CN107614533B - 锌结合的谷胱甘肽s转移酶与金属硫蛋白融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型的锌结合融合蛋白，其为与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白，其提供预防或治疗ROS‑关联疾病以及重金属中毒的功效。

Description

锌结合的谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白融合蛋白
技术领域
本发明涉及一种新型锌结合融合蛋白，尤其是一种包含谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白的锌结合融合蛋白。
背景技术
金属硫蛋白(MT)是普遍存在的低分子量蛋白质，且是具有极高金属及半胱氨酸含量且可形成金属-硫醇丛集的多胜肽。MT基因族群含有4个亚群，称为MT1至MT4。越来越多的证据显示哺乳动物MT1/MT2异构物参与锌的恒定性，且对重金属毒性及氧化压力有防护作用。MT3主要表达于神经元，但也可表达于神经胶质细胞；MT4则大部分存在于分化中的多层鳞状上皮细胞。
Vallee及Margoshe揭露由纯化来自马(马的)肾皮质的Cd-结合蛋白的MT(Margoshes&Vallee,“A cadmium protein from equine kidney cortex”.Journal ofthe American Chemical Society 79(17):4813–4814,1957)。有四个主要的异构物在人类中表达(族群1，参见下图)：MT1(亚型：A、B、E、F、G、H、L、M、X)、MT2、MT3、MT4。可在不同的哺乳动物组织中发现不同的MT异构物。例如，MT1及MT2一般在所有器官中发现，MT4主要表达于分层的组织，但MT3则主要存在于大脑中。MT3还称为生长抑制因子(GIF)。
MT在转录因子的调控上扮演重要的角色，因此细胞恶性转化以及最终的癌症可能因MT的功能或表达上的问题而造成(Krizkova et al.,“Metallothionein--a promisingtool for cancer diagnostics”.Bratisl Lek Listy 110(2):93–7,2009.)。据发现，在某些乳腺、结肠、肾脏、肝脏、皮肤(黑色素瘤)、肺脏、鼻咽、卵巢、前列腺、口腔、唾腺、睪丸、甲状腺以及膀胱的癌症中，MT的表达量增加；而在肝细胞癌及肝腺癌中，MT的表达量减少(Cherian,“Metallothioneins in human tumors and potential roles incarcinogenesis”.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms ofMutagenesis 533:201–209,2003.)。
文献已提出重金属毒性是自闭症的一种假定病因，以及MT合成的功能障碍。然而，MT功能障碍并没有具体地与自闭症谱系障碍有所关联。根据2006年探讨孩童暴露于疫苗防腐剂硫柳汞的报导指出，相比于非自闭症孩童而言，在自闭症孩童中MT的含量及针对MT的抗体并无显著差异(Singh&Hanson,“Assessment of metallothionein and antibodiesto metallothionein in normal and autistic children having exposure tovaccine-derived thimerosal”.Pediatr Allergy Immunol 17(4):291–6,2006.)。
因此，有需要发展一种符合现有技术要求且关联于金属硫蛋白的新型融合蛋白，从而提供新的诊断或治疗试剂。
发明内容
本发明是基于非预期性地发现一种锌结合融合蛋白，其为一种与锌结合的谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白，其在治疗活性氧族群(ROS)关联疾病以及因急性或慢性暴露于重金属下所造成的重金属中毒上，提供非预期性的优异治疗效果。
因此，本发明的一方面提供一种锌结合的GST与MT融合蛋白(GST-MT-Zn)。
在本发明的一个实施例中，该GST-MT-Zn是GST-MT3-Zn。
另一方面，本发明提供一种锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn用于制造可预防或治疗ROS-关联疾病的药物的用途。
又另一方面，本发明提供一种锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn用于制造可预防或治疗一个体因急性或慢性暴露于重金属下所造成的重金属中毒的药物的用途。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明的该锌结合融合蛋白GST-MT3-Zn与一种药学可接受载体。
据信，本发明所属领域的技术人员可依据本发明而不须进一步阐明的情况下使用本发明至其最广的保护范围。因此，所提供的说明书和权利要求书应被理解为示范目的，而不是以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
上述发明内容，以及以下本发明的详细描述，将由参阅附图而得到更佳的理解。为了说明本发明，在图中所揭示的为较佳的实施例。然而，应了解，本发明并不限定于所示的精确安排和手段。
图1A显示构建的pGEX2T，包含人类MT3。图1B显示pGEX2T表达载体上MT3cDNA的序列。
图2提供MT3氨基酸序列的比对，显示保守的关键半胱氨酸残基位置，其意味着，在不同物种间具有相同的功能相关性。
图3显示GST-MT3的锌结合能力。
