒图谱和构建方法如Huang DC等人(Oncogene 1997 Jan 30；14(4)：405-14)所述，使用Lipofectamine(采用生产厂商(Gibco-BRL)建议的步骤)。单个细胞克隆用有限稀释法(3-5细胞/毫升)分离，并采用96孔板筛选单个的抗生素抗性集落。
表达CrmA的MG-63细胞随后用pet V5-PKRwt质粒(杀稻瘟素；由Williams B.R.G.博士提供；克里夫兰临床基金会)采用Lipofectamine(Gibco-BRL)进行转染，在1.5μg/ml嘌呤霉素和10μg/ml杀稻瘟素(Invitrogen Corporation，Carlsbad，加利福尼亚)的存在下筛选稳定的细胞系。通过有限稀释法(3-5细胞/毫升)分离单个细胞克隆，并在96孔板中筛选单个的杀稻瘟素抗性集落。通过Western印迹采用V5抗原表位标记抗体(Invitrogen)测定PKR的表达。
如Inoue等人，1991所述进行SI(超诱导)。在超诱导前一天，细胞接种在6孔板中，并在5％CO2的存在下37℃孵育。第二天，细胞用100IU/ml IFN-β和1mM丁酸钠进行激发。24小时后，加入含有polyI：C(100μg/ml)和放线菌酮(5μg/ml)的新鲜培养基5小时。在最后一个小时加入放线菌素D至终浓度4μg/ml。然后用PBS冲洗细胞3次去除所有的诱导物，培养基换为含有5％血清的MEM。在孵育20小时后，收集培养基采用ELISA进行细胞因子分析，测定过程根据生产厂商(R&DSystems和BioSource International)的指导进行。分析的结果见表3，该表显示了分析的细胞因子的结果，MG-63表达IFN-β，IL-6，IL-8，GM-CSF，G-CSF，FGF和VEGF的结果。
          表3.MG-63细胞表达的细胞因子或其他治疗性蛋白
细胞因子/其他治疗性蛋白  蛋白表达水平  导入MG-63细胞中的基因
IFN-β  每106细胞125,000IU/ml每106细胞160,000IU/ml  CrmACrmA/PKR
IL-6  每106细胞40ng/ml每106细胞40ng/ml  CrmACrmA/PKR
IL-8  每106细胞340ng/ml每106细胞622ng/ml  CrmACrmA/PKR
GM-CSF  每106细胞340pg/ml每106细胞800pg/ml  CrmACrmA/PKR
G-CSF  104pg/ml117pg/ml  CrmACrmA/PKR
FGF  13pg/ml  CrmA
VEGF  44pg/ml  CrmA
                              实例5
表达分析
Namalwa PKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D.D1.G7.C1.A9的细胞因子表达曲线采用Affymetrix(Santa Clara，CA)人基因芯片进行测定，该芯片的描述见PNAS 1998，95：15623-15628。
制备RNA对添加10％FBS的DMEM/F12培养基中滚瓶培养的NamalwaPKR++41027细胞，亚克隆：2A1.D1.G7.C1.A9进行表达分析。在7至8×105细胞/毫升的细胞密度下，细胞用1mM的丁酸钠37℃激发24小时，在1200rpm离心，在含有1％FBS的新鲜生长培养基中以每毫升1×107细胞的密度重新悬浮。紧接着继续接触仙台病毒100HA单位60至90分钟，然后再添加3倍量的新鲜培养基，孵育48小时后诱导细胞因子的表达。在处理结束后收获细胞，如Anal.Biochemistry162，156-159(1987)所述采用单步硫氰酸胍/苯酚/氯仿提取法为基因芯片分析制备RNA。
表4. 诱导后A9(PKR-转染的)Namalwa细胞基因芯片表达的结果
    蛋白 Avg Diff     蛋白的描述
凋亡相关蛋白  1,218 包括AF022385的集簇：人凋亡相关蛋白TFAR15(TFAR15)mRNA
BMP 11  513.9 包括AF100907的集簇：人骨形态发生蛋白11(BMP11)mRNA
胱天蛋白酶样凋亡调节蛋白2  1,390 AF005775人胱天蛋白酶样凋亡调节蛋白2(clarp)mRNA，选择性叠加的
CD27  18,475 包括M63928的集簇：人T细胞激活抗原(CD27)mRNA
CD27L  17,166 包括L08096的集簇：人CD27配体mRNA
趋化因子  3,006 D43767＝HUMAR人趋化因子mRNA
趋化因子(TECK)  611.5 包括U86358的集簇：人趋化因子(TECK)mRNA
含prot CRADD的死亡结构域  795 U84388＝HSU84388含有蛋白CRADD mRNA的人死亡结构域
EGF  813 X04571＝HSEGFRER肾上皮生长因子(EGF)前体的人mRNA
FGF18  309 包括AF075292的集簇：人成纤维细胞生长因子18(FGF18)mRNA
胃泌素释放肽  223 K02054/FEATURE＝mRNA/DEFINTION＝HUMGRP5E人胃泌素释放肽mRNA，完全cds
GH-1/GH-2/CS-1/CS-2  9,416 包括J03071的集簇：人生长激素(GH-1 and GH-2)和绒毛膜生长催乳激素(CS-1，CS-2和CS-5)基因
热休克因子1  2,313 包括M64673的集簇：人热休克因子1(TCF5)mRNA
热休克因子1  1655.3 M64673＝HUMHSF1人热休克因子1(TCF5)mRNA
热休克因子2  567 包括M65217的集簇：人热休克因子2 mRNA
肝细胞瘤衍生生长因子  2,910 包括D16431的集簇：人肝细胞衍生生长因子mRNA
HGF样蛋白  684 包括U28055的集簇：人肝细胞生长因子样蛋白类似物mRNA
HSP 70  21,120 热休克蛋白，70Kda
