CN104072618A - 人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用。本发明所提供的杂种泛素结合结构域多肽，由至少两个泛素结合结构域串联而成；且在组成所述杂种泛素结合结构域多肽的所有泛素结合结构域中，至少有两个泛素结合结构域是不同的。另外，所述杂种泛素结合结构域多肽还可含有标签蛋白。实验证明，本发明提供的杂种泛素结合结构域多肽能够高效、无偏性的结合泛素分子及其携带的不同的泛素链，可以提高大规模泛素化蛋白质的富集效率，用于开发高效的泛素化蛋白质分离介质和生化试剂，也可为体内蛋白质泛素化的调节提供技术手段。本发明对于推动人类疾病样本泛素化蛋白质组学研究和健康医学的发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用，特别涉及一种人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其在蛋白质泛素化修饰研究中的应用。
背景技术
泛素本身是含有76个氨基酸的小蛋白，因其在真核细胞内广泛存在而得名。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome Systerm，UPS)是已知的所有真核生物体内保守性好、选择性高、也是最为重要的细胞内蛋白质特异性降解途径。蛋白质泛素化作为细胞的中心调节信号已经参与了包括蛋白质降解、蛋白质聚类、DNA修复和细胞凋亡等几乎细胞正常生命活动的所有过程，并与许多疾病过程密切相关，因此蛋白质泛素化研究是生命科学研究的热点。
与泛素分子的保守性相似，蛋白质的泛素化也是一个高度保守的可逆过程。在细胞内，泛素经由泛素活化酶E1，泛素铰链酶E2和泛素连接酶E3的接连式酶促反应，通过其C末端的甘氨酸的羧基将其共价铰链到被修饰的蛋白质底物的赖氨酸的ε-氨基。与之对应的是，泛素单体也可从被修饰的蛋白质底物或自由的泛素链上解离下来，这个过程需要脱泛素化酶(DUB)的参与才能完成。
由于泛素本身含有Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48和Lys63等7个赖氨酸，连接到底物蛋白上的泛素分子的7个赖氨酸又可以被泛素修饰，与76位的甘氨酸形成异肽键，由此形成泛素多肽链；另外，通过泛素的N端蛋氨酸与另一泛素的C端76位的甘氨酸共价结合可构成线性泛素链，进一步突显了泛素系统的复杂性。而泛素链的种类和长度决定了泛素化蛋白质的命运。如单泛素修饰主要调控DNA修复和内吞作用。特殊的线性泛素链主要参与激活NF-κB激酶。经典的K48泛素链通过引导蛋白质到26S蛋白酶体来降解目的蛋白质。而K63泛素链修饰则主要参与溶酶体的胞内运输、细胞内信号传导和DNA修复等。定量蛋白质组学和生化研究结果显示，K11泛素链引导内质网相关的蛋白质降解信号。而K33泛素链则调控不依赖于蛋白酶体的信号传导途径。其他泛素链的功能还不为所知。定量蛋白质组学研究表明上述泛素链在细胞中均广泛存在，但其浓度组成存在很大差异，例如对数生长期酵母中7种泛素链组成的比例为K6:K11:K27:K29:K33:K48:K63≈40:120:20:15:5:100:40。
蛋白质被引导到蛋白酶体降解需要其泛素化信号被细胞内泛素化系统识别才能得以传递。研究表明在人的蛋白质组中存在250多个包含有泛素结合结构域(UBD)的泛素受体蛋白。这些UBD根据其生化特征可分为16类，包括Ub-associated domain(UBA)、Ub-interactingmotif(UIM)、polyUb-associated zinc finger(PAZ)、MIU(motif interacting with Ub)，CUE(coupling of Ub conjugation to ER degradation)，GAT(Golgi-localized，Gamma-era-containing，Arf-binding)，UBZ(ubiquitin-binding zinc finger)，UBC(ubiquiin-conjugating enzyme)，UEV(ubiquitin-conjugating enzyme E2variant)，UBM(ubiquitin binding motif)，NZF(Np14zincfinger)，ZnF-UBP(ubiquitin-specific processing protease zinc finger)，ZnF-A20(zinc finger)，GLUE(GRAM-like ubiquitin binding in EAP45)，Jab1/MPN(Jun kinase activation domainbinding/Mpr1p and Pad1p N-terminal)和PFU(PLAA family ubiquitin binding)。结构上，UBD通常较小，含有20-150个氨基酸残基。UBD氨基酸序列的多样性决定了其与泛素结合的亲和力的多样性和特异性。
不同的UBD结合泛素的能力存在很大差异，其解离常数(Kd)从2到750μM不等。而UBD结合泛素链的亲和力通常更强，解离常数可高达30nM。在已知的UBD中，UBA是被研究的最早，也是最系统的。生化研究表明Ubiquilin1(UQ1)和Dsk2蛋白中的UBA结构域与泛素单体的结合力较强(Kd值约为20μM)，但其他UBA结构域与泛素单体结合较弱(Kd值为200-750μM)。根据UBA结构域连接多聚泛素链的不同情况可将其分为四类：I类结构域结合K48连接的多聚泛素链；II类结构域结合K63连接的多聚泛素链；III类结构域不结合泛素；IV类结构域对于泛素链的组成没有选择性。
与大多数的UBA相似，其他15类UBD通常与泛素的结合较弱。但有趣的是许多蛋白质通过产生重复的UBD序列或形成蛋白质的二聚体来增强与泛素分子的亲和特性。
多个UBD三维结构的解析结果表明UBD可通过三种方式与泛素分子结合。大多数UBD与泛素分子第44位的Ile为中心的疏水区结合。但是Rabex-5蛋白中的ZnF-A20结构域则与泛素第58位的Asp结合。第三种UBD是IsoT/USP5中的PAZ结构域，该结构域可与泛素C端的Gly-Gly尾巴结合。UBD与泛素结合的不同分子机制决定了UBD与泛素的结合能力及对不同泛素链的结合特性。
质谱偏爱对样品中高丰度的蛋白质进行测序。但泛素化蛋白在细胞中的丰度通常较低，难以直接对其进行大规模的鉴定。因此只有富集了的泛素化蛋白质才能被有效鉴定。常用的泛素化蛋白的纯化包括利用表位标签标记的泛素(如FLAG，HA-tag，myc-tag，His-tag和biotin等)，抗泛素抗体和含有泛素结合结构域的蛋白质的亲和结合等方法。
Peng等通过构建用6个组氨酸标签标记的泛素蛋白基因工程酵母菌株，在变性条件下成功地富集了酵母细胞中的泛素化蛋白质，得到了至今最大的泛素化蛋白质组鉴定数据。相同的策略已被成功地应用到其他类泛素蛋白修饰的蛋白质底物的鉴定。然而该方法存在明显的局限性。经基因改造的泛素基因可用于酵母、细胞甚至转基因动物，但无法应用于临床标本的研究。抗泛素抗体可从人细胞系样品中纯化泛素化蛋白，但对于大规模蛋白质组学研究而言，大量昂贵的抗体的获得和使用是一个明显的限制因素，而且抗体的特异性也是决定研究成果正确与否的关键。在此基础上发展出来的K-ε-GG抗体能够特异地识别并富集泛素化肽段，极大的提高了泛素化位点和泛素化蛋白的鉴定数目。但是该方法无法排除NEDD8或ISG15修饰底物蛋白产生的含有K-GG的肽段，也难于进行微观不均一性为特征的不同蛋白质翻译后修饰间串话的研究。此外，由于该方法在肽段水平进行富集，会提高鉴定的底物蛋白的错误率。
利用泛素结合结构域(Ubiquitin Binding Domain，UBD)亲和纯化泛素化蛋白质也是一种十分有效的方法。Layfield利用26S蛋白酶体亚基S5a蛋白与泛素分子的相互作用从哺乳动物组织中富集并鉴定了内源性泛素化蛋白。Hjerpe等进一步发现4个串联的UBA泛素结合结构域与泛素分子及泛素链的结合能力明显提高，而且能够保护多聚泛素化修饰的底物蛋白，避免其被蛋白酶体降解及去泛素化酶的作用。Shi等利用4个串联的UBA泛素结合结构域成功地从哺乳动物细胞中富集到许多原先未鉴定到的泛素化蛋白质。以上均说明了利用泛素结合结构域作为泛素亲和纯化介质的有效性。
但是不同的UBD对不同组成的泛素链的结合能力存在差异。例如RAD23A蛋白C端的UBA结构域与K48多聚泛素链的结合远高于与K63多聚泛素链的结合。而TAB2蛋白的NZF结构域则更倾向于结合K63修饰的多聚泛素链。已有报道中使用的均为单一的UBA结构域，在大规模泛素化蛋白质富集过程中，会根据所选择的泛素结合结构域的特性对不同泛素链修饰底物的结合存在偏性，无法全面、真实地进行泛素化蛋白质组学研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用。
