CN108794581B - 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性d型多肽及其应用 - Google Patents
一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性d型多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种靶向结合淋巴癌细胞的特异性多肽及其应用,属于生物医药领域;所述多肽D‑REVTUZG12的氨基酸序列为:RMLSGHGANPHM;所述多肽D‑REVTUZG12由D型氨基酸组成;本发明通过体外细胞摄取及分布实验证明所述D型逆序结构多肽D‑REVTUZG12对Jeko‑1、P815、Raji、Su‑4四个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性,但对Romas和Granta‑519淋巴癌细胞系及人正常淋巴细胞无靶向结合活性;本发明所涉及的多肽对多个淋巴癌细胞系具有良好的靶向结合活性,在临床上淋巴瘤的诊断和靶向治疗方面上具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性D型多肽及其应用。
背景技术
恶性淋巴瘤是我国最常见的十大肿瘤之一。根据2018年《The Lancet》杂志公布的数据,中国恶性淋巴瘤的发病率约为十万分之五,五年生存率仅为38.3%左右。淋巴瘤是一类起源于淋巴造血系统的单克隆增殖性恶性肿瘤,主要分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类,以非霍奇金淋巴瘤发病率为高。
套细胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma,MCL)是B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的一种亚型,约占非霍奇金淋巴瘤的6%。MCL被认为是兼有惰性和侵袭性的恶性淋巴瘤,通常以淋巴结肿大开始,可扩散到其他组织,如骨髓和肝脏,可累及胃肠道。MCL有特征性染色体易位t(11;14),过表达CD5,CD20抗原,细胞内过度表达周期蛋白Cyclin D1等特征。套细胞淋巴瘤预后差,大多数患者在确诊时已到晚期,且癌细胞具有侵袭性,病情进展迅速,治疗后常迅速出现复发的现象。虽然MCL有不同于其他亚型淋巴瘤的特征,但是临床上仍然主要采取常规化疗CHOP类方案(环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、强的松),MCL患者治疗后5年生存率低于30%。近年来研发成功的靶向类药物,如利妥昔单抗,及造血干细胞移植技术,在一定程度上改善了肿瘤治疗的预后,但在临床应用过程中,也存在诸如治疗费用昂贵、禁忌症多等实际问题。因此迫切需要开发新的诊疗技术,提高对MCL患者的治疗效果,降低疾病复发率,改善患者预后。
与传统化学合成药物相比,蛋白质和多肽药物具有作用机制明确,使用剂量少,毒副作用小等优势,但是此类药物因其体内半衰期短,需要多次反复给药,从而导致患者顺从性差,难以推广应用。蛋白质药物易在体内被蛋白酶降解是其半衰期短的主要原因之一。目前延长蛋白质药物半衰期的主要策略有两种方法:一是不影响药物药理活性情况下,改变蛋白药物的结构,从而减缓代谢速率;二是开发新的剂型,改变给药途径,以延缓药物在体内的释放过程。
由于生物体内缺乏降解D型多肽的蛋白水解酶,因此D型多肽较L型多肽具有更好的生物稳定性。近年来研究发现D型逆序多肽和L型顺序多肽除了氨基酸的手性方向不同外,其侧链具有相似的结构,从而表现出相似的生物活性。
本发明以体外噬菌体展示筛选所得的对多个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性的多肽TUZG12的氨基酸序列为基础,根据逆序翻转D构型理论设计了一条D型的多肽D-REVTUZG12,然后在多个淋巴癌细胞系中验证所述D型逆序多肽对多个淋巴瘤细胞的靶向结合活性,所述D型多肽可能为临床上淋巴瘤的诊断和靶向治疗提供新的选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种能靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽,所述多肽为D型的多肽D-REVTUZG12,其氨基酸序列为RMLSGHGANPHM(SEQ.ID.NO.1)。
其中所述的多肽是由D型氨基酸组成的。
其中所述的淋巴癌细胞系包括但不限于Jeko-1、P815、Raji、Su-4细胞,优选的为Jeko-1淋巴癌细胞系。
