DE4113255A1

DE4113255A1 - Verfahren zum messen von antigenen und/oder antikoerpern mittels einer immunologischen reaktion

Info

Publication number: DE4113255A1
Application number: DE19914113255
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Takekawa
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1991-04-23
Publication date: 1991-10-31
Anticipated expiration: 2011-04-24
Also published as: JP2690802B2; DE4113255C2; JPH046464A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen von Antigenen und/oder Antikörpern mit Mitteln der Immunologie. Als immuno logisches Meßverfahren ist weit verbreitet die sogenannte heterogene Enzym-Immuno-Analyse (EIA). Als ein solches Enzym- Immuno-Analyseverfahren ist das sogenannte Sandwich-Verfahren sehr empfindlich und deshalb weit verbreitet.

Fig. 1 zeigt schematisch die aufeinander folgenden Schritte des bekannten Sandwich-Verfahrens. Zunächst wird in einem Schritt 1 eine vorgegebene Menge einer Probe in ein Reaktionsgefäß 1 eingegeben, wobei an den Innenwänden des Gefäßes Antikörper 2 anhaften. Die Antikörper sind spezifisch reaktiv in bezug auf die zu vermessenden Antigene. Sodann wird in einem Schritt 2 die immunologische Reaktion im Reaktionsgefäß 1 durchgeführt. Ist zu vermessendes Antigen 3 in der Probe enthalten, so wird das Antigen an den Antikörper 2 gebunden. Sodann werden in einem Schritt 3 freie Antigene mittels Waschung von den gebun denen Antigenen 3, die an die Antikörper 2 angehängt sind, ge trennt. Dieser Schritt wird im allgemeinen als B/F-Trennung bezeichnet. Auf diese Weise verbleiben im Reaktionsgefäß 1 nur die gebundenen Antigene 3. Im darauffolgenden Schritt 4 wird eine vorgegebene Menge von mit einem Enzym markierten Antikör pern 4 in das Reaktionsgefäß 1 gegeben. Während des Schrittes 5 wird eine zweite immunologische Reaktion durchgeführt und die durch Enzyme markierten Antikörper 4 werden an die Antigene 3 gebunden, welche ihrerseits an die Antikörper 2 gebunden sind, welche an der Innenwand des Reaktionsgefäßes 1 anhaften. Auf diese Weise wird ein sandwich-artiger Komplex gebildet aus dem Antikörper 2, dem Antigen 3 und dem durch ein Enzym markierten Antikörper 4, wobei die Menge der enzymmarkierten Antikörper 4, welche an der Innenwand des Reaktionsgefäßes 1 anhaften, pro portional ist der Menge der gebundenen Antigene 3, die in der Probe enthalten waren.

Enthält hingegen die Probe keine Antigene 3, so werden die en zymmarkierten Antikörper 4 nicht an der Innenwand des Reak tionsgefäßes 1 anhaften, weil die enzymmarkierten Antikörper 4 ohne die Antigene 3 keine Bindung zu den Antikörpern 2 herstel len.

In dem darauffolgenden Schritt 6 werden freie, nicht an die Innenwand des Reaktionsgefäßes 1 angehängte enzymmarkierte Antikörper 4 von den anhaftenden enzymmarkierten Antikörpern 4 getrennt. Diese zweite B/F-Trennung wird ebenfalls durch eine Spülung durchgeführt. Auf diese Weise verbleiben nur diejenigen enzymmarkierten Antikörper 4, die an der Innenwand des Reak tionsgefäßes 1 anhaften, im Reaktionsgefäß.

Sodann wird im Schritt 7 ein Substrat in das Reaktionsgefäß 1 gegeben, welches mit dem Enzym 5 des enzymmarkierten Antikör pers 4 reagiert, um eine Farbgebung zu erhalten. Sodann wird das Ergebnis dieser Farbreaktion kolorimetrisch vermessen.

Befindet sich kein gesuchtes Antigen 3 in der Probe, so werden die enzymmarkierten Antikörper während der B/F-Trennung im Schritt 6 aus dem Reaktionsgefäß 1 ausgespült, so daß keinerlei Farbreaktion erfolgt. Das Ausmaß der Farbreaktion hängt ab von der Menge an Enzymen, die im Reaktionsgefäß verblieben sind, welche ihrerseits in Beziehung steht zur Menge an Antigenen 3, die an die Antikörper 2 gebunden sind, welch letztere an den Innenwänden des Reaktionsgefäßes anhaften. Somit ist es mög lich, mittels des Kolorimeters die Menge an Antigen 3 zu mes sen, die in der Proben enthalten ist.

