TW201702275A - 鋅結合之麩胺基硫轉移酶與金屬硫蛋白融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種新型的鋅結合融合蛋白，其為與鋅結合 的麩胺基硫轉移酶(GST)與金屬硫蛋(MT)的融合蛋白，其提供預防或治療ROS-關聯疾病以及重金屬中毒的功效。

Description

鋅結合之麩胺基硫轉移酶與金屬硫蛋白融合蛋白
本發明係關於一種新型鋅結合融合蛋白，尤其是一種包含麩胺基硫轉移酶與金屬硫蛋白的鋅結合融合蛋白。
金屬硫蛋白(MTs)是普遍存在的低分子量蛋白質，且是具有極高金屬及半胱氨酸含量且可形成金屬-硫醇叢集的多胜肽。MT基因族群含有4個亞群，稱為MT1至MT4。越來越多的證據顯示哺乳動物MT1/MT2異構物參與鋅的恆定性，且對重金屬毒性及氧化壓力有防護作用。MT3主要表現於神經元，但亦可表現於神經膠質細胞；MT4則大部分存在於分化中的多層鱗狀上皮細胞。
Vallee及Margoshe揭露由純化來自馬(馬的)腎皮質的Cd-結合蛋白的MTs(Margoshes & Vallee,"A cadmium protein from
equine kidney cortex".Journal of the American Chemical Society 79(17)：4813-4814,1957)。有四個主要的異構物在人類中表現(族群1，參見下圖)：MT1(亞型：A、B、E、F、G、H、L、M、X)、MT2、MT3、MT4。可在不同的哺乳動物組織中發現不同的MT異構物。例如，MT1及MT2一般在所有器官中發現，MT4主要表現於分層的組織，但MT3則主要存在於大腦中。MT3亦稱為生長抑制因子(GIF)。
MTs在轉錄因子的調控上扮演重要的角色，因此細胞惡性轉化以及最終的癌症可能因MT的功能或表現上的問題而造成(Krizkova et al.,"Metallothionein--a promising tool for cancer diagnostics".Bratisl Lek Listy 110(2)：93-7,2009.)。據發現，在某些乳腺、結腸、腎臟、肝臟、皮膚(黑色素瘤)、肺臟、鼻咽、卵巢、前列腺、口腔、唾腺、睪丸、甲狀腺以及膀胱的癌症中，MTs的表現量增加；而在肝細胞癌及肝腺癌中，MTs的表現量減少(Cherian,"Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis".Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 533：201-209,2003.)。
文獻已提出重金屬毒性是自閉症的一種假定病因，以及MT合成的功能障礙。然而，MT功能障礙並沒有具體地與自閉症譜系障礙有所關聯。根據2006年探討孩童暴露於疫苗防腐劑硫柳汞的報導指出，相較於非自閉症孩童而言，在自閉症孩童中MT的 含量及針對MT的抗體並無顯著差異(Singh & Hanson,"Assessment of metallothionein and antibodies to metallothionein in normal and autistic children having exposure to vaccine-derived thimerosal".Pediatr Allergy Immunol 17(4)：291-6,2006.)。
因此，有需要發展一種符合習知技藝要求且關聯於金屬硫蛋白的新型融合蛋白，從而提供新的診斷或治療試劑。
本發明係基於非預期性地發現一種鋅結合融合蛋白，其為一種與鋅結合的麩胺基硫轉移酶(GST)與金屬硫蛋白(MT)的融合蛋白，其在治療活性氧族群(ROS)關聯疾病以及因急性或慢性暴露於重金屬下所造成的重金屬中毒上，提供非預期性的優異治療效果。
