KR20100015774A - 암세포 검출 방법 및 그 질병의 진단 및 그 질병의 치료의 모니터링을 위한 상기 방법의 용도 - Google Patents

암세포 검출 방법 및 그 질병의 진단 및 그 질병의 치료의 모니터링을 위한 상기 방법의 용도 Download PDF

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Abstract

암세포 검출방법이 개시된다. 이 검출방법은 (a) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 암세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및 (b) 사전 설정된 기준치에 비교된 상기 전기적 신호의 수준의 차이가 암세포를 표시하는, 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 이 검출방법은 진단, 암치료의 모니터링, 암치료가 가능한 약제의 동정 및 암치료의 개별적 최적화를 위해 적용될 수 있다.
암세포, 검출(detecting cancer cells), 항암, 최적화

Description

암세포 검출 방법 및 그 질병의 진단 및 그 질병의 치료의 모니터링을 위한 상기 방법의 용도{METHODS OF DETECTING CANCER CELLS AND USE OF SAME FOR DIAGNOSING AND MONITORING TREATMENT OF THE DISEASE}
본 발명은 암 검출 방법, 더욱 상세하게는 암을 위한 약물 치료를 최적화하는 방법에 관한 것이다.
암은 최근의 의료기술의 발전에도 불구하고 전세계적으로 다대한 사망원인이다. 현재의 치료방법들은 다양한 외과적 방법 및 비외과적 방법을 통해 환자 내의 암 세포를 제거하거나 죽이는 것에 주로 초점이 맞추어져 있고, 가장 널리 사용되는 방법은 화학요법 및 감마선 조사법이다. 이들 방법들은 많은 현저한 단점들, 특히 환자 내의 건강한 세포/조직의 도태 및 암 치료에 사용되는 화학요법 약물의 독성의 부작용을 가지고 있다.
'분화 요법(differentiation therapy)'은 악성 표현형으로부터 정상 표현형으로의 복귀를 촉진시키는 대안적 접근방법이다. 분화 요법은 암세포는 정상 세포가 미성숙되거나 낮은 분화 상태에 머물러 있는 것으로서 자체 성장을 제어하는 능력이 결핍되어 있고, 그 결과 비정상적으로 빠른 속도로 증식하는 세포라는 개념에 기초한 것이다. 분화 요법은 암세포가 성숙화 과정을 재개하도록 강제하는 것을 목표로 한다. 분화 요법이 암세포를 죽이지는 않지만, 그 성장을 억제하고 잔류하는 악성 세포를 전멸시키기 위한 더욱 전통적인 치료법(예, 화학요법)의 적용을 가능하게 한다.
분화 요법은 암/종양 세포의 사멸을 표적으로 하는 종래의 치료방법에 비해 다수의 이점을 가진다. 먼저, 화학요법 약물이나 감마 조사에 따른 환자의 건강한 세포/조직의 도태가 제거되고, 그와 관련된 부작용도 제거된다. 많은 경우, 감마 조사나 화학요법을 통해 암세포를 사멸시키면 환자 내의 암세포가 완전하지는 않지만 대부분 제거되므로 질병으로부터 회복이 유도된다. 분화 요법에서, 암세포의 일부를 최종 분화 및 궁극적 노화의 경로 내로 유도하면, 이것이 다른 암세포들에게 어떤 신호를 줌으로써 이들 세포가 다양한 기구를 통해 참여하도록 한다고 추측된다.
다양한 마아커(markers)들이 분화 요법을 받는 환자의 모니터링 수단으로서 사용되고 있다. 이와 같은 마아커 중의 하나는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)로서, 이것의 발현은 세포의 분화 상태와 관련되는 것으로 밝혀졌다[Patnaik A, et al., Clin. Can Research, 2002 Jul;8(7):2142-8; Rephaeli A, Zhuk R, Nudelman A, 2000, Drug Develop. Res. Vol 50:379-391].
고감도, 고선택성 및 고정밀도로 상기 마아커를 신속하고 용이하게 발견함으로써 특정의 환자에 대한 치료제를 주문 제조할 수 있는 길이 열렸다(주문 의료(personalized medicine)). 이것은 종양의 치료 반응이 그 종양의 유형 및 해부학적 위치만으로는 예측될 수 없다는 것이 알려져 있으므로 암의 치료에서 매우 중 요하다.
현재까지 이들 모든 요구에 부합하는 마아커를 검출하기 위한 시스템이 존재하지 않는다.
미국특허출원 US 20060100488은 교류전류를 가한 후 세포의 전기적 반응을 직접 모니터링하는 것에 의한 암성 세포의 검출을 교시한다. 국제특허공개 WO 91/15595는 치료 및 약제 스크리닝에 대한 반응성을 모니터링하기 위한 암세포의 전기 전도성 분석을 교시한다. 국제특허공개 WO 91/15595는 특히 암세포의 전기 전도성을 분석하는 것에 의해 암세포의 체적 증가 및 수의 증가를 억제하기 위한 특정 약제의 유효성을 모니터링하는 것을 교시한다. 따라서, 이들 양 특허출원은 암세포의 고유의 전기적 특성이 암세포의 검출 및 모니터링을 위한 마아커로서 사용될 수 있다는 것을 교시한다.
미국특허출원 US 20040053425는 유체 내의 검체의 전류측정을 교시한다. 여기서 전극은 전류 발생 효소를 포함한다. 미국특허출원 US 20040053425는 세포 내 마아커의 전류측정 검출은 교시하지 않는다.
미국특허 US 5,149,629는 암세포 마아커를 포함하는 마아커의 전류측정 분석을 교시한다. 여기서 전극은 마아커를 접착할 수 있는 항체를 포함한다. 상기 분석은 기질경합(substrate competition)에 의한다. 미국특허 US 5,149,629는 암세포의 내인성 전류측정 특성을 검출하지 않는다.
따라서, 검체의 전류측정 검출은 검출을 위한 효과적인 방법이라는 것이 밝혀졌다. 그러나, 지금까지 전류측정 검출은 세포의 효소 활성을 분석하기 위해 사 용되지 않았다.
발명의 요약
본 발명의 일 관점에 따르면, 암세포의 검출방법으로서: (a) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 암세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및 (b) 사전 설정된 기준치에 비교된 상기 전기적 신호의 수준의 차이가 암세포를 표시하는, 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포의 검출방법이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 암을 가진 대상체의 진단방법으로서: (a) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 대상체의 샘플 내의 적어도 하나의 세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및 (b) 사전 설정된 기준치에 비교된 상기 전기적 신호의 수준의 차이가 암세포를 표시하는, 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포의 검출방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 암의 치료를 개별적으로 최적화하는 방법으로서: (a) 대상체의 샘플 내의 적어도 하나의 세포를 적어도 하나의 항암제에 접촉시키는 단계; (b) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 적어도 하나의 암세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 대상체의 암을 치료하기 위한 함암제의 효능을 표시하는, 상기 세포에 의해 발생된 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 치료를 개별적으로 최적화하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 대상체의 항암치료를 모니터링하는 방법으로서: (a) 상기 대상체에 적어도 하나의 항암제를 투여하는 단계; (b) 본 발명의 방법에 따른 (a) 단계 이후의 암의 상태를 나타내는 대상체의 샘플 내의 암세포의 존재 또는 암세포의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 대상체의 항암치료를 모니터링하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 대상체를 위한 항암치료의 결정방법으로서: (a) 본 발명의 방법에 따른 대상체의 샘플 내의 암세포의 존재 또는 수준을 분석하는 단계; (b) 대상체의 상기 샘플 내의 암세포의 존재 또는 수준에 따라 치료적으로 유효한 양의 항암제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 위한 항암치료의 결정방법이 제공된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 방법은 (b) 단계 이후에 (a) 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제의 동정방법으로서: (a) 적어도 하나의 암을 약제의 지배하에 두는 단계; (b) 상기 표현형의 역전이 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제를 표시하는, 제1항에 따른 (a)단계 이후 또는 선택적으로 (a)단계 이전에 세포의 악성 표현형을 측정하는 단계를 포함하는 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제의 동정방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 키트로서: (i) 적어도 하나의 생물학적 세포를 수용함과 동시에 전기화학적 측정을 수행하도록 구성된 전기화학적 세포; 및 (ii) 적어도 하나의 항암제를 포함하는 키트가 제동된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 키트는 상기 생물학적 세포의 효소와 효소 반응하여 상기 전기화학적 세포의 전극에서 산화환원 반응을 유발하는 반응 생성물을 생성하는 기질을 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 본 발명의 방법에 따른 암세포의 검출을 위해 구성된 시스템이 제공된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 적어도 하나의 세포는 복수의 세포를 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 측정단계는 고출력을 위한 수단을 이용하여 수행된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 수단은 자동화 샘플링 장치, 액체 처리장치, 분배기, 전극 배열, 로봇, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접촉단계는 인비트로 상태에서 수행된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 접촉단계는 엑스비보 상태에서 수행된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 샘플은 500 개 이하의 세포를 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 샘플은 10 개 이상의 세포를 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 효소는 알칼리 포스파타아제이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 기질은 p-APP이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 암세포들은 결장암 세포이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 측정단계는 전기화학적 세포를 이용하여 수행된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 측정단계는 멀티웰 어레이(multiwell array) 내에서 수행된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 멀티웰 어레이의 각 웰은 전기화학적 세포를 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 멀티웰 어레이의 각 웰은 나노-체적의 웰이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 약제는 시험 조성물을 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 시험 조성물은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 소분자 화학물질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 약제는 시험 조건을 포함한다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 시험 조건은 방사선 조건이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포는 무상세포이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 암세포들은 무상세포이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포는 포유류 세포이다.