HSP 70  11,072 热休克蛋白，70Kda
HSP 70  858 L12723＝HUMHSP70H人热休克蛋白70(hsp70)mRNA
HSP 70B  508 X51757/FEATURE＝cds/DEFINITION＝HSP70B人热休克蛋白HSP70B基因
HSP 90  16,057 包括M16660的集簇：人90-kDa热休克蛋白基因
HSP 90  13,458 包括X15183的集簇：人90-kDa热休克蛋白mRNA
HSP E  2238.2 包括L08069的集簇：人热休克蛋白，大肠杆菌
INF-a  9,344 M28585＝HUMIFNN人白细胞干扰素αmRNA
INF-a  8,053 J00207＝HUMIFNAA人白细胞干扰素(leif)α-a基因
INF-a a  2817.8 J00207＝HUMIFNAA人白细胞干扰素(leif)α-a基因
INF-a  2,019 包括V00541的集簇：人白细胞干扰素的信使RNA
INF-a d  9,300 J00210＝HUMIFNAD人白细胞干扰素(IFN-α)α-d基因
INF-a5  2,522 X02956＝HSIFNA5人干扰素α基因IFN-α5
INF-a6  1345.6 X02958＝HSIFNA6人干扰素α基因IFN-alpha 6
INF-a-M1  6,154 M27318＝HUMIFNAM1人干扰素(IFN-alpha-M1)mRNA
INF-b  8,284 V00535＝HSIFD6人成纤维细胞干扰素β1
INF-g  6,263 包括L07633的集簇：人(克隆1950.2)干扰素γIEF SSP 5111
 mRNA
 INF-g  152 包括X13274的集簇：人干扰素γmRNA
 INF-ω  2,356 包括X58822的集簇：人干扰素ω1的IFN-ω1基因
 IGF-II  1,217  M13970＝HUMGFI21人胰岛素样生长因子(IGF-II)基因，4个外显子中的外显子1
 IL-1b  291 包括M15330的集簇：人白介素1-β(IL1B)
 IL-1R2  1,522 X59770＝HSIL1R2II人II型白介素-1受体的IL-1R2 mRNA
 IL-1ra  1,816 包括X52015的集簇：人白介素-1受体拮抗剂mRNA
 IL-3  171 M20137＝HUMIL3A人白介素3(IL-3)mRNA
 IL-4  349 M13982＝HUMIL4人白介素4(IL-4)mRNA
 凋亡蛋白1抑制剂  11,479 U45878＝HSU45878人凋亡蛋白抑制剂mRNA
 脂皮素2  13253.2 包括M62895的集簇：人脂皮素(LIP)2假性基因mRNA
 脂皮素II  11,053 D00017＝HUMLIC人脂皮素II mRNA
 巨噬细胞衍生趋化因子  5,397 包括U83171的集簇：人巨噬细胞衍生趋化因子前体(MDC)mRNA
 MIF  21,100 L19686＝HUMMIF人巨噬细胞游走抑制因子(MIF)基因
 单核细胞特异增强因子  1,520 包括U49020的集簇：人肌细胞特异增强因子2A(MEF2A)基因
 髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白  334 包括D28113的集簇：人MOBP(髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白)mRNA
 肌细胞特异增强因子  1520.2 包括U49020的集簇：人肌细胞特异增强因子2A(MEF2A)基因
 NK增强因子  2,529 包括L19185的集簇：人自然杀伤细胞增强因子(NKEFB)mRNA
 口肿瘤抑制蛋白(doc-1)  4923.8 包括AF006484的集簇：人假想肿瘤抑制蛋白(doc-1)mRNA
 成骨蛋白  2356.6 包括X51801的集簇：人成骨蛋白OP-1 mRNA
 PK抑制剂  158.4 包括S76965的集簇：蛋白激酶抑制剂[人，成神经细胞瘤细胞系SH-SY-5Y
 PK抑制剂γ  846.1 包括AB019517的集簇：人蛋白激酶抑制剂γ的PKIG mRNA
 PKCI-1  12,528 U51004＝HSU51004人蛋白激酶C抑制剂(PKCI-1)
 前B细胞增强因子  733 包括U02020的集簇：人前B细胞增强因子(PBEF)mRNA
 原胸腺素α  5,279 包括M14630的集簇：人原胸腺素αmRNA
 RANTES  22,392 M21121＝HUMTCSM人T细胞特异蛋白(RANTES)mRNA
 RANTES  11,265 M21121/FEATURE＝/DEFINITION＝HUMTCSM人T细胞特异蛋白(RANTES)mRNA
 RANTES  1464.2 M21121＝HUMTCSM人T细胞特异蛋白(RANTES)mRNA
 SOD3  848 J02947＝HUMSODEC人细胞外超氧化物歧化酶(SOD3)mRNA
 sVEGF R(sflt)  645 U01134＝U01134人可溶性血管内皮细胞生长因子受体(sflt)mRNA
 TGF-b  3,899 M38449＝HUMTGFBA人转化生长因子βmRNA
胸腺素β-10  17,132 包括M92383的的集簇：人胸腺素β-10基因
胸腺素β-4  19,683 包括M17733的集簇：人胸腺素β-4 mRNA
胸腺素β4  915 包括AF000989的集簇：人胸腺素β-4 Y同型异构体(TB4Y)mRNA
TNF/LT  1,392 M16441＝HUMTNFAB人肿瘤坏死因子和淋巴毒素基因
TNF/LT  933 M16441＝HUMTNFAB人肿瘤坏死因子和淋巴毒素基因
TNF-b  5,506 包括D12614的集簇：人淋巴毒素(TNF-β)mRNA
TRAIL  6878.2 U37518＝HSU37518人TNF相关凋亡诱导配体TRAIL mRNA