本发明以体外噬菌体展示筛选所得的对多个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性的多肽TUZG12的氨基酸序列为基础,设计了一条D型逆序的多肽D-REVTUZG12,其氨基酸序列为RMLSGHGANPHM(SEQ.ID.NO.1);对照组随意序列多肽的D型逆序列多肽D-REVRandom的氨基酸序列为QTLAGQMPVYSV(SEQ.ID.NO.2),组成多肽D-REVTUZG12和D-REVRandom的氨基酸为D型氨基酸,在多肽D-REVTUZG12、对照多肽D-REVTUZG12的N端修饰FITC荧光分子用于定位并进行细胞的摄取和分布实验,结果表明多肽D-REVTUZG12对淋巴癌细胞系Jeko-1、P815、Raji和Su-4具有良好的结合能力,但与另外两种淋巴癌细胞系Romas和Granta-519及人正常淋巴细胞无结合活性,证明多肽D-REVTUZG12与靶细胞具有较好的特异性和选择性。
进一步的,本发明还提供所述多肽特异性结合淋巴癌细胞系的应用,更进一步的,所述多肽用于在制备靶向治疗淋巴癌药物中的应用。
本发明还提供一种靶向治疗淋巴癌的药物,所述药物包括所述的多肽。
本发明的有益效果是:
以体外噬菌体展示筛选所得的对多个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性的多肽TUZG12的氨基酸序列为基础设计得到的D型逆序结构多肽D-REVTUZG12对Jeko-1、P815、Raji和Su-4四个淋巴癌细胞系有良好的特异性结合能力,对临床上淋巴瘤的诊断和靶向治疗具有重要的意义和价值。
附图说明
图1为多肽TUZG12-FITC结构示意图。
图2为经过四轮淘选后的单克隆噬菌体PCR扩增后的2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
图3为单克隆噬菌体测序统计结果;图3左图为DNA测序后翻译为氨基酸序列结果;图3右图为各多肽序列分布情况。
图4为多肽TUZG12和多肽Random分别作用于Jeko-1淋巴瘤细胞系和人正常淋巴细胞后进行细胞免疫荧光实验的结果;图4A为荧光多肽和淋巴瘤细胞系Jeko-1结合结果;图4B为荧光多肽与人正常淋巴细胞结合结果;图中标尺大小均为1mm。
图5为多肽TUZG12和多肽Random分别作用于不同亚型淋巴瘤细胞系后进行细胞免疫荧光实验的结果;图5A为荧光多肽和Romas淋巴癌细胞系结合情况;图5B为荧光多肽与P815小鼠肥大细胞癌细胞结合情况;图5C为荧光多肽和Su-4淋巴瘤细胞系结合情况;图5D为荧光多肽和Granta-519淋巴瘤细胞系结合情况;图5E为荧光多肽和Raji淋巴瘤细胞系结合情况;图中标尺大小均为1mm。
图6为多肽D-REVTUZG12、多肽D-REVRandom和多肽TUZG12作用于Jeko-1淋巴瘤细胞系后进行细胞免疫荧光实验的结果;图中标尺大小均为100μm。
图7为多肽D-REVTUZG12和多肽D-REVRandom不同亚型淋巴瘤细胞系后进行细胞免疫荧光实验的结果;图7A为D型多肽和P815小鼠肥大细胞癌细胞结合情况;图7B为D型多肽与Raji淋巴瘤细胞系结合情况;图7C为D型多肽与Su-4淋巴瘤细胞系结合情况;图7D为D型多肽和Romas淋巴瘤细胞系结合情况;图7E为D型多肽与Granta-519淋巴瘤细胞系结合情况;图中标尺大小均为1mm。
具体实施方式
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及材料均为常规市售。
实施例1:Jeko-1淋巴瘤细胞系的培养、噬菌体滴度测定、噬菌体展示淘选
A.Jeko-1淋巴瘤细胞系的培养:
Jeko-1淋巴瘤细胞系(ATCC,美国模式培养物保藏所)置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养,1640培养基中加入10%小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。
B.噬菌体滴度测定:
(1)-80℃取ER2738甘油菌(NEB公司),在LB-Tet平板划线,37℃倒置培养12h-16h。
(2)用无菌枪头挑取ER2738单菌落于5-10mL LB-Tet培养基中,37℃、220rpm摇床培养至对数中期(OD600=0.5)。
(3)微波炉加热融化Top agar,分成3mL等份于无菌离心管中,45℃保温备用。
(4)37℃预温LB/IPTG/Xgal平板。
(5)用LB-Tet梯度稀释M13噬菌体(NEB公司)样品,每个梯度更换枪头。
(6)当菌体培养物达对数中期,分装成200μL每管。
(7)每管加入10μL不同稀释度的噬菌体样品,快速吹打混匀,室温温育5min。
(8)将感染噬菌体的细菌加入45℃预热的Top agar中,快速混匀,均匀倒在LB/IPTG/Xgal平板上。
(9)待Top agar冷却凝固后,倒置于37℃培养箱培养12h-16h。
(10)从37℃培养箱取出平板,数蓝斑计数,根据稀释梯度计算噬菌体样品的滴度。
C.噬菌体展示淘选:
第一轮淘选:
(1)-80℃取ER2738甘油菌,在LB-Tet平板划线,37℃倒置培养12h-16h。