本发明所提供的人工构建的杂种泛素结合结构域多肽，既可为不带有标签蛋白的杂种泛素结合结构域多肽(记为杂种泛素结合结构域多肽1)，也可为带有标签蛋白的杂种泛素结合结构域多肽(记为杂种泛素结合结构域多肽2)。
本发明所提供的杂种泛素结合结构域多肽1，具体由至少两个泛素结合结构域串联而成；且在组成所述杂种泛素结合结构域多肽1的所有泛素结合结构域中，至少有两个泛素结合结构域是不同的。
进一步，所述杂种泛素结合结构域多肽1为如下(a)或(b)：
(a)由至少两个(如两个)互不相同的泛素结合结构域串联而成；
(b)由至少两个相同的或彼此不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个(如两个)互不相同的泛素结合结构域串联而成。
所述泛素结合结构域具体可选自如下现有的16类泛素结合结构域(UBD)：UBA结构域、UIM结构域、PAZ结构域、MIU结构域、CUE结构域、GAT结构域、UBZ结构域、UBC结构域、UEV结构域、UBM结构域、NZF结构域、UBP ZnF结构域、ZnF-A20结构域、GLUE结构域、Jab1/MPN结构域和PFU结构域。
在本发明中，所述杂种泛素结合结构域多肽1具体可为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域(记为DSK2-A20)；
(b)由n(n为大于等于2的整数，如2-4)个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；
(c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域(记为DSK2-UQ2)；
(d)由n(n为大于等于2的整数，如2-4)个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域。
其中，所述来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域的氨基酸序列具体如序列表中序列1的第237-281位(或序列1的第357-401位、或序列1的第477-521位、或序列1的第597-641位、或序列2的第237-281位、或序列2的第342-386位、或序列2的第447-491位、或序列2的第552-596位)所示；所述来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域的氨基酸序列具体如序列表中序列1的第287-351位(或序列1的第407-471位、或序列1的第527-591位、或序列1的第647-711位)所示；所述来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域的氨基酸序列具体如序列表中序列2的第287-336位(或序列2的第392-441位、或序列2的第497-546位、或序列2的第602-651位)所示。
相应的，其中所述来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域的核苷酸序列具体如序列表中序列3的第709-843位(或序列3的第1069-1203位、或序列3的第1429-1563位、或序列3的第17891923位、或序列4的第709-843位、或序列4的第1024-1158位、或序列4的第1339-1473位、或序列4的第1654-1788位)所示；所述来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域的核苷酸序列具体如序列表中序列3的第859-1053位(或序列3的第1219-1413位、或序列3的第1579-1773位、或序列3的第1939-2133位)所示；所述来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域的核苷酸序列具体如序列表中序列4的第859-1008位(或序列4的第1174-1323位、或序列4的第1489-1638位、或序列4的第1804-1953位)。
本发明所提供的杂种泛素结合结构域多肽2，为在所述杂种泛素结合结构域多肽1上连接标签蛋白后得到的多肽(既可为氨基端连接，也可为羧基端连接)；
所述标签蛋白为能够进行亲和纯化的标签蛋白；
所述标签蛋白具体可选自如下现有蛋白标签：谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、His标签、Flag标签、HA标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、T7标签、纤维素结合域(CBD)标签、钙调蛋白标签。
在本发明中，所述标签蛋白为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签；所述谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第1-231位(或序列2的第1-231位)。
更加具体的，本发明所提供的所述杂合泛素结合结构域多肽1具体为如下(a1)-(a5)中任一种；所述杂合泛素结合结构域多肽2的氨基酸序列具体为如下(b1)-(b5)中任一种：
(a1)序列表中序列1的第237-351位(记为DSK2-A20)；
(a2)序列表中序列1的第237-471位(记为2(DSK2-A20))；
(a3)序列表中序列1的第237-711位(记为4(DSK2-A20))；
(a4)序列表中序列2的第237-336位(记为DSK2-UQ2)；
(a5)序列表中序列2的第237-651位(记为4(DSK2-UQ2))；
(b1)序列表中序列1的第1-351位(记为GST-(DSK2-A20))；
(b2)序列表中序列1的第1-471位(记为GST-2(DSK2-A20))；
(b3)序列表中序列1的第1-711位(记为GST-4(DSK2-A20))；
(b4)序列表中序列2的第1-336位(记为GST-(DSK2-UQ2))；
(b5)序列表中序列2的第1-651位(记为GST-4(DSK2-UQ2))。
相应的，所述杂合泛素结合结构域多肽1的编码基因序列具体为如下(a6)-(a10)中任一种；所述杂合泛素结合结构域多肽2的的编码基因序列具体为如下(b6)-(b10)中任一种：
(a6)序列表中序列3的第709-1053位(DSK2-A20基因)；
(a7)序列表中序列3的第709-1413位(2(DSK2-A20)基因)；
(a8)序列表中序列3的第709-2133位(4(DSK2-A20)基因)；
(a9)序列表中序列4的第709-1008位(DSK2-UQ2基因)；
(a10)序列表中序列4的第709-1953位(4(DSK2-UQ2)基因)；
(b6)序列表中序列3的第1-1053位(GST-(DSK2-A20)基因)；
(b7)序列表中序列3的第1-1413位(GST-2(DSK2-A20)基因)；
(b8)序列表中序列3的第1-2133位(GST-4(DSK2-A20)基因)；
(b9)序列表中序列4的第1-1008位(GST-(DSK2-UQ2)基因)；
(b10)序列表中序列4的第1-1953位(GST-4(DSK2-UQ2)基因)。
本发明还保护制备所述杂种泛素结合结构域多肽的方法。
该方法包括如下步骤：将所述杂种泛素结合结构域多肽的编码基因转化到大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，裂解所述重组大肠杆菌，分离得到所述杂种泛素结合结构域多肽。
所述方法中，所述杂种泛素结合结构域多肽的编码基因是以重组表达载体的形式导入到所述大肠杆菌中的；所述重组表达载体为在pGEX-4T-2载体的酶切位点(BglII和EcoRI)之间插入所述杂种泛素结合结构域多肽的编码基因后得到的重组质粒。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
如下(A)-(E)中任一生物材料均属于本发明的保护范围：
(A)含有所述杂种泛素结合结构域多肽的编码序列的核苷酸序列；
(B)含有所述杂种泛素结合结构域多肽的编码序列，或所述(A)中所述的核苷酸序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
(C)将所述杂种泛素结合结构域多肽固定于固相载体上后，得到的固相吸附剂；
(D)以所述(C)中的所述固相吸附剂为填料的层析柱；