TRAMP  5,480 包括X63679的集簇：人TRAMP蛋白mRNA
VEGF  2,444 包括U43368的集簇：人VEGF相关因子同型异构体VRF186前体(VRF)mRNA
从前面的描述可见，本发明解决了很多目的和特征。本领域的那些专业技术人员现在可从前面的描述中理解到，本发明中教导的广泛内容可以用多种形式来实现。因此，尽管本发明已经以一些特殊的实施方案及其实例被描述，但应该理解，可以进行多种改变和修饰而不会偏 离本发明的权利要求。

Claims (20)

1.一种含有人细胞因子混合物的组合物，通过以下步骤产生：
(a)培养能够产生细胞因子混合物的人细胞系，所述细胞系的特征在于过度表达细胞因子调节因子；
(b)处理过度表达细胞因子调节因子的细胞系以实现细胞因子混合物的产生增加；和
(c)收集由培养的、过度表达细胞因子调节因子的细胞系所产生的细胞因子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的过度表达细胞因子调节因子的细胞系是通过用编码细胞因子调节因子的核酸序列转化而产生的。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的过度表达细胞因子调节因子的人细胞系是通过亚克隆和选择而产生的。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的处理是指激发。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的处理是指激发和诱导。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的收集是指通过共同纯化所选择的细胞因子分馏产生的细胞因子。
7.根据权利要求1所述的组合物在癌症治疗中的用途，其中所述的产生的细胞因子包括选自以下的两种或多种细胞因子：白介素--2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、自然杀伤增强因子(NKEF)、自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)、TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
8.根据权利要求1所述的组合物在治疗病毒感染中的用途，其中所述的产生的细胞因子包括选自以下的两种或多种细胞因子：干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、转化生长因子β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
9.根据权利要求1所述的组合物在治疗炎症状态中的用途，其中所述的产生的细胞因子包括选自以下的两种或多种细胞因子：白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)。
10.包含人细胞因子混合物的组合物，通过以下步骤产生：
(a)培养能够产生细胞因子混合物的人细胞系，所述细胞系的特征在于过度表达抗凋亡蛋白；
(b)处理过度表达抗凋亡蛋白的细胞系以实现细胞因子混合物的产生增强；和
(c)收集由培养的、过度表达抗凋亡蛋白的细胞系所产生的细胞因子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述的过度表达抗凋亡蛋白的人细胞系可被修饰或选择以便获得一种细胞系，其进一步的特征是可过度表达细胞因子调节因子。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的过度表达抗凋亡蛋白和细胞因子调节因子的细胞系是用编码细胞因子调节因子的核酸序列转化而产生的。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的过度表达抗凋亡蛋白和细胞因子调节因子的细胞系是通过亚克隆和选择而产生的。
14.在细胞培养中产生人细胞因子混合物的方法，包括：
(a)培养能够产生人细胞因子混合物的人细胞系；
(b)选择或修饰培养的人细胞系，其中细胞因子调节因子被该细胞系过度表达；
(c)处理所述培养的、过度表达细胞因子调节因子的细胞系，以实现细胞因子的产生；和
(d)收集由培养的、处理的细胞系所产生的细胞因子。
15.根据权利要求16所述的方法，其中所述的过度表达细胞因子调节因子的细胞系是用编码细胞因子调节因子的核酸序列转化而产生的。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的过度表达细胞因子调节因子的人细胞系是通过亚克隆和选择而产生的。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述的过度表达细胞因子调节因子的细胞系进一步被修饰以表达抗凋亡蛋白。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的处理是指激发。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述的处理是指激发和诱导。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的细胞因子选自：
(a)白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、自然杀伤增强因子(NKEF)、自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)、TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的两种或多种，用于治疗癌症；
