DE60035515T2

DE60035515T2 - Hohe zytokinproduktion mit verbesserter zelllebensfähigkeit

Info

Publication number: DE60035515T2
Application number: DE60035515T
Authority: DE
Inventors: Allan S. 62 Mt. Davis Road LAU; Laura Brentwood BROWNING; Michael C. Clayton KIEFER
Original assignee: Genetrol Biotherapeutics Inc
Current assignee: Genetrol Biotherapeutics Inc
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: JP2003509025A; DE60035515D1; ATE366803T1; AU7126000A; EP1214399B1; WO2001018185A1; EP1214399A1; CA2383563A1; HK1048135A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Produktion von Cytokinen in Zellkultur durch Hemmung der mit der Synthese von Cytokinen einhergehenden Apoptose, speziell unter Bedingungen der Überproduktion von PKR.
Literaturverzeichnis

Abbas, AK, et al., Eds., CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, 3 Auflage WB Saunders Co., 256-257, 1997).
Antonelli, G., J Interferon Cytokine Res (17): Erg. 1:S39-S46, (1997).
Antonelli, et al., J. Inf. Disease 163:882-885 (1991).
Ausubel, FM, et al., in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1992).
Baker, S.J., et al., Science 249(4971):912-5, (1990).
Balachandran, S., et al., EMBO J. 17:6888-6902, (1998).
Balkwill FR und Burke F, Immunology Today, 10(9):299, (1989).
Boise, Thompson. Current Topics Microbial Immunol 200:107-121, (1995).
Chinnaiyen, D., et al., Cell 81:505-512, (1995).
Chong KL et al., EMBO J, 11(4):1553-62 (1992).
Clemens MJ und Sommer UA, Int J Biochem Cell Biol, 31(1):1-23, (1999).
Clemens MJ und Elia A, J Interferon Cytokine Res, 17(9):503-24, (1997).
Clark S und Kamen R, Science, 236:1229-1237, (1987).
Cohen, J.J., Immunol Today 14(3):126-130, (1993).
Cohen, J.J., et al., Annu Rev Immunol 10:267-293, (1992).
Der, D., und Lau, A.S., Proc Natl Acad Sci USA, 92:8841-8845, (1995).
Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY, 182, 1990; Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, New York (1982).
Donze, O., et al., Virol 256:322-329, (1999).
Dressler, K.A., et al., Science 255:1715-1718, (1992).
Feng GS et al, Proc Natl Acad Sci USA 89(12):5447-51 (1992).
Galabru, J., and Hovanessian, A., J. Biol. Chem. 262:15538-15544 (1987).
Garcia, I., et al., Science 258:302-304, (1992).
Guy, G.R., et al., J Biol Chem 267(3):1846-1852, (1992).
Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Pubs, N.Y. (1988).
Heller, R.A., et al., Cell 70(1):47-56, (1992).
Hershey, J.W.B., Ann. Rev. Biochem. 60:717-755, (1991).
Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988.
Huang et al., Oncogene 14:405-414, 1997.
Kane, D.J., et al., Science 262:1274-1277, (1993).
Korsmeyer, S.J., Blood 80(4):879-886, (1992).
Koromilas et al., Science 257:1685, 1992.
Kosik, K.S., Science 256:780-783, (1992).
Kumar, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:6288-6292, (1994).
Larrick, J.W., und Wright, S.C., FASER J 4:3215-3223, (1990).
Lau, A.S., et al., Pediat Infect Dis J, CME Review 15:563-575, (1996).
Levine, A.J., Annu Rev Biochem 62:623-651, (1993).
Liddil, J.D., et al., Cancer Res 49:2722-2728, (1989).
EF et Meurs al., J Virol. 66(10):5804-14 (1992).
Meurs, E., und Hovanessian, A.G., Cell 62:379-390, (1990).
Nagata, S., und Suda, T., Immunol Today 16(1):39-43, (1995).
Obeid, L.M., et al., Science 259:1769-1771, (1993).
Oehm, A., et al., J Biol Chem 267(15):10709-10715, (1992).
Orrenius, S., J Intern Med 237:529-536, (1995).
Reed, J., et al., Nature 336:259-261, (1988).
Reed, J., et al., Exp Cel Research 195:277-283, (1991).
Rubin, B.Y., et al., Cancer Res 48:6006-6010, (1988).
Sambrook J., et al., in MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989).
Schendel, Cell Death Differentiation 5(5):372-380, (1989).
Schulze-Osthoff, K., et al., Eur J Biochem 254:439-459, (1998).
Sen, G.C., und Lengyel, P., J Biol Chem 267:5017-5020, (1992).
Stellar, H., Science 267:1445-1449, (1995).
Srivastave, S., et al., J Biol Chem 273:2416-2423, (1998).
Taylor, J.L., und Grossberg, S.E., Virus Research 15:126, (1990).
Thompson, C.B., Science 267:1456-1462, (1995).
Tracey, K.J., und Cerami, A., Annu Rev Cell Biol. 9:317-343, (1993).
Van Lint, J., et al., J Biol Chem 267(36):25916-25921, (1992).
Vaux, D.L., Proc Natl Acad Sci USA 90:786-789, (1993).
Williams, B.R.G., Eur J Biochem. 200:111, (1991).
Williams, B.R.G., Seminars in Oncology 24(S9):70-77, (1997).
Wong G and Clark S, Immunology Today, 9(5):137, 1988.
Yeh, et al., Science 279:1954-1958, (1998).
Yeung, M.C., et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:12451-12455, (1996).
Yeung, M., und Lau, A.S., J Biol Chem 273:25198-25202, (1998).
Yeung, M., et al., AIDS 12:349-354, (1998).
Yonehara, S., et al., J Exp Med 169(5):1747-1756, (1989).
Zamanian-Daryoush M. et al., Oncogene 14;18(2):315-26, (1999).

Infektion durch Pathogene, wozu Viren, Bakterien und Parasiten gehören, hat eine Aktivierung des Immunsystems des Wirts zur Folge sowie eine Signalleitung durch verschiedene Moleküle wie z.B. Cytokine, was zu einer Mobilisierung von mehreren Zweigen des Immunsystems führt. Cytokine stellen eine schnell wachsende Ansammlung wirksamer pleiotroper Polypeptide dar, die als lokale und/oder systemische interzelluläre regulatorische Faktoren fungieren. (Siehe z.B. Balkwill und Burke, 1989; Wong und Clarke, 1988 und Clark und Kamen, 1987). Sie spielen eine entscheidende Rolle bei vielen biologischen Prozessen wie z.B. Immunität, Entzündung und Hämatopoese und werden von verschiedenen Zelltypen produziert, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Makrophagen/Monocyten und Lymphocyten. Bis heute ist eine große Zahl von Cytokinen identifiziert worden, einschließlich Interferonen (IFNs), Tumornekrosefaktoren (TNFs), Interleukinen (Ils), Wachstumsfaktoren (zum Beispiel epidermalen Wachstumsfaktoren) und Differenzierungsfaktoren [zum Beispiel Koloniestimulierungsfaktoren (CSF)]. Zahlreiche andere Proteine, für die es sowohl pharmazeutische als auch industrielle Anwendungen gibt, werden durch Zellkultur hergestellt.
Im Allgemeinen werden Cytokine und andere Proteine entweder durch Aufreinigung des natürlichen Proteins aus Zellkultur oder durch rekombinante Herstellung des Proteins in Insekten-, mikrobiellen oder menschlichen Zellen produziert. Natürliche Cytokine und andere Proteine sind bevorzugt, weil es bekannt ist, dass sie das komplette Repertoire von nativen Formen eines bestimmten Cytokins oder Proteins enthalten und die richtige Struktur aufweisen, aber ihre Herstellung ist teuer und zeitaufwändig.
Rekombinant hergestellte Cytokine und andere Proteine sind günstiger in der Herstellung, können aber je nach Quelle fremde Antigene enthalten, was eine Immunreaktion des Individuums zur Folge hat, dem sie verabreicht werden, oder sie können auf Grund von struktureller Abweichung von der nativen Form, etwa dem Glycosylierungsmuster, weniger aktiv sein.
Daher wäre ein Verfahren zur Erhöhung der Produktion natürlicher Cytokine und anderer Proteine vorteilhaft, das deren Herstellung günstiger machen würde.
Derzeitige Verfahren nutzen die Expression dieser Faktoren in mikrobiellen Systemen, die unter Umständen nicht die korrekte Glycosylierung für die native Faltung der Proteine erlauben, oder in menschlichen Zellen mit niedrigen Produktionsmengen.
Eine beispielhafte Gruppe von Cytokinen, die Interferone, werden in Reaktion auf virale Infektionen oder das Wachstum von Tumorzellen erzeugt. Diese Glycoproteine weisen zusätzlich zu ihren antiviralen Wirkungen Antitumor- und immunmodulatorische Aktivitäten auf. Seit 1994 haben IFNs die FDA-Zulassung für spezifische klinische Indikationen in den Vereinigten Staaten erhalten. Vor kurzem sind zwei IFN-beta-Präparate, das eine in E. coli hergestellt und das andere in Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, für Patienten mit Multipler Sklerose zugelassen worden. Von dem ersteren Produkt ist bekannt, dass es anti-IFN-Antikörper induziert und somit die Bildung von Interferon-Immunkomplexen. Es verursacht auch unerwünschte Nebenwirkungen, wozu eine Gewebenekrose an der Injektionsstelle bei den meisten Patienten gehört. Bakteriell hergestellten IFNs sind weitere Mängel zugeschrieben worden, wozu die Induktion von Antikörpern gehört, wahrscheinlich auf Grund des Fehlens der Glycosylierung; und eine beschränkte Wirksamkeit von IFN-alpha bei verschiedenen Krankheiten kann teilweise auf das Fehlen anderer Subtypen in den rekombinanten Formulierungen zurückgeführt werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Inzidenz einer Abstoßung, reflektiert durch die Bildung von Antikörpern, für in Bakterien hergestelltes IFN so hoch wie 20 bis 38% sein kann, verglichen mit nur 1,2% für natürliches IFN-alpha (Antonelli et al., 1991; Antonelli et al., 1997).
Durch dsRNA aktivierte Proteinkinase (PKR), bezeichnet als P1/eIF2-Kinase, als DAI oder dsl für den durch dsRNA aktivierten Inhibitor und als p68- (menschliche) oder p65-Kinase (von der Maus), ist eine Serin/Threonin-Kinase, deren enzymatische Aktivierung die Bindung an dsRNA oder an einzelsträngige RNA, welche interne dsRNA-Strukturen aufweist, sowie eine daraus folgende Autophosphorylierung erfordert (Galabru und Hovanessian, 1987; Meurs et al., 1990). PKR spielt eine Schlüsselrolle bei der Expression von einer Reihe von nützlichen Cytokinen, wozu Interferone gehören, wie in WO 97/08324 beschrieben ist, welche hierin ausdrücklich unter Bezugnahme aufgenommen ist.
Aktivitäten, welche der PKR zugeschrieben werden, umfassen eine Rolle bei (1) der Vermittlung von antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten von IFN-alpha und IFN-beta, (2) bei der Reaktion von uninfizierten Zellen auf physiologischen Stress und (3) bei der Regulation des Zellwachstums (Clemens und Elia, 1997; Zamanian-Daryoush et al., 1999).
Das am besten charakterisierte in vivo-Substrat für PKR ist die alpha-Untereinheit des eukaryontischen Initiationsfaktors 2 (eIF-2a), die, sobald sie phosphoryliert ist, im Endeffekt zur Hemmung der zellulären und viralen Proteinsynthese führt (Hershey, J.W.B., 1991). Es ist gezeigt worden, dass PKR den Initiationsfaktor eIF-2 alpha in vitro phosphoryliert, wenn sie durch doppelsträngige RNA aktiviert wird (Chong et al., 1992).
Es ist auch vorgeschlagen worden, dass PKR als ein Tumorsuppressor und als ein Induktor der Apoptose fungieren kann. (Siehe z.B. Clemens und Sommer, 1999; Koromilas et al., 1992), wobei vor kurzem gewonnene Ergebnisse einen Hinweis darauf liefern, dass die Expression einer aktiven Form von PKR Apoptosis auslöst, möglicherweise durch Hochregulierung des Fas-Rezeptors (Donze, O. et al., 1999). Siehe auch Yeung, M.C. et al., 1996; Yeung, M. und Lau, A.S., 1998).