因此，本發明之一方面提供一種鋅結合之GST與MT融合蛋白(GST-MT-Zn)。
在本發明的一個實例中，該GST-MT-Zn是GST-MT3-Zn。
另一方面，本發明提供一種鋅結合融合蛋白GST-MT3-Zn用於製造可預防或治療ROS-關聯疾病的藥物的用途。
又另一方面，本發明提供一種鋅結合融合蛋白GST-MT3-Zn用於製造可預防或治療一個體因急性或慢性暴露於重金屬下所造成的重金屬中毒的藥物的用途。
在另一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含根據本發明的該鋅結合融合蛋白GST-MT3-Zn與一種藥學可接受載體。
咸信，本發明所屬領域的技術人員可依據本發明而不須進一步闡明的情況下使用本發明至其最廣的保護範圍。因此，所提供的說明書和申請專利範圍應被理解為示範目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。
上述發明內容，以及以下本發明的詳細描述，將由參閱附圖而得到更佳的理解。為了說明本發明，於圖中所揭示的為較佳的實施例。然而，應了解，本發明並不限定於所示的精確安排和手段。
圖例：
圖1A顯示構築的pGEX2T，包含人類MT3。圖1B顯示pGEX2T表現載體上MT3 cDNA的序列。
圖2提供MT3氨基酸序列的比對，顯示保守的關鍵半胱氨酸殘基位置，其意味著，在不同物種間具有相同的功能相關性。
圖3顯示GST-MT3的鋅結合能力。
圖4顯示，分別由PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3處理的小鼠，其腦部經微型正子放射電腦斷層造影(micro PET)後以PMOD 3.6(PMOD Technologies,Zurich,Switzerland)分析的結果。將小鼠分成4組(每組n=3)，並在接受[18F]FDG前，分別以濃度為0.5μg/200μl的PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3進行處理。使用微型PET針對小鼠的腦部進行掃描40分鐘。
圖5顯示SK-N-SH神經細胞分別經GST-MT3-Zn、GST-MT3及GST處理30分鐘，以及以400μM的H2O2挑戰4小時後的ROS含量。相對於經GST及GST-MT3處理而言，經GST-MT3-Zn處理的細胞似乎擔任著抗-ROS清除劑的角色。進行3重複的測量，且由至少3個試驗而獲得統計分析結果。*p<0.05。
圖6顯示對於Cd易感的SK-N-SH神經細胞在3uM下處理96小時，再分別以0.2μM、1μM及5μM的GST-MT3-Zn處理後的MTT檢測結果。經指定濃度的GST-MT3-Zn處理的細胞對於經Cd誘導的神經細胞損傷有顯著的救護效果。進行3重複的測量，且由至少3個試驗而獲得統計分析結果。*p<0.05。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本領域技術人員對於本發明所屬領域的理解相同的含義。本文件，包括定義，將可控制與本文衝突的情況。
如本文所使用的，單數形式「一」，「一個」，及「該」包括複數對象，除非上下文另有明確說明。因此，例如，當提及「一個樣本」包括多個這樣的樣品及本領域技術人員已知的等同物。
如本文所使用的術語「麩胺基硫轉移酶與金屬硫蛋白的融合蛋白」、「GST與MT的融合蛋白」、或「GST-MT」係指一種麩胺基硫轉移酶(GST)與金屬硫蛋白(MT)的融合蛋白或一種其功能性變異體。該融合蛋白進一不包含一或多種化學修飾。該融合蛋白可藉由GST融合於MT的N端，或者MT融合於GST的N端而達成。
如本文所使用的術語「GST-MT-Zn」係指鋅結合的GST與MT的融合蛋白。
