CN103194478B - 一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法及其应用。该表达方法利用重组DNA技术以Trx替代重组胰岛素及其衍生物A、B链之间的C肽、从而有效改善可溶性重组胰岛素及其衍生物的基因工程表达产量。该表达方法与低温表达、多分子伴侣共表达联合应用时,能够显著提高可溶性重组胰岛素及其衍生物的产量。本发明还提供了一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的纯化制备方法及其在制备治疗糖尿病药物中的应用。
Description
一、技术领域:
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法及其应用。
二、背景技术:
在现代社会,糖尿病是一种发病率高、并发症多且难以根治的慢性疾病。在世界范围内,糖尿病发病率都在上升。这种疾病是导致失明、肾衰竭、截肢、心脏病和中风的主要原因。每年因它之而丧命的患者人数与因艾滋病病毒/艾滋病(HIV/AIDS)而导致的死亡人数不相上下。目前,我国可能已成为糖尿病患病人数最多的国家,我国糖尿病成人患者总数达9240万,其中农村4310万,城市4930万左右,发病率超过了10%,糖尿病用药市场已过百亿元。
胰岛素类药物是控制和治疗糖尿病的不二选择。按来源分类,有动物胰岛素、半合成人胰岛素和生物合成人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素);按药效时间长短又可分为超短效、短效、中效、长效、预混胰岛素。据不完全统计,胰岛素市场容量也近60亿元,同时每年增速超过20%。2010年,中国已经成为全球糖尿病患病率增长最快的国家之一,增速惊人。仅诺和诺德一家,2009年在中国市场的胰岛素销量就已经超过了40亿元,这个市场不可限量。但国内企业从这个大蛋糕中只分食到5%的份额。据统计,外资企业占据了中国胰岛素市场95%的份额,而在重组人胰岛素方面,只有通化东宝和甘李药业两家涉足,其主要瓶颈在于胰岛素及其衍生物生产工艺的高难度。
胰岛素及其衍生物分子量6063,由两条氨基酸肽链组成。A链有21个氨基酸,B链有32个氨基酸。A-B链之间有两处二硫键相连,A链自身有一对二硫键相连。虽然胰岛素及其衍生物已投入生产,但是其纯化步骤繁琐、产量较低的问题一直成为影响胰岛素及其衍生物成本的关键难题。
在经典的原核表达体系中,胰岛素及其衍生物由于两对二硫键的存在,常以不溶性的包涵体形式存在。由于大肠杆菌硫氧还蛋白(Trx)具有在大肠杆菌中表达水平高、可溶性能好等特点,已经被美国Novagen公司开发成为一个常用的融合表达标签(pET32系列表达载体),用于提高目标蛋白的可溶性,并且取得了较广泛的成功应用。已经有科学家尝试将人胰岛素与硫氧还蛋白(Trx)融合表达(张守涛等人,生物技术,2010,20(2):14-16;董文甫等人,草食家畜,2006,4:4-6),但实验结果表明:硫氧还蛋白(Trx)融合表达的胰岛素可溶性依然较差。例如,重庆理工大学范开等人2006年发明的可溶性胰岛素生产工艺将Trx置于胰岛素的N端,在胰岛素A、B链之间放置了C肽,因此,在产物后加工工艺环节,既需要切除N端的Trx蛋白,又需要切除胰岛素A、B链之间的C肽,由于使用了具有分子伴侣性质的Trx蛋白质,胰岛素的表达水平为20%,可溶性的胰岛素占细菌总蛋白的15%。大部分表达的重组胰岛素仍然以包涵体形式存在。
因此,对于重组胰岛素及其衍生物的生产来说,由于去除C肽的后加工环节已经成熟,包涵体复性的效率及其成本已经成为重组胰岛素及其衍生物生产的关键和瓶颈环节。有效避免重组胰岛素及其衍生物蛋白质在细菌中表达时包涵体的形成,这是国际重组胰岛素及其衍生物行业至今缺乏重大进展的难题。
三、发明内容:
为了有效避免克服重组胰岛素及其衍生物生产过程中存在的包涵体复性效率及其成本的难题,本发明的目的在于提供一种全新的重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌中可溶性表达的新的表达方法,用于制备重组胰岛素及其衍生物。
为达到上述目的,本发明的技术方案是用Trx代替C肽,将Trx作为胰岛素及其衍生物A、B链之间的连接肽使用的一种重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌表达系统中表达方法。