Es wäre wünschenswert, apoptotischen Zelltod bei Zelllinien in Kultur als ein Mittel, die Produktion von Cytokinen und anderen Proteinen durch die Zellen in solchen Kulturen zu verlängern und dadurch zu verstärken, zu hemmen.
Die Erfindung umfasst in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Cytokins oder von ausgewählten Cytokinen in einer Kultur von menschlichen Zellen. Das Verfahren umfasst Züchten einer menschlichen Zelllinie, die in der Lage ist, Cytokine zu produzieren, und die mit einem ersten Vektor transfiziert ist, der eine DNA, die ein Protein codiert, das wirksam ist, um die Apoptose von Zellen zu hemmen, unter der Kontrolle eines ersten Promotors enthält, sowie mit einem zweiten Vektor transfiziert ist, der eine DNA, die eine doppelsträngige RNA-abhängige Kinase (PKR) codiert, unter der Kontrolle eines zweiten Promotors enthält. Die Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, unter denen PKR in den transfizierten Zellen überproduziert wird, wie durch die Spiegel von PKR in der transfizierten Zelllinie gezeigt ist, die höher sind als diejenigen, die man in der menschlichen Zelllinie erhält, die nicht mit dem ersten und zweiten Vektor transfiziert sind, wenn man sie unter denselben Kulturbedingungen wachsen lässt. Die PKR überproduzierenden Zellen werden behandelt, um Cytokin zu induzieren, z.B. indem man die Zellen doppelsträngiger RNA (dsRNA) aussetzt, und das von der gezüchteten behandelten Zelllinie produzierte Cytokin (die von der gezüchteten behandelten Zelllinie produzierten Cytokine) wird (werden) aufgefangen.
Die gezüchteten Zellen werden bevorzugt hergestellt, indem man eine menschliche Zelle, die in der Lage ist, Cytokine zu produzieren, erfolgreich mit dem ersten und dem zweiten Vektor transfiziert. Bei dem Protein, das wirksam ist, um die Apoptose zu hemmen, kann es sich zum Beispiel um Bcl-2a, Bcl-X_L handeln, um eine modifizierte Form des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 alpha (eIF-2alpha) und um den eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor (eIF-3), um eine modifizierte Form der Fas-assoziierten Todesdomäne (FADD), um eine modifizierte Form von Bcl-X_S, um eine modifizierte Form des zu Bcl-2 homologen Antagonist/Killer (BAK) und um eine modifizierte Form von BAX, bevorzugt um Bcl-2a oder Bcl-X_L.
Der erste und der zweite Promotor können induzierbar sein, z.B. ein Metallothionein-Promotor. Das produzierte Cytokin (die produzierten Cytokine) kann (können) eines oder mehrere der folgenden sein: Interferone, einschließlich IFN-gamma, IFN-alpha und IFN-beta; Tumornekrosefaktoren (TNF), einschließlich TNF-alpha, TNF-beta und lösliche TNF-Rezeptoren (sTNF-R); Interleukine (IL), einschließlich IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 und IL-12; Koloniestimulierungsfaktoren, einschließlich Granulocyten-Koloniestimulierungsfaktor (G-CSF) und Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktor (GM-CSF); angiogene Faktoren, einschließlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF); Blutplättchen-Wachstumsfaktor 1 und 2 (PDGF-1 und -2); Chemokine, einschließlich Regulated Upon Activation Normally T-Expressed Secreted (RANTES); Makrophagenentzündungsproteine (MIP) wie z.B. MIP-1alpha und MIP2alpha, Monocyten-chemotaktisches Protein I (MCP); antiangiogenetische Faktoren, einschließlich Angiostatin und Endostatin; Leukämie-inhibierender Faktor (LIF); ciliärer neurotropher Faktor; Cardiotrophin und Oncostatine, einschließlich Oncostatin M.
Die menschliche Zelle ist zum Beispiel von menschlichen Fibroblasten abgeleitet oder von Immunzellen, B-Zellen, T-Zellen, Monocyten, Neutrophilen, natürlichen Killerzellen, pro-monocytären U937-Zellen, Namalwa-Zellen, MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Flow 1000-Zellen, Flow 4000-Zellen, FS-4-, FS-7-Zellen, MG-63-Zellen, CCRF-SB-Zellen, CCRF-CEM, Jurkat-Zellen, WIL2-Zellen und THP-1-Zellen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Cytokinen in einer menschlichen Zelllinie durch Züchten einer menschlichen Cytokin-produzierenden Zelle unter Bedingungen einer Überproduktion von PKR und einer Cytokin-Induktion. Das Verfahren umfasst zur Erhöhung der Lebensfähigkeit der Zellen die Verwendung von Zellen, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der eine DNA enthält, die ein Protein codiert, das wirksam ist, Apoptose in den Zellen zu hemmen, als die Zelllinie.
Eine bevorzugte Zelllinie ist eine, die mit einem Vektor transfiziert worden ist, der eine DNA enthält, die PKR exprimiert. Die DNA, die das Protein codiert, das Apoptose in den Zellen wirksam inhibiert, codiert zum Beispiel Bcl-2, Bcl-X_L, eine modifizierte Form des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 alpha (eIF-2 alpha) oder eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor (eIF-3), eine modifizierte Form der Fas-assoziierten Todesdomäne (FADD), eine modifizierte Form von Bcl-X_S, eine modifizierte Form von BAK und eine modifizierte Form von BAX, bevorzugt Bcl-2 oder Bcl-X.
Diese und andere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden noch offenkundiger, wenn die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Ver bindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Die 1A und 1B zeigen die Vektoren, pEF-FLAG-Bcl-X_L bzw. pcDNA-FLAG-PKR, welche bei der Ausführung der Erfindung nützlich sind;
Die 2A und 2B zeigen den prozentualen Anteil an lebensfähigen 6A-, A9- und WT-Zelllinien nach Cytokin-Induktion durch Sendai-Virus bzw. poly-IC; und
Die 3A und 3B zeigen die Spiegel von IFN-alpha, die in den 6A-, A9- und WT-Zelllinien nach Behandlung mit Sendai-Virus bzw. poly-IC produziert werden.
I. Begriffserklärungen
Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die neue Nucleinsäuren in sich aufnehmen und diese neuen Sequenzen in einem geeigneten Wirt vermehren kann. Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf rekombinante Plasmide und Viren. Der Vektor (zum Beispiel ein Plasmid oder ein rekombinantes Virus), der die Nucleinsäure der Erfindung umfasst, kann in einem Träger vorliegen, zum Beispiel einem Plasmid, das mit einem Protein in einem Komplex vorliegt, einem Plasmid, das in einem Komplex mit Lipid-basierten Nucleinsäure-Transduktionssystemen vorliegt, oder anderen nicht-viralen Trägersystemen.
Ein Clonierungs- oder Expressionsvektor kann zusätzliche Elemente umfassen, z.B. kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme besitzen, wodurch es ihm möglich ist, in zwei Organismen gehalten zu werden, zum Beispiel in menschlichen oder in Insektenzellen zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifizierung.
Sowohl Clonierungs- als auch Expressionsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, welche den Vektor befähigt, in einer oder in mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren wohlbekannt. Des Weiteren enthält der Expressionsvektor für die Integration des Expressionsvektors mindestens eine Sequenz, die zu dem Genom der Wirtszelle homolog ist, und bevorzugt zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionskonstrukt flankieren. Der Integrationsvektor kann auf einen spezifischen Locus in der Wirtszelle gerichtet sein, indem eine geeignete homologe Sequenz für die Einfügung in den Vektor ausgewählt wird. Konstrukte für Integrationsvektoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
Clonierungs- und Expressionsvektoren enthalten üblicherweise einen Selektionsmarker. Typische Selektionsmarker-Gene codieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, zum Beispiel gegen Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe liefern, die nicht aus komplexen Medien verfügbar sind, zum Beispiel das Gen, das die D-Alanin-Racemase für Bacilli codiert.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verknüpften codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, umfassen zum Beispiel einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Eukaryontische Zellen sind dafür bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Die codierende Nucleinsäuresequenz muss „funktionell verknüpft" sein, indem man sie mit einer anderen Nucleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung setzt. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder eine Leadersequenz für die Sekretion funktionell mit einer DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn dieses als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn sie so platziert ist, dass sie die Translation ermöglicht. Im Allgemeinen sind „funktionell verknüpfte" DNA-Sequenzen zusammenhängend und, im Fall einer Leadersequenz für die Sekretion zusammenhängend und im Leseraster. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Eine Verknüpfung wird durch Ligierung an passenden Restriktionsstellen bewerkstelligt. Falls es solche Stellen nicht gibt, werden die synthetischen OligonucleotidAdapter oder -Linker in Übereinstimmung mit der üblichen Praxis eingesetzt.
Promotorsequenzen codieren entweder konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder in der Natur vorkommende, konstruierte oder Hybridpromotoren sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „PKR-Expression" auf die Transkription und Translation des PKR-Gens, dessen Produkte Vorläufer-RNA, mRNA, Polypeptid, das posttranslationell prozessierte Polypeptid und Derivate davon umfassen, und schließt PKRs von anderen Spezies wie z.B. murine oder Affen-Enzyme ein. Beispielsweise schließen Tests für die PKR-Expression Autophosphorylierungs-Tests, einen Test für die Phosphorylierung von eIF2α, Western- und Northern-Blot-Analyse und reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) für PKR-mRNA ein.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „biologische Aktivität von PKR" und „biologisch aktive PKR" auf eine beliebige biologische Aktivität, die mit PKR oder einem beliebigen Fragment, Derivat oder Analog von PKR assoziiert ist, wie z. B. enzymatische Aktivität, was insbesondere Autophosphorylierungsaktivität und Phosphorylierungsaktivität des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 (eIF-2) einschließt.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „normaler Spiegel der PKR-Aktivität" und „normaler Spiegel der PKR-Expression" auf den Spiegel der PKR-Aktivität oder -Expression, von dem man feststellt, dass er in unstimulierten oder uninfizierten Zellen eines bestimmten Typs vorliegt, zum Beispiel einer bestimmten Zelllinie. Es ist ersichtlich, dass eine solche „normale" PKR-Aktivität oder -Expression als ein Bereich von PKR-Aktivität oder -Expression ausgewiesen wird, der im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird, die nicht mit einem Vektor transfiziert worden sind, der PKR codiert, die unstimuliert (nicht induziert oder sensibilisiert („primed") und uninfiziert sind.
Der Bereich „normaler" PKR-Aktivität oder -Expression kann je nach Kulturbedingungen etwas schwanken. Zum Beispiel kann die Zelllinie U937 einen normalen Bereich der PKR-Aktivität aufweisen, der sich von dem normalen Bereich der PKR-Aktivität für die Vero- oder Namalwa-Zelllinien unterscheidet. Daraus folgt, dass eine Überexpression von PKR einen Expressionsspiegel bedeutet, der oberhalb des normalen Bereichs der PKR-Expression liegt, die im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird, die nicht mit einem Vektor transfiziert sind, der PKR codiert, die unstimuliert (nicht induziert oder sensibilisiert) und uninfiziert sind. Dementsprechend bedeutet „Überexpression” von PKR einen Bereich der PKR-Aktivität oder -Expression, der höher ist als der, der im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird, die nicht mit einem Vektor transfiziert sind, der PKR codiert, die unstimuliert (nicht induziert oder sensibilisiert) und uninfiziert sind.