(2)取20mL LB-Tet培养基于250mL无菌锥形瓶中,用无菌枪头接种ER2738单菌落,37℃、220rpm摇床培养至对数前期。
(3)用血球计数板对Jeko-1计数,取1×106个细胞重悬于1640培养基中。
(4)加入10μL随机十二肽噬菌体展示文库(NEB公司,货号#E8111L),4℃旋转孵育60min。
(5)4℃、500g、5min离心沉淀细胞,弃上清。
(6)1mL TBS重悬细胞,取10μL按照步骤B中“噬菌体滴度测定方法”做滴度测定,剩余990μL加入到步骤(2)中培养的20mL ER2738菌液中扩增,37℃220rpm摇床培养4.5h。
(7)取菌液转移到无菌离心管中,4℃10000rpm离心10min。弃沉淀,上清液转入另一无菌离心管中,再次4℃10000rpm离心10min。
(8)取上清液的上部80%转移到新的无菌离心管中,按照体积比1:6加入PEG/NaCl溶液,4℃过夜沉淀。
(9)4℃12000g离心沉淀15min。除去上清液,再离心1min,吸去残留上清。
(10)沉淀物重悬于1mL TBS中,悬液转入离心管中,4℃12000g离心5min使残余细胞沉淀。
(11)上清转入另一离心管中,用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀,冰上孵育15-60min。
(12)4℃12000g离心10min,弃上清,再离心1min,用微量移液枪吸去残余上清。
(13)沉淀重悬于200μL TBS,0.02%NaN3中,12000g离心1min,除去沉淀。上清液转入新离心管中,此即为扩增后的第一轮噬菌体产物。
(14)按照步骤B中“噬菌体滴度测定方法”测定扩增后的第一轮噬菌体产物。
第二轮淘选:
(1)根据蓝斑数和稀释梯度计算噬菌体滴度,蓝斑数乘以稀释梯度即噬菌体滴度。根据滴度值来计算加入1-2×1011pfu的噬菌体加入量。
(2)进行第二轮淘选,步骤重复第一轮。
第三轮淘选:
(1)根据蓝斑数和稀释梯度计算噬菌体滴度,根据滴度值来计算加入1-2×1011pfu的噬菌体加入量。
(2)进行第三轮淘选,步骤重复第一轮。
第四轮淘选:
(1)根据蓝斑数和稀释梯度计算噬菌体滴度,根据滴度值来计算加入1-2×1011pfu的噬菌体加入量。
(2)进行第四轮淘选,步骤重复第一轮。
(3)在LB/IPTG/Xgal平板上测定第四轮淘选所得噬菌体回收量,即获得的噬菌体滴度。
实验结果显示:采用四轮淘选与Jeko-1淋巴瘤细胞系结合的噬菌体克隆,并将每一轮淘选获得的噬菌体进行计数,统计分析结果如表1所示。根据每轮噬菌体的回收率计算,经过四轮淘选后的阳性克隆数的浓度提高了约1×104倍,说明存在与Jeko-1高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。
表1.每轮淘选后噬菌体的富集结果
轮次 | 输入量(pfu) | 回收量(pfu) | 回收率 |
1 | 1×10<sup>11</sup> | 5×10<sup>3</sup> | 5×10<sup>-8</sup> |
2 | 1×10<sup>11</sup> | 1×10<sup>4</sup> | 1×10<sup>-7</sup> |
3 | 1×10<sup>11</sup> | 5×10<sup>5</sup> | 5×10<sup>-6</sup> |
4 | 1×10<sup>11</sup> | 1×10<sup>7</sup> | 1×10<sup>-4</sup> |
实施例2.噬菌体单克隆的获取和生物学信息分析
单克隆噬菌体扩增和纯化:
(1)-80℃取ER2738甘油菌,在LB-Tet平板划线,37℃倒置培养12h-16h。
(2)取步骤(1)得到的ER2738单克隆菌斑于20mL LB-Tet,37℃220rpm摇床培养12h-16h。
(3)将步骤(2)中ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基,分1mL到15mL离心管中。
(4)取第四轮淘选的滴度测定时用的LB平板,枪头挑蓝色噬菌斑于步骤(3)1mLER2738菌液中,37℃220rpm摇床培养4h-5h。
(5)培养物转移到离心管中,14000rpm离心30s,上清转移至新离心管,重复离心30s,80%上清液转移至新离心管中,此为单克隆噬菌体贮液。
PCR扩增目的基因及测序:
(1)根据随机十二肽噬菌体展示文库中M13噬菌体序列设计引物:Forwardprimer:5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’(SEQ.ID.NO.3)Reverse primer:5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’(SEQ.ID.NO.4)PCR体系
PCR反应条件:
