DE2427221A1

DE2427221A1 - Verfahren und vorrichtung zum analysieren einer probe

Info

Publication number: DE2427221A1
Application number: DE19742427221
Authority: DE
Inventors: Alexander M Saunders
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1973-06-08
Filing date: 1974-06-06
Publication date: 1975-01-02
Also published as: BE815426A; NL7407719A; JPS6112223B2; SE7407551L; SE414973B; AU6975274A; IT1020632B; US3925018A; JPS5033890A; FR2232757A1; FR2232757B1; DE2427221B2; DE2427221C3; GB1475608A; CA1024424A; CH569970A5

Description

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TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Verfahren und Vorrichtung zum Analysieren einer Probe

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Analysieren einer Probe auf einen Bestandteil, bei dem die Probe mit einem Reagenz zur Reaktion gebracht und ein Produkt der zwischen der Probe und dem Reagenz stattfindenden Reaktion bestimmt wird. Ferner befaßt sich die Erfindung mit einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Aus der US-PS 3 241 432 ist es bekannt, flüssige Proben in Gegenwart von Reagenzien, die in der Form einer Lösung vorliegen, zu analysieren. Diese Analyse wird automatisch unter Anwendung des kontinuierlichen Durchflußprinzips durchgeführt und enthält mehrere verschiedenartige Untersuchungen an verschiedenen Teilmengen jeder Probe. Die aus der genannten Patentschrift bekannte Analysiervorrichtung benutzt für besondere Analysen einen Dialysator, um von einem segmentierten Strom aus flüssigen Proben, beispielsweise aus menschlichen Blutproben, diejenigen Bestandteile, beispielsweise die Proteine, zu trennen, die sonst die Diffusion der Probe in das besondere Reagenz bei jedem der zahlreichen Untersuchungen stören wurden.Diese

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Dialyse erfordert einen getrennten Verfahrensschritt und Einrichtungen zur Durchführung dieses Schritts. Zur quantitativen Bestimmung eines interessierenden Bestandteils der Probe wird bei der bekannten Analysiervorrichtung in Verbindung mit einer Farbreaktion ein Kolorimeter benutzt. Mit Hilfe des Kolorimeters wird in einer Durchflußküvette ein Flüssigkeitsvolumen untersucht, um für eine besondere Untersuchungsreaktion bei einer besonderen Wellenlänge den Grad der Lichtabsorption oder Lichttransmission zu bestimmen. Der dabei anfallende Meßwert stellt ein quantitatives Maß für den interessierenden Bestandteil dar.

Ferner ist es bekannt, eine Suspension aus Partikeln in einen in der gleichen Richtung fließenden flüssigen Mantelstrom einzuleiten, um die Partikel nacheinander durch einen Lichtstrahl zu leiten. Dazu wird eine Mantelstromdurchflußküvette verwendet, wie sie beispielsweise aus einem Aufsatz von P.J. Crosland-Taylorj A Device for Counting Small Particles Suspended in a Fluid strough a Tube, NATURE, 3. Januar 1953, Seite 37, bekannt ist. Darüberhinaus ist es aus der DT-OS 2 153 405 bekannt, eine Suspension aus Partikeln, beispielsweise aus menschlichen Zellen, in Form eines schmalen Stroms durch einen Lichtstrahl zu schicken, um bestimmte Zelleigenschaften festzustellen und anzugeben.

Weiterhin ist es aus einem Aufsatz von Klaus Mosbach, Enzymes Bound to Artificial Matrixes, SCIENTIFIC AMERICAN, März 1971, Seiten 26-33, bekannt, Enzyme an künstliche Matrizen zu binden, um zum Studium von Enzymreaktionen und zur kommerziellen Herstellung von Verbindungen zu imitieren, wie Enzyme in lebenden Zellen an ihrem Platz gehalten werden. Auf der Seite 31 dieser Druckschrift ist eine von Howard H. Weetall and Norman Weliky entwickelte halbquantitative biochemische Analyse beschrieben, bei der die Enzymperoxidase an die Cellulose in der Form eines Papierstreifens gebunden ist. Auf dem Streifen sind kleine Mengen eines farblosen Farbstoffs und einer Lösung aufge-

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bracht, von der angenommen wird, daß sie Wasserstoffperoxid enthält. In Gegenwart der Enzymperoxidase wird in Abhängigkeit von der Menge des vorhandenen Wasserstoffperoxids eine kleinere oder größere Menge des Farbstoffs durch das Wasserstoffperoxid oxydiert.

Nach der Erfindung ist das eingangs beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß in einer Flüssigkeit eine Menge unlöslicher Mikrohalter, die das Reagenz enthalten, suspendiert wird und daß zur Förderung der Reaktion die Flüssigkeit und die Proben gemischt werden.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist nach der Erfindung gekennzeichnet durch eine Einrichtung, in der die Probe mit einem in Lösung befindlichen Reagenz in Gegenwart einer Menge von Mikrohaltern, die in der Lösung suspendiert sind und ein von dem genannten Reagenz unterschiedliches Reagenz enthalten, zur Reaktion gebracht wird, und durch eine Einrichtung, die zur Angabe des Probenbestandteils ein Reaktionsprodukt an den Mikrohaltern bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine quantitative kontinuierliche Durchflußanalyse dar, bei der eine flüssige Probe, im allgemeinen ohne Dialyse, zusammen mit einem flüssigen Reaktionsmittel in zahlreiche, ein Reagenz enthaltende Partikel diffundiert, die im suspendierten Zustand in einem Mantelstrom durch einen Lichtstrahl geleitet werden, um ein Reaktionsprodukt an den Partikeln festzustellen sowie zu messen und dadurch den interessierenden Bestandteil der Probe quantitativ zu bestimmen.

Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die Mikrohalter bzw. Partikel einen größeren Oberflächenbereich für die Diffusion der Probe darbieten und eine vollkommenere Zusammenwirkung der Probe und der Reagenzlösung mit dem in den Partikeln enthaltenen Reagenz sicherstellen. Die Parti-

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kel können aus künstlichen Matrizen bestehen, an die ein Reagenz, beispielsweise ein Enzym, gebunden sein kann. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren führt zu einer höheren Analysierempfindlichkeit, da es die Analyse eines Bestandteils ermöglicht, der nur in einer geringen Konzentration vorhanden ist, oder da es gleichzeitig die Analyse von mehreren interessierenden Probenbestandteilen in Gegenwart voneinander in einem einzigen hydraulischen Analysenkanal ermöglicht. Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren zum Durchführen von zahlreichen verschiedenartigen üntersuchungsreaktionen geeignet und bezüglich seines Anwendungsbereiches sehr flexibel. So kann man beispielsweise das partikelförmige Reagenz in einer Reaktion zum Erzeugen eines nicht stabilen Zwischenprodukts, beispielsweise Glutathion, verwenden, und dann dieses Produkt in einer nachfolgenden Enzymreaktion als Substrat benutzen. Darüberhinaus kann man für die ein Reagenz enthaltenden Partikel biologische Zellen benutzen. Zellen von Gewebekulturen mit kleinen, aber im wesentlichen konstanten Mengen von bestimmten Enzymen kann man zum Analysieren von ihren spezifischen Substraten benutzen.

Die Erfindung besteht somit in einer automatischen naßchemischen Analyse einer Probe und macht von zahlreichen Mikrohaltem oder Mikropartikeln Gebrauch, die jeweils ein Reagenz enthalten.

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Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung nach der Erfindung zur Analyse einer Probe auf einen interessierenden Bestandteil wird somit die Probe mit einem in Lösung befindlichen Reagenz in Gegenwart einer Vielzahl von Mikr ο trägern, die in der Lösung suspendiert sind und die ein gegenüber dem Lösungsreagenz unterschiedliches Reagenz enthalten, zur Reaktion gebracht und als ein Maß für den interessierenden Bestandteil wird ein Reaktionsprodukt an den Mikrohaltern bestimmt. Zur Analyse einer Probe auf mehrere interessierende Bestandteile werden mehrere Arten von Mikrohaltern verwendet, von denen jede Art ein besonderes Kennmerkmal aufweist und ein anderes Reagenz für einen besonderen interessierenden Bestandteil enthält. Die Mikrohalter der verschiedenen Arten werden während der Analyse voneinander unterschieden, um die interessierenden Bestandteile klassifizieren zu können.

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Ein "bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung wird anhand von Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht eines nach der Erfindung arbeitenden Analysiergeräts,

Fig. 2 eine schematische Ansicht einer Durchflußküvette t und einer optischen Einrichtung für das in der Fig. 1 dargestellte Analysiergerät und

Fig. 3 eine in dem Analysiergerät benutzte elektrische Schaltungsanordnung.

Ein in der Fig. 1 dargestelltes Analysiergerät enthält einen zusammendrückbaren Pumpenschlauch 10, über den von einer nicht dargestellten Probenquelle, beispielsweise von einem Probennehmer nach der US-PS 3 038 340, eine Reihe von flüssigen Proben aufeinanderfolgend zugeführt wird. Der Pumpenschlauch 10 ist in einer Proportionierpumpe 12 angeordnet, die entsprechend den Ausführungen in der US-PS 2 935 028 ausgebildet sein kann. Der nicht dargestellte Probennehmer segmentiert den Probenstrom mit Luftschüben in einer solchen Weise, daß jede Probe von ihren Nachbarproben im Probenstrom durch einen Luftschub getrennt ist. Bei den im Probenstrom fließenden Proben kann es sich um verschiedene flüssige Proben handeln, beispielsweise um Blutproben oder Blutserumproben von verschiedenen Patienten. Diese Proben sollen im Hinblick auf mehrere in ihnen vorkommende Substanzen behandelt und analysiert werden. Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel sollen beispielsweise Blut- oder Blutserumproben auf Glucose, Harnsäure und Ascorbinsäure untersucht werden. Das beschriebene Analysiergerät kann aber auch nach entsprechender Modifizierung zum Bestimmen der Menge einer beliebigen Anzahl von Substanzen verwendet werden, die in einer flüssigen Probe vorkommen.

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Der über den Pumpenschlauch 10 zugeführte luftsegmentierte Probenstrom wird während des Fließens zur quantitativen Analyse in bezug auf eine der genannten Substanzen behandelt, und zwar beispielsweise derart, daß die Probe nach einem Lichtabsorptionsverfahren analysiert werden kann. Zu diesem Zweck wird der im Pumpenschlauch 10 befindliche Probenstrom unter der Einwirkung der Pumpe 12 zu einer Verbindungsstelle gefördert, bei der der Probenstrom mit einem gleichzeitig über einen Pumpenschlauch zugeführten inerten Gasstrom zusammengeführt wird, um den Probenstrom durch weitere Gasschübe zu segmentieren. Dieser Strom wird an einer Verbindungsstelle mit einem Reagenzstrom zusammengebracht, der über einen Pumpenschlauch 16 zugeführt wird.