Ähnliche Definitionen gelten für Bcl-2, Bcl-X_L und verwandte Homologe, wobei „Überexpression" von Bcl-2 bzw. Bcl-X_L einen Bereich der Bcl-2- bzw. Bcl-X_L-Aktivität oder -Expression bedeutet, der höher ist als der, der im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird, die nicht mit einem Vektor transfiziert sind, der Bcl-2 oder Bcl-X_L codiert, und die nicht stimuliert worden sind, in Apoptose zu gehen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „modifizierte Form von" in Bezug auf Proteine, die mit Apoptose assoziiert sind, als Beispiele seien eIF-2a oder eIF-2 alpha, eIF-3, FADD, Bcl-X_S, BAK, BAX etc. genannt, ein Derivat oder eine abweichende Form des nativen Proteins. Das heißt, eine „modifizierte Form" eines Proteins weist eine Derivat-Polypeptidsequenz auf, die mindestens eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion aufweist, wobei Aminosäuresubstitutionen besonders bevorzugt sind. Die Aminosäuresubstitution, -insertion oder -deletion kann an jedem Rest innerhalb der Polypeptidsequenz vorkommen, der die biologische Aktivität des Proteins beeinflusst. Die entsprechende Nucleinsäuresequenz, welche das abweichende oder Derivat-Protein codiert, wird daher als „mutierte" oder „modifizierte Form" des Gens oder der codierenden Sequenz angesehen, und ist ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „biologische Aktivität" oder „biologisch aktiv" auf die Aktivität, die einem bestimmten Apoptose-assoziierten Protein in einer Zelllinie in Kultur in seiner nativen Form zugeschrieben wird. Es ist ersichtlich, dass die „biologische Aktivität" eines solchen Proteins je nach Kulturbedingungen etwas schwanken kann und im Allgemeinen als ein Aktivitätsbereich ausgewiesen wird. Dementsprechend bezieht sich eine „biologisch inaktive" Form eines Proteins auf eine Form des Proteins, die auf eine Weise modifiziert worden ist, die die Aktivität des Proteins, wie es in der Natur zu finden ist, beeinträchtigt. Zum Beispiel kann eine „biologisch inaktive" Form von eIF-2a eine Form des Proteins sein, die eine modifizierte Phosphorylierungsstelle aufweist, die nicht als ein Proteinsyntheseinhibitor fungiert und nicht zur Apoptose beiträgt, wie es die native „biologisch aktive" Form von eIF-2a tut.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „normaler Cytokinspiegel" und „normaler Proteinspiegel" in Bezug auf Aktivität, Expression und Produktion auf den Spiegel eines Cytokins oder die Aktivität, Expression oder Produktion eines anderen Proteins, von dem festgestellt wird, dass es in Zellen eines bestimmten Typs vorliegt, die nicht auf eine Weise behandelt worden sind, die wirksam ist, Apoptose zu hemmen, und nicht auf eine Weise transformiert worden sind, die wirksam ist, um eine Überexpression von PKR zur Folge zu haben. Beispiele umfassen eine Zelllinie, die nicht mit einem Transgen transfiziert worden ist, das PKR oder ein Protein, welches mit Apoptose assoziiert ist, codiert, und die ein bestimmtes Cytokin oder anderes Protein entweder normal produziert oder in der Lage ist, dieses zu produzieren. Es ist ersichtlich, dass die „normale" Aktivität, Expression oder Produktion eines solchen Cytokins oder anderen Proteins als ein Aktivitäts-, Expressions- oder Produktionsbereich ausgewiesen wird, der im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird und je nach Kulturbedingungen etwas schwanken kann.
Die Definitionen, die für Cytokine gelten, gelten in ähnlicher Weise auch für „andere Proteine", welche mit Hilfe der Verfahren der Erfindung hergestellt werden.
Zum Beispiel weist eine bestimmte Zelllinie, die PKR nicht überexprimiert und nicht auf eine Weise behandelt worden ist, die wirksam ist, um Apoptose zu hemmen, einen normalen Bereich von Cytokinaktivität auf, der sich von dem Bereich der Cytokinaktivität für dieselbe Zelllinie nach einer Modifikation unterscheidet, die (1) eine Überexpression von PKR und (2) eine Hemmung des apoptotischen Zelltods zur Folge hat.
Die Begriffe „apoptotischer Zelltod", „programmierter Zelltod" und „Apoptose", wie hierin verwendet, beziehen sich auf jeden Zelltod, der eine Folge der komplexen Kaskade zellulärer Ereignisse ist, oder damit verbunden ist, die in bestimmten Stadien der zellulären Differenzierung und in Reaktion auf bestimmte Stimuli auftreten. Apoptotischer Zelltod ist durch die Schrumpfung des Cytoplasmas und des Kerns sterbender Zellen gekennzeichnet.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „apoptotischen Zelltod hemmen" die teilweise oder vollständige Hemmung des Zelltodprozesses über den Zeitraum hinweg, währenddessen eine Zelllinie zum Zweck der Expression von Cytokinen oder anderen Proteinen gezüchtet wird. Eine solche Hemmung bedeutet im Allgemeinen, dass die Rate des apoptotischen Zelltods um mindestens 20% und bevorzugt 80% oder mehr gegenüber der Rate des apoptotischen Zelltods verringert ist, die in einer Zelllinie beobachtet wird, die nicht auf eine Weise modifiziert worden ist, die wirksam ist, Apoptose zu hemmen.
Bei der Cytokinherstellung bedeutet solch eine Inhibierung im Allgemeinen eine Abnahme der Menge an apoptotischem Zelltod um mindestens 50% und vorzugsweise um 80% oder mehr, je nach der beobachteten Menge an apoptotischem Zelltod in einer PKR-überexprimierenden Zelllinie, die nicht in einer Weise modifiziert worden ist, die effektiv ist, um Apoptose zu inhibieren.
II. PKR
IFNs lösen ihre biologischen Aktivitäten aus, indem sie an ihre zugehörigen Rezeptoren binden, gefolgt von einer Signalübertragung, die zu einer Induktion von durch IFN stimulierten Genen, ISG, führt. Diese IFGs vermitteln die biologischen Aktivitäten von IFNs intrazellulär über mindestens zwei Reaktionspfade: den Abbau von RNA über die Aktivierung einer spezifischen Ribonuclease und die Induktion einer IFN-regulierten und durch doppelsträngige RNA aktivierten Kinase (PKR).
Beispiele für ISGs schließen PKR (früher als p68-Kinase bekannt), 2'-5'-verknüpftes Oligoadenylat (2-5A)-Synthetase und Mx-Proteine (Taylor und Grossberg, 1990; Williams, 1991, 1997) ein. Die 2-5A-Synthetase synthetisiert unter Verwendung von ATP als Substrat kurze Oligomere von bis zu 12 Adenylatresten, die durch 2'-5'-Phosphodiesterbindungen verknüpft sind. Die so erhaltenen Oligoadenylat-Moleküle aktivieren eine latente Ribonuclease, RNase L, die virale und zelluläre RNAs abbaut. Der 2-5A-Synthetase-Reaktionspfad scheint wichtig zu sein für (1) eine Verringerung der Synthese von viralen Proteinen in Zell-freien Proteinsynthesesystemen, die aus mit IFN behandelten Zellen isoliert werden, und (2) für die Hemmung des Wachstums von Tumorzellen.
PKR ist das einzige identifizierte dsRNA-bindende Protein, von dem bekannt ist, dass es eine Kinase-Aktivität besitzt. PKR ist eine Serin/Threonin-Kinase, deren enzymatische Aktivierung die Bindung an dsRNA und eine sich daraus ergebende Autophosphorylierung erfordert (Meurs et al., 1990; Feng, GS et al., 1992).
PKR ist eine Reihe von Funktionen zugeschrieben worden, wozu die Phosphorylierung des eukaryontischen Initiationsfaktors 2 (eIF-2 alpha) gehört, welcher, sobald er phosphoryliert ist, zu einer Hemmung der Proteinsynthese führt (Hershey et al., 1991). Diese spezielle Funktion von PKR ist als einer der Mechanismen vorge schlagen worden, die dafür verantwortlich sind, die antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten von IFN-alpha und IFN-beta zu vermitteln. Eine zusätzliche biologische Funktion für PKR ist ihre mutmaßliche Rolle als ein Signalüberträger, zum Beispiel durch Phosphorylierung von IκB, was zu einer Freisetzung und Aktivierung des nuklearen Faktors κB führt (NF-κB) führt (Kumar, A. et al., 1994).
Es ist früher gezeigt worden, dass PKR die transkriptionelle Aktivierung der IFN-Expression vermittelt (Der, D. und Lau, A.S., 1995). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führte eine Unterdrückung der endogenen PKR-Aktivität durch Transfektion von U937-Zellen mit Antisense gegen PKR oder eine Expression einer PKR-defizienten Mutante zu einer verminderten Induktion von IFN in Reaktion auf eine virale Infektion (Der, D. und Lau, A.S., 1995).
Zusammenfassend gesagt ist PKR in Verbindung gebracht worden mit (1) der Signalübertragung für komplexe Rezeptorsysteme (einschließlich IFN, TNF und Fas), (2) mit der transkriptionellen Aktivierung von Cytokingenen, (3) mit der Einleitung der Apoptose und (4) mit der Hemmung der Proteinsynthese durch Phosphorylierung von eIF2α.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist entdeckt worden, dass die Lebensfähigkeit von Zellen in Zellen, die Cytokine produzieren, unter Bedingungen einer Überexpression von PKR erhöht ist, indem man als die Cytokin-produzierende Zelllinie Zellen verwendet, die mit einem Gen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors transfiziert worden sind, das ein Protein codiert, das in der Lage ist, die Apoptose in den Zellen zu hemmen. Der Promotor kann ein konstitutiver Promotor sein oder einer, der durch Zugabe eines geeigneten Induktors zum Kulturmedium induzierbar ist, wie z.B. ein Metallothionein-Promotor, der durch Zugabe bestimmter Metallsalze hochreguliert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Überexpression von PKR mit Zellen erreicht, die auch mit einem Gen, das PKR codiert, ebenfalls unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, entweder konstitutiv oder induzierbar, für die Überexpression der PKR in Kultur transfiziert worden sind.
Die Beispiele 1 und 2 hierin beschreiben beispielhafte Vektoren und Transfektionsverfahren, um Zellen zu gewinnen, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind. Üblicherweise werden die Zellen zuerst mit dem Vektor transfiziert, der das anti-apoptotische Gen enthält, dann werden erfolgreiche Transformanten weiter mit dem Vektor transfiziert, der das PKR-Gen enthält. Dies ermöglicht es, dass die zweite Transfektion und Selektion mit Zellen durchgeführt wird, die bereits mit einer antiapoptotischen Funktion „stabilisiert" worden sind. Die Konstruktion des Vektors und die Bedingungen der Transfektion sind herkömmlich und Fachleuten bekannt. Es ist bei solchen Vektorkonstruktionen insbesondere wohlbekannt, geeignete Plasmide oder andere Vektoren z.B. aus kommerziellen Quellen zu erhalten, die in der Lage sind, in ausgewählte menschliche Zellen eingebracht zu werden und darin zu replizieren, wobei die Plasmide auch mit Selektionsmarkern, Insertionsstellen und geeigneten Kontrollelementen ausgestattet sein können, wie z.B. Terminationssequenzen. Das Plasmid kann einen eigenen Promotor haben oder nicht. Falls nicht, wird die Konstruktion des Vektors die Insertion eines geeigneten Promotors erfordern, für welchen Sequenzen weit verbreitet verfügbar sind und zum Beispiel aus der GenBank-Datenbank codierender Sequenzen erhalten werden können. Typische codierende Sequenzen für ein PKR-Gen und für ein Bcl-X_L-Gen sind in Beispiel 1 aufgeführt und können, wie zitiert, aus der GenBank erhalten werden. Eine Vielzahl von Genen, deren Expressionsprodukte dafür bekannt sind, Apoptose zu hemmen, können verwendet werden und sind nachstehend aufgeführt. Die Promotor- und die codierenden Sequenzen werden nach wohlbekannten rekombinanten Techniken in einen geeigneten Vektor eingesetzt.
III. APOPTOSE
Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein der Zelle innewohnender Selbstmord-Prozess (in Übersichtsartikeln in Orrenius, 1995; Stellar, 1995; Vaux, 1993 beschrieben). Apoptose bringt viele Vorteile für Organismen, sowohl während der Entwicklung des Fötus (Cohen, 1992), bei der Kontrolle der Bildung von Organen (Nagata & Suda, 1995; Vaux, 1993) als auch zu Zwecken der Homöostase im Leben von Erwachsenen. Sobald sie auf Apoptose festgelegt sind, durchlaufen die Zellen neue Runden von Proteinsynthese und verschiedene morphologische/physiologische Veränderungen, einschließlich Schrumpfung des Cytoplasmas, Kondensation des Kernchromatins, Bläschenbildung der Membran sowie schlussendlich Abbau der DNA, was als charakteristische oligonucleosomale Leiter nachgewiesen wird (Levine, A.J., 1993). Die sterbende Zelle zersetzt sich letzten Endes in Membran-gebundene apoptotische Körperchen, die schnell durch Makrophagen oder benachbarte Zellen phagocytiert und verdaut werden.