图4显示，分别由PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3处理的小鼠，其脑部经微型正子放射电脑断层造影(micro PET)后以PMOD 3.6(PMOD Technologies,Zurich,Switzerland)分析的结果。将小鼠分成4组(每组n＝3)，并在接受[18F]FDG前，分别以浓度为0.5μg/200μl的PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3进行处理。使用微型PET针对小鼠的脑部进行扫描40分钟。
图5显示SK-N-SH神经细胞分别经GST-MT3-Zn、GST-MT3及GST处理30分钟，以及以400μM的H2O2挑战4小时后的ROS含量。相对于经GST及GST-MT3处理而言，经GST-MT3-Zn处理的细胞似乎担任着抗-ROS清除剂的角色。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05。
图6显示对于Cd易感的SK-N-SH神经细胞在3uM下处理96小时，再分别以0.2μM、1μM及5μM的GST-MT3-Zn处理后的MTT检测结果。经指定浓度的GST-MT3-Zn处理的细胞对于经Cd诱导的神经细胞损伤有显著的救护效果。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语具有与本领域技术人员对于本发明所属领域的理解相同的含义。本文件，包括定义，将可控制与本文冲突的情况。
如本文所使用的，单数形式“一”，“一个”，及“该”包括多个对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，当提及“一个样本”包括多个这样的样品及本领域技术人员已知的等同物。
如本文所使用的术语“谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白的融合蛋白”、“GST与MT的融合蛋白”、或“GST-MT”是指一种谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)的融合蛋白或一种其功能性变异体。该融合蛋白进一步包含一或多种化学修饰。该融合蛋白可通过GST融合于MT的N端，或者MT融合于GST的N端而达成。
如本文所使用的术语“GST-MT-Zn”是指锌结合的GST与MT的融合蛋白。
如本文所使用的术语“金属硫蛋白”是指编码着富含半胱氨酸且分子量低的蛋白质的基因族群，其可经由其半胱氨酸(Cys)残基上的硫醇基与重金属(例如Zn及Cu)结合。金属硫蛋白存在于各种生物中，包括细菌、真菌、以及所有真核植物及动物物种。有四种主要的金属硫蛋白异构物：MT1、MT2、MT3、以及MT4。
如本文所使用的术语，在胜肽中氨基酸的“取代作用”是指在胜肽中的一个氨基酸置换成另一个氨基酸。氨基酸是由另一个与其具有相似结构及/或化学性质的氨基酸所取代，例如，保守性氨基酸置换。“保守性”氨基酸取代作用可通过在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、及/或两性性质上的相似性而达成。
如本文所使用的术语，胜肽的“修饰作用”是指，在胜肽骨架(例如，氨基酸序列)上的任何操作或多胜肽的任何转译后修饰(例如，糖基化)。
如本文所使用的术语“载体”是指能使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括自我复制的核酸结构，该术语包括具有自我复制核酸结构的载体，以及嵌入已被导入宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能引导经操作性连接的核酸的表达。如此的载体在本文中是指“表达载体”。
术语“宿主细胞”是指已导入外源性核酸的细胞。宿主细胞是可用于产生本发明的融合蛋白的任何种类的细胞系统。
如本文所使用的术语“药学上可接受载体”是指一种可与适当化合物或衍生物结合的化学组合物，且根据该结合作用，可用于将该适当的化合物施用至一个体中。
如本文所使用的术语“活性氧族群-关联疾病”或“ROS-关联疾病”是指在存有异常含量的活性氧族群(ROS)的情况下，由不良的生物性反应所引起的疾病。异常的活性氧族群(ROS)含量可能参与多种疾病的致病机制。ROS-关联疾病包括肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、酒精性肝病、发炎性疾病、败血症以及重金属中毒。
本发明提供一种谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白的锌结合融合蛋白，其中GST可融合于MT的N端；或者，MT可融合于GST的N端。MT可以是来自任何动物物种的MT1、MT2、MT3或MT4。
在本发明的一个实施例中，锌结合融合蛋白是一种锌结合的GST与MT3融合蛋白(简称为“GST-MT3-Zn”)。MT3可由任何动物物种中分离而得，包括但不限定于人(Homosapiens)、海豚(Tursiops truncates)、狨猴(Callithrix jacchus)、羊驼(Vicugnapacos)、狗(Canis lupus familiaris)、兔(Oryctolagus cuniculus)、豚鼠(Caviaporcellus)、猪(Sus scrofa)、鼠兔(Ochotona princeps)、狐蝠(Pteropus vampyrus)、猫(Felis catus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、马(Equus caballus)、蝙蝠(Myotislucifugus)、象(Loxodonta Africana)、松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)、犰狳(Dasypus novemcinctus)、丛猴(Otolemur garnettii)、熊猫(Ailuropoda melanoleuca)、小马岛刺猬(Echinops telfairi)、眼镜猴(Tarsius syrichta)、羊(Ovis aries)、树鼩(Tupaia belangeri)、乳牛(Bos Taurus)、橄榄狒狒(Papio Anubis)、猩猩(Pongoabelii)、刺猬(Erinaceus europaeus)、大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)、猕猴(Macacamulatta)、长尾猴-非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)，如图2所示。