预变性:95℃,5min;变性:95℃,30s;退火:58℃,30s;延伸:72℃,30s;30个循环;延伸:2℃,5min;12℃保存。
(2)PCR产物回收(参见生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书)
a.在PCR反应液中加入5倍体积Buffer B3,吹打充分混匀。
b.将混合液全部移入吸附柱,8000g离心30s,倒掉收集管中的液体。
c.向吸附柱中加入500μL Wash Solution,9000g离心30s,倒掉收集管中的液体。
d.重复步骤c一次。
e.9000g离心空甩1min。
f.在吸附膜中央滴加15-40μL Elution Buffer,室温静置1-2min后,9000g离心1min。即为DNA溶液。
(3)将PCR纯化产物于2%琼脂糖胶电泳,确定成功PCR后,将PCR纯化产物寄至华大基因,利用反向引物进行正向测序。
(3)获得测序结果后,用Edit Seq软件反向互补得到模板链的DNA核酸序列,并按照三联密码子学说翻译成多肽序列。
实验结果显示:如图2,PCR扩增的目的基因,经2%琼脂糖凝胶电泳分析,不同噬菌体克隆的DNA大小不完全一致。这是由于噬菌体文库中存在一定数量的未能成功插入随机十二肽基因序列的噬菌体造成的,且野生型噬菌体具有明显的生长优势造成的,因此选取成功的噬菌体单克隆,经扩增后,将其PCR产物(图2中箭头所指处)送至华大基因测序。对测序结果通过Editseq软件进行分析,再将目的基因翻译成多肽序列,所获得的序列信息如图3所示,序列1和序列2所占比例分别为17%和14%,相同的噬菌体克隆存在富集现象,排除非特异序列1,将序列2作为候选研究多肽序列,命名为TUZG12,其氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR(SEQ.ID.NO.5)。
实施例3.淋巴瘤细胞的培养、人淋巴细胞的提取及原代培养、多肽免疫荧光实验
淋巴瘤细胞的培养:
淋巴瘤细胞系Jeko-1、Romas、Raji、Granta-5、Su-4,购于ATCC(美国模式培养物保藏所),用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。
小鼠肥大细胞癌细胞P815购于ATCC(美国模式培养物保藏所),用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养,所有细胞均在37℃、5%CO2的细胞培养箱常规培养。
人淋巴细胞的提取及原代培养:
(1)将正常人的血液转移到离心管内,500g离心8min,分离上清层血清于新的离心管内。
(2)加与步骤(1)中所得血清等体积的PBS于血清中,混匀。
(3)取新的15mL离心管,加与步骤(2)混合液总体积相同体积的人淋巴细胞分离液(HisToPAQVE@1077)于离心管内,将步骤(2)中得到的混合液再次混匀,慢慢转移到离心管内。
(4)500g离心25min。
(5)弃掉上层和下层,取中间层白色的淋巴细胞。
(6)加5倍体积的PBS冲洗,500g离心7min,弃上清。
(7)5mL PBS重悬,500g离心7min,弃上清。
(8)用4mL下述的培养基重悬,转移到T25培养瓶中,置于培养箱中培养。
所述培养基配制:在完全RPMI1640培养基中加入适量步骤(1)所得的血清,使血清的浓度为10%。
荧光多肽的合成:
TUZG12的氨基酸序列为MHPNAGHGSLMR,对照组多肽Random的序列为VSYVPMQGALTQ(SEQ.ID.NO.6),FITC通过氨基己酸修饰在多肽N端,分别记作TUZG12-FITC和Random-FITC。荧光标记的多肽由南京金斯瑞生物科技公司采用固相合成法合成。
多肽的免疫荧光实验:
(1)荧光标记的多肽母液浓度为2mM。
(2)Jeko-1淋巴瘤细胞系及人正常淋巴细胞生长状态良好后,用血球计数板计数。320g离心5min,用PBS重悬,使细胞数为1x103个/μL。
(3)用移液器取50μL细胞滴于载玻片上,37℃放置1h烘干。
(4)4%多聚甲醛室温固定10min,去掉固定液,PBS洗3次。
(6)将浓度为25μM的标记荧光的多肽(TUZG12-FITC和Random-FITC)悬液滴加在固定于载玻片上的细胞,于增湿容器中室温孵育1h。
(7)吸去标记荧光的多肽,PBS洗2次。
(8)用PBS按1:1000稀释4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),每个细胞上加50μL稀释后的DAPI,室温下反应5min。
(9)PBS洗3次。
(9)取10μL抗荧光淬灭剂p-苯二胺(PPD)于细胞上,盖上盖玻片并用树脂封片。
(10)在Olympus荧光倒置显微镜下观察并拍照。
实验结果显示:
如图4和图5所示,HPLC和质谱分析证明荧光多肽TUZG12-FITC和Random-FITC的纯度均大于95%;Random-FITC相对分子量为1810.60,TUZG12-FITC相对分子量为1810.60。