如本文所使用的術語「金屬硫蛋白」係指編碼著富含半胱氨酸且分子量低的蛋白質的基因族群，其可經由其半胱氨酸(Cys)殘基上的硫醇基與重金屬(例如Zn及Cu)結合。金屬硫蛋白存在於各種生物中，包括細菌、真菌、以及所有真核植物及動物物種。有四種主要的金屬硫蛋白異構物：MT1、MT2、MT3、以及MT4。
如本文所使用的術語，在胜肽中胺基酸的「取代作用」係指在胜肽中的一個胺基酸置換成另一個胺基酸。氨基酸係由另一個與其具有相似結構及/或化學性質的胺基酸所取代，例如，保守性胺基酸置換。「保守性」胺基酸取代作用可藉由在所涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、及/或兩性性質上的相似性而達成。
如本文所使用的術語，胜肽的「修飾作用」係指，在胜肽骨架(例如，氨基酸序列)上的任何操作或多胜肽的任何轉譯後修飾(例如，醣基化)。
如本文所使用的術語「載體」係指能使與其連接的另一核酸增殖的核酸分子。該術語包括自我複製的核酸結構該術語包括具有自我複製核酸結構的載體，以及嵌入已被導入宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能引導經操作性連接的核酸的表現。如此的載體在本文中係指「表現載體」。
術語「宿主細胞」係指已導入外源性核酸的細胞。宿主細胞是可用於產生本發明的融合蛋白的任何種類的細胞系統。
如本文所使用的術語「藥學上可接受載體」係指一種可與適當化合物或衍生物結合的化學組合物，且根據該結合作用，可用於將該適當的化合物投予至一個體中。
如本文所使用的術語「活性氧族群-關聯疾病」或「ROS-關聯疾病」係指在存有異常含量的活性氧族群(ROS)的情況下，由不良的生物性反應所引起的疾病。異常的活性氧族群(ROS)含量可能參與多種疾病的致病機轉。ROS-關聯疾病包括肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、酒精性肝病、發炎性疾病、敗血症以及重金屬中毒。
本發明提供一種麩胺基硫轉移酶(GST)與金屬硫蛋白的鋅結合融合蛋白，其中GST可融合於MT的N端；或者，MT可融合於GST的N端。MT可以是來自任何動物物種的MT1、MT2、MT3或MT4。
在本發明的一個實例中，鋅結合融合蛋白是一種鋅結合之GST與MT3融合蛋白(簡稱為“GST-MT3-Zn”)。MT3可由任何動物物種中分離而得，包括但不限定於人(Homo sapiens)、海豚(Tursiops truncates)、狨猴(Callithrix jacchus)、羊駝(Vicugna pacos)、狗(Canis lupus familiaris)、兔(Oryctolagus cuniculus)、豚鼠(Cavia porcellus)、豬(Sus scrofa)、鼠兔(Ochotona princeps)、狐蝠(Pteropus vampyrus)、貓(Felis catus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、馬(Equus caballus)、蝙蝠(Myotis lucifugus)、象(Loxodonta Africana)、松鼠(Ictidomys tridecemlineatus)、犰狳(Dasypus novemcinctus)、叢猴(Otolemur garnettii)、熊貓(Ailuropoda melanoleuca)、小馬島刺猬(Echinops telfairi)、眼鏡猴(Tarsius syrichta)、羊(Ovis aries)、樹鼩(Tupaia belangeri)、乳牛(Bos Taurus)、橄欖狒狒(Papio Anubis)、猩猩(Pongo abelii)、刺猬(Erinaceus europaeus)、大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)、獼猴(Macaca mulatta)、長尾猴-非洲綠猴(Chlorocebus sabaeus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)，如圖2所示。