후술하는 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 암세포들은 포유류 세포이다.
본 발명은 암세포를 전기적으로 검출하는 방법을 제공하는 것에 의해 현재 공지된 구성의 단점들에 성공적으로 대처한다.
본 명세서에 사용된 기술용어 및 과학용어는 다르게 정의되어 있지 않은 한 본 발명이 속하는 기술분야의 통상 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료를 이용하여 본 발명을 실시하거나 시험하는 것이 가능하지만, 적합한 방법 및 재료는 이하에 기재되어 있는 것이다. 본 명세서에 언급되어 있는 모든 특허공개, 특허출원, 특허, 및 기타의 참조문헌은 그 전체가 참조로서 도입된 것이다. 대립되는 경우, 정의를 포함하는 본 특허 명세서가 통제한다. 또, 재료, 방법, 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐 발명을 제한하는 의도가 없다.
이하에서 본 발명은 첨부한 도면을 참조하여 예시로서만 설명된다. 도면 상의 특정의 세부는 예시로서 그리고 본 발명의 바람직한 실시예의 설명을 위해 도시된 것이고, 본 발명의 원리 및 개념적 관점을 이해하는데 가장 유용하고 쉬운 것으로 생각되는 것을 제공하기 위해 제시된 것이다. 따라서, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것 이상의 구조적 세부를 보여주기 위한 노력은 시도되지 않았고, 도면을 참조한 설명으로부터 본 기술분야의 전문가는 본 발명의 다수의 실시형태가 구현될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
도 1A 내지 1C는 BA, 부티로일메틸-디에틸 포스페이트 및 피발로일옥시메틸 부티레이트에 대한 HT-29 결장암세포 반응을 도시한 그래프이다. 알칼리 포스파타아제 활성의 모니터링을 위한 전류측정 곡선은 전기화학 어레이 칩(array chip)을 이용하여 발생시켰다. HT-29 결장암세포를 다음의 분화제(differentiation agent)에 노출시켰다: 부티르 산 (2.5 mM) - 도 1A, 부티로일메틸-디에틸 포스페이트 및 피발로일옥시메틸 부티레이트 (50 μM) - 도 1B 및 도 1C. 기질 PAPP을 구비한 HT-29를 칩(chip) 상의 100nL 체적의 전기화학 체임버 내에 설치하였다. 전류는 220mV에서 전류측정 기법을 이용하여 측정하였다. 오차추정(5회 반복)은 2nA RMS 이다.
도 2A 내지 도 2C는 샘플 당 세포의 수를 설명하는 사진이다.
도 2D 내지 도 2F는 세포의 수에 대한 샘플들의 효소활성을 설명하는 그래프이다. 오차추정(5회 반복)은 3nA RMS이다.
도 3은 HT-29 결장암세포의 수와 유도된 알칼리 포스파타아제 효소활성 사이의 상호관계를 표현하는 막대그래프이다. 활성은 전류/시간으로 표시되었다. 각각의 결과는 3회의 측정의 평균치를 나타낸다. 전류는 220mV에서 전류측정 기법을 이용하여 측정하였다.
도 4A 내지 도 4C는 HT-29 세포 상의 부티로일메틸-디에틸 포스페이트의 8시간의 처리 효과를 설명하는 그래프이다. 도 4A는 알칼리 포스파타아제 전류신호의 기울기를 설명하는 막대그래프이다. 도 4B 및 도 4C는 상이한 수의 처리된 세포(도 4B) 및 미처리된 세포(도 4C) 상에서의 시간 경과에 따른 전류의 변화를 설명하는 그래프이다.
도 5A 내지 도 5C는 HT-29 세포 상의 부티로일메틸-디에틸 포스페이트의 78시간의 처리 효과를 설명하는 그래프이다. 도 5A는 알칼리 포스파타아제 전류신호의 기울기를 설명하는 막대그래프이다. 도 5B 및 도 5C는 상이한 수의 처리된 세포(도 5B) 및 미처리된 세포(도 5C) 상에서의 시간 경과에 따른 전류의 변화를 설명하는 그래프이다.
도 6A 내지 도 6C는 HT-29 세포 상의 부티로일메틸-디에틸 포스페이트의 96시간의 처리 효과를 설명하는 그래프이다. 도 6A는 알칼리 포스파타아제 전류신호 의 기울기를 설명하는 막대그래프이다. 도 6B 및 도 6C는 상이한 수의 처리된 세포(도 6B) 및 미처리된 세포(도 6C) 상에서의 시간 경과에 따른 전류의 변화를 설명하는 그래프이다.
바람직한 실시예의 상세한 설명
본 발명은 암세포 검출방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 진단, 치료의 모니터링, 치료 계획 및 그 질병에 대한 새로운 치료 양식의 개발을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 원리 및 실시는 도면 및 설명을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 실시예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 후술하는 설명란에 설명되거나 실시예에 의해 예시된 상세한 내용에 그 적용이 한정되지 않는다는 것을 먼저 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시예들이 가능하고, 또는 다양한 방식으로 실시될 수 있다. 또, 본 명세서에 사용된 표현 및 용어는 설명을 위한 것으로서 제한으로서 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
분화 요법은 암세포의 성숙 과정을 강제로 재개시키는 것에 의해 암세포를 정상세포로 유도하는 것에 초점이 맞추어진다. 다수의 마아커가 분화 요법을 받고 있는 환자들을 모니터링하는 수단으로서 사용되었다. 이러한 마아커 중의 하나는 알칼리 포스파타아제로서, 이것의 발현은 세포의 분화 상태와 관련되는 것이 밝혀졌다. 일반적으로, 정상적인 효소활성은 세포가 특수 약물요법의 결과로서 적절히 분화한다는 것을 나타내고, 반면 효소활성의 결핍은 특정 암에 대해 및/또는 특수 환자에 대해 비효과적인 약물요법을 나타낸다.
그러나, 아직까지 이와 같은 마아커를 고민감도, 고선택성 및 고정밀도로 신속하고 용이하게 검출하는 방법은 존재하지 않는다.
본 발명자들은 분화요법에 대한 암세포의 반응을 민감하고 고성능으로 검출하는 새로운 전기화학법을 개발하였다.