以Random多肽为对照,TUZG12多肽对Jeko-1、P815、Raji、Su-4四个淋巴癌细胞系具有靶向结合活性,但对Romas和Granta-519淋巴癌细胞系及人正常淋巴细胞无靶向结合活性。
实施例4.D型的荧光多肽的免疫荧光实验
荧光多肽合成:
以TUZG12的氨基酸序列(MHPNAGHGSLMR)为基础,根据翻转D构型理论设计D型的多肽D-REVTUZG12(以多肽TUZG12(L型)的氨基酸序列为基础,设计反向氨基酸序列的多肽序列,合成时(南京金斯瑞公司合成)以D型氨基酸代替L型氨基酸),其氨基酸序列为RMLSGHGANPHM;对照组随意序列多肽的D型多肽D-REVRandom的氨基酸序列为QTLAGQMPVYSV(以随机序列多肽Random(L型)的氨基酸序列为基础,设计反向氨基酸序列的多肽序列,合成时(南京金斯瑞公司合成)以D型氨基酸代替L型氨基酸),在多肽D-REVTUZG12、对照多肽D-REVRandom的N端修饰FITC荧光分子,分别记作D-REVTUZG12-FITC和D-REVRandom-FITC,用于定位并进行细胞的摄取和分布实验。
荧光标记的多肽由南京金斯瑞生物科技公司采用固相合成法合成。
多肽的免疫荧光实验:
(1)荧光标记的多肽母液浓度为2mM。
(2)Jeko-1淋巴瘤细胞系及人正常淋巴细胞生长状态良好后,用血球计数板计数。320g离心5min,用PBS重悬,使细胞数为1x103个/μL。
(3)用移液器取50μL细胞滴于载玻片上,37℃放置1h烘干。
(4)4%多聚甲醛室温固定10min,去掉固定液,PBS洗3次。
(6)在细胞上加入对应的荧光多肽,置于增湿容器中室温孵育1h。荧光多肽作用浓度为:25μM。
(7)吸去荧光多肽,PBS洗2次。
(8)用PBS按1:1000稀释4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),每个加50μL,室温下反应5min。
(9)PBS洗3次。
(9)取10μL抗荧光淬灭剂p-苯二胺PPD于细胞上,盖上盖玻片并用树脂封片。
(10)在Olympus荧光倒置显微镜下观察并拍照。
实验结果显示:HPLC和质谱分析证明荧光多肽D-REVTUZG12-FITC和D-REVRandom-FITC的纯度均大于95%。D-REVTUZG12-FITC相对分子量为1607.9。D-REVRandom-FITC相对分子量为1528.1。
如图6和图7所示,以D-REVRandom多肽为对照,D-REVTUZG12多肽和TUZG12都对Jeko-1细胞具有靶向结合活性;并且D-REVTUZG12多肽对P815、Raji、Su-4淋巴癌细胞系也具有靶向结合活性,但对Romas和Granta-519淋巴癌细胞系及人正常淋巴细胞无靶向结合活性。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性D型多肽及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Met Leu Ser Gly His Gly Ala Asn Pro His Met
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Thr Leu Ala Gly Gln Met Pro Val Tyr Ser Val
1 5 10
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttattcgcaa ttcctttag 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccctcatagt tagcgtaacg 20
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met His Pro Asn Ala Gly His Gly Ser Leu Met Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Ser Tyr Val Pro Met Gln Gly Ala Leu Thr Gln
1 5 10
Claims (3)
1.一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽,其特征在于,所述多肽为 D 型的多肽D-REVTUZG12,其氨基酸序列为 RMLSGHGANPHM;所述多肽由 D 型氨基酸组成。
2.权利要求 1所述多肽在制备靶向治疗由Jeko-1、P815、Raji或Su-4细胞系引起的淋巴癌药物中的应用。
3.一种靶向治疗由Jeko-1、P815、Raji或Su-4细胞系引起的淋巴癌的药物,其特征在于,所述药物包括权利要求 1 中所述的多肽。
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