在本发明的实施例中，MT3是指在SEQ ID No:1-32中所说明的任何一个氨基酸序列。在一特定实施例中，MT3为人类MT3，其氨基酸序列为SEQ ID No:1。
根据本发明，可通过重组DNA技术产生融合蛋白。举例而言，可将包含编码着该融合蛋白的核酸分子的载体转化于适当的宿主细胞中，并于其中表达融合蛋白。因此，本发明还提供编码着本发明融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体、以及经该载体转化而用于制备该融合蛋白的宿主细胞。
再者，GST与MT3的融合蛋白可暴露于锌离子下，例如含锌的溶液，例如氯化锌，以使锌经由其半胱氨酸(Cys)残基上的硫醇基结合至该融合蛋白上。
本发明的该融合蛋白或锌结合融合蛋白可包括任何一种具有一或多种不改变其功能的化学修饰作用。举例而言，该融合蛋白可包含一或多个氨基酸取代。
经验证，锌结合的GST与MT3融合蛋白(GST-MT3-Zn)可促进脑部活性，且非预期性地，GST-MT3-Zn较GST-MT3有显著较佳的功效，如图4所示。
因此，本发明提供一种用于增强个体脑部活性的方法，其包含将有效量的锌结合GST与MT3融合蛋白(GST-MT3-Zn)施用至该个体中。另可选择地，本发明提供一种GST-MT3-Zn用于制造可增强脑部活性的药物的用途。
还经证明，GST-MT3-Zn提供改善的抗氧化功效以及代谢活性，具体而言，移除ROS，且非预期性地，GST-MT3-Zn较GST-MT3有显著较佳的功效，如图5所示。
因此，本发明一种用于预防或治疗患有ROS-关联疾病的个体的方法，其包含将有效量的GST-MT3-Zn施用至有需要的个体。另可选择地，本发明提供一种GST-MT3-Zn用于制造一种可预防或治疗ROS-关联疾病的药物的用途。
在本发明的一个实施例中，ROS-关联疾病是指在存有异常含量的活性氧族群(ROS)的情况下，由不良的生物性反应所引起的疾病。本发明中，ROS-关联疾病是一种选自肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、酒精性肝病、发炎性疾病、败血症以及重金属中毒。
已进一步证明，GST-MT3-Zn对受重金属暴露影响的细胞的存活率有救护的效果，举例而言，如图6所示。
因此，本发明提供一种用于预防或治疗一个体因急性或慢性暴露于重金属下所造成的重金属中毒的药物的用途，其包含将有效量的GST-MT3-Zn施用至有需要的个体。另可选择地，本发明提供一种GST-MT3-Zn在制造一种用于预防或治疗重金属中毒的药物的用途。
在一实施例中，造成重金属中毒的重金属为镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、铬(Cr)、铜(Cu)、锰(Mn)、或镍(Ni)。在一特定实施例中，该重金属为镉(Cd)。
对于在治疗中的用途，治疗有效量的蛋白质，或其功能性变体，以及任何活性成分可以被调制成用于施用的药物组合物。
因此，本发明提供一种药物组合物，其包含谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白3的锌结合融合蛋白(GST-MT3-Zn)，以及一种药学上可接受载体。可使用常规技术，将该药物组合物可与任何适当的药学上可接受载体一同调制。
本发明提供的以下某些实施例将被解释为仅仅是说明性的，而非以任何方式限制本发明的其余部分。无需进一步详细说明，据信本领域的技术人员能够根据本说明书而利用本发明至其最大限度。
实施例
1.DNA克隆
根据制造商的操作手册，使用Qiagen微型RNA纯化试剂盒从人类胚胎肾脏上皮细胞(HEK293细胞)抽取总RNA。然后，使用大约100ng的总RNA于含有表1所列MT3引物的20ul反应混合物中，进行一步法RT-PCR。在55℃下进行反转录30分钟后，于94℃反应5分钟，接着进行35个循环的94℃反应30秒、55℃反应30秒、以及72℃反应30sec。反应完成后，在72℃下10分钟后，持温在4℃。在Veriti 96-well thermo cycler(Applied Biosystems,CA,USA)中进行这些反应。在1.5％琼脂糖胶体上进行电泳分析所得的PCR产物，并以QIAEX II GelExtraction Kit进行洗脱。然后，以BamHI及EcoRI消化所获得的DNA片段，接着，在连接于还由BamHI及EcoRI剪切的pGEX2T细菌表达载体(含有IPTG可诱导的启动子，以及在其多克隆位点前的氨基末端GST标志)前，先进行胶体洗脱。在16℃下进行DNA连接过夜。在转化至BL21感受态细胞后，使用氨芐青霉素抗性区段筛选出pGEX2T-MT3构建体，并以DNA测序法确认。从pGEX2T-MT3中以NheI及XhoI进行剪切，并与pET28a载体在相对应的位点上进行连接，而获得MT3开放读码框，因而产生pET28a-MT3。BL21细胞中的pET28a-MT3表达构建体，在MT3的氨基末端产生6个组氨酸标志(6xhis tag)，称为His-MT3。
2.蛋白质表达