Der durch den Pumpenschlauch 16 fließende Strom wird beispielsweise von einem Kolben 18 zugeführt, der eine Lösung aus einem farblosen Reagenz oder Chromogen enthalten kann, beispielsweise 4-chloro-1-naphthol. In der Lösung im Kolben 18 sind zahlreiche Mikrohalter oder Partikel von drei verschiedenen Arten suspendiert. Jede der Partikelarten weist beispielsweise eine Eigenschaft auf, durch die sie sich von den anderen Partikelarten unterscheidet. Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel handelt es sich bei diesem unterscheidenden Merkmal um die Größe der einzelnen Partikelarten. Die Größe der ersten Partikelart kann beispielsweise 5,0 /um, die Größe der zweiten Partikelart 10,0 /um und die Größe der dritten Partikelart 15,0 Aim betragen. Die Partikel einer Art können sich in ihrer Größe geringfügig voneinander unterscheiden, jedoch nicht in einem so hohen Maße, daß verschiedene Partikelarten größenmäßig miteinander verwechselt werden. Die Partikel der verschiedenen Arten tragen verschiedene, in ihnen enthaltene Reagenzien, die sich vom Reagenz der Lösung im Kolben 18 unterscheiden.

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Die zur praktischen Durchführung der Analyse verwendbaren Partikel fallen grundsätzlich in eine von zwei Klassen. Die Partikel der einen Klasse weisen einen Träger für das in ihnen enthaltene Reagenz auf. Das Reagenz kann an den Träger durch eine kovalente oder eine ionische Bindung gebunden sein. Bei dem Träger kann es sich auch um eine Gelmatrix handeln, in die das Reagenz eingebettet ist. Die Partikel der anderen Klasse können aus Aggregaten von Molekülen bestehen, die das Reagenz enthalten. Diese Klasse von Partikeln kann man nicht als Träger betrachten. Die Partikel von beiden Klassen zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß sie in wäßrigen Lösungen unlöslich sind und gegenüber Wasser und kleinen aufgelösten Stoffen porös sind. Einige sind für aufgelöste Stoffe von großem Molekulargewicht undurchdringlich, während andere in der Lage sind, aufgelöste Stoffe von großem Molekulargewicht und Präzipitate aufzunehmen. Solche Partikel zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, daß sie, wenn sie in wäßrigen Lösungen suspendiert sind, transparent sind und ein spezifisches Gewicht haben, das nahe bei dem von Wasser liegt. Ferner zeichnen sich die Partikel im allgemeinen dadurch aus, daß sie an sich Reaktionsprodukte konzentrieren, beispielsweise dunkle Präzipitate oder farbige Substanzen, so daß diese Produkte optisch analysiert werden können. Im allgemeinen haben diese Partikel eine kugelförmige Gestalt.

Die Partikel oder Mikrohalter, die zu der Klasse mit einem Träger gehören, können einen Träger haben, der in Übereinstimmung mit dem zu tragenden Reagenz und den in Betracht zu ziehenden chemischen Reaktionen, aber auch unter Berücksichtigung von anderen Gesichtspunkten ausgewählt sein kann, und zwar aus einer Gruppe von Stoffen, die beispielsweise Dextran, Gele, Acrylpolymerisate, Polyaminosäuren, Cellulose, Glas, Polystyrol und Stärke umfassen. Die Partikel oder Mikrohalter, die keinen Träger haben, können beispielsweise aus Enzymmolekülen gebildet

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sein, die unter Verwendung von bifunktionellen Verbindungen die Moleküle zu großen Aggregaten querverbinden. Darüberhinaus kommen zahlreiche andere Substanzen in Betracht.

Bei der Analyse der obengenannten Bestandteile, wie Glucose, Harnsäure und Ascorbinsäure, in einer einzigen Probe, können die zur Analyse verwendeten Partikel derart sein, daß sich $ede Partikelart von der anderen durch ihre Größe unterscheidet und alle drei Arten von Partikeln einen Träger aufweisen, der aus Polyacrylamid gebildet sein kann. Alle Reagenzien, die an solche Träger gebunden sind, weisen eine kovalente Bindung auf. An alle Träger der Größengruppe von 5>0 /um werden die Reagenzien GIucoseoxidase und Meerrettichperoxidase zur Bestimmung des in der Probe enthaltenen interessierenden Glucosebestandteils verwendet. Ein solcher Test dient zur Diagnose und Behandlung von Diabetes oder anderen Leiden.' An alle Träger der Größengruppe von 10,0 /Um werden die Reagenzien Uricase, also Harnsäureoxidase, und Meerrettichperoxidase für die Bestimmung des in der Probe vorkommenden interessierenden Harnsäurebestandteils gebunden. Dieser Test dient zur Diagnose und Behandlung von Gicht. An die Träger der Partikel der Größengruppe von 15_f0 /Um werden die Reagenzien Ascorbinsäureoxidase und Meerrettichperoxidase zur Bestimmung des in der Probe enthaltenen interessierenden Ascorbinsäurebestandteils gebunden. Dieser Test dient zur Bestimmung des Ernährungszustands, insbesondere zur Feststellung eines Mangels an Vitamin C. Die Gegenwart von molekularem Sauerstoff in Lösung ist für jeden der obengenannten Tests erforderlich. Die dazu erforderliche Konzentration wird durch die Luftsegmente im Probenstrom sichergestellt.

Die Reagenzsuspension wird von irgendeiner nicht dargestellten Quelle in einer geeigneten Weise über eine Leitung 20 dem Kolben 18 zugeführt. Die suspendierten Parti-