在本發明的實例中，MT3係指於SEQ ID Nos：1-32中所說明的任何一個氨基酸序列。在一特定實例中，MT3為人類MT3，其氨基酸序列為SEQ ID No：1。
根據本發明，可藉由重組DNA技術產生融合蛋白。舉例而言，可將包含編碼著該融合蛋白的核酸分子的載體轉殖於適當的宿主細胞中，並於其中表現融合蛋白。因此，本發明亦提供編碼著本發明融合蛋白的核酸分子、包含該核酸分子的載體、以及經該載體轉殖而用於製備該融合蛋白的宿主細胞。
再者，GST與MT3的融合蛋白可暴露於鋅離子下，例如含鋅的溶液，例如氯化鋅，以使鋅經由其半胱氨酸(Cys)殘基上的硫醇基結合至該融合蛋白上。
本發明的該融合蛋白或鋅結合融合蛋白可包括任何一種具有一或多種不改變其功能的化學修飾作用。舉例而言，該融合蛋白可包含一或多個胺基酸取代。
經驗證，鋅結合的GST與MT3融合蛋白(GST-MT3-Zn)可促進腦部活性，且非預期性地，GST-MT3-Zn較GST-MT3有顯著較佳的功效，如圖4所示。
因此，本發明提供一種用於增強個體腦部活性的方法，其包含將有效量的鋅結合GST與MT3融合蛋白(GST-MT3-Zn)投予至該個體中。另可選擇地，本發明提供一種GST-MT3-Zn用於製造可增強腦部活性的藥物的用途。
亦經證明，GST-MT3-Zn提供改善的抗氧化功效以及代謝活性，具體而言，移除ROS，且非預期性地，GST-MT3-Zn較GST-MT3有顯著較佳的功效，如圖5所示。
因此，本發明一種用於預防或治療患有ROS-關聯疾病的個體的方法，其包含將有效量的GST-MT3-Zn投予至有需要的個體。另可選擇地，本發明提供一種GST-MT3-Zn用於製造一種可預防或治療ROS-關聯疾病的藥物的用途。
在本發明的一個實施例中，ROS-關聯疾病係指在存有異常含量的活性氧族群(ROS)的情況下，由不良的生物性反應所引起的疾病。本發明中，ROS-關聯疾病是一種選自由肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、酒精性肝病、發炎性疾病、敗血症以及重金屬中毒所組成的群組中。
已進一步證明，GST-MT3-Zn對受重金屬暴露影響的細胞的存活率有救護的效果，舉例而言，如圖6所示。
因此，本發明提供一種用於預防或治療一個體因急性或慢性暴露於重金屬下所造成的重金屬中毒的藥物的用途，其包含將有效量的GST-MT3-Zn投予至有需要的個體。另可選擇地，本發明提供一種GST-MT3-Zn在製造一種用於預防或治療重金屬中毒的藥物的用途。
在一實施例中，造成重金屬中毒的重金屬為鎘(Cd)、鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、鉻(Cr)、銅(Cu)、錳(Mn)、或鎳(Ni)。在一特定實施例中，該重金屬為鎘(Cd)。
對於在治療中的用途，治療有效量的蛋白質，或其功能性變體，以及任何活性成分可以被調製成用於投予的藥物組合物。
因此，本發明提供一種藥物組合物，其包含麩胺基硫轉移酶與金屬硫蛋白3的鋅結合融合蛋白(GST-MT3-Zn)，以及一種藥學上可接受載體。可使用常規技術，將該藥物組合物可與任何適當的藥學上可接受載體一同調製。
本發明提供的以下某些實例將被解釋為僅僅是說明性的，而非以任何方式限制本發明的其餘部分。無需進一步詳細說明，咸信本領域的技術人員能夠根據本說明書而利用本發明至其最大限度。
實例
1. DNA選殖