将携带个别的前述pGEX2T-MT3表达构建体的BL21细菌，在37℃及250rpm下震荡培养于含有100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB培养基中。在OD600nm达到1.0时，接着将0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)及0.3mM ZnCl2加入培养基中，以在额外的8小时中诱导重组蛋白的表达。在3000g下离心总细胞裂解物，并重新悬浮于5ml PBS中，接着，使用MisonixSonicator 3000，在4级的强度下，以15-秒的暂停时间间隔/每分钟进行超音波处理10分钟。在4℃下以13000rpm进行离心10分钟后，收集上清液，将其重新悬浮于1ml PBS中，并通过GST-琼脂糖珠进行GST-MT3融合蛋白的纯化。使用于50mM Tris-HCl pH 9.5中的20mM还原态谷胱甘肽作为重组蛋白的洗脱物，接着进行尺寸排阻色层分析(S-200)，以获得纯化的GST-MT3重组蛋白。然后，将纯化的GST-MT3重组蛋白进行SDS-PAGE分析，并进行卡马斯蓝(coomassie blue)染色，以评估在IPTG可诱导的方式下，这些pGEX2T-MT构建体的表达情况。
针对在发酵中的大型量产而言，首先，在起始为50ml的含氨苄青霉素的LB培养基中接种携带pGEX2T-MT3表达载体的单一BL21菌落，并于37℃及250rpm下培养16小时。然后，将经隔夜培养的培养基转移至500ml且含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，使其进一步生长至OD600nm为10，之后将其进料至含有4.5公升新鲜LB培养基的5公升发酵槽中。在37℃、200rpm、15％O2及pH 7.0下，于存有1mM IPTG的条件下进行发酵24小时，同时其OD600nm为20。在13000rpm下离心10分钟以收取细菌，然后使其完全重新悬浮于100ml的PBS中。接着，在冰上，使用超音波(强度等级4)，以15-秒的暂停时间间隔/每分钟处理悬浮液30分钟。在13000rpm下离心30分钟后保留上清液，以进行GST亲和性管柱纯化。在洗脱前，使用5公升的含有1％Triton X114的PBS将潜在的内毒素污染洗掉。
为了产生仅含MT3的重组蛋白，根据制造商操作手册，使用凝血酶(Sigma)进行已纯化GST-MT3蛋白的裂解。简言之，将1mg结合于琼脂糖珠上的GST-MT3蛋白温和地搅拌并在22℃下与溶于1ml PBS缓冲液中的50单位的凝血酶蛋白酶(MW 37kDa,～4500单位/mg)混合16小时。然后，在3000rpm下离心该反应溶液4分钟，使琼脂糖珠沉淀。然后，小心地收集上清液，并保存于-80℃。一般而言，以SDS-PAGE-SDS确认经消化的溶液，或者使用FPLC层析法使其分离并进行收集。
再者，使GST-MT3蛋白暴露于锌离子溶液中，例如氯化锌溶液，以使锌经由其半胱氨酸(Cys)残基上的硫醇基而结合于融合蛋白。
3.Western印记分析
首先，以15％SDS-PAGE电泳分离重组蛋白。然后，将胶体转移至硝化纤维素薄膜上。将该薄膜置于TBST(137mM NaCl,2.7mM KCl,19mM Tris base,0.005％Tween-20,pH7.4)中的5％无脂肪脱脂牛奶进行封闭1小时，接着以混合于含有TBST的5％BSA中的抗-GST(稀释倍率1:1000,Pierce)或抗-MT(稀释倍率1:1000,Sigma)多克隆抗体，在4℃的震荡培养箱中进行印记分析。在添加HRP-结合的二级抗体前，以TBST清洗该薄膜5分钟，共三次。培养1小时以及以TBST清洗三次后，可使用ECL检测系统，并根据制造商的操作手册，在X光薄膜上观察结果。
4.蛋白质质谱分析
在明生生物科技股份有限公司(Mithra Biotechnology Inc.,台北,中国台湾)，使用10μg经FPLC纯化的蛋白进行重组GST-MT3蛋白的质谱分析。在37℃下以10mM DTT还原样本1小时，并在室温及黑暗条件下，以50mM IAM进行烷基化30分钟。
然后，在37℃下，加入于25mM碳酸氢铵中的胰蛋白酶，以进行消化18小时。以结合Ultimate 3000RSLC system(Dionex)的ESI-Q-TOF质谱仪(Bruker micrOTOF-Q II)进行样本的分析。使用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm x150mm,2μm,
Figure BDA0001403864430000071
)进行LC分离，而在总共70分钟的分离时间中，以从1％至30％的线性梯度的移动相B(移动相A：5％ACN/0.1％FA，移动相B：95％ACN/0.1％FA)进行40分钟，80％的移动相B进行10min。在m/z 350-2000的范围下，进行全频MS扫描，挑选10个在MS扫描中强度最强的离子进行MS/MS扫描。通过用于Mascot资料库搜寻的Proteome Discoverer 1.4，将原始数据处理成峰值列表。
5.以AA及ICP-OES检测锌离子
使用原子吸收光谱(AA)计算结合至融合蛋白的锌含量。对照标准曲线计算锌离子的浓度。另可选择地，以感应耦合电浆放射光谱仪(Inductively Coupled Plasma OpticalEmission Spectrometry；ICP-OES,
Figure BDA0001403864430000072
OptimaTM 8000)技术进行定量测量。将GST-MT3-Zn蛋白溶解于0.5M硝酸溶液中，然后在S-200FPLC中进行胶体过滤。可有效被检测到的锌离子浓度范围为0.1至50ppm。
6.使用微型PET扫描评估脑部活性
动物