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kel oder Mikrohalter werden in dem Kolben 18 mit Hilfe eines Rührflügels 22, der in einer nicht dargestellten, herkömmlichen Weise angetrieben wird, in Suspension gehalten. Der durch den Pumpenschlauch 16 geführte Reagenzstrom wird mit dem segmentierten Probenstrom zusammengeführt, und der vereinigte Strom durchfließt eine Mischschlange 24, von der er zu einem temperaturgeregelten Inkubator 26 gelangt. Hinter dem Inkubator wird der Probenstrom mit einem Verdünnungsmittelstrom vereinigt, der über eine Leitung 28 zugeführt wird, die an einen Pumpenschlauch 30 der Pumpe 12 angeschlossen ist. Der Einlaß des Pumpenschlauchs 30 steht mit einer nicht dargestellten Verdünnungsmittelquelle in Verbindung. Der verdünnte Probenstrom gelangt dann zu einer Mischschlange 32, die für eine Wiedersuspension der Partikelreagenzien sorgt. Von der Mischschlange 32 gelangt der Strom zu einer Verzweigungsstelle 34, in der der Strom in einer herkömmlichen Weise entgast wird und die entfernten Gase über eine zum Abfluß führende Leitung 36 abgeführt werden. Der verbleibende Flüssigkeitsstrom fließt von der Verzweigungsstelle 34 über eine Leitung 38 zu einer Analysiereinheit 40, die einen Einlaß für den behandelten Probenstrom aufweist. Bei dem dargestellten Beispiel enthält die Einheit 40 eine Durchflußküvette für einen Mantelstrom und optische Einrichtungen.

Die in der Fig. 2 dargestellte Mantelstromdurchflußküvette 41 kann einen Aufbau haben, der in der US-PS 3661460 beschrieben ist. Eine Einzelbeschreibung der Durchflußküvette ist daher hier nicht erforderlich. Die Durchflußküvette 41 weist einen Einlaß 42 für einen behandelten Probenstrom und einen Einlaß 44 für einen Mantelstrom auf. Der Mantelstrom wird von einer nicht dargestellten Quelle der Durchflußküvette zugeführt. Im Sichtbereich 46 der Durchflußküvette wird der behandelte Probenstrom derart eingeengt, daß die im Probenstrom befindlichen genannten Partikel praktisch nacheinander durch den Sichtbereich

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fließen und dabei einen auf den Strom auftreffenden Lichtstrahl überqueren. Vom Auslaß der Durchflußküvette gelangt der Strom über eine Leitung 48 zum Abfluß oder zu einem Sammelbehälter.

Wie es aus der Fig.,2 hervorgeht, kommt der Lichtstrahl von einer Lampe 50 und passiert hinter der Lampe eine Kondensorlinsenanordnung 52 sowie eine zentrische Lochblende 54, bevor er im Sichtbereich 46 der Durchflußküvette auf den behandelten Probenstrom auftrifft. Nach der Bestrahlung des Probenstroms gelangt der Lichtstrahl zu einem dichroitischen Spiegel 56, der als Strahlenteiler wirkt und einen Teil des Strahls mit einer Absorptionswellenlänge durch eine zentrische Lochfeldblende 58 auf eine Fotodiode 60 wirft, die auf Licht dieser Wellenr länge anspricht. Die Fotodiode stellt somit einen Absorptionsdetektor dar. Derjenige Teil des Lichtstrahls, der bei einer Lichtstreuungswellenlänge den dichroitischen Spiegel 56 passiert, gelangt über eine als Fadenkreuz ausgebildete Dunkelfeldblende 62 zu einer Fotodiode 64, die auf die Streuungswellenlänge anspricht und daher einen Streuungsdetektor darstellt.

Zur Erläuterung der chemischen Reaktionen wird wieder auf den in der Fig. 1 dargestellten hydraulischen Teil des Geräts Bezug genommen, und zwar insbesondere auf den Inkubator 26, in dem die chemischen Reaktionen im Hinblick auf die zu betrachtende Mehrfachanalyse stattfinden. Der Glucosebestandteil der Blutprobe bildet in Gegenwart des von den Partikeln mit der Größe von 5,0 /um getragenen Glycoseoxidasereagenzes Wasserstoffperoxid und andere Produkte. In Gegenwart des von den genannten Partikeln getragenen Meerrettichperoxidasereagenzes tritt das Wasserstoffperoxid in eine zweite Reaktion mit dem 4-chloro-1-naphthol als Chromogen ein. Dabei entsteht Wasser und ein dunkles wasserunlösliches Präzipitat mit einem hohen Extinktionskoeffizienten. Das'genannte Peroxidasereagenz

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wird von den genannten Partikeln im Überschuß geliefert, so daß die Menge des dunklen Präzipitats, das sich in diesen Partikeln ausbildet, durch den Absorptionsdetektor 60 meßbar ist, und zwar als eine quantitative Anzeige des interessierenden Glucosesubstrats der Reaktion. Gleichzeitig mit der lichtabsorbierenden optischen Wirkung dieser Partikel auf den Absorptionsdetektor 60 spricht der Streuungsdetektor 64 auf die von der Partikelgröße abhängige lichtstreuende optische Wirkung dieser Partikel an, um die Größe der Partikel zu bestimmen.

Der Harnsäurebestandteil des Bluts bildet in Gegenwart des von den Partikeln mit einer Größe von 10,0 /Um getragenen Enzymreagenzes Uricase oder Harnsäureoxidase Wasserstoffperoxid und andere Produkte. Das Wasserstoffperoxid dieser Reaktion tritt in Gegenwart des in diesen Teilchen gebundenen Enzymreagenzes Meerrettichperoxidase zusammen mit dem 4-chloro-1-naphthol als Chromogen in eine zweite Reaktion ein, wobei Wasser und ein dunkles unlösliches Präzipitat gebildet wird. Die Menge des dunklen Präzipitats, das sich an diesen Teilchen ausbildet, ist durch den Absorptionsdetektor 60 als eine quantitative Anzeige des interessierenden Harnsäuresubstrats der Reaktion meßbar. Gleichzeitig mit der lichtabsorbierenden optischen Wirkung dieser Partikel auf den Absorptionsdetektor 60 spricht wiederum der Streuungsdetektor 64 auf die von der Partikelgröße abhängige lichtstreuende optische Wirkung dieser Partikel an, um ihre Größe festzustellen.