Apoptose dient als ein Abwehrmechanismus, um unerwünschte und potenziell gefährliche Zellen zu entfernen, wozu von Viren infizierte Zellen, selbstreaktive Lymphocyten bei Autoimmunkrankheiten oder maligne Zellen gehören (Oehm et al., 1992, Yonehara et al., 1989; Vaux, 1993). Apoptose ist als ein Mittel angesehen worden, das Risiko einer Entwicklung von Krebszellen in Geweben zu minimieren, die häufig mutagenen Chemikalien, Carcionogenen oder UV-Strahlung ausgesetzt sind.
Im Gegensatz zu den morphologischen Transformationsereignissen, die mit Apoptose assoziiert sind, versteht man die Genetik und die Mechanismen, die am programmierten Zelltod beteiligt sind, nicht so gut.
Einen weiteren Schutz gegen Malignität bietet TNF-α, ein proinflammatorisches Cytokin, das in Reaktion auf die Aktivierung des Immunsystems produziert wird und das den apoptotischen Tod transformierter Wirtszellen auslösen kann (Heller, 1992, Yeung, 1996).
Eine Deregulierung des Apoptose-Prozesses kann zur Pathogenese von Krankheitsprozessen beitragen (Thompson, 1995). Man nimmt an, dass er eine entscheidende Rolle für die Krankheitsentwicklung spielt, einschließlich Krebs, AIDS, ischämischem Schlaganfall und neurodegenerativen Störungen, und Hinweise legen den Schluss nahe, dass sowohl die Hemmung von Zelltod als auch unangebrachter Zelltod für den Wirt schädlich sein kann. Zum Beispiel gehen neurodegenerative Krankheiten einschließlich Alzheimer- und Parkinson-Krankheit mit dem vorzeitigen Tod von bestimmten Subtypen von Neuronen einher (Kosik, K.S., 1992), während die unangebrachte Unterdrückung von oder der inhärente Mangel an zellulärer Apoptose die maligne Transformation von Zellen zur Folge haben kann (Korsmeyer, 1992).
Einzelne Proto-Oncogene sind ebenfalls mit Apoptose in Verbindung gebracht worden, was die Expression in Zellen anbelangt, die Apoptose durchlaufen, sowie die Auswirkung auf die Modulation einzelner Proto-Oncogene in dem Prozess. Die Liste der darin verwickelten Proto-Oncogene schließt c-myc, Fas (APO-1), p53 und Bcl-2 zusätzlich zu anderen Genen wie z.B. ced-3, ced-4, ced-9 und Ice ein, die zuerst in frühen Studien über C. elegans identifiziert wurden (Stellar, 1995; Cohen, 1993). Die codierenden Sequenzen der Proteine können zum Beispiel in der Gen- Bank-Datenbank gefunden werden.
DIE ROLLE VON PKR UND TNF-α BEI DER APOPTOSE
TNFs als Prototypen proinflammatorischer Cytokine sind cytotoxische Proteine, die von aktivierten Immunzellen während der Prozesse der Beseitigung von Pathogenen, antiviraler Aktivitäten und der Tumorzerstörung produziert werden. Hohe Spiegel von TNF-alpha in vivo können jedoch schädlich sein, da TNF-alpha metabolische Störungen, Auszehrung und Unterdrückung der Hämatopoese induziert. Auf der zellulären Ebene induziert TNF-alpha die Produktion von Superoxid-Radikalen, Aktivierung von lysosomalen Enzymen (Larrick et al., 1990; Liddil et al., 1989) und Fragmentierung der DNA durch die Aktivierung von Endonuclease-Aktivität (Rubin et al., 1988), was zu Apoptose führt.
Der genaue Mechanismus der mit TNF-α assoziierten Apoptose ist unklar, und verschiedene Mechanismen sind vorgeschlagen worden. (Siehe z.B. Dressler et al., 1992; Obeid et al., 1993). Es ist gezeigt worden, dass (i) Behandlung mit TNF-α die Aktivierung mehrerer Serin/Threonin-Kinasen, einschließlich PKR, zur Folge hat; (ii) TNF-α und PKR NF-κB mobilisieren; (iii) PKR eine Serin/Threonin-Kinase ist und Wachstum hemmt; (iv) PKR eine Schlüsselrolle im TNF-α-Signalübertragungsweg spielt und (v) das Tumorsuppressorgen p53 eine Rolle in dem durch TNF-α induzierten Apoptoseprozess spielt. (Siehe Guy et al., 1992; VanLint et al., 1992; Yeung und Lau et al., 1996).
IV. MODULIERTE EXPRESSION VON ZELLULÄREN FAKTOREN
Die Erfindung stellt Verfahren zur verstärkten Produktion von Cytokinen in menschlicher Zellkultur durch Unterdrücken des Prozesses des apoptotischen Zelltods bereit. Auf Grund der Hemmung der Apoptose haben die hierin beschriebenen Zelllinien eine längere Lebensspanne in Kultur; infolgedessen sind die Biosynthese von Cytokinen und/oder die Zeit erhöht, über die hinweg die Zellen funktionieren, um Cytokine zu produzieren.
Eine Unterdrückung des Prozesses des apoptotischen Zelltods in menschlicher Zellkultur lässt sich mit Hilfe einer beliebigen von einer Reihe von Strategien errreichen, die auf eine Hemmung der Apoptose gerichtet sind, einschließlich (1) Überexpression eines anti-Oncogens wie z.B. Bcl-2 (GenBank-Zugangsnummer M 14745), Bcl-X_L (GenBank-Zugangsnummer L20121) oder sein Homolog, (2) Unterdrückung der Aktivität des endogenen FADD (GenBank-Zugangsnummer NM00384), z.B. Überexpression einer mutierten Form von FADD, Mutation des endogenen FADD-Gens durch homologe Rekombination oder durch ortsspezifische Mutagenese; (3) Unterdrückung der Phosphorylierung von eIF-2 alpha (GenBank-Zugangsnummer A 457497) zum Beispiel durch Überexpression einer mutierten Form von eIF-2alpha, durch Mutation des endogenen eIF-2alpha-Gens durch homologe Rekombination oder durch ortsspezifische Mutagenese, wodurch die stromabwärts gelegenen Substrate von PKR gehemmt werden; oder (4) Verwendung einer transdominanten Mutante durch Mutation eines endogenen Gens für ein oder mehrere pro-apoptotische Gegenspieler von Bcl-2, zum Beispiel BAX (GenBank-Zugangsnummer 122473), BAK (GenBank-Zugangsnummer BE221666) sowie Bcl-X_S (GenBank-Zugangsnummer L20122), durch homologe Rekombination oder ortsspezifische Mutagenese oder durch Genablation oder Gendeletion von einem oder mehreren von BAX, BAK und Bcl-X_S.
Zelltod kann durch Färben der Zellen mit Propidiumjodid (PI) nachgewiesen werden oder durch die Verwendung von Tests, die für apoptotischen Zelltod spezifisch sind, zum Beispiel Färben mit Annexin V (Vermes et al., 1995). Nekrotischer Zelltod lässt sich von apoptotischem Zelltod unterscheiden, indem man die Ergebnisse einer Kombination der Tests auf Lebensfähigkeit der Zellen zusammen mit mikroskopischer Betrachtung der Morphologie der relevanten Zellen auswertet.
HEMMUNG DER APOPTOSE
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Modulieren der Produktion von Cytokin und anderen Proteinen durch Modifizieren der Zellen in der Zellkultur auf eine Weise bereit, die wirksam ist, zu einer teilweisen Unterdrückung oder zu einer Verzögerung des zum Zelltod führenden Prozesses zu führen, indem eine spezielle Zelllinie unter Bedingungen gezüchtet wird, die dazu führen, dass relativ zu einer Kultur derselben Zelllinie, die nicht die Unterdrückung des Prozesses des apoptotischen Zelltods aufweist, unter denselben Bedingungen über dem Normalen liegende Spiegel der Produktion von Cytokinen oder anderen Proteinen erreicht werden.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Cytokins oder eines anderen Proteins bereit, umfassend das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor besitzt, der funktionell mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die ein erwünschtes Gen codiert, welches wirksam ist, Apoptose zu hemmen. Bei diesen Proteinen kann es sich zum Beispiel um Bcl-2a, um Bcl-X_L, um eine modifizierte Form des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2alpha (eIF-2alpha) oder des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors (eIF-3) (GenBank-Zugangsnummer BE221666), eine modifizierte Form der Fas-assoziierten Todesdomäne (FADD), eine modifizierte Form von Bcl-X_S (GenBank-Zugangsnummer L20121), eine modifizierte Form von BAK und eine modifizierte Form von BAX, bevorzugt Bcl-2a oder Bcl-X_L, handeln. Das erwünschte Gen wird in der Wirtszelle überexprimiert, was zu einer Unterdrückung oder zu einer Verzögerung des apoptotischen Zelltods führt. Es können weitere Mittel eingesetzt werden, um eine Unterdrückung der endogenen Genexpression zu bewerkstelligen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Mutation des endogenen Gens zum Beispiel durch homologe Rekombination oder durch Orts-spezifische Mutagenese, Gendeletion oder Genablation.
Wie vorstehend erwähnt, sind Zellen, die diese Gene enthalten, üblicherweise Co-Transformanten, die auch Vektoren mit einem exogenen PKR-Gen enthalten, um eine PKR-Überexpression in den Zellen zu erreichen. Menschliche Zelllinien, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schließen Fibroblasten oder Immunzellen, B-Zellen, T-Zellen, Monocyten, Neutrophile, natürliche Killer-Zellen, promonocytäre U937-Zellen, Namalwa-Zellen, MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Flow 1000-Zellen, Flow 4000-Zellen, FS-4, FS-7-Zellen, MG-63-Zellen, CCRF-SB-Zellen, CCRF-CEM, Jurkat-Zellen, WIL2-Zellen und THP-1-Zellen ein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung schließen Zellen, die behandelt worden sind, um Apoptose zu hemmen, Zelllinien ein, die allgemein verwendet werden, um ein bestimmtes Cytokin oder Protein von Interesse zu exprimieren, wobei die Expression des Proteins nicht mit PKR assoziiert ist, zum Beispiel CHO-Zellen (Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters).
MODIFIZIERTE FORMEN APOPTOSE-ASSOZIIERTER PROTEINE
Wie vorstehend ausgeführt, kann Apoptose durch Vermindern der Expression von Proteinen, die mit der Durchführung des apoptotischen Prozesses in der Natur in Zusammenhang stehen, durch Modifizieren von Zellen auf eine Weise gehemmt werden, die wirksam ist, modifizierte oder abweichende Formen solcher Proteine zu exprimieren. Alternativ kann Apoptose gehemmt werden, indem man die Expression von Proteinen erhöht, die mit dem Blockieren des apoptotischen Prozesses in der Natur in Zusammenhang stehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die modifizierten eIF-2α-, die modifizierten FADD-, die modifizierten Bcl-X_S-, die modifizierten BAK- und die modifizierten BAX-Proteine Derivat- oder abweichende eIF-2α-, FADD-, Bcl-X_S-, BAK- und BAX-Formen der entsprechenden Proteine, wie sie in der Natur zu finden sind. Das heißt, das Derivat-Polypeptid oder -Protein enthält mindestens eine Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion, wobei Aminosäuresubstitutionen bevorzugt sind. Die Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion kann an jedem Rest innerhalb der Aminosäuresequenzen des Polypeptids oder des Proteins vorkommen, solange sie die biologische Aktivität des Proteins beeinflusst.
Diese modifizierten oder abweichenden Formen solcher nativen Proteine werden üblicherweise durch ortsspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der DNA hergestellt, die das eIF-2α-, FADD-, Bcl-X_S-, BAK- oder BAX-Protein codiert, wobei Kassetten- oder PCR-Mutagenese oder andere Methoden verwendet werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, um DNA herzustellen, die die Variante codiert, und danach die DNA in rekombinanter Form in Zellkultur exprimiert wird.