将12只6周龄雄性C57BL/6小鼠分成4组，每组3只小鼠(n＝3)，如下：经PBS处理的模拟组、经GST处理的对照组、经GST-MT3-Zn(含有Zn)处理的试验组、以及经GST-MT3(缺乏Zn)处理的试验组。在12小时的循环光照/黑暗、20-24℃、以及40-70％相对湿度的环境管控条件下维护动物，并在笼内使其自由采食食物及水。动物试验经由台湾大学的实验动物照护及使用委员会所核准。
微型PET扫描及分析
使小鼠禁食24小时，并在进行微型PET扫描前一小时，以单次腹膜内注射处理。进行PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3处理时，皆使用相同的浓度，0.5μg/200μl。在台湾大学医院分子影像中心进行静态微型PET扫描。针对葡萄糖代谢分析，小鼠先通过腹腔注射而接收288.6±20μCi[18F]FDG，并允许其有意识地摄取一段15分钟的时间。然后，立即进行小鼠的脑部扫描40分钟。以补充氧气的异氟烷吸入进行麻醉诱导(5％用于诱导麻醉，2％用于扫描时维持麻醉)。使用PMOD 3.6(PMOD technologies,Zurich,Switzerland)分析所取得的影像。
7.基于细胞的ROS清除检测
将大约5×103个SK-N-SH细胞播种于96-孔培养盘的每个孔中，并使其在经过16小时的血清禁食后，暴露于指定的GST、GST-MT3-Zn或GST-MT3(不含Zn)中30分钟。在H2O2(400μM)挑战4小时后，在37℃培养箱(无光线)中将细胞与荧光探针(CM-H2DCFDA,Sigma,USA)培养30分钟。然后，以胰蛋白酶消化进行细胞消化，并通过检测DCF量进行ROS定量分析，其相当于使用流式细胞仪(BD FACSCantoTM,USA)在525nm下的相对的ROS含量。进行三重复的测量。
8.Cd重金属在神经细胞中的MTT检测
使用MTT检测法测量试验的重金属对于诱导人类神经细胞死亡的能力。处理前24小时，将大约5×103个细胞播种于含有200μl培养基(每孔)的96-孔培养盘的各孔中。在暴露于各种浓度的指定重金属96小时后，将细胞与20μl的MTT(溴化噻唑蓝四氮唑；ThiazolylBlue Tetrazolium Bromide,Sigma,USA)溶液培养4小时。使用分光光度计(
Figure BDA0001403864430000081
190UV-Vis Microplate,Molecular Devices,USA)，测量在570nm下的吸光值评估细胞存活率。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。以(样本OD570nm/模拟组OD570nm)×100(％)计算存活细胞的百分比。
9.氨基酸序列比对
从Ensemble Genome Browser获得MT3的氨基酸序列。
10.统计分析
所有数据以三个独立试验的平均值±标准误差表示。以单向变异数分析(ANOVA)进行统计分析，接着进行Tukey检验，以测定所示的显著性。
结果
1.人类金属硫蛋白(MT)的构建
使用pGEX2T表达载体于生产人类金属硫蛋白的表达构建体，以生产GST-MT3(参见图1A及1B)。MT3的氨基酸序列显示于表1，而不同物种间的MT3氨基酸序列比对结果则如图2所示。pGEX2T载体含有可诱导的lac启动子，以启动大量的蛋白质表达，可达宿主大肠杆菌总蛋白质量的5-20％。
表1各种动物物种的MT3氨基酸序列
Figure BDA0001403864430000091
Figure BDA0001403864430000101
Figure BDA0001403864430000111
Figure BDA0001403864430000121
2.GST-MT3重组蛋白的表达及纯化
以15％SDS-PAGE呈现GST-MT3重组蛋白的表达及纯化结果，并以考马斯蓝染色观察。以Western印记分析确认GST-MT3重组蛋白。GST-MT3重组蛋白的纯化结果显示于表2。GST-MT3的纯度较His-MT3或MT3为高。
3.GST-MT3重组蛋白质的鉴定
除了上述的Western印记分析外，将GST-MT3重组蛋白质进行质谱分析以确保其身份。
Figure BDA0001403864430000131
在ESI-Q-TOF质谱仪中进行GST及人类MT3蛋白的MS/MS扫描后发现约有85％的GST-MT3覆盖率，这说明本发明中用于表达及纯化GST-MT3重组蛋白的方法是有效的。
4.GST-MT3的锌离子结合能力以及GST-MT3-Zn促进脑部活性的结果
鉴于GST-MT3蛋白(通过ICP)以及锌离子(通过AA)的重叠，显示出这两个分子共同存在性(参见图3)。根据这两个分子的摩尔比率，每个GST-MT3蛋白估计含有约7个锌离子。
将小鼠分成4组(每组n＝3)，在接受[18F]FDG前，以0.5μg/200μl的浓度通过腹腔注射进行PBS、GST、GST-MT3-Zn或GST-MT3的各个处理。然后，使用微型PET进行小鼠的脑部扫描40分钟。使用PMOD 3.6(PMOD technologies,Zurich,Switzerland)分析影像。如图4所示，结果显示，相比于阴性对照组(PBS及GST)以及缺乏锌的GST-MT3而言，GST-MT3-Zn主要可增进脑部活性。
6.GST-MT3-Zn表达出ROS清除剂活性
SK-N-SH神经细胞对于400uM的H2O2具有易感性。如图5所示，相比于GST或GST-MT3(缺乏Zn)处理而言，经GST-MT3-Zn处理的细胞似乎可担任着抗-ROS清除剂的角色。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05。
7.GST-MT3-Zn使由Cd诱导的神经损伤去毒化
SK-N-SH神经细胞对于3uM的Cd易感。如图6所示，经指定浓度的GST-MT3-Zn处理的细胞对于经Cd诱导的神经细胞损伤有显著的救护效果。进行三重复的测量，且由至少3个试验而获得统计分析结果。*p<0.05
