JP2690802B2 - 免疫学的検査法 - Google Patents

免疫学的検査法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔従来の技術〕 免疫学的検査法としては従来ヘテロジニアスEIA法が
広く使われている。その中でもサイドイッチ法が最も検
査適用範囲が広くまた感度の高い方法である。
第４図にその一例として従来技術１を示す。図示する
方法ではまずステップ１において、抗体２を内壁面に固
相化した反応容器１内に試料を分注する。次にステップ
２において第１反応が行われ、試料中に目的の抗原が存
在する場合には、抗原抗体反応により抗体２と抗原３と
が結合する。次にステップ３において抗体２と結合した
抗原と結合しなかった抗原を洗浄操作により分離するB/
F分解が行われ、反応容器１の内部には抗体２と結合し
た抗原だけが残る。次にステップ４で酵素標識抗体４を
分注する。ステップ５で第２反応が行われ抗体２と結合
した抗原３と上記酵素標識抗体４とが抗原・抗体反応に
より結合し、抗原３をはさんで抗体２と酵素標識抗体４
とがサンドイッチ状の結合物を形成し、抗原３に結合し
た酵素標識抗体４は反応容器１の内壁に固定される。
ここで試料中に抗原３が無い場合には、抗体２と酵素
標識抗体４とを連結することができないので酵素標識抗
体４は反応管内壁に固定されることはない。
次にステップ６において結合した酵素標識抗体と結合
しなかった酵素標識抗体とを洗浄によって分離する。B/
F分離が行われ、上記抗原３に結合し、反応容器１の内
壁に固定された標識抗体だけが反応容器１の内に残る。
次にステップ７において、上記酵素標識抗体４に結合
している酵素５と反応して発色する発色基質を分注し、
ステップ８において発色反応を行わせた後、ステップ９
において、その発色の度合を比色法にて測定する。
試料中に抗原３が無い場合には、上記酵素標識抗体
は、ステップ６のB/F分離操作により洗い流されて、反
応容器内に残っていないから、上記発色反応は起らな
い。上記発色反応の発色の度合は、結合した酵素の量に
応じて異なる。また試料中の抗原の量に応じて上記固相
化抗体２に結合する抗原３の量も異なり、従ってその結
合した抗原３に結合する酵素標識抗体の量も異なるの
で、上記発色反応による発色の度合を知ることにより試
料中の検査目的とする抗原の量を知ることができる。
次に、第５図に他の例として従来技術２を示す。図示
する例では、内部にグラスファイバーなどで形成した微
細孔を有するフィルター６を充填した円筒状の反応容器
１に微粒子の表面に抗体を固相化した固相担体７を多数
含む第１の反応試薬と試料を分注する。上記フィルター
６の微細孔のポアサイズは上記固相担体７が単独でも洗
浄などによってもフィルター６を通過できずにフィルタ
ー上あるいは内部に引っ掛かって留まる程度の大きさで
ある。
ステップ１で分注された試料と固相担体７はステップ
２で第１反応を行い試料中に目的の抗原が存在する場合
には、固相担体７上に固相化された抗体２と試料中の抗
原３とが抗原・抗体反応を起して抗原３は、固相担体７
表面上に結合する。次にステップ３で固相担体７に結合
した抗原と結合しない抗原を洗浄操作により分離するB/
F分離を行う。すなわち反応容器１の上方から洗浄液を
注入すると固相担体と結合しなかった抗原あるいは抗体
は洗浄液と一緒にフィルター６を通過して下方に流出す
る。これにより反応容器１内には固相担体７表面に結合
した抗原だけが残ることになる。
次にステップ４で酵素標識抗体４を分注するとステッ
プ５で第２反応が行われ、反応容器１内の固相担体７の
表面上に結合された抗原３と酵素標識抗体４とが抗原・
抗体反応により結合し、抗原３をはさんで抗体２と酵素
標識抗体４とがサンドイッチの結合物を形成し、抗原３
に結合した酵素標識抗体４は、固相担体の表面を固定さ
れることになる。
ここで試料中に抗原３が無い場合には、酵素標識抗体
４と抗体２とを連結することができないので、酵素標識
抗体４は、固相担体表面に固定されることはない。
次にステップ６において、固相担体７の表面に固定さ
れた酵素標識抗体と固定されなかった標識抗体とを上記
ステップ３と同様な方法で洗浄して分離するB/F分離を
行う。
その後、ステップ７で酵素標識抗体４に標識された酵