Ortsspezifische Mutagenese stellt ein Mittel zur Verfügung, um eine oder mehrere Nucleotidsequenzveränderungen in die DNA einzuführen, die ein gegebenes Protein codiert, und im Allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese auf dem Fachgebiet wohlbekannt und verwendet üblicherweise einen Phagenvektor, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form vorliegt.
Es ist selbstverständlich, dass alle mutierten, modifizierten oder abweichenden Formen hierin beschriebener nativer Proteine durch Punkt- oder ortsspezifische Mutagenese der passenden Nucleinsäuresequenz, oder durch homologe Rekombination (Knock-in oder Knock-out) erzeugt werden können, um die Hemmung der Funktion oder der Aktivität des Zielgens oder dessen Proteins zu bewerkstelligen.
Im Allgemeinen werden cDNA-Sequenzen sowohl für Hefe- als auch für menschliche Gene, die modifizierte Formen des eIF-2α-, des FADD-, des Bcl-X_S-, des BAK- oder des BAX-Proteins codieren, unter der Kontrolle eines starken konstitutiven viralen Promotors (des CMV-Promotors oder des SV40-Promotors) in einen Expressionsvektor eingesetzt. In anderen Fallen wird die cDNA-Sequenz unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, zum Beispiel eines Metallothionein-Promotors, in einen Expressionsvektor eingesetzt. Selektionsmarker zur Verwendung in solchen Expressionsvektoren sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel neo (G418, Geneticin) und EcoGPT (Mycophenolsäure). Es ist selbstverständlich, dass die Expressionsvektoren ferner Komponenten enthalten, die notwendig sind, um die Expression in einem bestimmten Zelltyp zu erleichtern, und die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Zellen werden mit Hilfe von Standardprozeduren transfiziert, wozu Elektroporation, Calciumphosphat-, DEAE-Dextran-, Lipofections- oder Lipofectaminbehandlung gehören, und in dem geeigneten Antibiotikum selektiert. Prozeduren für die Clonierung und Expression modifizierter Formen von nativem Protein mit Hilfe von rekombinanter DNA-Technologie sind allgemein auf dem Fachgebiet bekannt, wie in Ausubel, et al., 1992 und Sambrook, et al., 1989 beschrieben, die hierin ausdrücklich unter Bezugnahme aufgenommen sind.
In einem Ansatz können Zellen für die Produktion von Cytokinen mit einem Nucleinsäurekonstrukt oder Expressionsvektor, das (der) wirksam ist, eine modifizierte Form von eIF-2α, FADD, Bcl-X_S, BAK oder BAX zu exprimieren, und einem Expressionsvektor cotransfiziert werden, der wirksam ist, PKR zu überexprimieren. In einem ähnlichen Ansatz kann eine PKR-überexprimierende Zelllinie mit einem Nucleinsäurekonstrukt oder Expressionsvektor transfiziert werden, das (der) wirksam ist, eine modifizierte Form von eIF-2α, FADD, Bcl-X_S, BAK oder BAX zu exprimieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Zellen zur Produktion von Proteinen, deren Expression nicht durch PKR reguliert ist, mit einem Nucleinsäurekonstrukt oder Expressionsvektor transfiziert, das (der) wirksam ist, eine modifizierte Form von eIF-2α, FADD, Bcl-X_S, BAK oder BAX zu exprimieren.
Nach der Transfektion und Selektion der transformierten Zellen werden die Zellen weiter auf eine Weise gezüchtet, die wirksam ist, die Produktion des Cytokins oder des anderen Proteins von Interesse zur Folge zu haben, wie nachstehend weiter beschrieben.
UNTERDRÜCKEN DER PHOSPHORYLIERUNG VON eIF-2alpha
Es ist gezeigt worden, dass PKR eine entscheidende Rolle bei der durch TNF induzierten und durch p53 vermittelten Apoptose in Zellen spielt, wozu die promonocytären U937-Zellen gehören (Yeung, M.C. et al., 1996; Yeung, M. und Lau, A.S., 1998). Eine Unterdrückung der PKR-Aktivität, indem U937-Zellen mit PKR-Antisense-Expressionsplasmiden oder Expressionsplasmiden von PKR-Mutanten transfiziert werden, macht die Zellen resistenter gegenüber der durch TNF oder Endotoxin induzierten Cytotoxizität. Da eIF-2alpha ein physiologisches Substrat von PKR ist, ist es gezeigt worden, dass dessen Phosphorylierung durch PKR ausreichend ist, um Apoptose zu induzieren.
In Übereinstimmung damit ist die durch TNF induzierte Apoptose mit erhöhter Phosphorylierung der alpha-Untereinheit des eIF-2 korreliert worden (Srivastave et al., 1998).
Wie vorstehend ausgeführt, trägt eIF-2alpha nach der Phosphorylierung zur Hemmung der zellulären und viralen Proteinsynthese bei. Daraus folgt, dass die Unterdrückung der PKR-vermittelten Phosphorylierung von eIF-2 alpha durch Mutieren der Phosphorylierungsstelle des Faktors ein Mittel bereitstellt, um die apoptotische Wirkung der Überexpression von PKR auf gezüchtete Zelllinien zu hemmen.
Eine Variante des eIF-2alpha-Proteins ist in lymphoiden Zellen exprimiert worden, wobei ein Vektor verwendet wurde, der die codierende Sequenz für eine modifizierte Form von eIF-2alpha enthielt.
Die eIF-2alpha-Gene von Hefe und Mensch wurden mutiert, indem eine modifizierte DNA-Sequenz verwendet wurde, die ein Polypeptid codierte, das einen einzelnen Aminosäurenaustausch an Position 59 aufweist, der eine Serin-zu-Alanin-Variante zur Folge hat. Es ist früher gezeigt worden, dass die Position 59 der phosphoreszente Rest ist, der durch PKR phosphoryliert wird. Die Alanin-Variante ist nicht inaktiv, aber ist unempfindlich gegenüber den Wirkungen von PKR.
Eine Amplifikation der eIF-2α und PKR exprimierenden Plasmide wurde mit Hilfe von Methotrexat-Selektion in Gegenwart einer DHFR-Expressionskassette bewerkstelligt, die auf demselben Plasmid enthalten war wie die PKR-Kassette. Dies hat die Expression einer DHFR-Mutante zur Folge, die zu einer größeren Amplifikation in der Lage ist als das endogene DHFR, was selektive Steigerungen des co-exprimierten Produkts ermöglicht.
Eine abweichende (mutierte) cDNA-Sequenz von eIF-2alpha wurde in einen Vektor eingesetzt, der wirksam war, das eingesetzte Fragment unter der Kontrolle eines starken viralen Promotors zu exprimieren, wie vorstehend beschrieben.
Zellen, die eine modifizierte Form von eIF-2α exprimieren, wurden erzeugt, selektiert, weiter auf eine Weise gezüchtet, die wirksam war, eine Produktion des Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse zur Folge zu haben, und auf die Biosynthese des Cytokins oder anderen Proteins von Interesse analysiert, wie nachstehend beschrieben.
UNTERDRÜCKEN DER ENDOGENEN FADD-AKTIVITÄT
Der Fas-Rezeptor ist ein Mitglied der TNF- und der Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor-Superfamilie (Stellar, 1995). Nach der Bindung von Fas-Liganden an den Fas-Rezeptor wird Apoptose über unmittelbar stromabwärts gelegene Effektoren eingeleitet, wozu FADD, FLICS und TRADD gehören. FADD ist ein cytoplasmatisches Protein mit einer Todesdomäne, die entscheidend für die durch den CD95-Liganden und TNF induzierte Apoptose ist.
Die Bindung dieser Proteine an ihre entsprechenden Rezeptoren führt zur Aktivierung der Caspase-Protease-Kaskade und fördert die Apoptose. Es ist früher gezeigt worden, dass die Expression von Fas und die sich daraus ergebende Apoptose in NIH-3T3-Zellen durch PKR-Aktivität reguliert ist (Donze et al., 1999). In Zellen, die mit einer transdominant negativen Mutante transfiziert worden sind, die keine PKR-Aktivität aufweist, ist die Expression von Fas, TNFR-1, FADD (Fas-assoziierte Todesdomäne), FLICS, Bad und Bax unterdrückt, und die Zellen waren resistent gegenüber Apoptose induzierenden Agenzien. Darüber hinaus waren murine Fibroblasten, denen FADD fehlte, so gut wie resistent gegenüber dem durch dsRNA vermittelten Zelltod (Balachandran et al., 1998).
Abweichende, nicht funktionelle menschliche und Maus-FADD-Gene wurden aus dem Wildtyp-FADD-Gen erzeugt (Chinnaiyen et al., 1995; Yeh et al., 1998). Mutierte Gene sind dazu verwendet worden, um murine FADD-/- – Zellen zu erzeugen, denen FADD-Aktivität fehlte, mit einer sich daraus ergebenden Resistenz gegenüber durch PKR vermittelter Cytotoxizität (Balachandran et al., 1998). Der durch Fas vermittelte Prozess des Zelltods ist in Zellen, die ein modifiziertes FADD-Gen exprimieren, gehemmt oder ausgeschaltet, was eine Hemmung der Apoptose ermöglicht. Die hemmende Wirkung einer solchen biologisch inaktiven Form von FADD wird durch die PKR-Aktivierung nicht umgangen.
Eine mutierte FADD-cDNA-Sequenz wurde in einen Vektor eingesetzt, der wirksam war, um das eingesetzte Fragment unter der Kontrolle eines starken viralen Promotors zu exprimieren, wie vorstehend beschrieben.
Zellen, die eine modifizierte Form von FADD exprimieren, wurden erzeugt, selektiert, weiter auf eine Weise gezüchtet, die wirksam war, eine Produktion des Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse zur Folge zu haben, und, auf die Biosynthese des Cytokins oder anderen Proteins von Interesse analysiert, wie nachstehend beschrieben.
ÜBEREXPRESSION VON Bcl-2, Bcl-X_L ODER VON DESSEN HOMOLOG
Die Bcl-2-Familie von Genprodukten ist häufig an apoptotischen Prozessen beteiligt, die früher in verschiedenen biologischen Systemen untersucht worden sind. Bcl-2a und Bcl-X_L werden als anti-apoptotische Proteine angesehen (Boise und Thompson, 1995; Schendel, 1998), und frühere Studien über lymphocytäre und myeloide Zellen haben Hinweise für eine Rolle von Bcl-2a bei der Aufrechterhaltung des Zellwachstums und der Verhinderung von Zelltod geliefert (Cohen, 1993). Darüber hinaus spielt Bcl-2a eine wesentliche Rolle bei der Verhinderung der Apoptose neuronaler Zellen (Garcia et al., 1992), wahrscheinlich indem es die Erzeugung reaktiver Sauerstoffarten vermindert (Kane et al., 1993).
Die Lebensfähigkeit von vielen Zellen hängt von einer konstanten oder zeitweiligen Versorgung mit Cytokinen oder Wachstumsfaktoren ab. In der Abwesenheit solcher Cytokine oder Wachstumsfaktoren gehen die Zellen in die Apoptose. Die Bcl-2-Familie von Proteinen ist wesentlich für den durch Cytokine vermittelten apoptotischen Prozess. Es ist gezeigt worden, dass eine Überexpression von Bcl-2 und Bcl-X_L Apoptose unterdrückt, wenn Cytokine entzogen werden. Es ist gezeigt worden, dass eine Überexpression von BAX und BAK die eingehenden Signale von den Cytokin-Rezeptoren außer Kraft setzt und Apoptose induziert.
In einer beispielhaften Anwendung der Erfindung wurden Bcl-2 überexprimierende Zellen durch Transfizieren einer Zielzelllinie mit den pSV2-Bcl2-Expressionsplasmiden erzeugt (Reed et al., 1988; Reed et al., 1981).
Zellen, die Bcl-2 und Bcl-X_L überexprimieren, wurden erzeugt, selektiert, weiter auf eine Weise gezüchtet, die wirksam war, eine Produktion des Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse zur Folge zu haben, und auf die Biosynthese des Cytokins oder anderen Proteins von Interesse analysiert, wie nachstehend beschrieben.