(E)一种用于富集分离泛素化蛋白质的试剂盒，所述试剂盒中含有所述杂种泛素结合结构域多肽，或所述(A)中所述核苷酸序列，或所述(B)中所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述(C)中所述固相吸附剂，或所述(D)中所述层析柱。
在所述(C)中，所述固相载体包括但不限于琼脂糖凝胶颗粒。所述“将所述杂种泛素结合结构域多肽固定于固相载体上”，可为通过所述标签蛋白与其配体的结合进行固定，也可利用化学反应将其固定在活化偶联介质上。所述活化偶联介质包括(但不限于)：环氧活化琼脂糖凝胶介质，氨基/羧基活化琼脂糖凝胶介质，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化琼脂糖凝胶介质和溴化氢(CNBr)活化琼脂糖凝胶介质。
所述杂种泛素结合结构域多肽，或所述核苷酸序列，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述固相吸附剂，或所述层析柱，在富集分离泛素化蛋白质中的应用也属于本发明的保护范围。
所述应用，具体可按照如下步骤进行：
(1)将已被固定的所述杂种泛素结合结构域多肽(即所述固相吸附剂)与待分离样品共同孵育(如4℃旋转孵育30分钟)；
(2)洗脱结合的泛素化蛋白质，并对其进行鉴定。
步骤(1)中，所述待分离样品为细胞总蛋白裂解液。
步骤(2)中，所述洗脱的条件为加入SDS-PAGE电泳样品缓冲液，80-100℃(如100℃)加热处理(如煮5分钟)。所述SDS-PAGE电泳样品缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20g/L SDS，体积分数1％β-巯基乙醇，体积分数10％甘油，体积分数0.1％考马斯亮蓝，0.05MTris-HCl，pH6.8。
步骤(2)中，在所述洗脱之前还包括洗涤的步骤；所述洗涤为采用洗涤缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，体积分数0.5％Triton X-100，体积分数10％甘油，2mMβ-巯基乙醇，5mM IAA，pH8.0)清洗三次。
本发明利用SILAC-AQUA技术定量比较了不同的泛素结合结构域对七种泛素链的亲和特性，筛选到高效、无偏性的与泛素分子结合的杂种泛素结合结构域多肽。实验证明，本发明提供的杂种泛素结合结构域多肽可以提高大规模泛素化蛋白质的富集效率，用于开发高效的泛素化蛋白质分离介质和生化试剂，也可为体内蛋白质泛素化的调节提供技术手段，推动人类疾病样本泛素化蛋白质组学研究和健康医学的发展。
附图说明
图1为实施例1中SDS-PAGE检测纯化的GST-泛素结合结构域融合蛋白。其中，GST-A20为34.53kDa；GST-DSK2为31.9kDa；GST-HDAC6为45.4kDa；GST-UQ1为31.9kDa；GST-UQ2为32.27kDa；GST-DSK2-A20为40kDa；GST-DSK2-UQ2为38.86kDa。
图2为实施例1中Western blot定量比较不同泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性。其中，A为Western blot结果图；B为对A的统计结果。A和B中，onput表示投入的总蛋白；Ni-denature表示镍柱纯化的样品对照。
图3为实施例2中SDS-PAGE检测纯化的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白。其中，GST-4A20为58.5kDa；GST-4DSK2为48kDa；GST-4UQ2为49.5kDa；GST-4(DSK2-A20)为81.4kDa；GST-4(DSK2-UQ2)为76kDa。
图4为实施例2中Western blot定量比较不同的串联泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性。其中，A为Western blot结果图；B为对A的统计结果。A和B中，Ni-denature表示镍柱纯化的样品对照。
图5为实施例3中SDS-PAGE检测纯化的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白。其中，GST-(DSK2-A20)为40kDa；GST-2(DSK2-A20)为53.8kDa；GST-4(DSK2-A20)为81.4kDa。
图6为实施例3中Western blot定量比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性。其中，A为Western blot结果图；B为对A的统计结果。
图7为实施例4中利用筛选到的杂种泛素结合结构域多肽(GST-2(DSK2-A20))纯化酵母细胞中的泛素化蛋白质。其中，A为SDS-PAGE结果图；B为Western blot结果图。
图8为实施例4中本发明提供的泛素化蛋白质富集分离方法和已发表文章的酵母细胞泛素化蛋白质鉴定的维恩图。
图9为实施例5中利用筛选到的杂种泛素结合结构域多肽(GST-2(DSK2-A20))纯化哺乳动物细胞中的泛素化蛋白质。其中，A为SDS-PAGE结果图；B为Western blot结果图。
图10为实施例5中本发明提供的泛素化蛋白质富集分离方法和已发表文章利用K-GG抗体富集的哺乳动物细胞泛素化蛋白质的维恩图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、定量比较不同的泛素结合结构域与泛素的亲和特性。
一、表达和纯化泛素结合结构域多肽
1、重组表达载体的构建
利用PCR方法分别对含有不同泛素结合结构域的DNA片段进行扩增，并将其克隆到含有GST标签蛋白的pGEX-4T-2表达载体(GE生命科学)上。克隆的泛素结合结构域与GST标签蛋白融合表达，得到GST-泛素结合结构域融合蛋白。另外，还构建了杂种的泛素结合结构域：利用融合PCR技术将两个不同的泛素结合结构域编码序列通过连接序列进行连接，即为杂种泛素结合结构域，并将其克隆到含有GST标签蛋白的pGEX-4T-2表达载体上。本实施例中涉及到的泛素结合结构域相关信息见表1。
表1本实施例涉及的泛素结合结构域
| 名称 | 来源 | 分类 |
| DSK2 | 酵母的DSK2p蛋白 | UBA |
| UQ1 | 人类的UBQLN1蛋白 | UBA |
| UQ2 | 人类的UBQLN2蛋白 | UBA |
| A20 | 人类的RABGEF1蛋白 | ZnF-A20 |
| HDAC6 | 小鼠HDAC6蛋白 | ZnF-UBP |
| DSK2-UQ2 | 本发明 | - |
| DSK2-A20 | 本发明 | - |
以重组质粒pGEX-4T-2-DSK2的制备为例：
(1)设计用于扩增DSK2泛素结合结构域的编码基因(序列3的第709-843位)的引物，并在其两端分别加上BglII和EcoRI酶切位点。
(2)以序列3的第709-843位所示DNA为模板，采用步骤(1)的引物通过PCR的方法克隆得到DSK2泛素结合结构域的编码序列，用限制性内切酶BglII和EcoRI进行酶切。
(3)用限制性内切酶BglII和EcoRI酶切pGEX-4T-2载体，得到载体骨架大片段。
(4)将步骤(2)的酶切产物与步骤(3)的载体骨架大片段进行连接，得到重组质粒pGEX-4T-2-DSK2。经测序表明，重组质粒pGEX-4T-2-DSK2为在骨架载体pGEX-4T-2的BglII和EcoRI位点间插入了“序列3的第709-843位+TAA”所示DNA片段后得到的重组质粒。序列3的第709-843位编码序列表中序列1的第237-281位所示的蛋白(DSK2泛素结合结构域)。
本实施例所涉及到的多种泛素结合结构域，均用同DSK2类似的方法克隆到pGEX-4T-2载体上，得到相应的重组质粒。各泛素结合结构域的具体编码序列如下：UQ1泛素结合结构域(Gene ID：29979的第1791-1928位)、UQ2泛素结合结构域(序列4的第859-1008位)、A20泛素结合结构域(序列3的第859-1053位)、HDAC6泛素结合结构域(Gene ID：15185的第3107-3613位)、DSK2-UQ2杂种泛素结合结构域(序列4的第709-1008位，编码序列2的第237-336位所示的DSK2-UQ2蛋白)、DSK2-A20杂种泛素结合结构域(序列3的第709-1053位，编码序列1的第237-351位所示的DSK2-A20蛋白)。