본 발명의 실시 중에 본 발명자들은 전류측정 효소 측정이 분화제의 효과를 측정하기 위해 p-APP와 같은 전기화학 기질을 이용하여 실시될 수 있다는 것을 입증하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 3종의 분화제의가 인간 결장암세포에 미치는 영향이 본 발명의 방법을 이용하여 측정되었다. 소형의 전기화학적 세포(electrochemical cells)을 수용한 칩(chip)을 이용하여 본 발명자들은 세포의 극소형 샘플(15개 미만의 세포) 상에 미치는 3종의 분화 치료제의 효과를 고감도, 고정밀도 및 빠른 속도로 모니터링할 수 있었다(도 2A 내지 도 2F 및 도 3 참조).
약물 효과는 5분 내에 10 나노암페어의 분해전류반응(resolution current response)을 이용하여 측정할 수 있었다. 더욱, 이들 결과는 유도된 전류신호와 나노-체적의 체임버 내에서 계수된 암세포의 수 사이의 양적 관계를 입증한다.
나노-체적의 분석장치를 사용하는 것은 이것이 진단용 조직의 요구량이 적고, 고성능 분석이 가능하고, 하나의 종양 샘플에 대해 다양한 약물의 효과를 비교하는 것이 가능하고, 동시에 균일한 생물학적 조건 및 환경적 조건을 유지할 수 있으므로 임상 관련 샘플에서 특히 유리하다. 또, 이 새로운 방법은 '주문 의료'에 관련된 개별 환자에 대한 항암제 및 항암치료를 주문 제조하는데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 관점에 따르면 암세포의 검출방법이 제공된다. 본 방법은 전기 신호를 발생시킬 수 있고, 그 후 그 전기 신호의 수준을 측정할 수 있는 생성물을 발생시키기 위해, 효소가 세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건 하에서, 상기 세포와 상기 효소를 위한 기질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 사전설정된 기준치에 비교된 상기 전기 신호의 수준의 차이는 암세포를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "검출(detecting)"은 세포의 검출, 진단, 감지, 발견, 노출, 시각화 또는 동정 행위를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포(cell)"는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포를 말한다.단세포가 복수의 세포와 마찬가지로 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 바람직하게 복수의 세포는 10개 이상에서 500개 이하의 세포를 포함한다. 상기 세포는 접착세포 및 응집체(aggregates)가 여전히 검출되더라도 세포의 수를 계수할 수 있도록 단개 부유액(single suspension) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 복수의 세포는 세포주, 초대배양 및 세포 샘플(예, 생검(절개생검 또는 절제생검, 미세침 흡인생검 등을 포함하는 외과생검), 완전절제 또는 체액)과 같은 모든 생체 샘플로부터 얻을 수 있다. 생검 검색법은 본 기술분야에 공지되어 있다.
생체 샘플 내의 세포는 임의의 전처리 없이 기능 효소를 위해 분석될 수 있다. 따라서, 생체 샘플 내의 세포는 무상세포(즉, 전세포), 및 성장할 수 있는 세 포인 것이 바람직하다. 그러나, 세포 추출물 또는 비-무상세포의 생성과 같은 세포의 전처리도 본 발명에 의해 검토된다는 것은 높이 평가된다.
"악성 세포(malignant cell)"로서 본 명세서에서 말하는 "암세포(cancer cell)"는 정상 세포분열 제어로부터 방출된 세포이고, 따라서 이상성장(abnormal growth) 및 제어되지 않는 방식의 번식의 경향, 및 경우에 따라 전이의 경향을 가지는 것을 특징으로 한다. 따라서, 암세포는 신생 세포(neoplastic cell), 전암 세포(pre-malignant cell), 전이 세포, 종양 세포, 암유전자 세포, 암 유전자형을 가지는 세포, 악성의 표현형의 세포, 암유전자 트랜스펙트 세포(oncogene transfected cell), 바이러스 형질전환 세포, 암유전자를 발현하는 세포, 암을 위한 마아커를 발현하는 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 암세포의 비제한적 예는 선암 세포(adenocarcinoma cell), 부신종양 세포(adrenal gland tumor cell), 에나멜상피종 세포(ameloblastoma cell), 미분화 세포(anaplastic cell), 갑상선 세포의 미분화 암종(anaplastic carcinoma), 혈관섬유종 세포(angiofibroma cell), 혈관종 세포(angioma cell), 혈관육종 세포(angiosarcoma cell), 아푸도마 세포(apudoma cell), 아젠타핀노마 세포(argentaffinoma cell), 남화종양 세포(arrhenoblastoma cell), 복수종양 세포(ascites tumor cell), 복수종양 세포(ascitic tumor cell), 성상아세포종 세포(astroblastoma cell), 성상세포종 세포(astrocytoma cell), 혈관확장성 실조증 세포(ataxia-telangiectasia cell), 심방점액종 세포(atrial myxoma cell), 기저세포암 세포(basal cell carcinoma cell), 양성종양 세포(benign tumor cell), 골육종 세포(bone cancer cell), 골종양 세포(bone tumor cell), 뇌간 글리오마 세포(brainstem glioma cell), 뇌종양 세포(brain tumor cell), 유방암 세포(breast cancer cell), 버킷트 임파종 세포(Burkitt's lymphoma cell), 암성 세포(cancerous cell), 카르치노이드 세포(carcinoid cell), 암종 세포(carcinoma cell), 소뇌성상 세포종 세포(cerebellar astrocytoma cell), 자궁경암 세포(cervical cancer cell), 체리 혈관종 세포(cherry angioma cell), 담관암 세포(cholangiocarcinoma cell), 담관종 세포(cholangioma cell), 연골아세포종 세포(chondroblastoma cell), 연골종 세포(chondroma cell), 연골육종 세포(chondrosarcoma cell), 융모아세포종 세포(chorioblastoma cell), 융모종 세포(choriocarcinoma cell), 결장암 세포(colon cancer cell), 일반 급성 임파성 백혈병 세포(common acute lymphoblastic leukemia cell), 두개후두종 세포(craniopharyngioma cell), 낭포암 세포(cystocarcinoma cell), 시스토프브로마 세포(cystofbroma cell), 시스토마 세포(cystoma cell), 세포종 세포(cytoma cell), 비침윤성 유관암 세포(ductal carcinoma in situ cell), 관내유두종 세포(ductal papilloma cell), 미분화배세포종 세포(dysgerminoma cell), 뇌종양 세포(encephaloma cell), 자궁내막암 세포(endometrial carcinoma cell), 내피종 세포(endothelioma cell), 상의세포종 세포(ependymoma cell), 상피종 세포(epithelioma cell), 적백혈병 세포(erythroleukemia cell), 유잉 육종 세포(Ewing's sarcoma cell), 기외 결절성 임파종 세포(extra nodal lymphoma cell), 묘육종 세포(feline sarcoma cell), 섬유선종 세포(fibro adenoma cell), 섬유육종 세포(fibro sarcoma cell), 갑상선의 여포선암 세포(follicular cancer of the thyroid cell), 신경절교종 세포(ganglioglioma cell), 개스트리노마 세포(gastrinoma cell), 다형성 교아종 세포(glioblastoma multiform cell), 신경교종 세포(glioma cell), 생식선 아세포종 세포(gonadoblastoma cell), 혈관아종 세포(haemangioblastoma cell), 혈관내피아종 세포(haemangioendothelioblastoma cell), 혈과내피종 세포(haemangioendothelioma cell), 혈관주위세포종 세포(haemangiopericytoma cell), 헤마톨림프앤지오마 세포(haematolymphangioma cell), 헤모시토블라스토마 세포(haemocytoblastoma cell), 헤모시토마 세포(haemocytoma cell), 유모세포 백형병 세포(hairy cell leukemia cell), 과오종 세포(hamartoma cell), 간세포암 세포(hepatocarcinoma cell), 간세포암 세포(hepatocellular carcinoma cell), 간암 