HEMMUNG DER PRO-APOPTOTISCHEN GEGENSPIELER VON Bcl-2
Im Allgemeinen sind BAX, BAK, Bcl-X_S und andere pro-apoptotische Proteine (Boise und Thompson, 1998). Wie vorstehend ausgeführt, ist gezeigt worden, dass Überexpression von BAX, BAK, Bcl-X_S die eingehenden Signale von Cytokin-vermittelter Signalgebung, die mit Zelllebensfähigkeit assoziiert sind, außer Kraft setzt und Apoptose induziert.
In Übereinstimmung damit können abweichende, nicht funktionelle menschliche BAX-, BAK-, Bcl-X_S-Gene aus den BAX-, BAK-, Bcl-X_S-Wildtyp-Genen erzeugt wirksam. Solche mutierten Gene können dazu verwendet werden, transformierte Zellen zu erzeugen, die keine BAX-, BAK- bzw. Bcl-X_S-Aktivität aufweisen, was die Hemmung von Apoptose ermöglicht. Die hemmende Wirkung solcher biologisch inaktiven Formen von BAX, BAK oder Bcl-X_S auf die Apoptose stellt ein Mittel bereit, um die stimulatorische Wirkung einer Überexpression von PKR auf den apoptotischen Zelltod in gezüchteten Zelllinien zu umgehen.
Eine mutierte oder abweichende menschliche BAX-, BAK- oder Bcl-X_S-cDNA-Sequenz kann in einen Vektor eingesetzt werden, der wirksam ist, das eingesetzte Fragment unter der Kontrolle eines starken viralen Promotors zu exprimieren, wie vorstehend beschrieben.
Zellen, die eine modifizierte Form von menschlichem BAX, BAK oder Bcl-X_S exprimieren, werden dadurch erzeugt, selektiert und weiter auf eine Weise gezüchtet, die wirksam ist, eine Produktion eines Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse zur Folge zu haben, und auf die Biosynthese des Cytokins oder anderen Proteins von Interesse analysiert, wie nachstehend beschrieben.
V. CYTOKINE
Cytokine lösen ihre biologischen Aktivitäten aus, indem sie an ihre zugehörigen Rezeptoren binden, gefolgt von einer Signalübertragung, die zur Stimulierung verschiedener biochemischer Prozesse führt. In manchen Fällen wird die Expression solcher Rezeptoren durch spezifische Signale reguliert, ein Cytokin kann zum Beispiel in positive oder negative Rückkopplungsschleifen eingebunden sein und dadurch die Expression des Rezeptors für dasselbe oder ein anderes Cytokin regulieren. Solche Rezeptoren können von dem selben Zelltyp sein, der das Cytokin produziert, oder von einem anderen Zelltyp.
Cytokine dienen dazu, Immun- und Entzündungsreaktionen zu vermitteln und zu regulieren. Im Allgemeinen ist die Produktion von Cytokinen vorübergehend und die Produktion findet während eines kurzen Zeitraums der Transkription statt, was die Produktion von mRNA-Transkripten zur Folge hat, die ebenfalls kurzlebig sind und posttranslationellen Kontrollmechanismen unterliegen. Vor kurzem durchgeführte Studien haben gezeigt, dass ein gemeinsamer Signalübertragungsweg, der „Jak/STAT"-Reaktionspfad, von einer Vielzahl von Cytokinen benutzt wird (Abbas et al., 1997).
Es ist ersichtlich, dass die zelluläre Quelle von Cytokinen ein Unterscheidungsmerkmal jedes einzelnen Cytokins ist, das von vielen verschiedenen Zelltypen produziert werden kann. Darüber hinaus kann ein bestimmtes Cytokin (1) auf mehr als einen Zelltyp wirken, (2) kann mehr als eine Wirkung auf dieselbe Zelle haben, (3) kann eine Aktivität aufweisen, die es mit einem anderen Cytokin teilt, und (4) kann die Synthese oder die Wirkung anderer Cytokine beeinflussen, zum Beispiel indem es dessen Wirkungen antagonisiert oder mit diesen synergistisch ist.
Das produzierte Cytokin kann (die produzierten Cytokine können) eines oder mehrere der folgenden sein: Interferone, einschließlich IFN-gamma, IFN-alpha und IFN-beta; Tumornekrosefaktoren (TNF), einschließlich TNF-alpha, TNF-beta und lösliche TNF-Rezeptoren (sTNF-R); Interleukine (IL), einschließlich IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 und IL-12; Koloniestimulierungsfaktoren, einschließlich Granulocyten-Koloniestimulierungsfaktor (G-CSF) und Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierungsfaktor (GM-CSF); angiogenetische Faktoren, einschließlich Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF); Blutplättchen-Wachstumsfaktor 1 und 2 (PDGF-1 und -2); Chemokine, einschließlich Regulated Upon Activation Normally T-Expressed Secreted (RANTES); Makrophagenentzündungsproteine (MIP) wie z.B. MIP-1alpha und MIP-2alpha, Monocyten-chemotaktisches Protein-1 (MCP); antiangiogenetische Faktoren, einschließlich Angiostatin und Endostatin; Leukämie-inhibierender Faktor (LIF); ciliärer neurotropher Faktor; Cardiotrophin und Oncostatine, einschließlich Oncostatin M.
Die Verfahren der Erfindung können auch dazu verwendet werden, die Expression eines beliebigen von einer Anzahl von Proteinen zu erhöhen, die in Zellkultur produziert werden können. Beispielhafte Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Insulin, Erythropoetin (EPO), Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA), Wachstumshormon und Faktor VIII.
Sobald eine erhöhte Expression eines bestimmten Cytokins oder anderen Proteins erreicht worden ist, wird das dabei hergestellte Cytokin oder andere Protein aus der Zellkultur aufgereinigt. Beispielhafte Prozeduren, die für eine solche Aufreinigung geeignet sind, umfassen die folgenden: Antikörper-Affinitäts-Säulenchromatographie; Ionenaustausch-Chromatographie; Ethanol-Präzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Silica oder auf einem Kationen-Austausch-Harz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Präzipitation und Gelfiltration, wobei zum Beispiel Sephadex G-75 verwendet wird. Es können verschiedene Proteinaufreinigungsverfahren eingesetzt werden und solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel in Deutscher, 1990; Scopes, 1982 beschrieben. Der (die) Aufreinigungsschritt(e) wird (werden) zum Beispiel von der Art des verwendeten Herstellungsprozesses und dem jeweiligen hergestellten Cytokin oder Protein abhängen.
Ein „höherer als normaler Spiegel" der Produktion von Cytokinen oder anderen Proteinen bedeutet mindestens 200 oder 300%, bevorzugt 500% oder mehr des Spiegels der Produktion von Cytokinen oder anderen Proteinen für eine bestimmte Zelllinie in der Abwesenheit von entweder einer Transformation der Zelllinie auf eine Weise, die wirksam ist, eine Überexpression von PKR zur Folge zu haben, oder einer Modifikation der Zelllinie auf eine Weise, die wirksam ist, apoptotischen Zelltod zu hemmen.
Bei den Verfahrender Erfindung ist es bevorzugt, dass eine menschliche Zelllinie durch eine Kombination von PKR-Überexpression und Hemmung der Apoptose oder durch Hemmung der Apoptose allein, modifiziert und auf eine Weise gezüchtet wird, die wirksam ist, die Produktion eines Cytokins bzw. eines anderen Proteins um das 10-1000-Fache zu verstärken.
VI. ÜBEREXPRESSION VON PKR, HEMMUNG DER APOPTOSE UND PRODUKTION VON CYTOKINEN
Es ist bekannt, dass eine Reihe von Faktoren an der Induktion und/oder der verstärkten Expression von Cytokinen in Zellen, z.B. in menschlichen Zellen, beteiligt sind. Zu diesen Faktoren gehören transkriptionelle Regulatoren, die für ein Cytokin oder ein anderes Protein spezifisch sind, zum Beispiel Interferon-regulatorische Faktoren (IRF-1, IRF-3 und IRF-7), Cytokin-Rezeptoren, nukleärer Faktor κB (NF-κB), Aktivator-Protein-1 (AP-1), nukleärer Faktor IL-6 (NF-IL6) und insbesondere PKR.
Eine Verstärkung der Expression oder der Aktivität von einem beliebigen dieser Faktoren wird einen höheren als normalen Expressionsspiegel der Gene zur Folge haben, die ein oder mehrere Cytokine codieren. Eine solche verstärkte Expression von Cytokingenen wird eine effizientere und günstigere Produktion von Cytokinen zur Folge haben.
PKR wird hierin als ein Beispiel für ein Protein verwendet, das in der Lage ist, die Expression von Cytokinen und anderen Proteinen zu regulieren; es ist jedoch selbstverständlich, dass andere, Cytokine und andere Proteine verstärkende Faktoren an Stelle von PKR verwendet werden können, zum Beispiel (1) Induktoren von Proteinkinase C (PKC), TNF-α, GM-CSF, EGF und PDGF, G-CSF, TGF, TNF-alpha oder TNF-beta, IL-1, IFNs (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma) oder Chemokine (IL-8, Makrophagen-Entzündungs-Proteine [MIP-1a & -1b] und Monocyten-chemotaktische Proteine [MCPs]; (2) andere zelluläre Signalfaktoren wie z.B. PMA, Calcium-Ionophore, Natriumbutyrat oder Endotoxine; (3) poly-I:C, doppelsträngige RNA oder ein virales Analog; (4) zelluläre Stress-Signale, die PKR aktivieren können, wozu Hitzeschock oder Infektionen mit Pathogenen einschließlich Viren gehören), überproduziert aktivierte PKR und verschiedene Cytokine.
Durch Erhöhen der Expression von PKR in einer menschlichen Zelle kann die Produktion von Cytokinen erhöht werden. Tierische Zellkulturen, die eine höhere als die normale konstitutive Menge an PKR exprimieren oder in denen die Expression von PKR auf höhere als normale Spiegel induziert werden kann, sind daher nützlich für die Produktion von Cytokinen.
Die Zellen, die verwendet werden, um ein bestimmtes Cytokin zu produzieren, können PKR aus einer beliebigen Säuger-Quelle überexprimieren, wie z.B. die PKR, die normalerweise in Kaninchen-Retikulocyten, in verschiedenen Geweben der Maus oder in menschlichen peripheren mononucleären Blutzellen zu finden ist. Bevorzugt wird murine p65-Kinase und am meisten bevorzugt menschliche p68-Kinase in einer entsprechenden murinen bzw. menschlichen Zellkultur überexprimiert.
In manchen Fällen handelt es sich bei der PKR, die überexprimiert wird, um ein Analog von PKR, zum Beispiel eine nicht natürliche Proteinkinase, die die Aktivierung der Transkription des Cytokins oder des anderen Proteins durch dsRNA vermitteln kann (gewöhnlich durch Modifikation des Gens erhalten, das ein natives PKR-Protein codiert).
Menschliche Zellen, die in der Lage sind, PKR zu überexprimieren, lassen sich durch beliebig viele Verfahren gewinnen, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, oder sind aus kommerziellen Quellen erhältlich.
Beispielhafte Verfahren, um PKR-überexprimierende Zellen zu erhalten, umfassen Selektion auf Zellen, die höhere als normale PKR-Spiegel exprimieren, Transfektion mit einem Expressionsvektor, der PKR unter der Kontrolle eines Promotors codiert, oder andere Verfahren, die eine Zunahme der PKR-Expression über normale Spiegel zur Folge haben.
Geeignete Promotoren zur Verwendung in solchen Expressionsvektoren umfassen sowohl konstitutive Promotoren als auch induzierbare Promotoren, wobei Beispiele dafür einen CMV-Promotor und den Metallothionein-Promotor einschließen.
Transfektion wird, wie früher beschrieben, durchgeführt und Transfektanten werden auf Überexpression von PKR selektiert.