Fig. 2 illustriert die aufeinanderfolgenden Schritte eines zweiten Verfahrens. Bei diesem Verfahren werden in einem ersten Schritt 1 eine Probe und eine Anzahl fester Träger 7, von denen jeder aus einem feinen Teilchen gebildet ist, an dem Antikörper 2 anhaften, in ein Reaktionsgefäß 1 eingegeben, das mit einem Filter 6 versehen ist. Der Filter weist eine Anzahl von feinen Löchern auf und ist aus Glas-Fasern gebildet. Die Porengröße der feinen Löcher im Filter 6 ist so gewählt, daß die Festkör per-Träger 7 nicht passieren können, sondern auf oder im Filter hängen bleiben.

Enthält die Probe Antigene 3, die vermessen werden sollen, so wird in einer ersten immunologischen Reaktion im Schritt 2 das Antigen an die Antikörper 2 gebunden, welche an den Trägern 7 anhaften. In einem Schritt 3 werden freie Antigene, die nicht an die Antikörper 2 auf den Trägern 7 angebunden sind, von den gebundenen Antigenen abgetrennt und zwar mittels einer Spülung. Daß heißt, eine Spülflüssigkeit wird in eine obere Öffnung des Reaktionsgefäßes 1 eingegeben, um zusammen mit der Spülflüssig keit freie Antigene 3 durch das Filter 6 auszuwaschen. Auf diese Weise verbleiben ausschließlich jene Antigene 3 im Reak tionsgefäß 1, welche an den Feststoff-Teilchen 7 haften. In einem nachfolgenden Schritt 4 werden enzymmarkierte Antikörper 4 in das Reaktionsgefäß 1 eingegeben, um eine zweite immunolo gische Reaktion durchzuführen. Während dieser zweiten immuno logischen Reaktion werden die enzymmarkierten Antikörper 4 an die Antigene 3 gebunden, welche ihrerseits an den Antikörpern 2 anhaften, die auf der Oberfläche der Feststoff-Teilchen 7 be festigt sind. Auf diese Weise werden sandwich-artige Komplexe aus Antikörpern 2, Antigenen 3 und enzymmarkierten Antikörpern 4 gebildet. Die enzymmarkierten Antikörper 4 sind somit an den Trägern 7 angebunden.

Befindet sich kein Antigen 3 in der Probe, so werden auch keine enzymmarkierten Antikörper 4 an die Antikörper 2 auf den Trä gern 7 angekoppelt, so daß keine enzymmarkierten Antikörper 4 auf den Trägern anhaften, sondern aus dem Reaktionsgefäß 1 ab gespült werden.

In einem nachfolgenden Schritt 6 wird mittels einer Spülung entsprechend dem oben erwähnten Schritt 3 freie enzymmarkierte Antikörper, welche nicht an Antigene 3 auf den Trägern 7 gebun den sind, entfernt; es erfolgt also eine zweite B/F-Trennung.

Sodann wird in einem Schritt 7 ein fluoreszierendes Substrat in das Reaktionsgefäß 1 eingegeben, welches aufgrund einer Reak tion mit dem Enzym 5 des enzymmarkierten Antigens 4 Fluores zenzlicht erzeugt. Das derart erzeugte Fluoreszenzlicht wird photoelektrisch mittels eines Licht-Empfangselementes 11 ver messen. Die Intensität des Fluoreszenzlichtes ist ein Maß für die Menge an Antigen 3 in der Probe.

Fig. 3 zeigt eine weitere bekannte EIA-Methode. Bei diesem be kannten Verfahren werden in einem Schritt 1 eine Antigen 3 ent haltende Probe und ein Reagenz, welches Antigen 8 enthält, das dem zu vermessenden Antigen entspricht, aber mit einem Enzym 5 markiert ist, in ein Reaktionsgefäß 1 eingegeben, in dem Anti körper 2 an die Innenwände fixiert sind. Sodann erfolgt in einem Schritt 2 eine Reaktion des Antigens 3 in der Probe und des Antigens 8, welches mit dem Enzym 5 markiert ist, mit den Antikörpern 2 und zwar wird diese Reaktion in der Art eines "Wettbewerbs" zwischen den Teilchen durchgeführt, so daß die Menge an Antigen 3, die an die Körper 2 gebunden ist, propor tional ist der Menge an Antigen 3, die in der Probe enthalten ist, wenn die Menge an enzymmarkierten Antigenen 8 konstant bleibt.