进一步地,上述用Trx代替C肽,将Trx作为胰岛素及其衍生物A、B链之间的连接肽使用的一种重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌表达系统中表达方法,使Trx兼具胰岛素C肽和可溶性融合标签的双重功能,从而能够改善重组胰岛素及其衍生物表达产物的可溶性表达。
进一步地,上述重组胰岛素及其衍生物与多分子伴侣共表达的表达方法,从而显著提高重组胰岛素及其衍生物表达产物的可溶性表达产量。
进一步地,一种在低温下(10-35℃)表达上述重组胰岛素及其衍生物的方法。
进一步地,一种利用锌离子金属亲和层析纯化上述重组胰岛素及其衍生物的方法,但是并不局限利用锌离子金属亲和层析纯化上述重组胰岛素及其衍生物的纯化方法。
进一步地,一种利用Trx代替C肽,将Trx作为胰岛素及其衍生物A、B链之间的连接肽使用的重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌表达系统中实现可溶性表达的方法在制备重组胰岛素及其衍生物药物中的应用。
进一步地,一种利用锌离子金属亲和层析纯化上述重组胰岛素及其衍生物的方法所制备可溶性重组胰岛素及其衍生物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
与已有的重组胰岛素及其衍生物可溶性表达技术相比,本发明的特色和创新之处在于:
(1)本技术将Trx放在胰岛素及其衍生物A、B链之间,既保留了Trx蛋白质的分子伴侣特点,同时又省却了C肽,从而只需要一步切割工艺;
(2)本技术在选用了Trx的基础上,采用了低温发酵及多分子伴侣共表达技术,使得可溶性的胰岛素及其衍生物占细菌总蛋白的28%,78%的表达产物为可溶性产物,显著提高了可溶性的重组胰岛素及其衍生物的表达产量。因此在可溶性表达水平和生产工艺上都有显著的进步和改善。
四、附图说明
图1.Trx作为连接肽的甘精胰岛素表达的SDS-PAGE分析。
1:空载质粒pET28a诱导表达的上清;2:空载质粒pET28a诱导表达的沉淀;3:蛋白质标准;4:pET-ING诱导表达的上清;5:pET-ING诱导表达的沉淀。
图2.Trx作为连接肽的甘精胰岛素与多分子伴侣共表达的SDS-PAGE分析。
1:蛋白质标准;2:先诱导表达pET-ING1小时,再诱导表达pGTF2的表达上清;3:先诱导表达pET-ING1小时,再诱导表达pGTF2的表达沉淀;4:共转染pET-ING和pGTF2、但只用IPTG诱导pET-ING表达的表达上清;5:共转染pET-ING和pGTF2、但只用IPTG诱导pET-ING表达的表达沉淀;6:共转染pET-ING和pGTF2、但只用四环素诱导pGTF2表达的表达上清;7:共转染pET-ING和pGTF2、但只用四环素诱导pGTF2表达的表达沉淀;8:pGTF2诱导表达的上清;9:pGTF2诱导表达的沉淀;10:同时诱导表达pET-ING和pGTF2的表达上清;11:同时诱导表达pET-ING和pGTF2的表达沉淀;12:先诱导pGTF2表达1小时,再诱导表达pET-ING表达的表达上清;13:先诱导pGTF2表达1小时,再诱导表达pET-ING表达的表达沉淀。
图3目的蛋白中可溶性的Trx作为连接肽的甘精胰岛素的产量。
1:诱导表达pET-ING;:2:先诱导表达pET-ING1小时,再诱导表达pGTF2;3:pET-ING和pGTF2共转染、但只用IPTG诱导pET-ING;4:同时诱导表达pET-ING和pGTF2;5:先诱导表达pGTF21小时,再诱导表达pET-ING。
五、具体实施方式
实施例:
1、甘精胰岛素表达载体的构建
克隆有甘精胰岛素的A链(pUC57-A)和B链(pUC57-B)的质粒由金斯瑞公司合成和构建。在甘精胰岛素A链的N端和B链的C端分别添加有肠激酶的酶切位点。
从质粒pET32a中经PCR扩增出Trx基因,上游引物为:5’-CTTGCGGGATCCATGAGCGATAAAATTATTCACC-3’,下游引物为:5’-GTTATAATACCCAAGCTTGGCCAGGTTAGCG-3’。分别在上、下游引物的5’端引入限制性内切酶BamHI和HindIII的识别序列。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收,再用BamHI和HindIII双酶切,与经过相同双酶切的载体pUC57-B连接。得到pB-Trx质粒,用EcoRI和HindIII酶切pB-Trx质粒,回收获得包含甘精胰岛素的B链和Trx的融合基因的B-Trx片段。