세포(hepatoma cell), 조직종 세포(histoma cell), 호지킨병 세포(Hodgkin's disease cell), 부신종 세포(hypernephroma cell), 침윤성암 세포(infiltrating cancer cell), 침윤성 도관 세포암 세포(infiltrating ductal cell carcinoma cell), 인슐리노마 세포(insulinoma cell), 소아 앤지오포로마 세포(juvenile angioforoma cell), 카포시 육종 세포(Kaposi sarcoma cell), 신종양 세포(kidney tumor cell), 대세포 임파종 세포(large cell lymphoma cell), 백혈병 세포(leukemia cell), 만성 백혈병 세포(chronic leukemia cell), 급성 백혈병 세포(acute leukemia cell), 지방종 세 포(lipoma cell), 간암 세포(liver cancer cell), 간전이 세포(liver metastases cell), 루크 암 세포(Lucke carcinoma cell), 림프아데노마 세포(lymphadenoma cell), 림프관종 세포(lymphangioma cell), 임파성 백혈병 세포(lymphocytic leukemia cell), 임파성 임파종 세포(lymphocytic lymphoma cell), 림프오이토마 세포(lymphoeytoma cell), 림프오이데마 세포(lymphoedema cell), 임파종 세포(lymphoma cell), 폐암 세포(lung cancer cell), 악성 중피종 세포(malignant mesothelioma cell), 악성 기형종 세포(malignant teratoma cell), 비만세포종 세포(mastocytoma cell), 메듈로블라스톰 세포(medulloblastome cell), 흑색종 세포(melanoma cell), 수막종 세포(meningioma cell), 중피종 세포(mesothelioma cell), 전이성 세포(metastatic cell), 전이 세포(metastasis cell), 전이확산 세포(metastatic spread cell), 모톤 신경종 세포(Morton's neuroma cell), 다발성 골수종 세포(multiple myeloma cell), 골수아구종 세포(myeloblastoma cell), 골수성 백혈병 세포(myeloid leukemia cell), 골수지방종 세포(myelolipoma cell), 골수종 세포(myeloma cell), 근아세포종 세포(myoblastoma cell), 점액종 세포(myxoma cell), 비인강암 세포(nasopharyngeal carcinoma cell), 종양성 세포(neoplastic cell), 신아세포종 세포(nephroblastoma cell), 신경아세포종 세포(neuroblastoma cell), 신경섬유종 세포(neurofibroma cell), 신경섬유종증 세포(neurofibromatosis cell), 신경교종 세포(neuroglioma cell), 신경종 세포(neuroma cell), 비 호지킨 임파종 세포(non-Hodgkin's lymphoma cell), 핍돌기교종 세포(oligodendroglioma cell), 시신경교종 세포(optic glioma cell), 골연골 종 세포(osteochondroma cell), 골육종 세포(osteogenic sarcoma cell), 골육종 세포(osteosarcoma cell), 난소암 세포(ovarian cancer cell), 파제트 유두병 세포(Paget's disease of the nipple cell), 판코우스트 종양 세포(pancoast tumor cell), 췌장암 세포(pancreatic cancer cell), 갈색세포종 세포(phaeochromocytoma cell), 피오에포모시토마 세포(pheoehromocytoma cell), 형질세포종 세포(plasmacytoma cell), 원발성 뇌종양 세포(primary brain tumor cell), 태아전위종 세포(progonoma cell), 프로락티노마 세포(prolactinoma cell), 신세포암 세포(renal cell carcinoma cell), 망막아세포종 세포(retinoblastoma cell), 횡문근육종 세포(rhabdomyosarcoma cell), 횡문근육종 세포(rhabdosarcoma cell), 충실성종양 세포(solid tumor cell), 육종 세포(sarcoma cell), 이차성 종양 세포(secondary tumor cell), 세미노마 세포(seminoma cell), 피부암 세포(skin cancer cell), 소세포암 세포(small cell carcinoma cell), 인상세포암 세포(squamous cell carcinoma cell), 딸기상 혈관종 세포(strawberry haemangioma cell), T-세포 임파종 세포(T-cell lymphoma cell), 기형종 세포(teratoma cell), 정소암 세포(testicular cancer cell), 흉선암 세포(thymoma cell), 융모성 종양 세포(trophoblastic tumor cell), 종양형성성 세포(tumorigenic cell), 종양발생 세포(tumor initiation cell), 종양진행 세포(tumor progression cell), 전정신경초종 세포(vestibular schwannoma cell), 휠름 종양 세포(Wilm's tumor cell), 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 이 관점의 바람직한 실시예에 따르면, 암세포는 결장암 세포이다.
앞에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 효소 반응이 전기적 신호를 발생시킬 수 있는 세포 반응을 유발하기 위해 효소 기질에 세포를 접촉시키는 것에 의해 수행된다.
본 명세서에 사용되는 어구 "세포의 반응(reaction of the cell)"은 기질과 세포에 의해 발현된 내인성 효소 사이에서 발생하는 반응을 말하고, 외인성 효소에 의해 발생하는 반응을 의미하지 않는다.
기질은 검출이 요구되는 효소(본 명세서에서 "마아커 효소(marker enzyme)"라고도 함)에 따라 선택된다. 효소는 세포 내부에 위치(즉, 세포내형(intracellular))하거나, 세포막 상에 위치(즉, 막결합형)할 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 효소는 분비 효소이다. 검출이 요구되는 효소가 세포내형인 경우 기질은 막투과성인 것이 바람직하다는 것이 높은 평가를 받을 것이다. 더욱, 기질은 후속하는 촉매작용에 따라 선택되는 것이 바람직하고, 형성된 생성물은 또는 세포로부터 검출전극으로 확산되어 나갈 수 있도록 막투과성인 것이 바람직하다.
일 실시예에 따라 검출이 요구되는 효소는 알칼리 포스파타아제(또는 효소 분비 알칼리 포스파타아제(SEAP))이고, 기질은 17, 4-아미노페닐 포스페이트(p-APP)이다. 알칼리 포스파타아제는 p-APP를 전기화학적 생성물인 p-아미노페닐(PAP)로 변환시킨다.
p-APP는 시그마-안드리치사(Sigma-Aldrich; www.sigmaaldrich.com), 바이오-월드사(Bio-world; www.Bio-world.com) 및 다른 많은 제조회사와 같은 제조회사로부터 구입할 수 있다.
알칼리 포스파타아제는 정상 세포 내에 존재하지만 암성 세포 내에서는 감소된다(심지어, 존재하지 않는다). 따라서, 세포의 알칼리 포스파타아제 활성의 분석은 특정 약물의 암 치료의 효율을 평가하기 위한 마아커로서 또한 진단 목적을 위한 마아커로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉(contacting)"은 기질이 효소에 의해 촉매될 수 있는 조건 하에서 기질을 세포의 근처에 위치시키는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면, 접촉은 기질의 촉매반응이 가능한 그리고 전기화학적 세포에 의해 검출될 수 있는 충분한 생성물을 발생시킬 수 정도로 충분한 온도 및 시간에서 완충액 조건 항에서 수행되어야 한다. 예를 들면, p-APP를 기질로서 사용하는 경우, 접촉은 적어도 5분, 실온에서 수행되는 것이 바람직하다(후술의 실시예 2 및 실시예 3 참조).
접촉은 인비트로(in vitro), 엑스비보(ex vivo) 또는 인비보(in vivo) 상태에서 수행될 수 있다. 접촉은 전기신호가 온라인으로 검출되도록 효소반응(즉, 전기화학적 세포 내에서의 효소반응)의 생성물을 검출할 수 있는 용기(vessel) 내에서 수행될 수 있다. 이와 같은 용기들은 이하에서 더 기술한다. 대안으로서, 접촉은 샘플들을 특정의 시점에서 연속적으로 인출할 수 있고, 그 샘플들을 전기화학적 세포 내에 배치할 수 있도록 검출이 행해지는 별도의 용기 내에서 수행될 수 있다. 따라서, 접촉은 시험관, 플라스크, 조직배지, 칩(chip), 어레이(array), 플레이트(plate), 마이크로플레이트, 모세관 등에서 수행될 수 있다. 세포는 세포의 내용물의 연속적인 철저한 혼합을 위해 기질의 첨가 후 진동 플레이트 상에 설치될 수 있다.