根據製造商的操作手冊，使用Qiagen微型RNA純化套組從人類胚胎腎臟上皮細胞(HEK293細胞)抽取總RNA。然後，使用大約100ng的總RNA於含有表1所列MT3引子的20ul反應混合物中，進行一步法RT-PCR。在55℃下進行反轉錄30分鐘後，於94℃反應5分鐘，接著進行35個循環的94℃反應30秒、55℃反應30 秒、以及72℃反應30sec。反應完成後，在72℃下10分鐘後，持溫在4℃。在Veriti 96-well thermo cycler(Applied Biosystems,CA,USA)中進行這些反應。在1.5%瓊脂糖膠體上進行電泳分析所得的PCR產物，並以QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit進行洗提。然後，以BamHI及EcoRI消化所獲得的DNA片段，接著，在連接於亦由BamHI及EcoRI剪切的pGEX2T細菌表現載體(含有IPTG可誘導的啟動子，以及在其多選殖位點前的氨基末端GST標誌)前，先進行膠體洗提。在16℃下進行DNA連接過夜。在轉形至BL21勝任細胞後，使用氨芐青黴素抗性區段篩選出pGEX2T-MT3構築體，並以DNA定序法確認。從pGEX2T-MT3中以NheI及XhoI進行剪切，並與pET28a載體在相對應的位點上進行連接，而獲得MT3開放讀碼框，因而產生pET28a-MT3。BL21細胞中的pET28a-MT3表現構築體，在MT3的氨基末端產生6個組氨酸標誌(6xhis tag)，稱為His-MT3。
2. 蛋白質表現
將攜帶個別的前述pGEX2T-MT3表現構築體的BL21細菌，在37℃及250rpm下震盪培養於含有100μg/ml氨芐青黴素的5ml LB培養基中。在OD600nm達到1.0時，接著將0.5mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)及0.3mM ZnCl2加入培養基中，以在額外的8小時中誘導重組蛋白的表現。在3000g下離心總細胞裂解物，並重新懸浮於5ml PBS中，接著，使用Misonix Sonicator 3000，在4級的強度下，以15-秒的暫停時間間隔/每分鐘進行超音波處理10分鐘。在4℃下以13000rpm進行離心10分鐘後，收集上清液，將其重新懸浮於1ml PBS中，並藉由GST-瓊脂糖珠進行GST-MT3融合蛋白的純化。使用於50mM Tris-HCl pH 9.5中的20mM還原態麩胱甘肽作為重組蛋白的洗提物，接著進行尺寸排阻色層分析(S-200)，以獲得 純化的GST-MT3重組蛋白。然後，將純化的GST-MT3重組蛋白進行SDS-PAGE分析，並進行卡馬斯藍(coomassie blue)染色，以評估在IPTG可誘導的方式下，這些pGEX2T-MT構築體的表現情況。
針對在發酵中的大型量產而言，首先，在起始為50ml的含氨苄青黴素的LB培養基中接種攜帶pGEX2T-MT3表現載體的單一BL21菌落，並於37℃及250rpm下培養16小時。然後，將經隔夜培養的培養基轉移至500ml且含氨苄青黴素的新鮮LB培養基中，使其進一步生長至OD600nm為10，之後將其進料至含有4.5公升新鮮LB培養基的5公升發酵槽中。在37℃、200rpm、15% O2及pH 7.0下，於存有1mM IPTG的條件下進行發酵24小時，同時其OD600nm為20。在13000rpm下離心10分鐘以收取細菌，然後使其完全重新懸浮於100ml的PBS中。接著，在冰上，使用超音波(強度等級4)，以15-秒的暫停時間間隔/每分鐘處理懸浮液30分鐘。在13000rpm下離心30分鐘後保留上清液，以進行GST親和性管柱純化。在洗提前，使用5公升的含有1% Triton X114的PBS將潛在的內毒素汙染洗掉。