用XhoI和HindIII酶切pUC57-A载体,回收甘精胰岛素的A链基因片段待用。
将经XhoI和HindIII酶切的pET28a载体与上述酶切过的A链基因片段用T4连接酶连接,获得pET28a-A质粒。用EcoRI和HindIII酶切pET28a-A质粒,与经过相同酶切的B-Trx片段连接,最终获得pET28a-B-Trx-A(即pET-ING)质粒载体。
2、甘精胰岛素表达质粒pET-ING的诱导表达
将表达质粒pET-ING转化BL21(DE3)大肠杆菌,再将单克隆接种到3毫升含卡那霉素的LB培养基中,37℃培养过夜。过夜菌按1:1000的比例转接到3毫升含卡那霉素的LB液体培养基中37℃摇菌培养。当A600nm达到0.6时,加入终浓度为0.3mMIPTG,20℃诱导17小时。离心收集菌体,将菌体重新悬浮于300微升的PBS中,超声破碎,12,000rpm4℃离心10分钟,取菌体裂解液上清及沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
3、甘精胰岛素与多分子伴侣共表达
用pET-ING和多分子伴侣表达质粒pGTF2(表达分子伴侣GroEL、GroES、TF)共同转化大肠杆菌BL21(DE3),根据卡那霉素和氯霉素的抗性挑选克隆。将单克隆接种到3毫升含卡那霉素和氯霉素的LB培养基中,37℃培养过夜。过夜菌按1:1000的比例转接到3毫升LB液体培养基中37℃摇菌培养。当A600nm达到0.6时,在20℃条件下,用0.3mMIPTG和20ng/ml四环素诱导表达17小时,按照先诱导pET-ING或先诱导pGTF2或者两者同时诱导的条件进行实验,从而探索最优诱导条件,将诱导产物进行SDS-PAGE分析。pET-ING表达质粒:抗生素筛选标记:卡那霉素,诱导物:IPTG;pGTF2表达质粒:抗生素筛选标记:氯霉素,诱导物:四环素。
4、甘精胰岛素目的蛋白的初步纯化
甘精胰岛素表达质粒pET-ING转化BL21(DE3)大肠杆菌后,挑选单克隆接种到1升LB培养基中,加入终浓度为0.3mMIPTG,20℃诱导17小时。pET-ING和pGTF2共同转化大肠杆菌BL21(DE3)后,挑选单克隆接种到1升LB培养基中,同时加入0.3mMIPTG和20ng/ml四环素,20℃诱导表达17小时,7,000rpm4℃离心收集两种菌体,分别重悬于裂解缓冲液(50mMNaH2P04,300mMNaCL,10mM咪唑,pH8.0)中,冰浴超声(2秒开,2秒关,20分钟)破菌后4℃,12,000rpm,10分钟收集上清过Zn2+Sepharose6FF柱,500mM咪唑洗脱得到目的蛋白,经分光光度计检测蛋白浓度,计算目的蛋白的产量。
在实施例1中,我们构建的甘精胰岛素表达质粒pET-ING的目标蛋白为甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链。含表达质粒pET-ING的BL21(DE3)菌株经IPTG诱导,在相对分子质量为25kD处有一明显的诱导表达条带,与重组目标蛋白甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链的相对分子质量一致(图1)。在20℃低温表达时,有超过60%的目的蛋白以不可溶的包涵体形式存在于沉淀中。当同时诱导多分子伴侣和甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链共表达,目的蛋白中可溶性甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链的含量最高,目标蛋白的78%以上的蛋白为可溶性,可溶性的目的蛋白表达占细菌上清总蛋白的比例为28%,约为只诱导表达pET-ING时的两倍,说明多分子伴侣能够有效地提高目的蛋白的可溶性(图2)。