전술한 바와 같이, 전기적 신호(즉, 전기화학적 생성물)을 발생시키기 위해 화학적 세포의 전극에서 산화환원 반응(즉, 전자 이동이 가능한 반응)을 받을 수 있는 생성물의 전기화학적 측정은 전형적으로 전기화학적 세포 내에서 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "전기적 신호(electrical signal)"는 전자들 또는 전기화학적 활성종을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "전기화학적 측정(electrochemical measurement)"은 통상 전기화학적 세포 내의 용액 내에서 전극의 사용에 의해 수행되는 측정을 말한다. 측정은 예를 들면 시간-전류측정법(chrono-amperometry), 시간-전위차측정법(chrono-potentiometry), 사이클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry), 시간-전량분석법(chrono-coulometry) 또는 방형파 볼타메트리(square wave voltammetry)에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 측정에서 검출이 가능한 신호는 대조(control)로부터의 전기화학적 측정과 다른 것이다.
온-라인 측정을 위해, 본 발명의 전기화학적 세포는 측정 전극, 리턴 전극(return electrode), 기준 전극(reference electrode), 및 세포들을 수용하는 체임버를 구비한다.
작업전극(working electrode)은 다양한 상이한 종류일 수 있고, 예를 들면, 글래스상 탄소(glassy carbon), 활성화 탄소포 전극(activated carbon cloth electrode), 탄소 펠트(carbon felt), 백금 코팅 탄소포(platinized carbon cloth), 보통 탄소포(plain carbon cloth)를 포함한 탄소로 제조되거나, 금, 백금 또는 은으로 제조될 수 있다. 대전극(counter electrode)도 작업전극과 동일한 재료로 제조될 수 있다. 기준전극은 예를 들면 포화 칼로멜 전극(saturated calomel electrode)일 수 있고, Ag/AgCl 전극일 수 있다. 더욱, 전극들은 샘플의 인출의 필요성 및 별도의 전기화학적 세포 내로의 이동의 필요성 없이 세포를 구비하는 용기 내에 삽입될 수 있는 스크린 인쇄 전극일 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 생성물의 검출에 사용되는 전극은 재사용이 가능한 전극 또는 사용 후 폐기처분이 가능한 전극일 수 있다. 재사용이 가능한 전극은 예를 들면 테플론 내에 매립된 디스크상 또는 봉상의 글래스상 탄소로 제조된 전극일 수 있다. 사용 후 폐기처분이 가능한 전극은 예를 들면 탄소지(carbon paper), 탄소포(carbon cloth), 탄소 펠트, 또는 전술한 종류의 스크린 인쇄된 전극의 형태의 전극일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 전기화학적 세포는 3-전극 세포이다. 다른 실시예에 따르면, 전기화학적 세포는 2-전극 세포이다. 바람직한 실시예에 따르면, 전기화학적 세포는 복수의 세포, 즉 각 웰(well)이 나노 체적의 치수를 가지는 멀티웰 어레이(multiwell array)를 구비하는 어레이(즉, 칩)로서 제공된다.
반응 생성물에 의해 생성되는 전기적 신호를 측정하기 위한 시스템은 컴퓨터, 포텐티오스탯(potentiostat), 및 복수의 전기화학적 세포로부터의 동시적 측정을 위한 전형적인 실시예의 경우에 요구되는 멀티플렉서 모듈(multiplexer module)일 수 있는 제어 모듈을 더 구비할 수 있다.
이하, 세포 내에서 수행되는 전기화학적 측정을 시간-전류측정 모드에 관하 여 설명한다. 이해할 수 있는 바와 같이, 이것은 전술한 다른 전기화학적 측정 모드로 변경해야 할 때는 변경할 수 있다. 더욱, 이하에서 (다수의 전극을 포함하는) 다중-전극 시스템을 이용하는 것에 관하여 설명할 수 있고, 단일의 세포를 구비하는 시스템에 적용하는 것도 분명하다.
전기화학적 측정의 개시 시에, 모든 전극들이 함께 작동되고, 컴퓨터는 패러랠 포트를 통해 모든 전극을 스캔하고, 각 전극의 잠재 적용에 대한 백그라운 반응(background response)은 상기 컴퓨터에 의해 기록된다. 전체 전기화학적 측정 순서는 생성물의 농도 변화의 결과 생성되는 전류를 측정함과 동시에 장시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 전극들의 표면이 자연적인 변동에 기인하여 동일하지 않은 경우, 상기 시스템은 전형적으로 전기화학적 세포 내에서의 효소반응의 생성물인 동일한 종(species)인 전기활성종(electroactive species)의 산화 또는 환원을 측정하는 것 및 상기 모든 전극들의 측정 결과를 비교하는 것에 의해 조정될 수 있다.
분석의 수행시, 전극들을 포텐티오스탯에 접속함과 동시에 멀티플렉서를 경유하여 마이크로컴퓨터의 패러렐 포트에 집결시킬 수 있다.
각 전극은 기준전극 및 상기 포텐티오스탯에 접속되는 대전극을 수용하고 있는 전기화학적 세포 내에 삽입된다. 특수 전위가 포텐티오스탯에 의해 전극들에 인가되고(전위는 모든 전극들에 대해 동일하거나 각 전극마다 다를 수 있다), 각 전극의 전류가 검출된다. 전기적 신호는 컴퓨터 모니터 상에서 실시간으로 시각화된다.
효소반응의 전기화학적 생성물에 의해 생성되는 전기적 신호는 세포 내의 효 소의 수준을 반영하고, 또 그 효소(효소의 존재, 비존재, 또는 효소의 수준)는 암에 대한 마아커이므로, 상기 신호들을 이용하여 세포가 암성 세포(악성 세포)인지의 여부를 측정할 수 있다. 구체적으로, 만일 생성된 전기적 신호의 수준이 사전 설정된 기준치와 다르면, 이것은 세포가 암성 세포임을 표시하는 것이다. 전형적으로, 사전 설정된 기준치는 대조 세포(control cell)에 의해 생성되는 전기적 신호에 의해 측정된다.
대조세포는 정상적으로 분화된 세포, 비-암성 세포, 바람직하게는 암성 또는 미분화된 표현형으로 의심되는 조직 및 시편과 동일한 것이 바람직한 것일 수 있다. 바람직하게, 차이는 대조세포에 비해 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 100 % (즉, 2배), 3배, 5배 또는 10배이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 암세포 내의 효소(및 따라서 전기적 신호)의 양은 비-암성 세포 내의 효소(및 따라서 전기적 신호)의 양보다 적다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 암세포 내의 효소(및 따라서 전기적 신호)의 양은 비-암성 세포 내의 효소(및 따라서 전기적 신호)의 양보다 많다.
본 발명의 방법은 암을 가지고 있는 대상체를 진단하기 위해 사용될 수 있다는 것이 충분히 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단(diagnosing)"은 암의 분류, 암의 중증도(등급 또는 단계)의 판단, 암의 진행의 모니터링, 암의 예후 및/또는 회복의 가능성의 예측을 말한다.
대상체는 건강한 동물 또는 정기적인 건강검진을 받는 인체 대상체일 수 있 다. 대안으로서, 대상체는 암을 가지고 있을 위험 상태에 있는 대상체(예, 유전적 소인이 있는 대상체, 암의 병력 및/또는 가족력을 가지는 대상체, 발암성 물질, 직업상의 위험, 환경적 위험에 노출된 대상체 및/또는 임상적으로 암의 의심이 있는 증상(예, 혈변 또는 하혈, 원인불명의 통증, 발한, 원인불명의 발열, 원인불명의 체중감소 내지 식욕부진, 배변습관의 변화(변비 및/또는 설사), 테네스머스(tenesmus) (특히, 직장암에 대한 잔변감), 빈혈 및/또는 전신 무력감)을 나타내는 대상체)일 수 있다.