In einem Schritt 3 wird eine B/F-Trennung durchgeführt und freie Antigene werden aus dem Reaktionsgefäß 1 entfernt, worauf in einem Schritt 4 ein farbgebendes Substrat in das Reaktions gefäß eingegeben wird, welches mit den Enzymen 5 reagiert. In einem Schritt 5 wird die Farbreaktion durchgeführt. Während eines Schrittes 6 wird die Farbe der Testflüssigkeit im Reak tionsgefäß photoelektrisch vermessen, wobei ein von einer Lichtquelle 9 ausgehender Lichstrahl die Testflüssigkeit pas siert und mittels eines Lichtempfangselementes 11 vermessen wird, um eine Kolorimetrie durchzuführen. Auf diese Weise kann die Menge an Antigen 3, die in der Probe enthalten ist, gemes sen werden.

Bei der vorstehend anhand der Fig. 1 erläuterten Messung ist es erforderlich, die immunologische Reaktion und die B/F-Trennung zweimal durchzuführen, so daß das Verfahren aufwendig ist und eine lange Zeit erfordert. Da die Antikörper 2 an der Innenwand des Reaktionsgefäßes 1 anhaften, ist es erforderlich, während der gesamten Reaktionszeit eine Agitation (Rührung) durchzufüh ren, um eine gleichmäßige immunologische Reaktion der Antikör per 2 mit den Antigenen 3, welche in der Probe enthalten sind, zu erreichen.

Beim zweiten bekannten Verfahren gemäß Fig. 2 werden die Anti körper auf der Außenfläche einer Vielzahl von feinen Teilchen 7 fixiert, welche gleichmäßig in der Flüssigkeit verteilt sind, weshalb die immunologische Reaktion der Antigene 3 in der Probe mit den Antikörpern 2 auf den Teilchen 7 gleichförmig ausge führt werden kann, ohne das eine Agitation der Flüssigkeit in der Reaktionszeit erforderlich wäre. Jedoch erfordert auch die ses bekannte Verfahren jeweils zweimal eine immunologische Reaktion und eine B/F-Trennung, so daß das Verfahren aufwendig ist und ebenfalls eine lange Zeit beansprucht.

Beim zuletzt anhand der Fig. 3 erläuterten Verfahren wird zwar die immunologische Reaktion nur einmal ausgeführt, jedoch ist es ebenso wie beim ersten Verfahren erforderlich, die Flüssig keit während der immunologischen Reaktion zu agitieren (rüh ren). Darüber hinaus ist bei diesem bekannten Verfahren die Menge an verwendbaren Antigenen oder Antikörpern beschränkt, so daß dieses Verfahren bei einer Vielzahl von Untersuchungen und Analysen nicht einsetzbar ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues immunolo gisches Meßverfahren zu schaffen, bei dem die vorstehend ge nannten Nachteile der bekannten Verfahren überwunden sind, bei dem also insbesondere die immunologische Reaktion nur einmal durchgeführt zu werden braucht, ohne daß eine Agitation der Reaktionsflüssigkeit erforderlich ist und wobei das Verfahren auch bei unterschiedlichen Test- und Analysemethoden verwendbar sein soll.

Das diese Aufgabe erfindungsgemäß lösende Verfahren zum Messen von Antigenen oder Antikörpern, die in einer Probe enthalten sind, sieht folgende Schritte vor:
Einführen einer Probe und einer Vielzahl von Feststoff-Trägern in ein Reaktionsgefäß, das einen porösen Filter aufweist, um eine immunologische Reaktion durchzuführen, wobei jeder der ge nannten Feststoff-Träger durch ein feines Teilchen gebildet ist, an welchem Markierungsmaterial und Antikörper oder Anti gene fixiert sind, wobei die genannten Antigene bzw. Antikörper spezifisch in bezug auf die Antigene oder Antikörper in der zu vermessenden Probe reaktiv sind, und wobei das genannte poröse Filter so ausgelegt ist, daß diskrete Feststoff-Träger es pas sieren können, während ein Komplex aus einer Mehrzahl von Feststoff-Trägern, welche aneinander haften, das poröse Filter nicht passieren kann;
Auswaschen des Reaktionsgefäßes, um freie Feststoff-Träger und andere Substanzen, die im Reaktionsgefäß enthalten sind, durch das poröse Filter zu entfernen, wobei jedoch der aus einer Mehrzahl von aneinander haftenden Feststoff-Trägern gebildete Komplex im und/oder auf dem porösen Filter verbleibt; und
Messen der Menge des Markierungsmaterials, das auf den Fest stoff-Trägern fixiert ist, welche auf und/oder in dem porösen Filter verblieben sind, um das Vorhandensein oder die Menge von Antigenen oder Antikörpern in der Probe zu bestimmen.

Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zum Ermitteln eines Bluttyps folgende Schritte vor:
Es wird eine Agglutinationsreaktion mit roten Blutkörperchen (-Zellen) in einem Reaktionsgefäß durchgeführt, welches ein poröses Filter aufweist mit feinen Löchern, durch welche diskrete rote Blutkörperchen passieren können während agglu tinierte rote Blutkörperchen nicht durchgelassen werden;
Waschen des Reaktionsgefäßes, um diskrete rote Blutkörperchen (d. h. rote Blut-Zellen) und andere Substanzen durch das poröse Filter zu entfernen und agglutinierte rote Blutkörperchen auf dem porösen Filter zu behalten;
Ermitteln des Musters der agglutinierten roten Blutkörperchen auf der oberen Fläche des porösen Filters; und
Bestimmen des Bluttyps entsprechend dem ermittelten Muster.

Gemäß einer dritten Variante des Erfindungsgedankens sieht ein Verfahren zum Messen von Antigenen oder Antikörpern, die in einer Probe enthalten sind, folgende Schritte vor:
Eingeben einer Probe und einer Vielzahl von gefärbten Fest stoff-Trägern in ein Reaktionsgefäß, das ein poröses Filter aufweist, um eine immunologische Reaktion durchzuführen, wobei jeder der genannten gefärbten Feststoff-Träger durch ein feines Teilchen gebildet ist, an dem Antikörper oder Antigene fixiert sind, wobei die genannten Antikörper oder Antigene spezifisch reaktiv sind in bezug auf die Antigene oder Antikörper in der zu vermessenden Probe, und wobei der genannte poröse Filter so ausgelegt ist, daß diskrete gefärbte Feststoff-Träger ihn pas sieren können während ein Komplex aus einer Mehrzahl von ge färbten Feststoff-Trägern den porösen Filter nicht passieren kann;
Waschen des Reaktionsgefäßes, um freie gefärbte Feststoff-Trä ger und andere Substanzen, die im Reaktionsgefäß enthalten sind, durch das poröse Filter zu entfernen, wobei jedoch Kom plexe, die aus gefärbten Feststoff-Trägern, die aneinander haften, auf der oberen Fläche des porösen Filters verbleiben; und
Ermitteln der Komplexe aus gefärbten Feststoff-Trägern, welche auf der oberen Fläche des porösen Filters verblieben sind, um die in der Probe enthaltenen Antigene oder Antikörper zu be stimmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

1) Es ist ausreichend, die Antigen/Antikörper-Reaktion nur einmal durchzuführen, so daß das Verfahren vereinfacht und verkürzt ist.
2) Die Antigen/Antikörper-Reaktion kann mittels einer großen Anzahl von Feststoff-Trägern durchgeführt werden, so daß die Reaktion gleichförmig und gut reproduzierbar innerhalb einer kurzen Zeitspanne durchführbar ist, ohne daß die Flüssigkeit gerührt werden müßte.
3) Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden auf die Messung von Hormonen, Antigenen oder Antikörpern von Viren, Krebs-Markierern, und Medikamenten od. dergl., welche mit herkömmlichen Verfahren meßbar sind, wie der Enzym-Immuno-Analyse (EIA), der Radio-Immuno-Analyse (RIA), der Lumineszenz-Immuno-Analyse (LIA oder CLEIA) und der Fluoreszenz-Immuno-Analyse (FIA) sowie auch zur Be stimmung des Blut-Typs und der Ermittlung von irregulären Antikörpern sowie der Messung von Viren.
4) Wird das erfindungsgemäße Verfahren auf die Bestimmung des Blut-Typs angewandt und dabei das Muster agglutinierter roter Blutkörperchen untersucht, das sich auf einem porö sen Filter bildet, so kann das Muster in deutlicher Weise auf der Oberfläche des Filters erzeugt werden, da nicht agglutinierte rote Blutkörper nicht auf dem Filter ver bleiben. Somit ist eine Blutbestimmung mit sehr hoher Empfindlichkeit möglich.

Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines bekannten EIA-Verfahrens;

Fig. 2 schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines weiteren bekannten EIA-Verfahrens;

Fig. 3 schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines weiteren bekannten EIA-Verfahrens;

Fig. 4A und 4B schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 5A und 5B schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens; und

Fig. 6A und 6B schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens, und

Fig. 6C und 6D Draufsichten auf ein Teilchenmuster, das auf einer Filteroberfläche ausgebildet ist.

Die Fig. 4A und 4B zeigen schematisch die aufeinanderfolgenden Schritte eines ersten Ausführungsbeispiels des erfindungsge mäßen Verfahren. Dieses Ausführungsbeispiel ist besonders ge eignet für die Messung von Hormonen, Viren, Krebs-Markierern und in Blut-Serum enthaltenen Medikamenten.