Der Ascorbinsäurebestandteil der Blutprobe bildet in Gegenwart des Enzymreagenzes Ascorbinsäureoxidase, das von den Partikeln mit der Große von 15,0 /Um getragen wird, Wasserstoffperoxid und andere Produkte. Das Wasserstoffperoxid tritt in Gegenwart des von diesen Partikeln getragenen Meerrettichperoxidasereagenzes mit dem 4-Chloro-1-naphthol in eine zweite Reaktion ein, bei der Wasser

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und ein dunkles unlösliches Präzipitat gebildet wird. Die Menge des dunklen Präzipitats, das an diesen Teilchen ausgebildet wird und bei dem es sich um dasselbe dunkle Präzipitat der zuvor beschriebenen Reaktionen handelt, ist durch den Absorptionsdetektor 60 als quantitative Anzeige der interessierenden Ascorbinsäure der Reaktion meßbar. Gleichzeitig mit der lichtabsorbierenden optischen Wirkung dieser Partikel auf den Absorptionsdetektor 60 spricht, wie zuvor, der Streuungsdetektor 64 auf die von der Partikelgröße abhängige lichtabsorbierende optische Wirkung dieser Partikel an, um deren Größe zu bestimmen.

Obwohl es nicht erforderlich ist, ist es von Vorteil, die Reaktionen zum Bestimmen von mehreren interessierenden Bestandteilen der Probe gleichzeitig und in Gegenwart voneinander durchzuführen, wie es bei dem Ausführungsbeispiel der Fall ist. Weiterhin ist es vorteilhaft, daß bei jeder der Reaktionen ein gemeinsames Reaktionsprodukt auftritt, beispielsweise Wasserstoffperoxid, wie bei dem Ausführungsbeispiel, und daß das zu messende Produkt, bei dem es sich beim Ausführungsbeispiel um das dunkle Präzipitat handelt, allen Reaktionen gemeinsam ist. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß die Partikel der drei verschiedenen Größen bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ein gemeinsames Reagenz tragen, nämlich Meerrettichperoxidase. Derartige Gemeinsamkeiten vermeiden Probleme, die sonst in Anbetracht von unterschiedlichen pH-Bedingungen und unterschiedlichen Probendiffusions- und Reaktionsgeschwindigkeiten auftreten könnten.

Die Reagenzpartikel oder Mikrohalter der drei verschiedenen Größenarten passieren somit nacheinander in einer willkürlichen Reihenfolge den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette 40. In der Fig. 3 ist die Signalverarbeitung zum Unterscheiden der verschieden großen Reagenzpartikel beschrieben, die hier eine Größe von 5,0 /Um, 10,0 /Um oder

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15,0 /Um haben. Aufgrund einer Lichtstreuung gibt der Streuungsdetektor 64 über eine Leitung 66 ein Signal an einen Verstärker ab. Der Ausgang des Verstärkers ist über eine Leitung 68 an die Eingänge von Schwellwertvergleichern I bis IV angeschlossen. Dem Vergleicher I wird eine Eingangsbezugsspannung V1 zugeführt, die niedriger als dl^ Eingangsbezugsspannung V2 des Vergleichers II ist. Die Eingangsbezugsspannung V3 des Vergleichers III ist höher als die Bezugsspannung V2 und niedriger als die Eingangsbezugsspannung V4 des Vergleichers IV. Die verstärkten Spannungssignale, die von den Partikeln mit der Größe von 5,0 /um stammen, fallen zwischen die Bezugsspannungen V1 und V2. Die verstärkten Spannungssignale, die von den Partikeln mit der Größe von 10,0 /van. stammen, fallen zwischen die Bezugsspannungen V2 und V3. Die verstärkten Spannungssignale, die von den Partikeln mit der Größe von 15,0 /um. stammen, fallen zwischen die Bezugsspannungen V3 und V4.

Der Ausgang des Vergleichers I ist an den Eingang eines monostabilen Multivibrators 70 angeschlossen. In entsprechender Weise ist der Ausgang des Vergleichers II an den Eingang eines monostabilen Multivibrators 72, der Ausgang des Vergleichers III an den Eingang eines monostabilen Multivibrators 74 und der Ausgang des Vergleichers IV an den Eingang eines monostabilen Multivibrators 76 angeschlossen. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators führt zu dem einen Eingang eines NAND-Glieds 78. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 72 ist an den anderen Eingang des NAND-Glieds 78 und an den einen Eingang eines NAND-Glieds 80 angeschlossen. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 74 ist an den anderen Eingang des NAND-Glieds 80 und an den einen Eingang eines NAND-Glieds 82 angeschlossen. Der Ausgang des monostabilen Multivibrators 76 ist an den anderen Eingang des NAND-Glieds 82 angeschlossen.

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Der Ausgang des NAND-Glieds 78 ist über eine Leitung 84 mit dein Eingang eines voreingestellten Zählers 86 verbunden, um die durch den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette strömenden Partikel mit der Größe von 5,0 /um zu zählen. Der Ausgang des NAND-Glieds 80 ist über eine Leitung 88 mit dem Eingang eines voreingestellten Zählers 90 verbunden, um die durch den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette strömenden Teilchen mit der Größe von 10,0 /Um zu zählen. Der Ausgang des NAND-Glieds 82 ist über eine Leitung 92 mit dem Eingang eines voreingestellten Zählers 94 verbunden, um die durch den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette strömenden Teilchen mit der Größe von 15,0 /um zu zählen. Die voreingestellten Zähler 86, 90 und 94 können alle auf denselben Wert voreingestellt sein, beispielsweise auf 10000.