素５と反応して螢光を発する螢光基質を分注し、発生し
た螢光を受光素子11で測光し、その光量から、試料中の
検査目的とする抗原の量を知ることができる。
第６図に更に他の例の従来技術３を示す。図示する例
では、まずステップ１において内壁に検査目的に応じた
抗体２を固相化した反応容器１の中で、試料および試料
中の目的の抗原３と同じ抗原に酵素５を標識した標識抗
原８を混合するとステップ２において、試料中の抗原３
と標識抗原８とが抗体２に対して競合的に反応し、抗原
３と標識抗原８の量の比によって、それぞれが抗体２と
結合する量が決まり標識抗原８の分注量が一定にしてお
けば、試料中の抗原３の量に応じて、抗体２に結合する
量が決まる。
ステップ３において、B/F分離を行い、反応にあずか
らなかった余分の抗原３やその他の共存物質を除去した
後、ステップ４において標識酵素５と反応して、発色す
る発色基質を分注し、ステップ５において発色反応を行
わせた後、ステップ６においてその発色の程度を光源９
からの励起光を当て受光素子11により比色することによ
り試料中の目的抗原の量を知ることができる。
〔発明が解決しようとする課題〕
上述した従来技術１は、免疫反応を２回行うためB/F
分離などの操作が繁雑でまた結果の出るまでの時間も長
かった。また固相化抗体の固相は反応容器内壁面に限定
されるため、検液中の抗原と固相化抗体との接触の機会
を多くし反応を安定して迅速に行わせようとすると、反
応工程の間常に攪拌操作を行わせていなければならない
不便さがあった。
また従来技術２は、多数の微粒子の表面に抗体を固相
化してあるので、反応工程においてこの微粒子が検液の
中で均一に分散して抗原・抗体反応が行われるため特別
な攪拌操作をしなくても検液中の抗原と微粒子表面上の
抗体との接触の機会は多く安定して迅速な抗原・抗体反
応は得られるが、免疫反応は２回必要であり、B/F分離
などの操作が繁雑であり、また検査結果を得るまでに時
間がかかる。
更に、従来技術３においては、免疫反応は１回ですむ
が、従来技術１と同様、反応工程中常に攪拌操作を必要
とするわずらわしさがあり、またこの方法は、適用でき
る抗原あるいは抗体の種類が限られるため、広範囲の検
査項目に適用できないと言う欠点がある。
本発明は以上の様な従来技術の欠点を解決し、免疫反
応工程を１回としかつ特別な攪拌操作をしなくても安定
して迅速に反応が行われ、また検査の適用範囲も広い免
疫学的検査法を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段〕
上記目的を達成した本発明は、赤血球凝集反応におい
て、赤血球の１個は通過できるが、２個以上の赤血球が
結合した凝集物は通過できない程度の微孔質フィルター
上に赤血球を含む試料と該試料中の赤血球と反応させる
ための抗体を含む試薬とを供給して凝集反応を行わせた
後、前記試料および試薬からなる検液を洗浄して反応に
あずからなかった単体の赤血球及びその他の共存物質は
上記フィルターを通して濾過除去し、抗原・抗体反応に
より２個以上の赤血球が結合した凝集物だけをフィルタ
ーに残した後、このフィルターに残った凝集物が形成す
る凝集像を観察することにより、反応にあずからなかっ
た単体の赤血球の影響を受けることなく試料中の赤血球
表面抗原とそれに対応する抗体を介した凝集物の有無の
判定を行うことを特徴とする。このとき、凝集反応を行
わせた反応容器の上記微孔質のフィルターの下方から、
上記反応にあずからなかった単体の赤血球及びその他の
共存物質を吸引除去することが好ましい。
以下図面を参照して本発明を実施例および参考例によ
り説明する。
〔実施例〕
参考例１ 本例は血清中のホルモン、ウイルス、腫瘍マーカー、
薬物などの検査に好適な方法であり、以下第１図A,Bに
より説明する。
螢光物質を表面にコーティングした直径３μｍ程度の
微粒子に抗体２を感作したものを固相担体７として用い
た。
第１図Ａは試料中に検査目的の抗原を存在する場合で
あり、第１図Ｂは試料中に検査目的の抗原が無い場合で
ある。まず第１図Ａにおいてステップ１で固相抗体７の
１個は通過させるが、複数個の結合物は通過できない程
度、本例では５μｍ程度の微孔質フィルター６を充てん
した円筒状の反応容器１の中に試料と固相担体７を多数
含む反応試液を分注したフィルター６上で混和した。第