Bei diesem Ausführungsbeispiel werden Feststoff-Träger 27 ver wendet, welche so definiert sind, daß sie durch feine, unlös liche Teilchen gebildet sind. Sie haben beim dargestellten Aus führungsbeispiel einen Durchmesser von etwa 3 Mikrometern und sind belegt mit Antikörpern 22, die spezifisch reaktiv sind in bezug auf in der Probe enthaltene zu vermessende Antigene.

Die Teilchen sind weiterhin mit einem Markierungsmaterial be schichtet. Beim gezeigten Ausführungsbeispiel ist ein Fest stoff-Träger 27 jeweils mit einem Fluoreszenz-Material be schichtet.

Fig. 4A zeigt einen Fall, bei dem eine Probe zu vermessendes Antigen enthält, während Fig. 4B einen Fall zeigt, bei dem ein solches Antigen nicht in der Probe enthalten ist. Zunächst wer den in einem Schritt 1 eine Probe und ein Teilchen-Reagenz mit den oben erwähnten Feststoff-Trägern 27 in vorgegebener Konzen tration in ein Reaktionsgefäß 21 eingegeben, welches ein porö ses Filter 26 aufweist mit einer Anzahl von feinen Löchern, deren Durchmesser etwa bei 5 Mikrometer liegt. Der Durchmesser der Löcher im Filter 26 ist so ausgewählt, daß jeder einzelne (diskrete) Festkörper-Träger 27 das Filter passieren kann, während jedoch Komplexe aus mehreren (zwei oder mehr) Fest stoff-Trägern, die aneinander gebunden sind, das Filter nicht passieren können. In einem Schritt 2 werden gemäß Fig. 4A eine Vielzahl von Feststoff-Trägern 27 mittels einer immunologischen Reaktion aneinander gebunden und zwar mittels des Antigens 23, das in der Probe enthalten ist und eine Agglutination bewirkt. Bei Schritt 2 gemäß Fig. 4B werden jedoch - weil die Probe keine Antigene 23 enthält - die Feststoff-Träger 27 nicht aneinander gebunden, so daß keinerlei Agglutination erfolgt. In einem an schließenden Schritt 3 wird die Waschung durchgeführt. Beim dargestellten Ausführungsbeispiel wird eine Waschflüssigkeit in das Reaktionsgefäß 21 gegeben und zwar in desssen obere Öffnung und gleichzeitig wird die Waschflüssigkeit durch Anlegen eines Unterdrucks vom Boden des Reaktionsgefäßes abgesaugt.

In Abwandlung des vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiels ist es auch möglich, ein Flüssigkeit absorbierendes Element (insbesondere ein Wasser absorbierendes Element) in Kontakt mit dem Boden des Filters 26 im Reaktionsgefäß 21 zu bringen. Jedes Verfahren, welches die Waschflüssigkeit durch das poröse Filter zieht, kann verwendet werden.

Beim Beispiel gemäß Fig. 4A werden Komplexe aus Feststoff-Trä gern 27 gebildet und diese verbleiben auf der oberen Fläche des porösen Filters 26, während Feststoff-Träger und andere in der Flüssigkeit enthaltene Substanzen über das poröse Filter 26 während des Waschschrittes aus dem Reaktionsgefäß 21 abgezogen wurden.

Beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 4B sind alle Feststoff-Trä ger 27 mittels des Filters 26 während des Waschschrittes aus dem Reaktionsgefäß abgezogen worden.

In Schritt 4 gemäß Fig. 4A wird ein anregender Lichtstrahl, der durch eine Lichtquelle 29 erzeugt wird, auf die obere Fläche des Filters 26 gelenkt und das fluoreszierende Material, das auf die Oberfläche der Feststoff-Träger 27 aufgebracht ist, wird angeregt, um Fluoreszenzlicht zu erzeugen. Das derart erzeugte Fluoreszenzlicht wird mittels eines Lichtempfangs elementes 31 und eines geeigneten optischen Filters 30 nachge wiesen.

Die Intensität des Fluroszenzlichtes ist abhängig von der Menge an Feststoff-Trägern 27, die auf dem Filter 26 verblieben sind, welche Menge ihrerseits proporational ist zur Menge der Anti gene 23, die in der Probe enthalten sind. Somit kann die zu nächst unbekannte Menge der Antigene 23 in der Probe quanti tativ durch Vermessung der Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen werden. Mit bekannten Mengen an Antigen kann die Meß einrichtung geeicht werden.

Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel erfolgt die Agglutinationreaktion der Feststoff-Träger 27 in der sehr dün nen Flüssigkeitsschicht, die sich über die obere Fläche des Filters 26 gleichförmig ausbildet, so daß die Wahrscheinlich keit eines Kontakts zwischen den Antigenen 23 in der Probe und den Antikörpern 22 auf den Trägern 27 sehr groß ist und somit die Agglutinationsreaktion sehr schnell durchgeführt werden kann. Deshalb ist die Meßzeit relativ kurz.

Die Fig. 5A und 5B zeigen aufeinanderfolgende Schritte eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfah rens, welches besonders geeignet ist für die Messung von Hor monen, Viren, Krebs-Markierern und Medikamenten, die in Blut-Serum enthalten sind. Bei diesem Ausführungsbeispiel sind Feststoff-Träger 47 geformt durch unlösliche Teilchen, die mit einer Lumineszenz-Schicht als Markierungsmaterial versehen sind und weiterhin mit Antikörpern 42 versehen sind, welche spezi fisch mit den zu vermessenden Antigenen 43 reagieren.

Die Schritte 1 bis 3 gemäß Fig. 5A entsprechen denen gemäß Fig. 4A, jedoch ist im Schritt 4 vorgesehen, daß in das Reak tionsgefäß 41 ein Reagenz eingegeben wird, wie Peroxid (POD) oder H₂O₂, welche das Lumineszenz-Material (Luminol) auf den Feststoff-Trägern 47 veranlassen, Lumineszenz-Licht abzugeben. Die Intensität des derart erzeugten Lumineszenz-Lichtes wird mittels eines Licht-Empfangselementes 51 über ein optisches Filter 50 gemessen. Auf diese Weise kann die Menge an Antigen 43, die in der Probe enthalten ist, vermessen werden.

Enthält die Probe jedoch kein Antigen 43, wie in Fig. 5B ange nommen ist, so erfolgt keine Agglutinationsreaktion, so daß jegliche Feststoff-Träger 47 nach der Waschung von der oberen Fläche des porösen Filters 46 verschwunden sind. Auch wenn Per oxid und H₂O₂ in das Reaktionsgefäß 41 gegeben werden, wird somit keinerlei Lumineszenz-Licht erzeugt.

Bei den bis jetzt erläuterten ersten und zweiten Ausführungs beispielen kann gezielt der besondere, in der Probe enthaltene Antikörper vermessen werden, wenn der Feststoff-Träger sensi tiviert wird mit einem Antigen, das in bezug auf diesen be stimmten Antikörper spezifisch reagiert.

Die Fig. 6A bis 6D zeigen ein drittes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann der Blut-Typ eines ABO-Systems unter Verwendung einer Agglutinationsreaktion der roten Blutkörperchen bestimmt wer den.

In Schritt 1 gemäß Fig. 6A werden eine Probe, die rote Blutkör perchen enthält (Blut als solches oder eine Dispersion von roten Blutkörperchen) sowie ein Reagenz, welches ein Anti-A- Serum enthält, in ein Reaktionsgefäß 61 eingegeben. Im nachfol genden Schritt 2 wird die Antigen/Antikörper-Reaktion ausge führt und rote Blut-Zellen 75 werden aneinander gebunden, weil auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen bestimmte Antigene 76 fixiert sind, welche den Blut-Typ bestimmen, wobei die Anti gene 76 spezifisch reaktiv sind in bezug auf die Antikörper 62 im Anti-A-Serum. Sodann bilden die agglutinierten roten Blut körperchen ein Agglutinationsmuster auf der oberen Fläche des porösen Filters 66.

Da beim Beispiel gemäß Fig. 6B das Antigen 76 nicht auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen 75 vorhanden ist, erfolgt keine Agglutinationsreaktion und somit befinden sich nur dis krete rote Blutkörperchen auf oder in dem Filter 66. Somit wer den bei der Waschung in Schritt 3 die roten Blutkörperchen 75 über das poröse Filter 66 aus dem Reaktionsgefäß 61 entfernt.

In Fig. 6A verbleiben bei und nach der Waschung in Schritt 3 nur die agglutinierten roten Blutkörperchen 75 auf der Oberfläche des porösen Filters 66.

Fig. 6C ist eine Draufsicht auf die agglutinierte Struktur (Muster) der roten Blutkörperchen, die sich auf der oberen Fläche des porösen Filters 66 gebildet hat. Wie Fig. 6C zu ent nehmen ist, bildet sich bei der Agglutinationsreaktion eine sehr klare Struktur (Muster) der agglutinierten roten Blutkör perchen auf der Oberfläche des Filters. Das so geformte Muster kann dann photoelektrisch in Schritt 4 mittels einer Bildauf nahmevorrichtung 73 und mittels einer Abbildungslinse 72 ver messen werden.