(b)干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-ω(IFN-ω)、转化生长因子β(TGF-β)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的两种或多种，用于治疗病毒感染；和
白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素--10(IL-10)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)中的两种或多种，用于治疗炎症状态。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010031859A1 (en) * 1999-09-08 2001-10-18 Lau Allan S. High level cytokine production with enhanced cell viability
AU2001290855A1 (en) 2000-09-14 2002-03-26 Genetrol Biotherapeutics, Inc. Method and cell composition for screening compounds for anti-inflammatory activity
US6896879B2 (en) * 2003-07-03 2005-05-24 Cel-Sci Corporation Method of pre-sensitizing cancer prior to treatment with radiation and/or chemotherapy and a novel cytokine mixture
CA2536041A1 (en) * 2003-11-10 2005-05-26 Angiotech International Ag Medical implants and fibrosis-inducing agents
US20060100264A1 (en) * 2004-11-06 2006-05-11 Bjeldanes Leonard F 3,3'-Diindolylmethane immune activating compositions
KR101143369B1 (ko) * 2009-04-28 2012-05-17 한국생명공학연구원 종양괴사인자?알파를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 분화방법

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US150541A (en) * 1874-05-05 Improvement in pressure-regulators
US129162A (en) * 1872-07-16 Improvement in vinegar-generators
US6410697B1 (en) * 1979-04-20 2002-06-25 Schering Corporation Process for purifying human leukocyte interferon
DE3211263A1 (de) * 1981-03-31 1983-01-27 Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo Human-interferon verwandte peptide, antigene und antikoerper, sowie verfahren zu deren herstellung
US4683199A (en) * 1983-01-31 1987-07-28 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Interleukin-2 dependent cytotoxic T-cell clones
DE3423234A1 (de) * 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
RU2130493C1 (ru) * 1984-07-06 1999-05-20 Новартис Аг Способ получения белка с активностью gm-csf приматов
UA29377C2 (uk) * 1984-09-19 2000-11-15 Новартіс Аг Спосіб отримання білка з активністю колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів(gm-csf) приматів
CA1291706C (en) * 1986-04-03 1991-11-05 Alfred Rudolph COMBINATION THERAPY USING INTERFERON-.beta. AND INTERLEUKIN-2
US5425940A (en) * 1986-04-09 1995-06-20 Cetus Oncology Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
US5098702A (en) * 1986-04-09 1992-03-24 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
US5362490A (en) * 1986-07-25 1994-11-08 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Human myelomonocyte interferon-gamma, and process for preparation and use thereof