본 발명은 암의 치료를 개별적으로 최적화하는 것에 관련되고, 대상체의 항암 치료를 모니터링하고, 대상체를 위한 항암 치료를 결정하고, 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제를 동정하는 다양한 적용분야를 가진다는 것이 충분히 이해될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제를 동정하는 방법이 제공된다. 이 방법은 적어도 하나의 암세포를 하나의 약제의 지배를 받게 하는 단계 및 본 발명의 방법에 따라 마아커 효소(예, 알칼리 포스파타아제)의 활성 또는 발현을 모니터링하는 것에 의해 항암제의 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "악성 표현형의 역전(reversing a malignant phenotype)"은 악성 세포의 증식 특성 및/또는 침습 특성을 적어도 부분적으로 역전시키는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제(agent)"는 생물학적 약제 또는 화학적 약제를 포함하는 시험 조성(test composition)를 말한다.
본 발명의 방법에 따른 잠재적인 항암 약제로서 시험될 수 있는 생물학적 약제의 예에는 핵산(예, 폴리뉴클레오티드, 리보자임, 저분자 간섭 RNA 및 안티센스 분자(RNA, DNA, RNA/DNA 하이브리드, 펩티드 핵산, 및 변경된 주쇠 및/또는 염기 구조 또는 다른 화학적 개변을 구비하는 폴리뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 이것에 제한되지 않음)); 단백질, 폴리펩티드(예, 펩티드), 탄수화물, 지질 및 "소분자(small molecules)" 약물 후보가 포함된다. "소분자(small molecules)"는 예를 들면 자연발생적 화합물(예, 식물 추출물로부터 유도된 화합물, 미생물 배양액 등) 또는 분자량이 약 10,000 달톤 미만, 바람직하게는 약 5,000 달톤 미만, 가장 바람직하게는 약 1,500 달톤 미만인 합성 유기화합물 또는 유기금속 화합물일 수 있다.
본 발명의 이 관점의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 약제는 부티르 산 및 그 유도체를 포함(그러나, 이것에 한정되지 않음)하는 분화제(differentiation agent)이다.
본 발명의 방법에 따른 잠재적인 항암제로서 시험될 수 있는 조건의 예는 방사선 노출(예, 감마선, 자외선, X선)을 포함(그러나, 이것에 한정되지 않음)한다.
본 발명의 이 관점의 실시예에 따르면, 상기 "마아커 효소(marker enzyme)"는 또한 처치의 전후에 비교가 이루어질 수 있도록 약제와의 접촉 전에 분석된다.
본 발명의 이 관점에 따른 다른 실시예에 따르면, 상기 약제는 항암 효과를 가지는데 충분한 충분히 긴 기간 동안 암세포에 가해진다. 따라서, 예를 들면 부티르 산 및/또는 그 유도체를 분석하려면, 이들 약제를 적어도 1일간 및 더욱 바람 직하게는 3일간 암세포에 가하는 것이 바람직하다.
상기 약제는 인비트로, 엑스비보 또는 인비보 상태에서 암세포와 접촉시킬 수 있다는 것이 충분히 이해될 것이다. 상기 접촉이 인비보에서 수행되는 경우, 세포는 통상 본 발명의 기질과의 접촉 전에 대상체로부터 제거된다.
본 발명은 이론적으로는 단일의 전기화학적 세포를 이용하여 수행될 수 있으나, 이러한 방법은 효율적이지 않고, 바람직하지도 않다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 다수의 약제를 동시에 선별하기 위해 다수의 전기화학적 세포들을 이용하는 고도의 처리능력을 가지는 선별을 위해 사용된다. 세포들은 칩, 예를 들면 후술하는 실시예 1에 설명되는 바와 같은 실리콘 칩의 일부일 수 있다.
따라서, 일 실시예에 따르면, 본 발명의 방법은 고출력용 수단을 이용하여 수행된다. 따라서, 본 방법은 예를 들면 자동화 샘플링 장치, 액체 처리장치, 분배기, 전극 배열, 로봇, 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 수행될 수 있다.
현재 종양의 치료 반응은 종양의 유형 및 해부학적 위치만으로는 예측할 수 없다는 것이 공지되어 있다. 특정 환자의 세포를 분석 시스템 내에서 이용하여, 특정 환자의 치료제를 주문 제조할 수 있도록 세포의 악성 표현형을 역전(reversing)시킬 수 있는 약제를 동정하는 방법을 개변할 수 있다는 것이 충분히 이해될 것이다. 더욱, 본 발명의 방법을 이용하여 특수 약제를 선택할 수 있을 뿐 아니라 본 발명의 방법에 따라 최적의 용량 및 최적의 치료 계획도 인식될 수 있다는 것이 충분히 이해될 것이다. 이 방법으로 약제의 치료적 유효량을 결정하는 것이 가능하다.
환자는 본 발명의 방법을 활용하여 선택되는 최적의 치료 조건에 따라 치료될 수 있고, 필요에 따라 적절한 시간 후에 재시험될 수 있다. 이 방법으로 치료를 받고 있는 환자의 반응이 연속적으로 모니터링된다.
효소 수준의 분석 및 투여 단계들이 치료의 과정 중에 다수 회 반복될 수 있다는 것을 생각할 수 있다. 예를 들면, 알칼리 포스파타아제 수준은 약제 투여의 1주일 후에 분석될 수 있다. 알칼리 포스파타아제 수준이 대조에 비해 높으면, 약제의 투여량을 감소시킬 수 있다. 알칼리 포스파타아제 수준이 대조에 비해 낮게 유지되면, 약제의 투여량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 전기화학적 세포는 항암제가 암세포에 미치는 효과를 결정하기 위해 적어도 하나의 항암제와 함께 키트(kit) 내에 제공될 수 있다. 본 발명의 상기 키트는 필요한 경우 하나 또는 다수의 본 발명의 키트 유닛을 수용할 수 있는 팩(pack) 내에 제공될 수 있다. 상기 팩에는 키트의 사용설명서 및 특정 갯수의 세포에 대한 항암제의 추정 용량이 첨부될 수 있다. 상기 팩에는 또 실험 보조물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정하는 형태의 용기에 관한 통지서가 첨부될 수 있다. 이 통지서에는 상기 정부 기관에 의한 조성물의 형태에 승인이 반영되어 있다.
일 실시예에 따라, 상기 키트에는 또 생물학적 세포(즉, 암세포)의 마아커 효소와 효소적으로 반응하여 전기화학적 세포의 전극에서 산화환원반응을 유발하는 반응생성물을 생성하는 기질이 포함될 수 있다. 이와 같은 기질들은 앞에서 설명하였다.
이 특허의 존속기간 중에 많은 관련되는 기질이 개발될 것이고, 기질이라는 용어의 범위는 그와 같은 모든 새로운 기술을 포함하는 용어로 예상된다.
본 기술분야의 당업자는 제한의 의도가 없는 후술하는 실시예를 검토하는 것에 의해 본 발명의 추가의 목적들, 이점들, 및 새로운 특징들을 명확히 이해할 것이다. 또, 각각의 다양한 실시예들 및 전술한 본 발명의 관점들 그리고 후술하는 청구범위에 청구된 본 발명의 관점들은 다음의 실시예들에 의해 실험적으로 지지된다.
실시예
이하, 전술한 설명과 함께 본 발명을 비제한적인 방식으로 설명하는 실시예에 대해 설명한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 발명에서 사용되는 실험과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이들 기술은 문헌들에 철저히 설명되어 있다(참조 문헌의 예: "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); all of which are incorporated by reference as if fully set forth herein). 다른 일반적인 참조들은 본 명세서를 통해 제공된다. 본 명세서의 과정들은 본 기술분야에 공지된 것으로 생각되고, 독자의 편의를 위해 제공된다. 본 명세서에 게재된 모든 정보들은 참조로서 도입되었다.