结论为，根据本发明的GST-MT3-Zn锌结合融合蛋白可增强脑部活性，其较GST-MT3的效果更佳。此外还说明GST-M3-Zn具有改进的抗-抗氧化功效，以及从重金属诱导的神经元细胞的损伤有显著的救护效果。
虽然本发明已经由参照具体的实施例而公开，显而易见的是，可由本领域技术人员在不脱离本发明的真实精神及范畴的情况下可以设计出本发明的其他实施例及变体。
序列表
<110> 大喆生物科技股份有限公司
<120> 锌结合的谷胱甘肽S转移酶与金属硫蛋白融合蛋白
<130> MUB0001WO
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 68
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> 海豚(Tursiops truncatus)
<400> 2
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Lys Cys Ser
50 55 60
Cys Cys Gln
65
<210> 3
<211> 68
<212> PRT
<213> 狨猴(Callithrix jacchus)
<400> 3
Met Asp Pro Glu Pro Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Lys Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Thr Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 4
<211> 68
<212> PRT
<213> 羊驼(Vicugna pacos)
<400> 4
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Glu Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Ala Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 5
<211> 68
<212> PRT
<213> 狗(Canis lupus familiaris)
<400> 5
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Asp Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Thr Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 6
<211> 66
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<400> 6
Met Asp Pro Glu Ser Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Glu Asp Ser Cys Lys Cys Gln Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Lys Cys Ser Cys
50 55 60
Cys Gln
65
<210> 7
<211> 66
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 7
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asn Ser Cys Lys Cys Glu Asp Cys Lys Cys Thr Asp Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Glu Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Val Lys Ala Glu Glu Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys
65
<210> 8
<211> 68
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 8
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Ser Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Cys Thr Cys Lys Ala Cys Arg Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 鼠兔(Ochotona princeps)
<400> 9
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Glu Asp Ser Cys Lys Cys Gln Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Ala Glu Ala Glu Lys Cys Ser Cys
50 55 60
Cys Gln
65
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> 狐蝠(Pteropus vampyrus)
<400> 10
Glu Thr Cys Thr Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Ala Gly Ser
1 5 10 15
Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys
20 25 30
Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Thr Lys Asp Cys Ala Cys