当表达质粒pET-ING单独表达时,经Zn2+Sepharose6FF亲和层析纯化,得到目的蛋白1.5mg,纯度为72%;当表达质粒pET-ING和多分子伴侣表达质粒pGTF2共同诱导表达时,经Zn2+Sepharose6FF亲和层析纯化,得到目的蛋白4.5mg,纯度为65%,是pET-ING单独表达时产量的3倍,从而说明甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链与多分子伴侣共表达可以显著提高可溶性ING-Trx的产量。
硫氧还蛋白(Trx)可以促进二硫键的正确折叠,有利于提高目标蛋白的可溶性,但是与Trx融合表达的胰岛素可溶性依然较低,并且融合Trx后使得目的蛋白表达后需要进行Trx和胰岛素C肽的两步切割,造成了生产工艺的繁琐。本发明采用Trx代替C肽,使Trx同时兼具连接肽和可溶性融合标签的双重功能,使得目的蛋白表达后只需进行Trx一步切割,有效地简化了纯化步骤。但是实验结果表明,采用Trx代替C肽并没有显著有效地改善目的蛋白甘精胰岛素的可溶性。
分子伴侣可以减少蛋白质的错误折叠,同时在蛋白质折叠完毕后与之分离,不影响蛋白质结构和功能。但是以往的研究往往只是用个别分子伴侣,例如分子伴侣GroEL、GroES,但是效果并不明显。本实验采用多分子伴侣(GroEL、GroES、TF)与甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链共表达,并试验了不同的诱导方案(图3)。多分子伴侣共表达后,再加上培养温度的调节,甘精胰岛素的可溶性表达得到了显著提高。其中多分子伴侣与甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链同时诱导时,可溶性甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链的含量最高,占目标蛋白的78%,是只表达甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链的2倍。同时,我们也可以看到,先诱导多分子伴侣并不能有效提高目的蛋白的可溶性。多分子伴侣与甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链共表达时目标蛋白经初步纯化,得到目的蛋白的产量是只表达甘精胰岛素A链-Trx-甘精胰岛素B链时的3倍。由于胰岛素及其衍生物的C肽去除工艺及方法是在目前胰岛素类多肽药物生产中已经是常规的、成熟的技术,因此,本发明未对C肽去除工艺再进行深入的研究和探索。因此,本发明成功证明了采用Trx代替C肽的可行性,以及使用多分子伴侣、加上表达温度的调控,可以显著提高目的蛋白的可溶性表达,为胰岛素及其衍生物的基因工程生产提供了新方法和新思路。
Claims (5)
1.一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法,其特征是以Trx替代重组胰岛素及其衍生物A、B链之间的C肽,将含有该Trx替代C肽的重组胰岛素及其衍生物的重组表达菌株在低温下与多种分子伴侣共表达,所述的重组胰岛素及其衍生物是指:含有A、B两条胰岛素氨基酸肽链,A-B链之间有两对二硫键相连,A链自身有一对二硫键相连,在基因工程表达时A、B链之间需要存在有连接肽C肽;所述的低温表达是指在10-35℃的温度下进行表达;所述的多种分子伴侣是指多于2种分子伴侣。
2.根据权利要求1所述的一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法,其特征是合成或者克隆含有Trx替代C肽的重组胰岛素及其衍生物基因、构建该种重组胰岛素及其衍生物的表达质粒,在常见的微生物表达体系中进行基因工程表达。
3.根据权利要求1所述的一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法所表达的可溶性重组胰岛素及其衍生物的纯化方法,其特征是利用锌离子金属亲和层析纯化、制备可溶性重组胰岛素及其衍生物。
4.根据权利要求1所述的一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法在制备重组胰岛素及其衍生物药物中的应用。
5.根据权利要求3所制备的可溶性重组胰岛素及其衍生物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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