Beim in Fig. 6B illustrierten Verfahren werden alle roten Blut körperchen 75 in Schritt 3 aus dem Reaktionsgefäß 61 ausgewa schen, so daß keinerlei Muster der roten Blutkörperchen auf der Oberfläche des Filters 66 gebildet wird, wie in Fig. 6D gezeigt ist. Deshalb ist es durch Anfertigung eines Bildes der Ober fläche des Filters 66 in Schritt 4 möglich, zu ermitteln, daß die Blutprobe nicht vom A-Typ ist. Nach der Erfindung ist es also möglich, aufgrund der agglutinierten roten Blutkörperchen, die ein deutliches Muster auf der Oberfläche des Filters 66 bilden, den Blut-Typ durch Untersuchung des auf der oberen Fläche des porösen Filters gebildeten Musters zu ermitteln, und zwar entweder apparativ (photoelektrisch oder durch einen Fest körper-Bildaufnahmewandler) oder auch mit dem bloßen Auge.

Wird das vorstehende Verfahren mit zwei unterschiedlichen Anti-Serum-Reagentien, d. h. Anti-A-Serum-Reagenz und Anti-B- Serium-Reagenz durchgeführt, ist es möglich, den Blut-Typ entsprechend dem ABO-System der Blutprobe zu bestimmen. Nach der Erfindung ist es auch möglich, den Blut-Typ unterschied lichster Systeme durch Verwendung geeigneter Anti-Serum-Reagen tien zu bestimmen.

Auch ist es möglich, ein Blut-Serum oder -Plasma als Probe zu verwenden sowie rote Blutkörperchen des 0-Typs als Reagenz für eine irreguläre Antikörper-Messung. In diesem Falle können ir reguläre Antikörper, die in der Probe enthalten sind, gemessen werden.

Die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lasen sich abwandeln. So ist z. B. beim ersten Ausführungsbeispiel gemäß den Fig. 4A und 4B der Feststoff-Träger beschichtet mit einem Fluoreszenzmaterial und das Fluoreszenzlicht wird gemessen, während beim zweiten Ausführungsbeispiel gemäß den Fig. 5A und 5B die Feststoff-Träger mit einem Lumineszenzmaterial, wie Luminol, beschichtet sind und das Lumineszenzlicht gemessen wird. Es können jedoch auch andere Markierungsmaterialien, wie Enzyme, radioaktives Material, ein lumineszentes Substrat, ein fluoreszentes Substrat oder ein farbgebendes Substrat verwendet werden. Weiterhin kann dieses Markierungsmaterial im Feststoff- Träger enthalten sein anstelle einer Auftragung auf die Ober fläche des Trägers. Weiterhin ist es möglich, gefärbte Fest stoff-Träger zu verwenden, die eine starke Anziehungskraft in bezug auf die obere Fläche des porösen Filters aufweisen. In diesem Falle kann das Muster der agglutinierten Feststoff-Teil chen mittels der Farben des Feststoff-Teilchen-Musters auf der oberen Fläche des porösen Filters bestimmt werden, in ähnlicher Weise wie beim dritten Ausführungsbeispiel entsprechend den Fig. 6A bis 6D.

Claims

1. Verfahren zum immunologischen Messen von Antigenen oder Antikörpern, die in einer Proben enthalten sind, mit folgenden Schritten:
Einführen der Probe und einer Vielzahl von festen Trägern in ein Reaktionsgefäß, das mit einem porösen Filter versehen ist, um die immunologische Reaktion durchzuführen, wobei jeder der festen Träger aus einem feinen Teilchen gebildet ist, an dem ein Markierungsmaterial und Antikörper oder Antigene fixiert sind, wobei die genannten Antikörper oder Antigene spezifisch mit den zu messenden Antigenen oder Antikörpern in der Probe reagieren, und wobei das poröse Filter so ausgelegt ist, daß diskrete feste Träger es passieren können, während ein Komplex aus mehreren festen Trägern, die aneinander anhaften, das po röse Filter nicht passieren kann;
Auswaschen des Reaktionsgefäßes, um durch das poröse Filter freie feste Träger und andere Substanzen, die im Reaktionsgefäß enthalten sind, zu entfernen, wobei jedoch aus den festen Trä gern gebildete Komplexe in und/oder auf dem porösen Filter verbleiben, und
Vermessen der Menge des markierenden Materials an oder in den festen Trägern, die auf und/oder in dem porösen Filter verblie ben sind, um das Vorhandensein oder die Menge von Antigenen bzw. Antikörpern in der Probe zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungs material auf die Oberfläche der festen Teilchen aufgetragen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungs material in den festen Trägern enthalten ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungs material lumineszent ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Markierungs material fluoreszierend ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material ein Enzym vorgesehen ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material eine radioaktive Substanz vorgesehen ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material ein Lumineszenz-Substrat vorgesehen ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material ein Fluoreszenz-Substrat vorgesehen ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material ein farbgebendes Substrat vorgesehen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungs material ein Enzym-Substrat vorgesehen ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasch-Schritt derart ausgeführt wird, daß eine Waschflüssigkeit in eine obere Öffnung des Gefäßes eingeführt wird und daß ein Unterdruck an der Unterseite des porösen Filters erzeugt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Wasch- Schritt eine Waschflüssigkeit in eine obere Öffnung des Reak tionsgefäßes eingegeben wird und daß ein flüssigkeitabsorbie rendes Element mit einer unteren Fläche des porösen Filters in Kontakt gebracht wird.