為了產生僅含MT3的重組蛋白，根據製造商操作手冊，使用凝血酶(Sigma)進行已純化GST-MT3蛋白的裂解。簡言之，將1mg結合於瓊脂糖珠上的GST-MT3蛋白溫和地攪拌並在22℃下與溶於1ml PBS緩衝液中的50單位的凝血酶蛋白酶(MW 37kDa,~4500單位/mg)混合16小時。然後，在3000rpm下離心該反應溶液4分鐘，使瓊脂糖珠沉澱。然後，小心地收集上清液，並保存於-80℃。一般而言，以SDS-PAGE-SDS確認經消化的溶液，或者使用FPLC層析法使其分離並進行收集。
再者，使GST-MT3蛋白暴露於鋅離子溶液中，例如氯化鋅溶液，以使鋅經由其半胱氨酸(Cys)殘基上的硫醇基而結合於融合蛋白。
3. 西方墨點分析
首先，以15% SDS-PAGE電泳分離重組蛋白。然後，將膠體轉移至硝化纖維素薄膜上。將該薄膜置於TBST(137mM NaCl,2.7mM KCl,19mM Tris base,0.005% Tween-20,pH 7.4)中的5%無脂肪脫脂牛奶進行封閉1小時，接著以混合於含有TBST的5% BSA中的抗-GST(稀釋倍率1：1000,Pierce)或抗-MT(稀釋倍率1：1000,Sigma)多株抗體，在4℃的震盪培養箱中進行墨點分析。在添加HRP-結合的二級抗體前，以TBST清洗該薄膜5分鐘，共三次。培養1小時以及以TBST清洗三次後，可使用ECL偵測系統，並根據製造商的操作手冊，在X光薄膜上觀察結果。
4. 蛋白質質譜分析
在明生生物科技股份有限公司(Mithra Biotechnology Inc.,Taipei,Taiwan)，使用10μg經FPLC純化的蛋白進行重組GST-MT3蛋白的質譜分析。在37℃下以10mM DTT還原樣本1小時，並在室溫及黑暗條件下，以50mM IAM進行烷基化30分鐘。
然後，在37℃下，加入於25mM碳酸氫銨中的胰蛋白酶，以進行消化18小時。以結合Ultimate 3000 RSLC system(Dionex)的ESI-Q-TOF質譜儀(Bruker micrOTOF-Q Ⅱ)進行樣本的分析。使用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC,75μm x 150mm,2μm,100Å)進行LC分離，而在總共70分鐘的分離時間中，以從1%至30%的線性梯度的移動相B(移動相A：5% ACN/0.1% FA，移動相B：95% ACN/0.1% FA)進行40分鐘，80%的移動相B進行10min。在 m/z 350-2000的範圍下，進行全頻MS掃描，挑選10個在MS掃描中強度最強的離子進行MS/MS掃描。藉由用於Mascot資料庫搜尋的Proteome Discoverer 1.4，將原始數據處理成峰值列表。
5. 以AA及ICP-OES偵測鋅離子
使用原子吸收光譜(AA)計算結合至融合蛋白的鋅含量。對照標準曲線計算鋅離子的濃度。另可選擇地，以感應耦合電漿放射光譜儀(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry；ICP-OES,PerkinElmer® OptimaTM 8000)技術進行定量量測。將GST-MT3-Zn蛋白溶解於0.5M硝酸溶液中，然後在S-200 FPLC中進行膠體過濾。可有效被偵測到的鋅離子濃度範圍為0.1至50ppm。
6. 使用微型PET掃描評估腦部活性
動物
將12隻6週齡雄性C57BL/6小鼠分成4組，每組3隻小鼠(n=3)，如下：經PBS處理的模擬組、經GST處理的對照組、經GST-MT3-Zn(含有Zn)處理的試驗組、以及經GST-MT3(缺乏Zn)處理的試驗組。在12小時的循環光照/黑暗、20-24℃、以及40-70%相對溼度的環境管控條件下維護動物，並在籠內使其自由採食食物及水。動物試驗經由國立台灣大學的實驗動物照護及使用委員會所核准。
微型PET掃描及分析