Mit Überexpression von PKR sind Spiegel von PKR-Aktivität gemeint, die höher sind als normal. Eine solche „normale" PKR-Aktivität oder -Expression wird als ein Bereich der PKR-Aktivität oder -Expression ausgewiesen, der im Allgemeinen für einen bestimmten Typ von Zellen beobachtet wird, die nicht mit einem Vektor transfiziert worden sind, der PKR codiert, die unstimuliert (nicht induziert oder sensibilisiert) und uninfiziert sind. Es ist selbstverständlich, dass der Bereich der normalen PKR-Aktivität für einen bestimmten Zelltyp je nach Kulturbedingungen etwas schwanken kann.
Eine höhere als normale PKR-Expression bedeutet mindestens 150%, bevorzugt mindestens 200 oder 300% und stärker bevorzugt 500% oder mehr des normalen PKR-Spiegels. Die PKR überexprimierende Zellkultur kann PKR konstitutiv überexprimieren oder induzierbar überexprimieren, je nach dem jeweils zur Isolierung und Herstellung der Kultur verwendeten Verfahren.
Bevorzugt wird die PKR überexprimierende Zelllinie PKR induzierbar überexprimieren, um die Menge von PKR zu regulieren, die für die Induktion von Cytokinen zur Verfügung steht.
Auf ähnliche Weise wird die Zellkultur bevorzugt ein Protein induzierbar überexprimieren, das den apoptotischen Prozess stört, oder eine modifizierte Form eines Proteins induzierbar überexprimieren, das den apoptotischen Prozess fördert, um den apoptotischen Prozess zusammen mit der PKR-Expression für eine optimale Induktion von Cytokinen zu regulieren.
Die Aktivität von PKR und Apoptose-assoziierten Proteinen kann mit Hilfe von einem beliebigen der auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt werden. Beispielhafte Tests für die Expression von PKR umfassen Autophosphorylierungstests, einen Test für eIF-2α, Western-Blot und (reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion) RT-PCR für PKR-mRNA. Auf ähnliche Weise kann die Expression von Apoptose-assoziierten Proteinen durch Western-Blot und RT-PCR bestimmt werden.
Beliebige von einer Anzahl von bekannten Zelltypen, die auf eine Weise modifiziert worden sind, um Apoptose zu hemmen, sind nützlich, um eine PKR überexprimierende Zelllinie zu erzeugen.
Beliebige von einer Anzahl von bekannten Zellkulturen sind nützlich als ein parentaler Stamm, um eine PKR überexprimierende Zellkultur zu erzeugen. Beliebige Zellen, die normalerweise in der Lage sind, Cytokine zu produzieren, sind, wie vorstehend erwähnt, als der parentale Stamm nützlich. Es kann jedoch jede beliebige Zelllinie in den Verfahren der Erfindung verwendet werden, die in der Lage ist, ein bestimmtes Cytokin oder Protein von Interesse zu produzieren. Menschliche Zelllinien, die in der Lage sind, Cytokine oder andere Proteine zu produzieren, lassen sich durch beliebig viele Verfahren gewinnen, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, einschließlich Isolierung von primären Zelllinien, oder solche Zelllinien können von kommerziellen Quellen bezogen werden. In den meisten Fällen werden Zellen, die in der Lage sind, ein bestimmtes Cytokin oder anderes Protein zu produzieren, in irgendeinem geeigneten Medium gezüchtet.
In manchen Fällen werden zusätzliche Schritte unternommen, um die PKR-Expression durch menschliche Zellen zu verstärken, insbesondere indem man PKR exprimierende Zellen sensibilisiert. Eine solche Sensibilisierung kann die Behandlung mit einem Sensibilisierungsmittel umfassen wie z.B. (1) G-CSF, EGF, TNF-alpha oder TNF-beta, IL-1, Interferone einschließlich IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma oder Chemokine, einschließlich IL-8, Makrophagen-Entzündungs-Proteine, einschließlich MIP-1a & -1b, und Monocyten-chemotaktische Proteine (MCP); (2) andere zelluläre Signalfaktoren wie z.B. Phorbolmyristatacetat (PMA), Calcium-Ionophore, Natriumbutyrat oder Endotoxin; (3) poly-IC, doppelsträngige RNA oder ein virales Analog; (4) zelluläre Stress-Signale, die PKR aktivieren können, wozu Hitzeschock oder Infektionen mit Pathogenen einschließlich Viren gehören.
Eine solche Behandlung kann die Zugabe von mikrobiellen oder nicht-mikrobiellen Induktoren zur Zellkultur einschließen. Bevorzugt wird es sich bei dem Induktor um einen nicht-mikrobiellen Induktor handeln, zum Beispiel poly-IC oder poly-rIC.
VII. BEURTEILUNG DER EXPRESSION VON CYTOKINEN ODER ANDEREN PROTEINEN
Um die Expression eines Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse durch eine PKR überexprimierende Zelllinie zu beurteilen, die auf eine Weise behandelt worden ist, die wirksam ist, Apoptose zu hemmen, können Tests auf der Proteinebene oder auf der RNA-Ebene durchgeführt werden oder indem man spezielle funktionelle Biotests für das jeweilige Cytokin oder andere Protein verwendet, das exprimiert wird.
Um die Erfindung zu veranschaulichen, wurden Zelllinien, die mit einem PKR-Gen und sowohl mit PKR- als auch Bcl-X_L-Genen transfiziert worden waren, unter Bedingungen der Cytokin-Induktion sowohl mit poly-IC als auch dsRNA von Sendaivirus auf die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht, wie in Beispiel 3 ausführlich dargestellt. In diesen Studien wurden „6A"-Zellen sowohl mit PKR- als auch Bcl-X_L-Genen transfiziert; „A9"-Zellen nur mit dem PKR-Gen und „WT" nicht transformiert. Die Zellen wurden unter Bedingungen einer Überproduktion von PKR getestet (die in den 6A- und A9-Zellen vorlag), gefolgt von einer Cytokin-Induktion mit entweder poly-IC oder Sendaivirus-RNA. Wie man an den Daten in den 2A und 2B sehen kann, erhöhte die Hemmung der Apoptose in PKR überexprimierenden Zellen die Lebensfähigkeit der Zellen unter Bedingungen einer Cytokin-Induktion signifikant und verstärkte die Lebensfähigkeit sogar über die von WT-Zellen (keine Überproduktion von PKR) hinaus.
In einem ähnlichen Experiment, das im Beispiel 3 ebenfalls ausführlich dargestellt ist, wurden die Expressionsspiegel von IFN-alpha in denselben drei Zelllinien gemessen, wiederum unter Bedingungen einer Überproduktion von PKR und einer Cytokin-Induktion mit entweder Sendaivirus oder poly-IC. Aus den Daten in 3A ist zu sehen, dass eine Überproduktion von PKR (6A und A9 gegenüber WT) die Cytokin-Produktion signifikant verstärkte und dass durch Hemmen der Apoptose während der Cytokin-Induktionsbedingungen (6A gegenüber A9) eine weitere mehrfache Verstärkung der Cytokin-Produktion beobachtet wurde. Die analogen Ergebnisse in 3B veranschaulichen ebenfalls die signifikante Verstärkung der durch eine Überproduktion von PKR erreichten Cytokin-Induktion (6A und A9 gegenüber WT). Die höheren Spiegel der Cytokin-Produktion in A9- gegenüber 6A-Zellen können einen zeitlichen Effekt widerspiegeln und berücksichtigen nicht die Gesamtmenge der Cytokin-Produktion während des Zeitraums der Lebensfähigkeit der Zellen.
Immuntests für ein bestimmtes Cytokin oder bestimmte andere Proteine können durchgeführt werden, indem man Verfahren verwendet, die routinemäßig von Fachleuten eingesetzt werden. Solche Immuntests können dazu verwendet werden, um die Expression eines Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse qualitativ und quantitativ zu analysieren.
Im Allgemeinen gewinnt man eine aufgereinigte Form des Cytokins oder eines anderen Proteins von Interesse aus einer natürlichen Quelle oder stellt es rekombinant in transfizierten Zellen her und reinigt es mit Hilfe von Standardmethoden für die Proteinaufreinigung. Das aufgereinigte Protein wird dann dazu verwendet, entweder monoclonale oder polyclonale Antikörper zu erzeugen, die für das exprimierte Protein spezifisch sind und die in verschiedenen Immuntests eingesetzt werden können. (Siehe z. B. Harlow und Lane, 1988). Beispielhafte Tests umfassen ELISA, kompetitive Immuntests, Radioimmuntests, Western-Blots, indirekte Immunfluoreszenztests und dergleichen.
Im Allgemeinen können für den quantitativen Immuntest des Expressionsspiegels von bekannten Cytokinen oder anderen Proteinen Kits eingesetzt werden, die im Handel erhältlich sind.
Darüber hinaus ist die funktionelle Expression eukaryontischer Proteine wohlbekannt. Beispielhafte Verfahren sind in Sambrook et al., 1989 beschrieben, was hierin ausdrücklich unter Bezugnahme aufgenommen ist. In Kürze, Zellen werden mit einem geeigneten Expressionsvektor transfiziert und unter Bedingungen gezüchtet, die wirksam sind, eine Expression des Cytokins oder anderer Proteine von Interesse in das Kulturmedium oder auf der Oberfläche der transfizierten Zelle zur Folge zu haben
Beispiel 1
Herstellung der Plasmide pEF-FLAG-Bcl-X_L und pcDNA-FLAG-PKR
1. Herstellung von pEF-FLAG-Bcl-X_L
Der Vektor pEF-FLAG-Bcl-X_L (Huang et al., 1997) in 1A enthält eine Volllängen-cDNA, die das anti-apoptotische Protein Bcl-X_L codiert, das funktionell mit dem starken Elongationsfaktor 1 alpha (EF-1alpha)-Promotor verknüpft ist. Ein zusätzliches hervorstechendes Merkmal des Vektors ist das N-terminale FLAG-Epitop (Hopp et al., 1988), das an das Bcl-X_L-Protein angehängt wurde, um die Selektion der Zelllinien zu erleichtern, die hohe Mengen von Bcl-X_L exprimieren.
Der Vektor umfasst auch (i) ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz, um die Stabilität der mRNA zu erhöhen; (ii) einen SV40-Ursprung für episomale Replikation und einfache Wiedergewinnung des Vektors; (iii) ein Ampicillin-Resistenzgen und einen ColE1-Ursprung für Selektion und Haltung in E. coli; und (iv) einen Puromycin-Resistenzmarker (Puro), um eine Selektion und Identifizierung der Plasmid enthaltenden eukaryontischen Zellen nach Transfektion mit Bcl-X_L und PKR zu ermöglichen.
2. Herstellung von pcDNA-FLAG-PKR
Der Vektor pcDNA-FLAG-PKR in 1B enthält cDNA, die das menschliche Volllängen-PKR-Molekül (551 Aminosäuren; Meurs et al., 1990; GenBank-Zugangsnummer NM002759) codiert und welche durch die Polymerasekettenreaktion modifiziert wurde, um den N-terminalen FLAG-Marker zu beinhalten (Hopp et al., 1988), der die Sequenz MDYKDDDDK codiert und so in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) eingesetzt wurde, dass die FLAG-PKR codierende Sequenz unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert wird.
Der pcDNA-FLAG-PKR genannte Vektor enthält verschiedene Merkmale, die für eine Transkription von PKR geeignet sind, einschließlich: (i) eine Promotorsequenz von dem sehr frühen Gen des menschlichen CMV für eine mRNA-Expression auf hohem Niveau; (ii) ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz von dem Rinder-Wachstumshormon-Gen (BGH), um die Stabilität der mRNA zu erhöhen; (iii) einen SV40-Ursprung für episomale Replikation und einfache Wiedergewinnung des Vektors; (iv) ein Ampicillin-Resistenzgen und einen ColE1-Ursprung für Selektion und Haltung in E. coli; und (v) einen G418-Resistenzmarker (neo), um eine Selektion und Identifizierung der Plasmid enthaltenden eukaryontischen Zellen nach Transfektion zu ermöglichen.
Ein zweiter PKR-Vektor, der als pTRE-PKR bezeichnet wurde, wurde hergestellt, indem dieselbe PKR-cDNA in die Geninsertionsstelle eines pTRE-Plasmids eingesetzt wurde, das von Clontech bezogen wurde. Das Plasmid pTRE ähnelt dem pFLAG, das dazu verwendet wurde, den zuerst beschriebenen PKR-Vektor herzustellen, enthält aber ein Tetracyclin-responsives Element stromaufwärts von dem CMV-Promotor, das zur Kontrolle des eingesetzten Gens verwendet wird. In den Studien, über die in Beispiel 3 berichtet wird, wurde die TRE-Funktion nicht ausgenutzt und daher steht zu erwarten, dass die Funktion der zwei PKR-Vektoren in transformierten Zellen im Wesentlichen identisch ist.