US4929442A (en) * 1986-09-26 1990-05-29 Exovir, Inc. Compositions suitable for human topical application including a growth factor and/or related materials
EP0392300B1 (de) * 1989-04-11 1992-08-26 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Verwendung von mindestens ein Cytokin zur Herstellung eines Arzneimittels zur systemischen Behandlung von präneoplastischen Läsionen
US5141735A (en) * 1990-06-18 1992-08-25 Hoffman-La Roche, Inc. Substituted amino-benzodiazepines having anitviral activity
US5300292A (en) * 1991-05-03 1994-04-05 The Regents Of The University Of California Composition and method for treating inflammation
US5248499A (en) * 1991-10-07 1993-09-28 Genentech, Inc. Control of microbial infections in transplant patients
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
AU5847794A (en) * 1992-12-09 1994-07-04 Indiana University Foundation Suppression of myeloid cells
DE4242863A1 (de) * 1992-12-18 1994-06-23 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von G-CSF
TW381026B (en) * 1993-01-13 2000-02-01 Schering Corp Method of extracorporally activating cytolytic activity of peripheral blood mononuclear cells and pharmaceutical composition comprising the activated peripheral blood mononuclear cells
US5554512A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
US5624895A (en) * 1994-02-18 1997-04-29 Georgetown University Medical Center Treatment and/or prevention of type I diabetes mellitus with gamma interferon administration
DE69533941T2 (de) * 1994-11-17 2005-12-29 University Of South Florida, Tampa Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung des sekundärimmunmangels
EP0721780A3 (en) * 1994-12-16 1997-12-17 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Agent for promoting platelet and/or leukocyte production
US6033674A (en) * 1995-12-28 2000-03-07 Johns Hopkins University School Of Medicine Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression
WO1998000013A1 (en) * 1996-06-28 1998-01-08 The Regents Of The University Of California Enhancement of cancer cell death
CA2376487A1 (en) * 1999-06-15 2000-12-21 Allan S. Lau Methods for enhancing the production of cytokines in cell culture
DE60035515T2 (de) * 1999-09-08 2008-04-17 GeneTrol Biotherapeutics, Inc., Oakland Hohe zytokinproduktion mit verbesserter zelllebensfähigkeit

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WO2002022848A3 (en) 2002-06-13
JP2004529851A (ja) 2004-09-30
WO2002022848A2 (en) 2002-03-21
CA2422060A1 (en) 2002-03-21
EP1318834A2 (en) 2003-06-18
US20020150552A1 (en) 2002-10-17

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