Immer wenn der Zähler 86 ein Teilchen zählt, gibt er über eine Leitung 96 ein Ausgangssignal an den einen Eingang · eines Datentransferglieds 98 ab. In ähnlicher Weise gibt der Zähler 90, wenn er ein Teilchen zählt, über eine Leitung 100 ein Ausgangssignal an den einen Eingang eines Datentransferglieds 102 ab. In entsprechender Weise gibt der Zähler 94, wenn er ein Teilchen zählt, über eine Leitung 104 ein Ausgangssignal an den einen Eingang eines Datentransferglieds 106. ab,

Wie es aus der Fig. 3 hervorgeht, werden die Glieder 98, 102 und 106 durch die Ausgangssignale der voreingestellten Zähler 86, 90 und 94 freigegeben. Die Ausgänge der Glieder 98, 102 und 106 führen jeweils zu dem Eingang eines zugeordneten Akkumulators 108. Die Ausgänge der Akkumulatoren sind über geeignete Kabel mit den Eingängen eines Multiplexers 110 verbunden, dessen Ausgang an den Eingang eines Druckers 112 angeschlossen ist, um die Gesamtabsorptionswerte anzugeben, die vom Absorptionsdetaktor 60 aus der Menge der von 10000 gezählten Teilchen getragenen Reaktionsprodukte für jede der drei Größenarten

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gewonnen werden, wenn diese Teilchen durch den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette strömen. Die von dem Drucker gegebene Sichtanzeige ist in drei Abschnitte unterteilt, von denen jeder Abschnitt einen interessierenden Bestandteil quantitativ angibt.

Wie es aus der Fig. 3 hervorgeht, wird das Ausgangssignal des Absorptionsdetektors 60 über eine Leitung 114 dem Eingang eines Verstärkers zugeführt. Das verstärkte Signal gelangt über eine Leitung 116 zu einem Analog/Digital-Umsetzer 118, der die Amplitude dieses Signals in eine Binärzahl umsetzt. Diese Binärzahl erscheint an einer Leitung 120, die mit jedejn der anderen Eingänge der Datentransferglieder 98, 102 und 106 verbunden ist. Die jeweils zugeordneten MuItivibratoren 70, 72, 74 und 76 arbeiten mit den Datentransfergliedern 98, 102 und 106 derart zusammen, daß sie diese Glieder für eine hinreichend lange Zeit, beispielsweise 20 /US, offenhalten, damit die das Reaktionsprodukt der durch den Sichtbereich strömenden Partikel quantitativ anzeigende binäre Zahl zu dem entsprechend zugeordneten Akkumulator 108 gelangen kann. Das besondere Partikel, das gerade durch den Sichtbereich der Durchflußküvette strömt und das Reaktionsprodukt trägt, betätigt somit einen der voreingestellten Zähler 86, 90 und 94, und dieser Zähler gibt nur das ihm zugeordnete Glied der Datentransferglieder frei, um die dem Reaktionsprodukt dieses Partikels entsprechende Binärzahl an der Leitung 120 in den zugeordneten Akkumulator 108 zu übertragen. Die Zeitspanne, während der dieses Datentransferglied durch die Multivibratorwirkung offengehalten bzw. im durchgeschalteten Zustand gehalten wird, ist kürzer als die Zeit, die zwischen dem Durchtreten von zwei aufeinanderfolgenden Partikeln durch den Lichtstrahl vergeht.

Die Arbeitsweise der in der Fig. 3 dargestellten Signalverarbeitungsanordnung geht somit augenscheinlich aus dem

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beschriebenen und gezeigten Aufbau hervor. So wirkt beispielsweise ein Teilchen oder Partikel mit einer Größe von 10,0 /Um, das vom Lichtstrahl getroffen den Sichtbereich 46 der Durchflußküvette durchströmt und eine besondere Menge des dunklen Präzipitats trägt, das in Übereinstimmung mit der beschriebenen Reaktion die interessierende Harnsäure anzeigen soll, gleichzeitig auf den Absorptionsdetektor 60 und den Streuungsdetektor 64 ein. Das verstärkte Streuungssignal an der Leitung 68 erregt die Vergleicher I und II, jedoch nicht die Vergleicher III und IV, da die verstärkte Spannung zwischen die Bezugsspannungen V2 und V3 fällt. Die Vergleicher I und II steuern daher die Multivibratoren 70 und 72 an, die daraufhin das NAND-Glied 80 durchschalten, so daß das Signal zur Leitung 88 gelangt. Das NAND-Glied 78 bleibt gesperrt bzw. geschlossen. Das Signal an der Leitung 88 aktiviert den Zähler 90, um das Partikel im Sichtbereich der Durchflußküvette zu registrieren. Der voreingestellte Zähler 90 gibt dann über die Leitung 100 ein Signal an den Eingang des Datentransferglieds 102 ab. Gleichzeitig wird das vom Absorptionsdetektor 60 stammende verstärkte Absorptionssignal über die Leitung 116 dem Eingang des Analog/ Digital-Umsetzers 118 zugeführt, der dieses Signal in Abhängigkeit von der Signalamplitude in eine Binärzahl umsetzt. Diese Binärzahl tritt an der Leitung 120 auf. Da durch das Streusignal das Datentransferglied 1>02 freigegeben bzw. geöffnet ist, kann die an der Leitung 120 liegende Binärzahl das Glied 102 passieren und zu dem an dieses Glied angeschlossenen Akkumulator 108 gelangen, um registriert zu werden. Der Akkumulator 108 wird von dem Multiplexer 110, der den Drucker 112 ansteuert, abgetastet, um den Gesamtabsorptionswert des interessierenden Bestandteils auszudrucken, der den akkumulierten Zählwert von insgesamt 10000 Partikeln der Größe von 10,0 /um darstellt. In entsprechender Weise werden die Partikel mit der Größe von 5,0 /um und 15,0 /um von den Zählern 86 und 94 gezählt und dann die Gesamtabsorptionswerte der voll-

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ständigen Partikelzählungen für jede Partikelgröße durch den Drucker 112 ausgedruckt. Anstelle des hier beschriebenen Lichtabsorptionsverfahrens kann man zur Analyse der interessierenden Bestandteile auch ein Fluoreszenzverfahren anwenden.