经测序，以上所得各重组质粒均是在骨架载体pGEX-4T-2的BglII和EcoRI位点之间插入“各自泛素结合结构域的编码序列+TAA”后得到的重组质粒。并且，依据所携带的泛素结合结构域的编码序列的不同，将各重组质粒分别命名为pGEX-4T-2-UQ1、pGEX-4T-2-UQ2、pGEX-4T-2-A20、pGEX-4T-2-HDAC6、pGEX-4T-2-DSK2-UQ2、pGEX-4T-2-DSK2-A20。在各重组质粒中，外源插入基因均位于载体自身携带的GST标签的下游，与其形成融合基因，编码相应的融合蛋白(GST标签的基因序列如序列3的第1-693位，编码序列1的第1-231位所示的GST蛋白)。
2、GST融合蛋白的表达与纯化
将步骤1构建的含有GST-泛素结合结构域的各表达载体分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)(北京康为世纪生物科技有限公司产品，其产品目录号为CW0808A)中。转化后的细菌在37℃用LB培养基培养到A600(600nm处的吸光值)为0.4-0.6的密度时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，并在30℃诱导融合蛋白表达4小时。融合蛋白表达后的细菌用离心机在6000rpm，4℃离心5分钟收集细胞。
收集的细菌细胞重悬于裂解液(配方：1×PBS，pH7.4，蛋白酶体抑制剂，1mM DTT，1mM EDTA，体积分数1％Triton X-100)中。每500毫升的细菌细胞用10毫升裂解液重悬。超声破碎仪超声裂解细胞(工作2秒，静置4秒，总共超声30分钟，功率为30％)。总蛋白裂解液在4℃，15000rpm离心10分钟，将上清液转移到新管中。在上清液中加入谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒(200微升，QIAGEN公司产品，其产品目录号为30900)，在4℃滚动孵育60分钟。琼脂糖凝胶颗粒用洗涤液(配方：1×PBS，pH7.4，1mM DTT，1mM EDTA)清洗3次，每次10毫升。得到结合在琼脂糖凝胶颗粒上的GST-泛素结合结构域融合蛋白。取少量的琼脂糖凝胶颗粒，加入1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液(SDS-PAGE电泳样品缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：20g/L SDS，体积分数1％β-巯基乙醇，体积分数10％甘油，体积分数0.1％考马斯亮蓝，0.05M Tris-HCl，pH6.8)，100℃，煮5分钟，将结合在琼脂糖凝胶颗粒上的GST-泛素结合结构域融合蛋白解离下来，经10％SDS-PAGE电泳分离后，考马斯亮蓝染色，检测纯化的GST-泛素结合结构域融合蛋白的纯度和浓度。
结果如图1所示，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒，成功的纯化到条带单一、与理论大小一致的融合蛋白，并且不同的GST-泛素结合结构域融合蛋白以相似的浓度偶联在谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒上。
二、利用Western Blot技术比较不同的泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性
取步骤一中获得的偶联在谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒上的GST-泛素结合结构域融合蛋白作为亲和介质，从相同量的酵母细胞中富集泛素化蛋白质，比较不同的GST-泛素结合结构域融合蛋白与泛素分子的结合能力。同时以变性条件下镍柱纯化作为对照(具体参考文章PengJ,Schwartz D,Elias J E,et al.A proteomics approach to understanding protein ubiquitination[J].Nature biotechnology,2003,21(8):921-926中记载的方法)。
具体操作如下：
A、酵母细胞总蛋白裂解液的制备
在收集的酵母菌株SUB592(含有His-myc-Ub，酵母菌株SUB592记载于“Finley D,et al.Inhibition of proteolysis and cell cycle progression in a multiubiquitination-deficient yeast mutant.Mol Cell Biol,1994,14:5501-5509.”一文中，公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所获得)细胞中加入预冷的细胞裂解缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.1％(质量体积比)SDS，体积分数1％Triton X-100，体积分数10％甘油，2mMβ-巯基乙醇，5mM IAA，pH8.0)，重悬细胞后，加入适量的玻璃珠，利用多功能细胞破碎仪裂解细胞(6000rpm，20秒，工作1分钟，冰浴1分钟，共裂解10次)。裂解后的细胞裂解液在4℃，15000rpm，离心10分钟，以清除细胞残渣，上清液即为得到的酵母细胞总蛋白裂解液。
B、琼脂糖凝胶颗粒的准备
取相同体积的偶联有GST-泛素结合结构域融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒，用细胞裂解缓冲液(配方同上)洗3次，每次1毫升。
C、利用GST-泛素结合结构域融合蛋白纯化酵母细胞中的泛素化蛋白质
取相同体积的步骤A获得的酵母细胞总蛋白裂解液与步骤一获得的几种不同的偶联有GST-泛素结合结构域融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒混合，4℃旋转孵育30分钟。将混合液装到Poly-prep层析空柱(Bio-RAD公司产品，其产品目录号为731-1550)上，利用重力作用沉淀琼脂糖凝胶颗粒，并用洗涤缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mMNaH2PO4，500mM NaCl，体积分数0.5％Triton X-100，体积分数10％甘油，2mMβ-巯基乙醇，5mM IAA，pH8.0)清洗三次，1×SDS-PAGE电泳样品缓冲液(配方同上)重悬琼脂糖凝胶颗粒，100℃，煮5分钟，将结合在琼脂糖凝胶颗粒上的泛素化蛋白质解离下来，即为酵母细胞泛素化蛋白质。
D、Western Blot比较不同泛素结合结构域与泛素分子的亲和能力
取少量步骤C富集的酵母细胞泛素化蛋白质(每个样品取相同的体积，包括利用不同泛素结合结构域和镍柱纯化的样品)，经10％SDS-PAGE电泳分离后，转移到NC膜上用myc抗体(一抗，鼠源，invitrogen公司产品，其产品目录号为AHO0052)和羊抗鼠IgG抗体(二抗，invitrogen公司产品，其产品目录号为626620)检测泛素化信号。
结果如图2中A所示，可见不同的GST-泛素结合结构域融合蛋白与泛素分子的结合能力存在明显差异。其中酵母DSK2蛋白的UBA结构域(简称为DSK2)和人类ubiquilin2蛋白的UBA结构域(简称为UQ2)及人类RAB guanine nucleotide exchange factor(GEF)1(RABGEF1)蛋白的ZnF-A20结构域(简称为A20)与泛素分子的结合能力明显高于其他的泛素结合结构域，同时也高于镍柱变性条件下的纯化能力。而人工构建的杂种泛素结合结构域结合泛素分子的能力较天然存在的泛素结合结构域均有明显提高，说明杂种泛素结合结构域由于组合了不同泛素结合结构域，会累加各自泛素结合结构域与泛素的亲和力，与泛素的结合能力有明显提高。图2中B是根据Western Blot结果的灰度值，定量比较不同泛素结合结构域与泛素分子的结合能力，筛选出与泛素分子具有高亲和力的泛素结合结构域，即为天然存在的DSK2、UQ2和A20结构域，及杂种泛素结合结构域DSK2-A20和DSK2-UQ2，特别是杂种泛素结合结构域DSK2-A20和DSK2-UQ2与其他的泛素结合结构域相比，对泛素分子的亲和力显著提高(P<0.05)。
三、利用SILAC-AQUA技术定量比较不同泛素结合结构域与不同泛素链的亲和能力
A、内标样品的制备