Beispiel 2
Herstellung der PKR überexprimierenden Namalwa-Zelllinien 6A und A9
1. Herstellung der Zelllinie 6A
Die menschliche lymphoblastoide B-Zelllinie Namalwa (WT) wurde nacheinander mit den Plasmiden pEF-FLAG-Bcl-X_L und pcDNA-FLAG-PKR transfiziert. Die transfizierte Zelllinie wird 6A genannt.
Stabile Transfektanten wurden durch Elektroporation von 4 × 10⁶ exponentiell wachsenden Namalwa-Zellen mit 15 μg des Plasmids pEF-FLAG-Bcl-X_L in DMEM/F12 (+10% FKS) erhalten, wobei ein GenePulser-Apparat (BioRad) verwendet wurde, der auf 800 μF, 300 V eingestellt war. Massenpopulationen stabiler Transformanten wurden, wie folgt, durch Selektion mit 2 μg/ml Puromycin (Gibco-BRL) für 3-4 Wochen erhalten und auf Bcl-X_L-Expression durch Durchflusscytometrie durchmustert. Die Masse der Transfektanten wurde gewaschen, mit Aceton permeabilisiert und anschließend mit 2 μg/ml des monoclonalen Maus-anti-FLAG M2-Antikörpers (IBI) und dann mit einem Phycoerythrin-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG (1 μg/ml; Becton Dickinson) gefärbt. Zellen wurden im FACScan analysiert, wobei lebende und tote Zellen auf der Basis ihrer Vorwärts- und Seitwärts-Streueigenschaften und Bcl-X_L exprimierende Zellen über ihren Grad an Fluoreszenz-Intensität unterschieden wurden. Transformanten, die hohe Spiegel von Bcl-X_L exprimierten (Namalwa-Bcl-X_L), wurden dann mit pcDNA-FLAG-PKR transfiziert.
Stabile Transfektanten, die hohe Spiegel von Bcl-X_L exprimierten, wurden mittels Elektroporation von 4 × 10⁶ exponentiell wachsenden Namalwa-Bcl-X_L-Zellen mit 15 μg des Plasmids pcDNA-FLAG-PKR in DMEM/F12 (+10% FKS) erhalten, wobei ein GenePulser-Apparat (BioRad) verwendet wurde, der auf 800 μF, 300 V eingestellt war. Massenpopulationen stabiler Transfektanten wurden mittels Selektion für 3-4 Wochen mit 2 mg/ml Geneticin (G418, Gibco-BRL) erhalten. Clonale Linien wurden anschließend durch Clonierung mittels Grenzverdünnung erhalten und durch Western-Blot-Analyse auf Expression von Bcl-X_L und PKR analysiert (Huang et al., 1997). Die Proteine wurden mit 2 μg/ml anti-FLAG-M2-Antikörper, gefolgt von Ziege-anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat und ECL-Nachweis (Amersham) identifiziert.
2. Herstellung der Zelllinie A9
Stabile Transfektanten, die hohe Spiegel von PKR exprimierten, wurden mittels Elektroporation von 4 × 10⁶ exponentiell wachsenden Namalwa-Zellen mit 15 μg des Plasmids pTRE-PKR in DMEM/F12 (+10% FBS) erhalten, wobei ein GenePulser-Apparat (BioRad) verwendet wurde, der auf 800 μF, 300 V eingestellt war. Massenpopulationen stabiler Transfektanten wurden mittels Selektion für 3-4 Wochen mit 2 mg/ml Geneticin (G418, Gibco-BRL) erhalten. Clonale Linien wurden anschließend durch Clonierung mittels Grenzverdünnung erhalten und durch Western-Blot-Analyse auf Expression von PKR analysiert (Huang et al., 1997).
Beispiel 3
Charakterisierung einer Bcl-X_L und PKR überexprimierenden Namalwa-Zelllinie
1. Erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen
Namalwa-Wildtyp-Zellen (WT) und die A9- und 6A-Zellen von Beispiel 2 wurden unter Bedingungen einer Überexpression von PKR und Cytokin-Induktion auf Lebensfähigkeit der Zellen in Kultur untersucht. Speziell wurden mit PKR und Bcl-X_L doppelt transformierte Namalwa-Zellen (die 6A-Zelllinie), mit PKR transfizierte Namalwa-Zellen (die A9-Zelllinie) und parentale Namalwa-Zellen (WT) bei 2,5 × 10⁵ Zellen/ml in DMEM/F12-Medium gezüchtet, das mit 10% FKS ergänzt war. Die Zellen wurden für 20 h mit 20 mM PMA (Sensibilisierungsmittel) behandelt, gefolgt von einer Behandlung mit entweder 200 μg/ml poly-r(I):poly-r(C) und 10 μg/ml DEAE-Dextran (poly-IC-Induktion) für 72 h oder mit 200 HAU/1 × 10⁶ Zellen Sendaivirus für 48 h. Nach der Behandlung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mittels Durchflusscytometrie auf einem FACScan getestet.
Die 2A und 2B zeigen, dass Induktion mit poly-IC aller drei Zelllinien eine signifikant geringere Lebensfähigkeit der Zellen zur Folge hatte als eine Induktion der Zellen mit Sendaivirus zu den jeweiligen angegebenen Zeiten. Bei Induktion mit poly-IC blieben 54% der 6A-, 40% der A9- und 51% der WT-Zellen lebensfähig, wohingegen bei Induktion mit Sendaivirus 87% der 6A-, 66% der A9- und 63% der WT-Zellen lebensfähig blieben.
Mit beiden Induktionsprotokollen zeigte die Zelllinie 6A, die sowohl das anti-apoptotische Protein Bcl-X_L als auch PKR überexprimiert, eine größere Lebensfähigkeit als die Zelllinie A9, die PKR überexprimiert, aber bei der die Apoptose nicht gehemmt ist.
2. Erhöhte Expression von Interferon-alpha
Der Spiegel der Produktion von Interferon-alpha wurde ebenfalls in den drei Zelllinien nach Cytokin-Induktion durch poly-IC und Sendaivirus analysiert, beide unter Bedingungen einer Überproduktion von PKR. Die Kulturüberstände wurden aufgefangen und mittels ELISA gemäß dem von dem Lieferanten der ELISA-Kits (R&D Systems) bereitgestellten Verfahren auf IFN-alpha-Spiegel analysiert. Die Ergebnisse sind in 3A und 3B gezeigt und vorstehend diskutiert.
Aus dem Vorangehenden kann man sehen, wie verschiedene Aufgaben und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Fachleute können nun aus der vorangehenden Beschreibung ersehen, dass die breit angelegten Lehren der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Formen ausgeführt werden können. Aus diesem Grund sollte der eigentliche Schutzbereich, obgleich diese Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen und Beispielen davon beschrieben worden ist, nicht auf diese Weise beschränkt sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Cytokinen in einer menschlichen Zellkultur, umfassend (a) Züchten einer menschlichen Zelllinie, welche in der Lage ist, Cytokine zu produzieren und transfiziert ist mit (i) einem ersten Vektor, welcher DNA enthält, die ein Protein codiert, das die Hemmung von Zellapoptose bewirkt, unter der Kontrolle eines ersten Promotors und (ii) einem zweiten Vektor, welcher DNA enthält, die doppelsträngige RNA-abhängige Kinase (PKR) codiert, unter der Kontrolle eines zweiten Promotors, unter Kulturbedingungen, bei welchen PKR in den transfizierten Zellen überproduziert wird, wie durch die PKR-Mengen in der transfizierten Zelllinie nachgewiesen werden kann, welche höher sind als die jene, welche in menschlichen Zelllinien erhalten werden, die nicht mit dem ersten und dem zweiten Vektor transfiziert sind, wenn sie unter denselben Kulturbedingungen angezogen werden, (b) Behandlung der gezüchteten, PKR-überproduzierenden menschlichen Zelllinie mit doppelsträngiger RNA (dsRNA), und (c) Gewinnung eines oder mehrerer Cytokine, welche von der gezüchteten, behandelten Zelllinie produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gezüchtete Zelllinie durch die nacheinanderfolgende Transfizierung einer menschlichen Zelle, welche in der Lage ist, Cytokine zu produzieren, mit dem ersten und dem zweiten Vektor erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein, welches die Hemmung von Apoptose bewirkt, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B-Zelllymphom/Leukämie-2-Gen (Bcl-2a), B-Zelllymphom/Leukämie-X_L (Bcl-X_L), einer modifizierten Form des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF-2 Alpha), dem eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor (eIF-3), einer modifizierten Form der Fas-assoziierten Todesdomäne (FADD), einer modifizierten Form von Bcl-X_s, einer modifizierten Form des Bcl-2-homolgen Antagonisten/Killers (BAK) und einer modifizierten Form von BAX.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein, welches die Hemmung von Apoptose bewirkt, Bcl-2a oder Bcl-X_L ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste oder der zweite Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der induzierbare Promotor ein Metallothionein-Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das/die produzierte(n) Cytokin(e) ausgewählt ist/sind aus der Gruppe bestehend aus: (i) Interferonen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IFN-α, IFN-β und IFN-γ; (ii) Tumornekrosefaktoren (TNF), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNF-α, TNF-β und löslichen TNF-Rezeptoren (sTNF-R); (iii) Interleukinen (IL), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 und IL-12; (iv) koloniestimulierenden Faktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktoren (G-CSF) und Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF); (v) angiogenen Faktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), vaskulären endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor 1 und 2 (PDGF 1 und 2); (vi) Chemokinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Regulated Upon Activation Normally T-Expressed Secreted (RANTES), Makrophagen-Entzündungsproteinen (MIP) einschließlich MIP-1α und MIP-2α und Monocyten-chemotaktischem Protein 1 (MCP); (vii) anti-angiogenen Faktoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Angiostatin und Endostatin; (viii) Leukämie-inhibierendem Faktor (LIF); (ix) ziliärem neurotrophem Faktor und Cardiotrophin; und (x) Oncostatinen, einschließlich Oncostatin M.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die gezüchtete menschliche Zelllinie abgeleitet ist aus einer elterlichen Stammzelllinie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten oder Immunzellen, B-Zellen, T-Zellen, Monocyten, Neutrophilen, natürlichen Killerzellen, pro-monocytischen U937-Zellen, Namalwa-Zellen, MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, Flow 1000-Zellen, Flow 4000-Zellen, FS-4, FS7-Zellen, MG-63-Zellen, CCRF-SB-Zellen, CCRF-CEM, Jurkat-Zellen, WIL2-Zellen und THP-1-Zellen.
Verfahren zur Herstellung von Cytokinen in einer menschlichen Zellkultur durch das Züchten einer menschlichen Cytokin-produzierenden Zelle unter Bedingungen der PKR-Überproduktion und Cytokininduktion, dadurch gekennzeichnet, dass zur Steigerung der Lebensfähigkeit der Zellen Zellen als Zelllinien verwendet werden, welche mit einem Vektor transfiziert wurden, der DNA enthält, welche ein Protein codiert, das die Hemmung von Apoptose in den Zellen bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zelllinie ebenfalls mit einem Vektor transfiziert ist, welcher PKR-exprimierende DNA enthält.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die DNA, welche ein Protein codiert, das die Hemmung von Apoptose in den Zellen bewirkt, ein Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bcl-2, Bcl-X_L, einer modifizierten Form des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 2 Alpha (eIF-2 Alpha), dem eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor (eIF-3), einer modifizierten Form der Fas-assoziierten Todesdomäne (FADD), einer modifizierten Form von Bcl-X_s, einer modifizierten Form von BAK und einer modifizierten Form von BAX, welche funktionell mit einem zweiten Promotor verknüpft sind, unter Bedingungen, die die Expression des Proteins durch die Zellen der transfizierten Zelllinie bewirken.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Protein, welches die Hemmung von Apoptose bewirkt, Bcl-2a oder Bcl-X_L ist.