Ein weiteres Beispiel einer mehrfachen Simultananalyse in einem gemeinsamen hydraulischen Kanal ist eine Analy-.se, bei der die interessierenden Bestandteile Glucose und Glycin sind und unterstellt wird, daß die Probe freies Wasserstoffperoxid enthält. Es werden drei verschiedene Arten von Partikeln mit Reagenzien benutzt, die·in einer Lösung aus einem anderen Reagenz suspendiert sind, wie das zuletztgenannte Chromogen. Die eine Partikelart enthält als Reagenz Peroxidase, die andere enthält als Reagenzien Glucoseoxidase und Peroxidase und die dritte enthält als Reagenzien Glycinoxidase und Peroxidase. Die Reaktion der Glucose mit der Glucoseoxidase und die Reaktion des Glycin mit der Glycinoxidase ergeben beide Wasserstoffperoxid als Reaktionsprodukt.

Dieses Reaktionsprodukt und das freie Wasserstoffperoxid der Probe reagieren mit der Peroxidase von allen drei Partikelarten, um in unterschiedlichen Mengen an den Partikeln von allen drei Arten ein gemeinsames dunkles Präzipitat zu bilden. Da sich das bei den genannten Reaktionen gebildete Wasserstoffperoxid in dem Mikronahbereich der Partikel der zweiten und dritten Art befindet, was bedeutet, daß die Wasserstoffperoxiderzeugung in Gegenwart der Peroxidase stattfindet, wird praktisch das gesamte Wasserstoffperoxidprodukt der Reaktionen in dunkles Präzipitat an den Partikeln umgesetzt. Die in die Lösung diffundierte Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids ist so klein, daß sie gegenüber dem Gesamtvolumen der Lösung vernachlässigbar ist. Wenn nan daher bei beendeter Zählung den Gesaintabsorptionswert der Partikel-

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art, die als Reagenz nur Peroxidase enthält und damit das freie Wasserstoffperoxid in der Probe angibt, von jedem der Gesamtabsorptionswerte der beiden anderen Partikelarten subtrahiert wird, erhält man als Subtraktionsergebnis wahre Absorptionswerte für die beiden interessierenden Bestandteile.

Wenn beispielswesie die Aktivität der Enzymamylase im Blut von Interesse ist, kann der in der Probe vorkommende Überschuß an Glycose, die die Reaktion der Enzymamylase und ihre in der Reaktion vonhandenen Substrate stört, in nicht störende Substanzen aufgebrochen werden, indem man diese Glycose mit Partikeln zur Reaktion bringt, die Glycoseoxidase enthalten.

Enzyme, die für ähnliche Arten von Analysen als Reagenzien in den Partikeln benutzt werden, sind zur Bestimmung ihrer Inhibitoren wirksam, die beispielsweise im menschlichen Körper vorhanden sind. Der Trypsininhibitor, der bei Enphysemleiden abgeschwächt wirkt, ist für solche Krankheiten prognostisch. Der Hyaluronidaseinhibitor wirkt bei besonderen Krankheiten verstärkt.

Das Verfahren und die Vorrichtung können für Reihen aus Antigenen oder Antikörpern verwendet werden. So kann man beispielsweise verschiedene Antigene mit jeweils denselben Proteinen, die kollektiv als Komplement bekannt sind, in verschiedene Partikelgrößen einbringen. Besondere Antikörper werden mit dem besonderen Antigen in der einen oder anderen Partikelgröße einen Komplex bilden. Dieser Komplex reagiert dann mit dem Komplement und aktiviert diesen infolge seiner Enzymfunktion. Allerdings aktivieren nicht alle Antikörper dasselbe Antigen. Andererseits sind zahlreiche Arten von Antikörper-Antigen-Komplexen bekannt, die dasselbe Komplement aktivieren. Das Komplement enthält ein inaktives Enzym, das als Reagenz betrachtet wird.Die Partikel sind in einer Lösung suspendiert, die beispi «ds ^e.:*? Al p^anaph ttiylacetat, ein Sub-

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strat für das Komplementenzym und einen Azokoppler enthält. Die verschiedenen Antigene vereinigen sich mit irgendwelchen der in der Probe vorhandenen besonderen Antikörpern und aktivieren in einer Kettenreaktion das Komplement, das in den Reagenzpartikeln enthalten ist, in denen ein Antigen-Antikörper-Komplex ausgebildet wird. In der Gegenwart des aktivierten Enzyms dieser Partikel wird das Substrat Alphanaphthylacetat zerlegt, wobei Alphanaphthol entsteht, das mit dem Azokoppler reagiert, um an den Partikeln, an denen die Antigen-Antikörper-Komplexe ausgebildet wurden, ein zum Nachweis dienendes wasserunlösliches Präzipitat zu erzeugen.

Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist die Partikelgröße die Kenngröße, um bei der gleichzeitigen Vielfachanalyse in einem einzigen hydraulischen Kanal verschiedene Arten von gleichzeitig anwesenden Reagenzpartikeln voneinander zu unterscheiden. Unter Verwendung von geeigneten optischen und signalverarbeitenden Einrichtungen kann man zum Unterscheiden der verschiedenen Partikelarten auch andere Kenngrößen verwenden, beispielsweise die Farbe. Dazu kann man eine Farbcodierung der verschiedenen Arten von Reagenzpartikeln vornehmen.