内标样品制备方法参考文献Xu P,Duong D M,Seyfried N T,et al.Quantitative proteomicsreveals the function of unconventional ubiquitin chains in proteasomal degradation[J].Cell,2009,137(1):133-145中记载的方法。简单来说，用含有重稳定性同位素标记的氨基酸(赖氨酸)的SC培养基培养酵母菌株SUB592，30℃，220rpm培养到对数生长期(OD600＝1.5)收集细胞。参考Peng等(Peng J,Schwartz D,Elias J E,et al.A proteomics approach to understandingprotein ubiquitination[J].Nature biotechnology,2003,21(8):921-926.)的方法用镍柱在变性条件下富集重标培养的酵母细胞中的泛素化蛋白质。
B、SILAC-AQUA待检测样品的制备
将步骤A中获得的重标的酵母细胞泛素化蛋白质样品与步骤二中C中利用不同的泛素结合结构域或镍柱富集的正常的酵母细胞泛素化蛋白质样品分别以1:1的体积比进行混合。得到的混合样品经SDS-PAGE电泳，待样品进入浓缩胶0.5-1cm后停止电泳。切胶，将胶条切为1mm3的颗粒，50mM碳酸氢铵和30％(体积分数)乙腈混合液对胶粒进行脱色，以100％乙腈进行脱水干燥后以12ng/μL的胰蛋白酶(trypsin)于37℃进行消化。消化13小时后加入5％(体积分数)甲酸和50％(体积分数)乙腈的混合液终止消化，13300rpm离心后收集上清，加入60μL乙腈，涡旋20分钟，13300rpm离心1分钟后收集上清，再次加入乙腈60μL，重复涡旋离心操作，直至凝胶颗粒中液体抽干，胶粒完全变硬。将得到的肽段溶液在真空干燥仪器中完全蒸干。
C、色谱-质谱联用分析纯化的泛素化蛋白质样品中泛素链的组成
将步骤B中获得的蒸干的肽段样品用10μL的5％(体积分数)乙腈和1％(体积分数)甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析，利用选择反应检测扫描(SRM)方法检测样品中不同泛素链的信号强度。具体参考文献Xu P,Duong D M,Seyfried N T,et al.Quantitative proteomics reveals the function of unconventional ubiquitin chainsin proteasomal degradation[J].Cell,2009,137(1):133-145中记载的方法。
D、数据分析
利用质谱高灵敏度、高特异性的目标导向蛋白质选择性反应检测技术(selected reactionmonitoring,SRM)，结合SILAC-AUQA定量策略，对不同的泛素结合结构域富集的泛素化蛋白质中的代表7种泛素链(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)的特征性肽段进行监测，以评估不同的泛素结合结构域富集泛素化蛋白的能力。以镍柱变性条件下纯化的酵母重标泛素化蛋白为定量内标，对不同样品中7种泛素链特异肽段的信号强度进行定量归一化(即用轻标肽段信号强度/重标肽段信号强度)，具体参考文献Ping Xu,Dongmei Cheng,Duong D M,et al.A Proteomic Strategy for Quantifying Polyubiquitin Chain Topologies[J].Israel Journal ofChemistry,2006,46,171-182中记录的方法。
结果见表2。从表2中可以看出，不同的泛素结合结构域对不同泛素链的亲和能力存在明显的偏性。A20结构域倾向于结合K11泛素链，而UQ1结构域更倾向于结合K11和K63泛素链。而人工构建的杂种泛素结合结构域DSK2-A20对7种泛素链均有较好的结合能力。说明杂种泛素结合结构域由于组合了不同泛素结合结构域，不仅会累加各自泛素结合结构域与泛素的亲和力，而且使杂种泛素结合结构域具有了两个泛素的结合面，减少了对不同泛素链的结合偏性，提高了对泛素化蛋白质的纯化效率。
表2SILAC-AQUA技术定量比较不同泛素结合结构域与7种泛素链的亲和特性
通过实施例1，本发明的发明人定量比较了不同的泛素结合结构域与泛素分子和不同泛素链的结合能力，筛选到人工构建的杂种泛素结合结构域能够高效、无偏性地与泛素结合，为泛素化蛋白质的富集纯化提供了有效的工具。
实施例2、定量比较不同的串联生成的泛素结合结构域与泛素的亲和特性
一、表达和纯化串联泛素结合结构域多肽
1、重组表达载体的构建
本实施例所涉及的串联泛素结合结构域有如下五种：4UQ2、4DSK2、4A20、4(DSK2-A20)和4(DSK2-UQ2)。各杂种泛素结合结构域，均用同实施例1步骤一1中DSK2类似的方法克隆到pGEX-4T-2载体上，得到相应的重组质粒。各泛素结合结构域的具体编码序列如下：4UQ2泛素结合结构域(序列4的第859-1008位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列4的第859-1008位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列4的第859-1008位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列4的第859-1008位)、4DSK2泛素结合结构域(序列3的第709-843位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第709-843位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第709-843位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第709-843位)、4A20泛素结合结构域(序列3的第859-1053位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第859-1053位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第859-1053位+GGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGT+序列3的第859-1053位)、4(DSK2-A20)杂种泛素结合结构域(序列3的第709-2133位，编码序列1的第237-711位所示的4(DSK2-A20)蛋白)、4(DSK2-UQ2)杂种泛素结合结构域(序列4的第709-1953位，编码序列2的第237-651位所示的4(DSK2-A20)蛋白)。
经测序，以上所得各重组质粒均是在骨架载体pGEX-4T-2的BglII和EcoRI位点之间插入“各自串联泛素结合结构域的编码序列+TAA”后得到的重组质粒。并且，依据所携带的泛素结合结构域的编码序列的不同，将各重组质粒分别命名为pGEX-4T-2-4UQ2、pGEX-4T-2-4DSK2、pGEX-4T-2-4A20、pGEX-4T-2-4(DSK2-A20)、pGEX-4T-2-4(DSK2-UQ2)。在各重组质粒中，外源插入基因均位于载体自身携带的GST标签的下游，与其形成融合基因，编码相应的融合蛋白(GST标签的基因序列如序列3的第1-693位，编码序列1的第1-231位所示的GST蛋白)。
2、GST融合蛋白的表达与纯化
参照实施例1步骤一2进行。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒纯化融合蛋白时，由于融合蛋白分子量偏大，形成的空间结构会影响GST与GSH的结合，偶联到谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒的融合蛋白的量明显减少。因此，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒纯化融合蛋白时，最终加入洗脱液(配方：50mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl，20mM还原型GSH，体积分数0.1％Triton X-100，1mM DTT)，4℃孵育30min，将融合蛋白从谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒上洗脱下来。取少量样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，考马斯亮蓝染色确定纯化的融合蛋白的纯度及浓度。
结果如图3所示，可见经过以上纯化到了纯度较高，与理论大小一致的如下融合蛋白：GST-4UQ2，GST-4DSK2，GST-4A20，GST-4(DSK2-A20)(序列3)和GST-4(DSK2-UQ2)(序列4)。