35 40 45
Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu
50 55
<210> 11
<211> 68
<212> PRT
<213> 猫(Felis catus)
<400> 11
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Asn Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Thr Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 12
<211> 68
<212> PRT
<213> 黑猩猩(Pan troglodytes)
<400> 12
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 13
<211> 68
<212> PRT
<213> 马(Equus caballus)
<400> 13
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 14
<211> 70
<212> PRT
<213> 蝙蝠(Myotis lucifugus)
<400> 14
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys
20 25 30
Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Pro Glu Cys Glu Lys Cys Thr
35 40 45
Lys Asp Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Pro Gly Ala Glu Ala Gln
50 55 60
Lys Cys Ser Cys Cys Asp
65 70
<210> 15
<211> 68
<212> PRT
<213> 象(Loxodonta Africana)
<400> 15
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ala Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Gln Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Asp Glu Gly Ala Gln Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 16
<211> 68
<212> PRT
<213> 松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)
<400> 16
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Asn Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 17
<211> 68
<212> PRT
<213> 犰狳(Dasypus novemcinctus)
<400> 17
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 18
<211> 68
<212> PRT
<213> 丛猴(Otolemur garnettii)
<400> 18
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ser Glu Lys Cys
50 55 60
Asn Cys Cys Gln
65
<210> 19
<211> 68
<212> PRT
<213> 熊猫(Ailuropoda melanoleuca)
<400> 19
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Asp Gly Thr Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Thr Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Thr Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 20
<211> 68
<212> PRT
<213> 小马岛刺猬(Echinops telfairi)
<400> 20
Met Asp Pro Glu Thr Cys His Cys Pro Thr Gly Gly Thr Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Ala Lys Pro Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 21
<211> 68
<212> PRT
<213> 眼镜猴(Tarsius syrichta)
<400> 21
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Asn Cys Cys Gln
65
<210> 22
<211> 68
<212> PRT
<213> 羊(Ovis aries)
<400> 22
Met Asp Pro Glu Ala Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Thr Cys Ala Ser Ser Lys Lys
20 25 30
Ser Glu Cys Gly Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Lys Lys Cys