使小鼠禁食24小時，並在進行微型PET掃描前一小時，以單次腹膜內注射處理。進行PBS、GST、GST-MT3-Zn及GST-MT3處理時，皆使用相同的濃度，0.5μg/200μl。在國立台灣大學醫院分子影像中心進行靜態微型PET掃描。針對葡萄糖代謝分析，小鼠先藉由腹腔注射而接收288.6±20μCi[18F]FDG，並允許其有意識地攝取一 段15分鐘的時間。然後，立即進行小鼠的腦部掃描40分鐘。以補充氧氣的異氟烷吸入進行麻醉誘導(5%用於誘導麻醉，2%用於掃描時維持麻醉)。使用PMOD 3.6(PMOD technologies,Zurich,Switzerland)分析所取得的影像。
7. 基於細胞的ROS清除檢測
將大約5×103個SK-N-SH細胞播種於96-孔培養盤的每個孔中，並使其在經過16小時的血清禁食後，暴露於指定的GST、GST-MT3-Zn或GST-MT3(不含Zn)中30分鐘。在H2O2(400μM)挑戰4小時後，在37℃培養箱(無光線)中將細胞與螢光探針(CM-H2DCFDA,Sigma,USA)培養30分鐘。然後，以胰蛋白酶消化進行細胞消化，並藉由偵測DCF量進行ROS定量分析，其相當於使用流式細胞儀(BD FACSCantoTM,USA)在525nm下的相對的ROS含量。進行三重複的量測。
8. Cd重金屬在神經細胞中的MTT檢測
使用MTT檢測法量測試驗的重金屬對於誘導人類神經細胞死亡的能力。處理前24小時，將大約5×103個細胞播種於含有200μl培養基(每孔)的96-孔培養盤的各孔中。在暴露於各種濃度的指定重金屬96小時後，將細胞與20μl的MTT(溴化噻唑藍四氮唑；Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,Sigma,USA)溶液培養4小時。使用分光光度計(SpectraMax® 190 UV-Vis Microplate,Molecular Devices,USA)，測量在570nm下的吸光值評估細胞存活率。進行3重複的測量，且由至少3個試驗而獲得統計分析結果。以(樣本OD570nm/模擬組OD570nm)×100(%)計算存活細胞的百分比。
9. 氨基酸序列比對
從Ensemble Genome Browser獲得MT3的氨基酸序列。
10. 統計分析
所有數據以三個獨立試驗的平均值±標準誤差表示。以單向變異數分析(ANOVA)進行統計分析，接著進行Tukey檢定，以測定所示的顯著性。
結果
1. 人類金屬硫蛋白(MTs)的建構
使用pGEX2T表現載體於生產人類金屬硫蛋白的表現構築體，以生產GST-MT3(參見圖1A及1B)。MT3的氨基酸序列顯示於表1，而不同物種間的MT3氨基酸序列比對結果則如圖2所示。pGEX2T載體含有可誘導的lac啟動子，以啟動大量的蛋白質表現，可達宿主大腸桿菌總蛋白質量的5-20%。
2. GST-MT3重組蛋白的表現及純化
以15% SDS-PAGE呈現GST-MT3重組蛋白的表現及純化結果，並以考馬斯藍染色觀察。以西方墨點分析確認GST-MT3重組蛋白。GST-MT3重組蛋白的純化結果顯示於表2。GST-MT3的純度較His-MT3或MT3為高。
3. GST-MT3重組蛋白質的鑑定
除了上述的西方墨點分析外，將GST-MT3重組蛋白質進行質譜分析以確保其身份。
在ESI-Q-TOF質譜儀中進行GST及人類MT3蛋白的MS/MS掃描後發現約有85%的GST-MT3覆蓋率，這說明本發明中用於表現及純化GST-MT3重組蛋白的方法是有效的。
4. GST-MT3的鋅離子結合能力以及GST-MT3-Zn促進腦部活性的結果
鑒於GST-MT3蛋白(藉由ICP)以及鋅離子(藉由AA)的重疊，顯示出這兩個分子共同存在性(參見圖3)。根據這兩個分子的莫耳比率，每個GST-MT3蛋白估計含有約7個鋅離子。