将纯化的融合蛋白经透析或超滤管处理，置换到新的蛋白缓冲液(配方：0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)中。一定量的NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒(GE公司产品，其产品目录号为17-0906-01)分别用1mM HCl洗2次，新的蛋白缓冲液(配方同上)洗3次，每次1毫升。将处理后的NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒与GST-串联泛素结合结构域融合蛋白按照体积比1:2的比例混合，4℃滚动反应过夜。通过氨基-羧基反应将GST-串联泛素结合结构域融合蛋白偶联到NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上。得到的琼脂糖凝胶颗粒重悬于1×PBS和30％(体积分数)甘油混合液中，-20℃保存待用。
二、利用Western Blot技术比较不同的泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性
取步骤一获得的偶联在NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白作为亲和介质，从相同量的酵母细胞中富集泛素化蛋白质，比较不同的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白与泛素分子的结合能力。
具体操作如下：
A、酵母细胞总蛋白裂解液的制备
同实施例1步骤二A所述。
B、琼脂糖凝胶颗粒的准备
为了定量比较不同的串联泛素结合结构域多肽纯化泛素化蛋白的能力，本发明的发明人利用SILAC-AQUA技术定量偶联到NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白的摩尔数，使起始材料量一致。
具体操作如下：取少量偶联有GST-串联泛素结合结构域融合蛋白的NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒，进行on-beads的消化：首先用10M尿素重悬琼脂糖凝胶颗粒，变性底物蛋白。然后加入酶解反应液(配方：NH4HCO3 50mM；乙腈5％(体积分数)；Lys-C(丝氨酸蛋白酶，Wako公司产品，其产品目录号为121-05063)8ng/μL；稀释尿素使其终浓度为2M)，37℃消化。消化13小时后加入甲酸使其终浓度为4％(体积分数)，终止反应。利用C18脱盐柱(Emproe公司产品，其产品目录号为EM-2315)进行脱盐处理(具体参考文献Zhai L,ChangC,Li N,et al.Systematic research on the pretreatment of peptides for quantitative proteomics usinga C18microcolumn[J].Proteomics,2013,13(15):2229-2237中记载的方法)。脱盐后的样品在真空干燥仪器中完全蒸干。
内标样品的制备：利用含有重稳定性同位素标记的赖氨酸(K+6)的培养基培养含有pGEX-4T-2空载体的大肠杆菌BL21(DE3)(具体参考文献Ping L,Zhang H,Zhai L,et al.Quantitative proteomics reveals significant changes in cell shape and an energy shift after IPTGinduction via an optimized SILAC approach for Escherichia coli[J].Journal of proteome research,2013,12(12):5978-5988的中记载的方法)。然后利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒纯化其中的GST蛋白，得到的重标GST蛋白利用BCA定量试剂盒(Thermo Scientific)定量。取已知量的重标GST蛋白以8ng/μL的丝氨酸蛋白酶(Lys-C)于37℃进行溶液消化，消化13小时后加入甲酸使其终浓度为4％(体积分数)，终止反应。利用C18脱盐柱进行脱盐处理(具体方法如上所述)。脱盐后的样品在真空干燥仪器中完全蒸干。
色谱-质谱联用技术确定偶联在NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白的量：将上述蒸干的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白的肽段样品与已知浓度的重标GST肽段以一定的比例混合，进行LC-MS/MS质谱分析。选择相同的肽段，根据重标肽段与轻标肽段的信号强度比值，计算出轻标GST蛋白的量，即为GST-串联泛素结合结构域融合蛋白的量(具体参考文献Ping L,Zhang H,Zhai L,et al.Quantitative proteomics revealssignificant changes in cell shape and an energy shift after IPTG induction via an optimized SILACapproach for Escherichia coli[J].Journal of proteome research,2013,12(12):5978-5988的中记载的方法)。
取等摩尔量的融合蛋白，用细胞裂解缓冲液(见上文)洗3次，每次1毫升。
C、利用GST-串联泛素结合结构域融合蛋白纯化酵母细胞中的泛素化蛋白质
同实施例1步骤二C所述。
D、Western Blot比较不同泛素结合结构域与泛素分子的亲和能力
同实施例1步骤二D所述。
结果如图4所示，可见不同的GST-串联泛素结合结构域融合蛋白与泛素分子的结合能力存在明显差异。其中串联杂种泛素结合结构域(GST-4(DSK2-A20)和GST-4(DSK2-UQ2))与泛素的结合能力明显增强(P<0.05)，体现了杂种泛素结合结构域与泛素结合的高亲和力。
三、利用SILAC-AQUA技术定量比较不同串联泛素结合结构域与不同泛素链的亲和能力
A、内标样品的制备
同实施例1步骤三A所述。
B、SILAC-AQUA待检测样品的制备
同实施例1步骤三B所述。
C、色谱-质谱联用分析纯化的泛素化蛋白质样品中泛素链的组成
同实施例1步骤三C所述。
D、数据分析
同实施例1步骤三D所述。
结果见表3，可见以镍柱纯化的泛素链为对照，不同的泛素结合结构域对不同泛素链的亲和能力存在明显的偏性。而串联杂种泛素结合结构域GST-4(DSK2-A20)对七种泛素链均有较高的结合能力，进一步体现了杂种泛素结合结构域与各种泛素链的高亲和力。
表3SILAC-AQUA技术定量比较不同的串联泛素结合结构域与七种泛素链的亲和特性
通过实施例2，本发明的发明人定量比较了不同的串联泛素结合结构域与泛素分子和不同泛素链的结合能力，筛选到串联杂种泛素结合结构域GST-4(DSK2-A20)能够高效、无偏性地与泛素结合，为泛素化蛋白质的富集纯化提供了有效工具。
实施例3、比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素的亲和特性
为了进一步筛选到更加高效地泛素化蛋白质富集纯化材料，本发明的发明人比较了不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素链的亲和能力。
一、表达和纯化不同串联个数的杂种泛素结合结构域多肽
1、重组表达载体的构建
本实施例所涉及的串联泛素结合结构域有如下三种：DSK2-A20、2(DSK2-A20)和4(DSK2-A20)。各杂种泛素结合结构域，均用同实施例1步骤一1中DSK2类似的方法克隆到pGEX-4T-2载体上，得到相应的重组质粒。各泛素结合结构域的具体编码基因序列如下：DSK2-A20泛素结合结构域(序列3的第709-1053位)；2(DSK2-A20)泛素结合结构域(序列3的第709-1413位)；4(DSK2-A20)泛素结合结构域(序列3的第709-2133位)。
经测序，以上所得各重组质粒均是在骨架载体pGEX-4T-2的BglII和EcoRI位点之间插入“各自串联泛素结合结构域的编码序列+TAA”后得到的重组质粒。并且，依据所携带的泛素结合结构域的编码序列的不同，将各重组质粒分别命名为pGEX-4T-2-DSK2-A20、pGEX-4T-2-2(DSK2-A20)、pGEX-4T-2-4(DSK2-A20)。在各重组质粒中，外源插入基因均位于载体自身携带的GST标签的下游，与其形成融合基因，编码相应的融合蛋白(GST标签的基因序列如序列3的第1-693位，编码序列1的第1-231位所示的GST蛋白)。