１図Ａにおいては、試料中の検査目的の抗原３がステッ
プ２における抗原・抗体反応で、抗原３を仲立ちにして
固相担体７同士が結合するいわゆる凝集反応による凝集
が起り、凝集物を生成した。一方第１図Ｂにおいては試
料中に目的の抗原がなく、固相担体同士を仲立ちして結
合させるものがないから凝集は起らない。次にステップ
３において洗浄操作を行った。洗浄のやり方としては本
例では反応容器１の上方から洗浄液を注入し、それと同
時に反応容器１の下方から陰圧で、洗浄液を吸引した
が、あるいは、吸水性の物質を反応容器１に充てんした
フィルター６の下部に接触させてフィルター６の上部か
ら注入した洗浄液を、フィルター６の下部から吸い取る
方法等種々の方法が考えられる。
ここで、第１図Ａにおいては凝集反応が起り複数個の
固相担体７の結合物が形成され、その結合した固相担体
はフィルター上に残り、凝集反応にあずからなかった単
体の固相担体と、その他の試料中反応試液がフィルター
６を通過して下方に濾過された。
第１図Ｂにおいては、試料中に目的の抗原が存在せ
ず、凝集反応が起らず、全ての固相担体が単体なので、
洗浄操作によりフィルター６上に固相担体が残ることは
ない。
次に第１図Ａの場合はステップ４で、フィルター６の
表面に光源９により励起光を当てると、フィルター６の
表面に残った固相担体７の表面にコーティングされた螢
光物質が励起され螢光を発するのでこの螢光の強度を適
当な光学フィルター10を通して受光素子11で測光した。
ここで測定される螢光の強度はフィルター６上に残っ
た、凝集した固相担体７の数に関係し、更に凝集した固
相担体の数は、試料中の抗原の量に関係するので、上記
螢光の強度を知ることにより、試料中の目的の抗原の量
を知ることができる。
上記、凝集反応は少量の液中に多量の微粒子の固相担
体を含んだ検液が上記フィルター６の表面に一面に広が
った極めて薄い検液層の中で固相担体が密集した状態で
行われるため試料中の抗原３と固相担体７の表面上の抗
体２とが接触する機会で極めて多く、従って凝集反応は
迅速に行われ、検査結果を早く知ることできる。
参考例２ 本例も血清中のホルモン、ウイルス、腫瘍マーカー、
薬物などの検査に好適な方法であり、発光性物質として
ルミノールを用い、ルミノールを表面にコーティングし
た微粒子に抗体を感作したものを固相担体７として用い
た。
以下第２図A,Bにより説明する。
第２図Ａの反応工程のステップ１からステップ３まで
は実施例１と同様であるが、ステップ４において反応容
器１内にルミノールを発光させる物質、本例では、ペル
オキシダーゼ（POD）とH2O2を分注することにより凝集
してフィルター６上に残った固相担体表面にコーティン
グされたルミノールが発光するので、この発光強度を適
当な光学フィルター10を通して受光素子11にて測光する
ことにより試料中の目的の抗原の濃度を知ることができ
た。
また第２図Ｂに示すように試料中に目的の抗原がない
時には、凝集反応は起らないのでステップ３における洗
浄操作の後フィルター６上には固相担体７は残っていな
いのでステップ４においてペルオキシダーゼ（POD）お
よびH2O2などを反応容器１内に分注しても発光は起らな
いので試料中に目的の抗原が存在しなかった事が分っ
た。
以上参考例１および参考例２において固相担体７の表
面に、試料中の目的の抗体に対応する抗原を固相化して
おけば、試料中の抗体を検出することもできる。
実施例１ 本例は、赤血球凝集反応による血液型判定のABO式血
液型を判定する場合について示す。
以下第３図A,Bにより説明する。第３図Ａに示すステ
ップ１において赤血球を含む試料（全血あるいは赤血球
浮遊液）と抗血清の抗Ａ血清を反応容器１内に分注し混
和した。次にステップ２で抗原・抗体反応が行われ、試
料中の赤血球15の表面に上記分注した抗血清中の抗体２
に対応する血液型抗原16と凝集反応が起り、上記赤血球
同志が抗体２を仲立ちにして凝集しフィルター６上に凝
集塊を形成した。
一方第３図Ｂに示す場合には、試料中の赤血球15の表
面に、上記分注した抗血清中の抗体２に対応する血液型
抗原16が存在しない場合には凝集反応は行われず従って
フィルター６上あるいはフィルター中には単体の赤血球
15のみが存在することになる。次にステップ３で洗浄操
作を行った。洗浄の方法は参考例１と同様である。