將小鼠分成4組(每組n=3)，在接受[18F]FDG前，以0.5μg/200μl的濃度藉由腹腔注射進行PBS、GST、GST-MT3-Zn或GST-MT3的各個處理。 然後，使用微型PET進行小鼠的腦部掃描40分鐘。使用PMOD 3.6(PMOD technologies,Zurich,Switzerland)分析影像。如圖4所示，結果顯示，相較於陰性對照組(PBS及GST)以及缺乏鋅的GST-MT3而言，GST-MT3-Zn主要可增進腦部活性。
6. GST-MT3-Zn表現出ROS清除劑活性
SK-N-SH神經細胞對於400uM的H2O2具有易感性。如圖5所示，相較於GST或GST-MT3(缺乏Zn)處理而言，經GST-MT3-Zn處理的細胞似乎可擔任著抗-ROS清除劑的角色。進行3重複的測量，且由至少3個試驗而獲得統計分析結果。*p<0.05。
7. GST-MT3-Zn使由Cd誘導的神經損傷去毒化
SK-N-SH神經細胞對於3uM的Cd易感。如圖6所示，經指定濃度的GST-MT3-Zn處理的細胞對於經Cd誘導的神經細胞損傷有顯著的救護效果。進行3重複的測量，且由至少3個試驗而獲得統計分析結果。*p<0.05。
結論為，根據本發明的GST-MT3-Zn鋅結合融合蛋白可增強腦部活性，其較GST-MT3的效果為佳。此外亦說明GST-M3-Zn具有改良的抗-抗氧化功效，以及從重金屬誘導的神經元細胞的損傷有顯著的救護效果。
雖然本發明已經由參照具體的實施例而公開，顯而易見的是，可由本領域技術人員在不脫離本發明的真實精神及範疇的情況下可以設計出本發明的其他實施例及變體。

Claims (19)

  1. 一種鋅結合融合蛋白，其係一種與鋅結合的麩胺基硫轉移酶(GST)與金屬硫蛋白(MT)的融合蛋白。
  2. 根據請求項1的鋅結合融合蛋白，其進一步包含一或多種化學修飾作用。
  3. 根據請求項1的鋅結合融合蛋白，其中該MT係MT3.
  4. 根據請求項1的鋅結合融合蛋白，其中該GST係融合於該MT的N端。
  5. 根據請求項1的鋅結合融合蛋白，其中該MT係融合於該GST的N端。
  6. 根據請求項1的鋅結合融合蛋白，其中該MT3具有一種選自由SEQ ID Nos：1-32所述的氨基酸序列的群組中的氨基酸序列。
  7. 根據請求項3的鋅結合融合蛋白，其中該MT3係人類MT3。
  8. 根據請求項7的鋅結合融合蛋白，其中該MT3具有SEQ ID No：1的氨基酸序列。
  9. 一種包含請求項1的鋅結合融合蛋白以及一種藥學上可接受載體的藥物組合物。
  10. 一種包含請求項3的鋅結合融合蛋白以及一種藥學上可接受載體的藥物組合物。
  11. 根據請求項10的藥物組合物，其增強腦部活性。
  12. 根據請求項10的藥物組合物，其係有效於預防或治療ROS-關聯疾病。
  13. 根據請求項10的藥物組合物，其係有效於預防或治療一個體因急性或慢性暴露於重金屬下而造成的重金屬中毒。
  14. 根據請求項13的藥物組合物，其中該重金屬係鎘(Cd)、鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、鉻(Cr)、銅(Cu)、錳(Mn)或鎳(Ni)。
  15. 根據請求項14的藥物組合物，其中該重金屬係鎘(Cd)。
  16. 使用根據請求項3的鋅結合融合蛋白於製造一種用於預防或治療ROS-關聯疾病的藥物的用途。
  17. 使用根據請求項3的鋅結合融合蛋白於製造一種用於預防或治療重金屬中毒的藥物的用途。
  18. 根據請求項17的用途，其中該重金屬係鎘(Cd)、鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、鉻(Cr)、銅(Cu)、錳(Mn)或鎳(Ni)。
  19. 根據請求項18的用途，其中該重金屬係鎘(Cd)。
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