실시예 1
나노-바이오-칩의 제조
나노-바이오-칩을 표준 마이크로-시스템-기술(micro-system-technology; MST)을 이용하여 설계 및 제조하였다. 그 구조는 소형화된 전기화학적 세포의 배열을 포함하였다. 이들 세포를 나노-체적의 체임버(즉, 전기화학적 세포) 내에 도입하였다. 이 원통형 체임버들은 각각 100 nL의 체적을 유지하였다. 모든 배열들은 양성 대조 체임버 및 음성 대조 체임버를 포함하였다.
장치는 2 부분으로 제작되었다: a) 세포가 설치되는 나노-체임버를 구비하는 사용후 폐기처분할 수 있는 칩, 및 b) 멀티플렉서, 포텐티오스탯, 온도 제어장치 및 검출 및 데이터 분석을 위한 포켓 PC를 포함하는 전자회로에 대해 인터페이스를 구비하는 재사용이 가능한 칩. 이 세팅은 다수의 측정에 대해 연속적인 재사용이 가능하였다.
칩은 실리콘으로 제작되었고, 8개의 소형 전기화학적 세포를 수용하였다. 각 전기화학적 세포는 실리콘 질화물 층에 의해 피복된 3개의 원형 전극으로 구성 되었다: 1) 금제 작업전극, 2) 금제 대전극 및 3) Ag/AgCl 기준전극. 전극들은 금 스퍼터링(gold sputtering), 마이크로리소그래피 및 기준전극의 경우 Ag를 선택적으로 침착하고 이것을 염화물을 함유하는 용액 내에서 양극화 처리하는 것에 의해 제조하였다. 체임버의 벽은 광중합 폴리이미드(SU-8)(도 1A 및 도 1B 참조)로부터 구축되었다. 실리콘 칩은 전자회로에 인터페이싱되어있는 플라스틱 칩에 와이어본딩되었다.
신호 검출은 전극 신호 조절 및 검출을 위한 전자회로에 대해 인터페이스를 구비하는 휴대형 팜-포텐티오스탯(palm-potentiostat)에 의해 수행되었다(Palm Instruments BV-2004). 전자장치는 전기화학적 세포의 8개의 독립된 복회선(duplicate circuits)으로 구성되었고, 이들 복회선은 온도 제어되었다. 각 전기화학적 세포 내의 작업전극과 기준전극의 사이에 전위를 가하고, 출력전류는 측정하였다.
실시예 2-3
일반적 재료 및 방법
세포주 및 배양물: HT-29 인간 결장암 세포를 95%의 공기, 5%의 CO2 내에서 37 ℃의 소의 태아 혈청의 존재 하에서 3일간 DMEM 배지에서 배양시킨 후, 부티레이트 처리(butyrate treatment)하였다. 상이한 농도의 부티레이트를 HT-29 세포 배양물에 첨가하였다. 적용된 농도는 0, 0.078, 0.156, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 mM였다. 따라서, 최적의 부티레이트 농도, LC50 및 생존율을 계산하였다. 측정은 무상세포를 이용하여 그리고 용해(lysis)와 같은 암세포의 추가 처리 없이 PBS 내에서 수행되었다.
부티르 산( BA ) 및 그 유도체 : 0.08-10 Mm의 농도 범위의 BA(이스라엘의 Sigma사)를 HT-29 결장암 세포에 도입하고, 최적화를 위해 72 시간 동안 배양하였다. 2.5 mM의 일정한 농도의 BA를 모든 전기화학적 실험에 적용하였다. BA 유도체, 부티로일메틸-디에틸 포스페이트, 및 피발로일옥시메틸 부티레이트를 문헌 [Rephaeli A, Zhuk R, Nudelman A, 2000, Drug Develop. Res.Vol 50:379-391]에 설명되어 있는 바에 따라 합성하였다. 부티로일메틸-디에틸 포스페이트를 PBS 내에서 용해하고, 피발로일옥시메틸 부티레이트를 DMSO 내에서 용해하고, 매질(medium)로 희석시켜 최종 DMSO의 농도가 ≤0.1%이 되게 하였다. 다음에 프로드러그를 50 μM의 일정 농도로 세포에 도입한 다음, 95%의 공기, 5%의 CO2 조건 및 37℃의 온도에서 96시간 동안 배양하였다. 분화제를 이용한 배양 후, 생존 세포를 트리파 블루 배제법(tripa blue exclusion)에 의해 계수하고, 생존율 시험 및 LC50 계산을 행하였다. 모든 전기화학적 측정 전, 세포들을 원심분리시키고, PBS로 희석시켰다. 모든 측정은 PBS 내에서 수행되었다. BA, 피발로일옥시메틸 부티레이트 및 부티로일메틸-디에틸 포스페이트의 작용을 알칼리 포스파타아제의 효소 작용의 측정에 의해 조사하였다.
알칼리 포스파타아제의 활성의 측정:
광학적 측정: 알칼리 포스파타아제의 활성을 광학기판인 파라-니트로페닐 포스페이트(para-Nitrophenyl Phosphate)(Sigma사의 PNPP 키트)를 이용하여 검출하였다. 얻어진 효소 생성물을 420nm의 파장에서 측정하였다.
전기화학적 측정: 전류측정식 효소 측정을 전기화학적 기판인 p-APP를 이용하여 수행하였다.효소반응 생성물(아미노페놀(p-AP))을 금제의 작업전극(gold working electrode)에서 220mV의 전압으로 산화시키고, 생성된 전류를 측정하였다. 8개의 체널을 가진 100 nL 체적의 전기화학적 체임버에 HT-29 암세포를 장입하고, 이 세포들을 BA 또는 그 유도체를 이용하여 처리하였다. 세포들을 전기화학적 체임버 내에 장입한 다음, 기질을 1 mg/ml의 최종 농도 및 100 nL의 총체적이 될 때까지 첨가하였다. 발생전류를 측정하고, 세포의 수를 현미경 하에서 계수하였다. 세포의 수와 전류 밀도 사이의 관계가 분석되었다.
실시예 2
본 발명의 바이오칩에 의해 분석된 결장암 세포에 미치는 약물의 효과
암치료의 특성화를 위해, 인간 결장암 세포(HT-29)에 미치는 다양한 단일 소스의 약물의 영향을 검사하였다.
결과
HT-29 결장암 세포를 96시간 동안 다양한 분화(differentiation) 치료제에 노출시키고, 유도된 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하였다. 어레이 상의 각 전 기화학적 체임버에 다양한 약제(즉, 부티르 산, 부티로일메틸-디에틸 포스페이트 및 피발로일옥시메틸 부티레이트)에 노출된 세포를 장입하였다. 측정 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시되어 있다. 정상의 효소 활성은 특정의 약물 치료의 결과로서 세포가 적절히 분화하는 것을 의미한다. 도 1A 내지 도 1C에 도시된 바와 같이, BA 및 부티로일메틸-디에틸 포스페이트는 알칼리 포스파타아제의 효소 활성을 유도하였고, 한편 피발로일옥시메틸 부티레이트는 50 μM 농도의 노출시 효소 활성을 전혀 유도하지 않았다. 이것은 HT-29 암세포에 관한 감소된 효력에 관련될 수 있다[M. Entin-Meer, et al., Molecular Cancer Therapeutics, vol. 4, pp.1952-1961, 2005; D. Engel, et al., Clinical Cancer Research, vol.11, pp. 9052S-9052S, 2005]. 또, 양성 대조 및 음성 대조가 수행되었다: 체임버에 약물 처리된 세포, 음성 대조로서 미처리된 세포, 및 양성 대조로서 정제된 알칼리 포스파타아제가 장입하였다. 부티로일메틸-디에틸 포스페이트는 그 농도가 BA 에 비해 500 배만큼 낮은데도 불구하고(즉, 50 μM : 2.5 mM), BA와 유사한 분화 효과를 발휘한다는 것에 주목해야 한다.