50 55 60
Gly Cys Cys Gln
65
<210> 23
<211> 68
<212> PRT
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 23
Met Asp Pro Glu Ala Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Thr Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Ser Gln
65
<210> 24
<211> 68
<212> PRT
<213> 乳牛(Bos Taurus)
<400> 24
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Asp Pro Cys Lys Cys Glu Gly Cys Thr Cys Ala Ser Ser Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Glu Lys Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 25
<211> 68
<212> PRT
<213> 橄榄狒狒(Papio Anubis)
<400> 25
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Glu
65
<210> 26
<211> 68
<212> PRT
<213> 猩猩(Pongo abelii)
<400> 26
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 27
<211> 68
<212> PRT
<213> 刺猬(Erinaceus europaeus)
<400> 27
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Arg Cys Lys Asp Gly Glu Gly Ala Lys Thr Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 28
<211> 68
<212> PRT
<213> 大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)
<400> 28
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 29
<211> 68
<212> PRT
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
<400> 29
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Glu
65
<210> 30
<211> 68
<212> PRT
<213> 长尾猴-非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)
<400> 30
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Gly Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Glu
65
<210> 31
<211> 68
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 31
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Cys Lys Cys Lys Gly Cys Lys Cys Thr Asn Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Gly Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Lys Cys
50 55 60
Ser Cys Cys Gln
65
<210> 32
<211> 66
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 32
Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Cys Lys Cys Lys Gly Cys Lys Cys Thr Asn Cys Lys Lys
20 25 30
Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Gly Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp
35 40 45
Cys Val Cys Lys Gly Glu Glu Gly Ala Lys Ala Glu Lys Cys Ser Cys
50 55 60
Cys Gln
65

Claims (3)

1.一种蛋白GST-MT3-Zn，其是由谷胱甘肽S转移酶(GST)与金属硫蛋白(MT)与锌组成，其中该金属硫蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1。
2.一种药物组合物，包含权利要求1所述的蛋白GST-MT3-Zn以及一种药学上可接受载体。
3.一种根据权利要求1所述的蛋白GST-MT3-Zn在制造一种用于治疗一重金属中毒的药物的用途，其中该重金属是镉(Cd)。
CN201680014863.1A 2015-03-13 2016-03-14 锌结合的谷胱甘肽s转移酶与金属硫蛋白融合蛋白 Active CN107614533B (zh)

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