そうすると、第３図Ａの場合には凝集にあずからなか
った余分の赤血球15やその他の共存物質はフィルター６
を通して濾過除去され、フィルター６上には凝集反応に
あずかって凝集した赤血球の凝集塊だけが残るので、第
３図Ａ−ａに示すように、凝集にあずからなかった余分
な赤血球によるボヤケなどのない凝集塊だけのクリヤー
な凝集像14を得ることができた。これをステップ４にお
いてレンズ12などの光学系を通して撮像素子13などでパ
ターン認識させ、凝集を判定するかあるいは目視判定し
た。
一方第３図Ｂの場合にはステップ３で洗浄操作を行う
とフィルター上の赤血球は全て単体であるから全ての赤
血球および検液中の、その他の共存物質はフィルター６
を通して濾過除去されるので第３図Ｂ−ｂに示すように
フィルター６上には赤血球は全く残らないので、これを
ステップ４において撮像素子13でパターン認識したり目
視観察した時、明確に非凝集であることが分る。
以上の反応において、抗血清として抗Ａ血清および抗
Ｂ血清を用いればABO式血液型を判定することができ、
その他種々の抗血清を用いることにより種々の血液型を
判定することができる。
〔発明の効果〕
以上説明してきたように、本発明によると、 １） 抗原・抗体反応が１回で済むため操作の手間が少
なく、また検査結果が早く分かる。
２） 試料中の赤血球と、赤血球の１個は通過できるが
２個以上の赤血球が結合した凝集物は通過できない程度
の微孔質フィルターとを用いて、多数の赤血球による抗
原・抗体反応を行わせて、凝集物の有無の判定を行うこ
とによって、短時間で検査精度の高い血液型判定或いは
ウイルスの検出等ができる。
３） 判定又は検出すべき凝集にあずからなかった余分
の赤血球がフィルター上に存在しない状態で凝集像を観
察できるので、従来の試料中の赤血球を用いた凝集像に
比べて、余分の赤血球によるボヤケなどの無い極めてク
リヤーなパターンが形成されるから判定又は検出の感度
が向上する。
【図面の簡単な説明】
第１図Ａは参考例１の方法の工程図、 第１図Ｂは参考例１の対照方法の工程図、 第２図Ａは参考例２の方法の工程図、 第２図Ｂは参考例２の対照方法の工程図、 第３図Ａは実施例１の方法の工程図、 第３図Ａ−ａは実施例１のステップ３で濾過した後のフ
ィルター上の赤血球の凝集像を示す説明図、 第３図Ｂは実施例１の対照方法の工程図、 第３図Ｂ−ｂは実施例１の対照方法のステップ３で濾過
した後のフィルター上の状態を示す説明図、 第４図は従来技術１の方法の工程図、 第５図は従来技術２の方法の工程図、 第６図は従来技術の方法の工程図である。 １……反応容器、２……抗体 ３……抗原、４……酵素標識抗体 ５……酵素、６……光学フィルター ７……固相担体、８……標識抗原 ９……光源、10……フィルター 11……受光素子、12……レンズ 13……撮像素子、14……凝集像 15……赤血球、16……血液型抗原

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】赤血球凝集反応において、赤血球の１個は
    通過できるが、２個以上の赤血球が結合した凝集物は通
    過できない程度の微孔質フィルター上に赤血球を含む試
    料と該試料中の赤血球と反応させるための抗体を含む試
    薬とを供給して凝集反応を行わせた後、前記試料および
    試薬からなる検液を洗浄して反応にあずからなかった単
    体の赤血球及びその他の共存物質は上記フィルターを通
    して濾過除去し、抗原・抗体反応により２個以上の赤血
    球が結合した凝集物だけをフィルターに残した後、この
    フィルターに残った凝集物が形成する凝集像を観察する
    ことにより、反応にあずからなかった単体の赤血球の影
    響を受けることなく試料中の赤血球表面抗原とそれに対
    応する抗体を介した凝集物の有無の判定を行うことを特
    徴とする免疫学的検査法。
  2. 【請求項２】凝集反応を行わせた反応容器の上記微孔質
    フィルターの下方から、上記反応にあずからなかった単
    体の赤血球及びその他の共存物質を吸引除去することを
    特徴とする請求項１に記載の免疫学的検査法。
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