14. Verfahren zum Ermitteln eines Blut-Typs mit folgenden Schritten:
Bewirken einer Agglutinationsreaktion von roten Blutkörperchen in einem Reaktionsgefäß, welches ein poröses Filter aufweist mit feinen Löchern, die für diskrete rote Blutkörperchen pas sierbar sind, nicht jedoch für agglutinierte rote Blutkörper chen;
Auswaschen des Reaktionsgefäßes, um diskrete rote Blutkörper chen und andere Substanzen durch das poröse Filter zu entfer nen, wobei agglutinierte rote Blutkörperchen auf dem porösen Filter verbleiben;
Ermitteln eines Musters agglutinierter roter Blutkörperchen, welches auf der oberen Fläche des porösen Filters gebildet ist; und
Bestimmen des Blut-Typs entsprechend dem ermittelten Muster.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der Ermittlung des Musters der agglutinierten roten Blutkörperchen die Erzeugung eines Bildes der oberen Fläche des porösen Fil ters mittels einer Bildaufnahmeeinrichtung vorsieht.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasch-Schritt derart durchgeführt wird, daß eine Waschflüssigkeit in eine obere Öffnung des Reaktionsgefäßes eingeführt wird, und daß ein Unterdruck an der unteren Fläche des porösen Filters erzeugt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasch-Schritt derart durchgeführt wird, daß eine Waschflüssigkeit in eine obere Öffnung des Reaktionsgefäßes eingeführt wird, und daß ein diese Flüssigkeit absorbierendes Element in Kontakt gebracht wird mit der unteren Fläche des porösen Filters.

18. Verfahren zum immunologischen Messen von Antigenen oder Antikörpern, die in einer Probe enthalten sind, mit folgenden Schritten:
Eingeben der Probe und einer Mehrzahl von gefärbten festen Trä gern in ein Reaktionsgefäß, welches ein poröses Filter auf weist, um eine immunologische Reaktion durchzuführen, wobei jeder der gefärbten festen Träger gebildet ist aus einem feinen Teilchen, an dem Antikörper oder Antigene fixiert sind, wobei die Antikörper oder Antigene spezifisch mit Antigenen oder Antikörpern in der zu vermessenden Probe reagieren, und wobei das poröse Filter so ausgelegt ist, daß diskrete gefärbte feste Träger es passieren können, während ein Komplex aus einer Mehr zahl von gefärbten festen Trägern, die aneinander gebunden sind, das poröse Filter nicht passieren kann;
Auswaschen des Reaktionsgefäßes, um freie gefärbte feste Träger und andere im Reaktionsgefäß enthaltene Substanzen durch das poröse Filter zu entfernen, nicht jedoch Komplexe aus gefärbten festen Trägern, die aneinander gebunden sind, welche auf einer oberen Fläche des porösen Filters verbleiben; und
Bestimmung der Komplexe aus gefärbten festen Teilchen, die auf der oberen Fläche des porösen Filters verblieben sind, um die in der Probe enthaltenen Antigene oder Antikörper zu messen.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der letztgenannte Bestimmungsschritt derart durchgeführt wird, daß ein Bild der oberen Fläche des porösen Filters mittels einer Bildaufnahme einrichtung aufgenommen wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß beim Wasch- Schritt eine Waschflüssigkeit in eine obere Öffnung des Reak tionsgefäßes gegeben wird und daß ein Unterdruck an der unteren Fläche des porösen Filters erzeugt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß beim Wasch- Schritt eine Waschflüssigkeit in ein oberes Ende des Reaktions gefäßes eingegeben wird und daß ein die Flüssigkeit, insbeson dere Wasser, absorbierendes Element in Kontakt gebracht wird mit der unteren Fläche des porösen Filters.