Falls die Analyse lediglich für einen einzigen interessierenden Bestandteil vorgenommen wird und beispielsweise eine Farbreaktion umfaßt, kann das Reaktionsprodukt der Probe in bezug auf das benutzte Mikrohalterreagenz oder die benutzten Reagenzien lösbar sein oder nicht. Im ersten Fall kann die Reaktion beispielsweise kolorimetrisch analysiert werden.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zum Analysieren einer Probe auf einen Bestandteil, bei dem die Probe mit einem Reagenz zur Reaktion gebracht und ein Produkt der zwischen der Probe und dem Reagenz stattfindenden Reaktion bestimmt wird,

dadurch gekennzeichnet, daß in einer Flüssigkeit eine Menge unlöslicher Mikrohalter,. die das Reagenz enthalten, suspendiert wird und daß zur Förderung der Reaktion die Flüssigkeit und die Probe gemischt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß in der Flüssigkeit ein Reagenz gelöst wird, das von dem in den Mikrohaltern enthaltenen Reagenz verschieden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrohalter einen Träger für das in ihnen enthaltene Reagenz aufweisen.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrohalter in einen kontinuierlich fließenden Strom eingebracht werden, um darin mit der Probe zu reagieren.

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5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,

daß das in den Mikrohaltern enthaltene Reagenz ein ist.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einige der Mikrohalter mehrere Reagenzien enthalten.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikrohalter Partikel verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Analysieren der Probe auf mehrere Bestandteile in Gegenwart voneinander mehrere Arten von Mikrohaltern verwendet werden, von denen jede Mikrohalterart ein anderes Reagenz für einen anderen der Bestandteile enthält und von den übrigen Mikrohalter arten durch ein feststellbares Kennmerkmal unterscheidbar ist, daß die verschiedenen Mikrohalterarten aufgrund ihrer verschiedenen Kennmerkmale voneinander unterschieden werden und daß zur quantitativen Angabe der verschiedenen Bestandteile die Reaktionsprodukte an den Mikrohaltern der verschiedenen Arten bestimmt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den unterscheidbären Kennmerkmalen der Mikrohalterarten um Unterschiede in der Größe handelt.

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10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe bei der Reaktion zusätzlich mit einer weiteren Art von Mikrohaltern zur Reaktion gebracht wird, die ein Reagenz enthalten und die ein feststellbares Kennmerkmal aufweisen, mit dessen Hilfe diese Mikrohalterart von den übrigen Arten unterscheidbar ist, daß diese weitere Mikrohalterart von den übrigen Arten unterschieden wird und daß an den Mikrohaltern dieser weiteren Art das Reaktionsprodukt bestimmt wird, das bei der Bestimmung der interessierenden Probenbestandteile als Bezugsgröße dient.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die reagierten Mikrohalter zur Unterscheidung der Mikrohalterarten und zur Bestimmung der Reaktionsprodukte an den Mikrohaltern nacheinander als Strom durch einen Lichtstrahl geleitet werden, in dem die Mikrohalter aufeinanderfolgend bestrahlt werden, und daß jeder bestrahlte Mikrohalter zur Feststellung seines Kennmerkmals fotometrisch abgefühlt wird und gleichzeitig das Reaktionsprodukt von jedem Mikrohalter fotometrisch abgefühlt wird.
12. Vorrichtung zum Analysieren einer Probe auf einen Bestandteil,

gekennzeichnet durch eine Einrichtung, in der die Probe mit einem in Lösung befindlichen Reagenz in Gegenwart einer Menge von Mikrohaltern, die in der Lösung suspendiert sind und ein von dem genannten Reagenz unterschiedliches Reagenz enthalten, zur. Reaktion gebracht wird, und durch eine Einrichtung, die zur Angabe des Probenbestandteils ein Reaktionsprodukt an den .Mikrohaltern bestimmt.

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13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zum Analysieren der Probe auf mehrere Bestandteile in Gegenwart voneinander mehrere Arten von Mikrohaltern verwendet werden, von denen jede Mikrohalterart ein anderes Reagenz für einen anderen der Bestandteile enthält und von den übrigen Mikrohalterarten durch ein feststellbares Kennmerkmal unterscheidbar ist, und daß eine Einrichtung vorgesehen ist, die die verschiedenen Mikrohalterarten aufgrund ihrer verschiedenen Kennmerkmale voneinander unterscheidet, und eine Einrichtung vorgesehen ist, die zur Angabe der verschiedenen Proberibestandteile die Reaktionsprodukte an den Mikrohaltern der verschiedenen Arten bestimmt.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Bestimmen eines Reaktionsprodukts an den Mikrohaltern eine Durchflußküvette (41), durch die die Mikrohalter nacheinander fließen, und eine mit der Durchflußküvette zusammenarbeitende fotometrische Ein-'richtung (50, 60) enthält, die von jedem reagierten Mikrohalter die Lichtabsorption registriert.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13, , dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Unterscheiden der verschiedenen Mikrohalterarten eine Durchflußküvette (41), durch die die Mikrohalter nacheinander fließen, und mit der Durchflußküvette zusammenarbeitende fotometrische und logische Einrichtungen (50, 64 und I, II ...., 70, 72 ...., 78, 80 ..., 84, 90 ..., 98, 102 ..., 108, 110) enthält, die die unterschiedlichen Kennmerkmale der Mikrohalterarten feststellen und die Mikrohalter ihrer Art nach identifizieren,und daß die Einrichtung zum Bestimmen der Reaktionsprodukte an den Mikrohaltern einen zwischen die Durchflußküvette und die logische Einrichtung geschalteten Fotodetektor (6o) enthält,

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der gleichzeitig mit der Feststellung des die Mikrohalterart betreffenden Kennmerkmals eines Mikrohalters ein Absorptionskennmerkmal des Mikrohalters registriert.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung, in der die Probe zur Reaktion gebracht wird, einen einzigen kontinuierlichen Durchflußkanal (24, 26, 32, 38, 40) aufweist.

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