2、GST融合蛋白的表达与纯化
参照实施例1步骤一2进行。由于GST-四串联泛素结合结构域融合蛋白较大，在大肠杆菌中诱导表达时表达水平偏低，为了提高目的蛋白的表达水平，优化诱导条件：将诱导温度降低，改为25℃诱导表达6小时。
融合蛋白的纯化及固定如实施例2步骤一所述。图5为SDS-PAGE检测纯化得到的融合蛋白，可见经过以上纯化到了纯度较高，与理论大小一致的如下融合蛋白：GST-(DSK2-A20)、GST-2(DSK2-A20)和GST-4(DSK2-A20)。最终将纯化的融合蛋白偶联到NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上。
二、利用Western Blot技术比较不同个数的杂种泛素结合结构域与泛素分子的亲和特性
取步骤一中的偶联在NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上的融合蛋白作为亲和介质，从相同量的酵母细胞中富集泛素化蛋白质，比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素分子的结合能力。
具体操作如下：
A、酵母细胞总蛋白裂解液的制备
同实施例2步骤二A所述。
B、琼脂糖凝胶颗粒的准备
同实施例2步骤二B所述。
C、利用不同串联个数的杂种泛素结合结构域纯化酵母细胞中的泛素化蛋白质
同实施例2步骤二C所述。
D、Western Blot比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素链分子的亲和能力
同实施例2步骤二D所述。
结果见图6，可见GST-2(DSK2-A20)与泛素分子的结合能力最强，GST-4(DSK2-A20)与泛素分子的结合能力次之，两者均显著高于(P<0.05)与泛素分子的结合能力最弱的GST-(DSK2-A20)。说明杂种泛素结合结构域与泛素分子的结合能力并没有随着串联个数的增加呈现递增趋势。杂种泛素结合结构域的串联个数为2时，其与泛素分子的结合能力已达到饱和。
三、利用SILAC-AQUA技术定量比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与不同泛素链的亲和能力
A、内标样品的制备
同实施例2步骤三A所述。
B、SILAC-AQUA待检测样品的制备
同实施例2步骤三B所述。
C、色谱-质谱联用分析纯化的泛素化蛋白质样品中泛素链的组成。
同实施例2步骤三C所述。
D、数据分析
同实施例2步骤三D所述。
结果见表4，可以看出，以镍柱纯化的泛素链为对照，不同串联个数的杂种泛素结合结构域对不同泛素链的亲和能力均无明显的偏性。进一步体现了利用杂种泛素结合结构域富集纯化泛素化蛋白质的可行性。
表4SILAC-AQUA技术定量比较不同串联个数的杂种泛素结合结构域与七种泛素链的亲和特性
通过实施例3，本发明的发明人定量比较了不同串联个数的杂种泛素结合结构域与泛素分子和不同泛素链的结合能力，筛选到GST-2(DSK2-A20)能够高效、无偏性地与泛素结合，为泛素化蛋白质的富集纯化提供了有效工具。
实施例4、利用筛选到的两个串联的杂种泛素结合结构域多肽纯化酵母细胞的泛素化蛋白质
一、表达和纯化GST-2(DSK2-A20)
同实施例3步骤一所述。将纯化的GST-2(DSK2-A20)融合蛋白偶联在NHS活化的琼脂糖凝胶颗粒上。
二、酵母细胞总蛋白裂解液的制备
同实施例3步骤二A所述。
三、酵母细胞泛素化蛋白质的富集纯化
同实施例3步骤二C所述。
纯化得到的泛素化蛋白质取少量经6％-20％梯度SDS-PAGE电泳分离后，银染检测富集的泛素化蛋白的纯度和富集效率。同时富集的泛素化蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转移到NC膜上用Ub抗体(一抗，兔源，Abcam公司产品，其产品目录号为ab19247)和anti RabbitIgG抗体(二抗，GE公司产品，其产品目录号为NA934)进行western blot验证富集的泛素化蛋白。
结果显示，利用筛选到的杂种泛素结合结构域多肽，成功的从酵母细胞中富集到了泛素化蛋白(图7中A)：与总细胞蛋白质(图7中A中的TCL样品)相比，富集的泛素化蛋白质(图7中A中Elution样品)在带型上出现了明显的变化，具有规律性的分子量跃迁，而且在胶图上大分子量部分形成特征性弥散条带。利用Ub抗体进行western blot检测发现，富集后的样品中有明显的泛素化信号(图7中B)，说明绝大多数蛋白质为泛素化蛋白质，进一步证明了本发明的泛素化蛋白质富集分离材料的有效性及高效性。
四、酵母泛素化蛋白质样品的酶解
通过上述操作富集的泛素化蛋白质经SDS-PAGE电泳分离后，根据分子量分成25个条带进行切胶。胶条切为1mm3的颗粒，50mM碳酸氢铵和30％(体积分数)乙腈混合液对胶粒进行脱色，100％乙腈脱水干燥后以12ng/μL的胰蛋白酶(trypsin)消化12-16小时。消化13小时后加入5％(体积分数)甲酸和50％(体积分数)乙腈的混合液终止消化，13300rpm离心后收集上清，加入60μL乙腈，涡旋20分钟，13300rpm离心1分钟后收集上清，再次加入乙腈60μL，重复涡旋离心操作，直至凝胶颗粒中液体抽干，胶粒完全变硬。将得到的肽段溶液在真空干燥仪器中完全蒸干。
五、色谱-质谱联用分析鉴定酵母细胞泛素化蛋白质
将步骤四获得的蒸干的肽段样品用10μL的5％(体积分数)乙腈和1％(体积分数)甲酸的色谱-质谱联用上样缓冲液进行溶解，取2μL进行色谱-质谱联用分析，具体参考文献Xu,P.；Duong,D.；Peng,J.,Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgunproteomics.J Proteome Res2009,8(8),3944-50中记载的方法。
六、酵母细胞泛素化蛋白质组学鉴定结果
利用本发明的杂种泛素结合结构域多肽富集的酵母细胞泛素化蛋白质经串联质谱分析后，总共鉴定到2790个可能的泛素化蛋白质，744个泛素化位点，对应477个蛋白质。将本研究鉴定的酵母泛素化蛋白质组数据与Peng等(Peng J,Schwartz D,Elias J E,et al.Aproteomics approach to understanding protein ubiquitination[J].Nature biotechnology,2003,21(8):921-926.)在2003年发表的迄今为止最大的酵母泛素化蛋白质组学数据进行比较，发现两个数据集有821个蛋白是共同鉴定的，说明本发明鉴定的泛素化蛋白的可靠性。另外利用本发明涉及的方法还特有鉴定到1969个额外的泛素化蛋白质，比Peng等的方法特有鉴定到的泛素化蛋白质数目多一倍以上(见图8)。说明利用本发明筛选的杂种泛素结合结构域多肽能够富集到更多的泛素化蛋白质，进一步提高鉴定的泛素化蛋白质的数目，推动酵母细胞泛素化蛋白质组学的研究。
实施例5、利用筛选到的两个串联的杂种泛素结合结构域多肽纯化哺乳动物细胞的泛素化蛋白质
一、表达和纯化GST-2(DSK2-A20)
同实施例4步骤一所述。
二、哺乳动物细胞总蛋白裂解液的制备
哺乳动物细胞中加入预冷的细胞裂解缓冲液(配方：50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，体积分数0.1％NP-40，5mM IAA，cocktail蛋白酶抑制剂(Roche公司产品，其产品目录号为05892791001))，重悬细胞后，利用超声破碎仪裂解细胞(工作1秒，冰浴7秒，总工作时间为20分钟，功率30％)。将裂解后的细胞裂解液在4℃，100000g离心15分钟，以清除细胞残渣，上清液用于分离泛素化蛋白质。
三、哺乳动物细胞泛素化蛋白质的富集纯化
哺乳动物细胞裂解液上清和GST-2(DSK2-A20)琼脂糖凝胶颗粒在4℃旋转孵育1小时，混合液体装到纯化柱上，利用重力作用沉淀琼脂糖凝胶颗粒并用洗涤缓冲液A(配方：50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，体积分数0.1％NP-40，5mM IAA)清洗三次，洗涤缓冲液B(配方：50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，体积分数0.1％NP-40)清洗三次以去除其中的IAA，然后用1×SDS-PAGE电泳样品缓冲液重悬琼脂糖凝胶颗粒，100℃，煮5分钟，将结合在琼脂糖凝胶颗粒上的泛素化蛋白解离下来，上清液取少量6％-20％梯度SDS-PAGE电泳分离，银染检测富集的泛素化蛋白的纯度和富集效率。同时富集的泛素化蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，转移到NC膜上用Ub抗体(一抗，兔源，Abcam公司产品，其产品目录号为ab19247)和anti Rabbit IgG抗体(二抗，GE公司产品，其产品目录号为NA934)进行western blot验证富集的泛素化蛋白。