실시예 3
바이오칩에 의한 암세포의 정량화
결과
유도된 전류 신호와 나노-체적의 체임버 내에서 계수된 암세포의 수 사이의 주목할 만한 정량적 관계가 검출되었다. 암세포의 수와 그것에 관련된 효소 활성이 도 2A 내지 도 2F에 도시되어 있다. 알칼리 포스파타아제 활성의 모니터링을 위한 전류측정 반응곡선이 전기화학적 어레이 칩을 이용하여 생성되었다. HT-29 결장암 세포를 부티르 산(2.5 mM)에 노출시켰다. 기질인 PAPP를 구비하는 HT-29 세포를 칩 상의 100 nL 체적의 전기화학적 체임버 내에 도입하였다. 전류를 220 mV에서의 전류측정법을 이용하여 측정하였다. 상 곡선, 중 곡선 및 하 곡선은 각각 체임버의 내측에서 계수된 100개의 세포, 15개의 세포 및 0개의 세포의 전류 응답을 나타낸다. 다수회의 측정에 의해 체임버 내에서 계수된 세포의 수와 알칼리 포스파타아제 활성 사이의 높은 상관관계가 입증되었다. 측정 결과는 도 3에 도시되어 있다. 효소 반응을 정량화하는 능력은 전기화학적 검출방법의 이점과 결합된 칩의 소형화 설계에 기인된다.
실시예 4
본 발명의 바이오칩에 의해 분석된 결장암 세포에 미치는 부티로일메틸 - 디에틸 포스페이트의 효과
바이오칩의 감도(sensitivity)를 더욱 시험하기 위해, 증가된 수의 HT-29 결장암 세포를 상이한 시간 동안 부티로일메틸-디메틸 포스페이트를 이용하여 배양하였다. 내인성 알칼리 포스파타아제의 양을 본 발명의 바이오칩을 이용하여 측정하였다.
결과
측정 결과는 도 4A 내지 도 4C, 도 5A 내지 도 5C 및 도 6A 내지 도 6C에 도시되어 있다.암세포에 미치는 부티로일메틸-디에틸 포스페이트의 효과는 배양 시간의 증대에 따라 증대되었다. 또, 효과의 크기는 시험된 세포의 수와 상관관계가 있다는 것을 볼 수 있다.
결론
분화요법에 따른 암세포를 고감도 및 고성능으로 검출하기 위한 새로운 방법이 입증되었다.인간 결장암 세포의 경우, 이들 세포는 상이한 분화요법 약제를 이용하여 치료되었고, 상이한 약물에 반응하는 세포는 동시에 그리고 온라인으로 측정되었다. 이 마이크로어레이(microarray) 기법은 다수의 약제를 온라인으로 시험할 수 있는 능력 및 개인에게 부합하는 효과적인 치료법을 제공하는 능력을 제공한다.
이 '랩-온-칩(Lab-on-a-chip)' 시스템은 극소형 샘플(15개 미만의 세포)에 대해 고감도의 측정 능력을 제공하고, 세포를 칩 내에 삽입하기 전에 세포의 특별한 처리가 불필요하다.
명확화를 위해 독립된 다수의 실시예에 관련하여 기술된 본 발명의 특정의 특징들은 조합하여 단일의 실시예로 제공될 수도 있다는 것이 충분히 이해될 것이다. 반대로, 간결화를 위해 단일의 실시예에 관하여 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 독립적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수도 있다.
이상에서 본 발명은 특정의 실시예에 관련하여 기술되었으나, 본 기술분야의 전문가는 많은 변경례, 개조례 및 변화례를 명백히 이해할 것이다. 따라서, 이와 같은 모든 변경례, 개조례 및 변화례는 첨부된 청구범위의 정신 및 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허공개, 특허 및 특허출원은 각 개별적인 특허공개, 특허 또는 특허출원이 특별히 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로서 도입되는 것으로 표시된 것과 같은 정도로 그 전체가 참조로서 본 명세서에 도입되었다. 또, 본 출원에서의 임의의 참조문헌의 인용 또는 식별은 그 인용문헌이 본 발명의 종래기술로서 사용할 수 있다는 것을 승인하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (32)

  1. 암세포의 검출방법으로서:
    (a) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 암세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 사전 설정된 기준치에 비교된 상기 전기적 신호의 수준의 차이가 암세포를 표시하는, 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포의 검출방법.
  2. 암을 가진 대상체의 진단방법으로서:
    (a) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 대상체의 샘플 내의 적어도 하나의 세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 사전 설정된 기준치에 비교된 상기 전기적 신호의 수준의 차이가 암세포를 표시하는, 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암세포의 검출방법.
  3. 암의 치료를 개별적으로 최적화하는 방법으로서:
    (a) 대상체의 샘플 내의 적어도 하나의 세포를 적어도 하나의 항암제에 접촉 시키는 단계;
    (b) 전기적 신호를 발생할 수 있는 생성물을 생성시키기 위해, 효소가 암세포와 기질 사이의 반응을 촉매하는 조건하에서 적어도 하나의 암세포를 상기 효소를 위한 기질에 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 대상체의 암을 치료하기 위한 함암제의 효능을 표시하는, 상기 세포에 의해 발생된 상기 전기적 신호의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 치료를 개별적으로 최적화하는 방법.
  4. 대상체의 항암치료를 모니터링하는 방법으로서:
    (a) 상기 대상체에 적어도 하나의 항암제를 투여하는 단계;
    (b) 제1항의 방법에 따른 (a) 단계 이후의 암의 상태를 나타내는 대상체의 샘플 내의 암세포의 존재 또는 암세포의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 대상체의 항암치료를 모니터링하는 방법.
  5. 대상체를 위한 항암치료의 결정방법으로서:
    (a) 제1항의 방법에 따른 대상체의 샘플 내의 암세포의 존재 또는 수준을 분석하는 단계;
    (b) 대상체의 상기 샘플 내의 암세포의 존재 또는 수준에 따라 치료적으로 유효한 양의 항암제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 위한 항암치료의 결정방법.
  6. 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제의 동정방법으로서:
    (a) 적어도 하나의 암을 약제의 지배 하에 두는 단계;
    (b) 상기 표현형의 역전이 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제를 표시하는, 제1항에 따른 (a)단계 이후 또는 선택적으로 (a)단계 이전에 세포의 악성 표현형을 측정하는 단계를 포함하는 세포의 악성 표현형을 역전시킬 수 있는 약제의 동정방법.
  7. 청구항 5에 있어서, (b) 단계 이후에 (a) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체를 위한 항암치료의 결정방법.
  8. 청구항 2, 3 및 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 세포는 복수의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1, 2, 3 및 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정단계는 고출력을 위한 수단을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 수단은 자동화 샘플링 장치, 액체 처리장치, 분배기, 전극 배열, 로봇, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 접촉단계는 인비트로 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 암세포의 검출방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 접촉단계는 엑스비보 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 암세포의 검출방법.
  13. 청구항 2 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 500 개 이하의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 2 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 10 개 이상의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 알칼리 포스파타아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 p-APP인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포들은 결장암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정단계는 전기화학적 세포를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 측정단계는 멀티웰 어레이 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 멀티웰 어레이의 각 웰은 전기화학적 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 멀티웰 어레이의 각 웰은 나노-체적의 웰인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 3 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 시험 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 시험 조성물은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 소분자 화학물질, 탄수화물, 지질 및 이들의 조합으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 3 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 시험 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 시험 조건은 방사선 조건인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 무상세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포들은 무상세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포들은 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 1의 방법에 따른 암세포의 검출을 위해 구성된 시스템.
  31. 키트로서:
    (i) 적어도 하나의 생물학적 세포를 수용함과 동시에 전기화학적 측정을 수행하도록 구성된 전기화학적 세포; 및
    (ii) 적어도 하나의 항암제를 포함하는 키트.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 생물학적 세포의 효소와 효소 반응하여 상기 전기화학적 세포의 전극에서 산화환원 반응을 유발하는 반응 생성물을 생성하는 기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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