结果显示，利用开发的泛素化蛋白质富集分离材料，成功的从哺乳动物细胞中富集到了泛素化蛋白(图9中A)：与总细胞蛋白质(图9中A中的TCL样品)相比，富集的泛素化蛋白质(图9中A中Elution样品)在带型上出现了明显的变化，具有规律性的分子量跃迁，而且在胶图上大分子量部分形成特征性弥散条带。利用Ub抗体进行western blot检测发现，富集后的样品中有明显的泛素化信号(图9中B)，进一步证明了本发明的杂种泛素结合结构域多肽在哺乳动物细胞及组织样本的泛素化蛋白质组学研究中的重要作用。
四、哺乳动物细胞泛素化蛋白质样品的酶解
同实施例4步骤四所述。通过上述方法富集的哺乳动物细胞泛素化蛋白质经SDS-PAGE电泳分离后，分成17个条带进行切胶。
五、色谱-质谱联用分析鉴定哺乳动物细胞泛素化蛋白质
同实施例4步骤五所述。
六、哺乳动物细胞泛素化蛋白质组学鉴定结果
利用本发明的泛素化蛋白质富集分离材料经单次实验富集的哺乳动物细胞泛素化蛋白质经串联质谱分析后，总共鉴定到3145个可能的泛素化蛋白质，670个泛素化位点，对应445个蛋白质。这是目前为止利用泛素结合结构域获得的最大的哺乳动物细胞泛素化蛋白质数据集。利用本发明的方法经单次实验鉴定的泛素化蛋白质与利用K-GG抗体经多组实验(参见“Kim W,Bennett E J,Huttlin E L,et al.Systematic and quantitative assessment of theubiquitin-modified proteome[J].Molecular cell,2011,44(2):325-340.”和“Wagner S A,Beli P,Weinert B T,et al.A proteome-wide,quantitative survey of in vivo ubiquitylation sites revealswidespread regulatory roles[J].Molecular&Cellular Proteomics,2011,10(10):M111.013284.”)获得的泛素化蛋白质在数量上基本持平(本发明鉴定的泛素化蛋白质数目为3145，两次K-GG抗体富集鉴定的泛素化蛋白质数目分别为4492和4154，见图10)，说明了本发明提供的方法的高效性。与利用K-GG抗体获得的哺乳动物细胞泛素化蛋白质数据集相比，利用本发明的方法鉴定的哺乳动物细胞泛素化蛋白质80％均已被鉴定到(图10)，说明本发明提供的方法鉴定结果的可靠性。
通过实验数据表明，本发明的杂种泛素结合结构域多肽可以高效、无偏性地富集各种样品中的泛素化蛋白质。
Claims (10)
1.杂种泛素结合结构域多肽1，由至少两个泛素结合结构域串联而成；且在组成所述杂种泛素结合结构域多肽1的所有泛素结合结构域中，至少有两个泛素结合结构域是不同的。
2.根据权利要求1所述的杂种泛素结合结构域多肽1，其特征在于：所述杂种泛素结合结构域多肽1为如下(a)或(b)：
(a)由至少两个互不相同的泛素结合结构域串联而成；
(b)由至少两个相同的或彼此不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个互不相同的泛素结合结构域串联而成。
3.根据权利要求1或2所述的杂种泛素结合结构域多肽1，其特征在于：所述泛素结合结构域选自如下：UBA结构域、UIM结构域、PAZ结构域、MIU结构域、CUE结构域、GAT结构域、UBZ结构域、UBC结构域、UEV结构域、UBM结构域、NZF结构域、ZnF-UBP结构域、ZnF-A20结构域、GLUE结构域、Jab1/MPN结构域和PFU结构域；或
所述杂种泛素结合结构域多肽1为如下(a)或(b)或(c)或(d)：
(a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；
(b)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；
n为大于等于2的整数；
(c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；
(d)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；
n为大于等于2的整数。
4.根据权利要求3所述的杂种泛素结合结构域多肽1，其特征在于：所述来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域的氨基酸序列如序列表中序列1的第237-281位所示；和/或
所述来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域的氨基酸序列如序列表中序列1的第290-354位所示；和/或
所述来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域的氨基酸序列如序列表中序列2的第301-350位所示。
5.杂种泛素结合结构域多肽2，为在权利要求1-4中任一所述的杂种泛素结合结构域多肽1上连接标签蛋白后得到的多肽；
所述标签蛋白为能够进行亲和纯化的标签蛋白；
所述标签蛋白具体选自如下：谷胱甘肽-S-转移酶标签、His标签、Flag标签、HA标签、Myc标签、麦芽糖结合蛋白标签、T7标签、纤维素结合域标签、钙调蛋白标签。
6.根据权利要求5所述的杂种泛素结合结构域多肽2，其特征在于：所述标签蛋白为谷胱甘肽-S-转移酶标签；
所述谷胱甘肽-S-转移酶标签的核苷酸序列为序列表中序列1的第1-231位。
7.根据权利要求1-4中任一所述的杂合泛素结合结构域多肽1，或权利要求5或6中所述的杂合泛素结合结构域多肽2，其特征在于：所述杂合泛素结合结构域多肽1的氨基酸序列为如下(a1)-(a5)中任一种；所述杂合泛素结合结构域多肽2的氨基酸序列为如下(b1)-(b5)中任一种：
(a1)序列表中序列1的第237-354位；
(a2)序列表中序列1的第237-480位；
(a3)序列表中序列1的第237-732位；
(a4)序列表中序列2的第237-350位；
(a5)序列表中序列2的第237-716位；
(b1)序列表中序列1的第1-354位；
(b2)序列表中序列1的第1-480位；
(b3)序列表中序列1的第1-732位；
(b4)序列表中序列2的第1-350位；
(b5)序列表中序列2的第1-716位。
8.根据权利要求1-7中任一所述的杂种泛素结合结构域多肽1或所述的杂种泛素结合结构域多肽2的制备方法，包括如下步骤：将所述杂种泛素结合结构域多肽1或所述的杂种泛素结合结构域多肽2的编码基因转化到大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，裂解所述重组大肠杆菌，分离得到所述杂种泛素结合结构域多肽1或所述的杂种泛素结合结构域多肽2。
9.如下任一材料：
(A)含有权利要求1-8中任一所述杂种泛素结合结构域多肽1或所述杂种泛素结合结构域多肽2的编码序列的核苷酸序列；
(B)含有权利要求1-8中任一所述杂种泛素结合结构域多肽1或所述杂种泛素结合结构域多肽2的编码序列，或所述(A)中所述的核苷酸序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
(C)将权利要求1-8中任一所述杂种泛素结合结构域多肽1或所述杂种泛素结合结构域多肽2，固定于固相载体上后，得到的固相吸附剂；
(D)以所述(C)中的所述固相吸附剂为填料的层析柱；
(E)一种用于富集分离泛素化蛋白质的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-8中任一所述的杂种泛素结合结构域多肽1或所述杂种泛素结合结构域多肽2，或所述(A)中所述核苷酸序列，或所述(B)中所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述(C)中所述固相吸附剂，或所述(D)中所述层析柱。
10.权利要求1-8中任一所述的杂种泛素结合结构域多肽1或所述杂种泛素结合结构域多肽2，或权利要求9中的所述核苷酸序列，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或所述固相吸附剂，或所述层析柱，在富集分离泛素化蛋白质中的应用。
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