RU2640246C2 - Устойчивые к бактериям трансгенные растения - Google Patents
Устойчивые к бактериям трансгенные растения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2640246C2 RU2640246C2 RU2013143539A RU2013143539A RU2640246C2 RU 2640246 C2 RU2640246 C2 RU 2640246C2 RU 2013143539 A RU2013143539 A RU 2013143539A RU 2013143539 A RU2013143539 A RU 2013143539A RU 2640246 C2 RU2640246 C2 RU 2640246C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plant
- protein
- seq
- nucleotide sequence
- plants
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 50
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 52
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 52
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 327
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 11
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 claims description 9
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims description 8
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 8
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 8
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 claims description 6
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 241001507946 Cotoneaster Species 0.000 claims description 5
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 claims description 5
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 claims description 5
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims description 5
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 claims description 5
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 claims description 4
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009917 Crataegus X brevipes Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013204 Crataegus X haemacarpa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009685 Crataegus X maligna Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009444 Crataegus X rubrocarnea Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009486 Crataegus bullatus Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000017181 Crataegus chrysocarpa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009682 Crataegus limnophila Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000004423 Crataegus monogyna Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002313 Crataegus paludosa Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000009840 Crataegus x incaedua Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000208152 Geranium Species 0.000 claims description 4
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 4
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000128206 Pyracantha coccinea Species 0.000 claims description 4
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 claims description 4
- 241001092391 Sorbus Species 0.000 claims description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000008345 mountainash Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims description 4
- 240000000171 Crataegus monogyna Species 0.000 claims 2
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 94
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 30
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 26
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 17
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 14
- 241000589649 Xanthomonas campestris pv. campestris Species 0.000 description 13
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 13
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 11
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 9
- 241000588694 Erwinia amylovora Species 0.000 description 9
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 9
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 9
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 8
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 7
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- 241000589652 Xanthomonas oryzae Species 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 6
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 6
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 5
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 4
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241001327829 Erwinia pyrifoliae Species 0.000 description 4
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000234295 Musa Species 0.000 description 4
- -1 N-substituted 7-quinolylmethylamine Chemical class 0.000 description 4
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 4
- 108010008681 Type II Secretion Systems Proteins 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 101150063420 hrpA gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001092040 Crataegus Species 0.000 description 3
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 241001677738 Aleuron Species 0.000 description 2
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 241000349755 Baikiaea Species 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 2
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 244000037364 Cinnamomum aromaticum Species 0.000 description 2
- 235000014489 Cinnamomum aromaticum Nutrition 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 244000236931 Cydonia oblonga Species 0.000 description 2
- 241001187100 Dickeya dadantii Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033558 Histone H1.8 Human genes 0.000 description 2
- 101100123312 Homo sapiens H1-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 2
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100454022 Oryza sativa subsp. japonica OSH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 2
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 241000204715 Pseudomonas agarici Species 0.000 description 2
- 241001148199 Pseudomonas tolaasii Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100242307 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SWH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012639 bacterial effector Substances 0.000 description 2
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 2
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 101710124145 1,4-alpha-glucan-branching enzyme 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 1
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 1
- WFPZSXYXPSUOPY-UHFFFAOYSA-N ADP-mannose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WFPZSXYXPSUOPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022933 ATM interactor Human genes 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 240000004507 Abelmoschus esculentus Species 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000219068 Actinidia Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000157282 Aesculus Species 0.000 description 1
- 241000592335 Agathis australis Species 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000524150 Albizia amara Species 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241001135756 Alphaproteobacteria Species 0.000 description 1
- 241000962146 Alsophila tricolor Species 0.000 description 1
- 241000744007 Andropogon Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 102000010637 Aquaporins Human genes 0.000 description 1
- 108010063290 Aquaporins Proteins 0.000 description 1
- 101100036901 Arabidopsis thaliana RPL40B gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003911 Arachis Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 244000080767 Areca catechu Species 0.000 description 1
- 235000006226 Areca catechu Nutrition 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000243239 Astelia fragrans Species 0.000 description 1
- 241001061305 Astragalus cicer Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000701513 Badnavirus Species 0.000 description 1
- 235000012284 Bertholletia excelsa Nutrition 0.000 description 1
- 244000205479 Bertholletia excelsa Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 244000277360 Bruguiera gymnorhiza Species 0.000 description 1
- 241001424028 Burkea africana Species 0.000 description 1
- 241000565319 Butea monosperma Species 0.000 description 1
- 102100031102 C-C motif chemokine 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000628166 Cadaba farinosa Species 0.000 description 1
- 235000008635 Cadaba farinosa Nutrition 0.000 description 1
- 101100495842 Caenorhabditis elegans cht-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451483 Caenorhabditis elegans hrpk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001343295 Calliandra Species 0.000 description 1
- 244000292211 Canna coccinea Species 0.000 description 1
- 235000005273 Canna coccinea Nutrition 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000021511 Cinnamomum cassia Nutrition 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 241000350000 Colophospermum mopane Species 0.000 description 1
- 235000014493 Crataegus Nutrition 0.000 description 1
- 240000005109 Cryptomeria japonica Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 1
- 244000024469 Cucumis prophetarum Species 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 244000304337 Cuminum cyminum Species 0.000 description 1
- 108010060273 Cyclin A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 1
- 108010058545 Cyclin D3 Proteins 0.000 description 1
- 102100025191 Cyclin-A2 Human genes 0.000 description 1
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 241000931332 Cymbopogon Species 0.000 description 1
- FEPOUSPSESUQPD-UHFFFAOYSA-N Cymbopogon Natural products C1CC2(C)C(C)C(=O)CCC2C2(C)C1C1(C)CCC3(C)CCC(C)C(C)C3C1(C)CC2 FEPOUSPSESUQPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000746417 Dalbergia monetaria Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241000035389 Davallia divaricata Species 0.000 description 1
- 241000522190 Desmodium Species 0.000 description 1
- 241000196119 Dicksonia Species 0.000 description 1
- 241000219761 Dioclea Species 0.000 description 1
- 101500011076 Diploptera punctata Allatostatin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101150093545 EXPA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007349 Eleusine coracana Nutrition 0.000 description 1
- 244000078127 Eleusine coracana Species 0.000 description 1
- 241000982867 Erwinia psidii Species 0.000 description 1
- 101100395587 Erwinia pyrifoliae hrpA gene Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 241001175061 Euclea schimperi Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 244000233576 Feijoa sellowiana Species 0.000 description 1
- 235000012068 Feijoa sellowiana Nutrition 0.000 description 1
- 241001022083 Flemingia Species 0.000 description 1
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 1
- 241000169596 Freycinetia Species 0.000 description 1
- 102100024185 G1/S-specific cyclin-D2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037859 G1/S-specific cyclin-D3 Human genes 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 244000105059 Geranium thunbergii Species 0.000 description 1
- 235000005491 Geranium thunbergii Nutrition 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101710180399 Glycine-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000014751 Gossypium arboreum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001814 Gossypium arboreum Species 0.000 description 1
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 241001648387 Grevillea Species 0.000 description 1
- 241000013479 Guibourtia coleosperma Species 0.000 description 1
- 241000214032 Hedysarum Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 108010066161 Helianthus annuus oleosin Proteins 0.000 description 1
- 241001582739 Heteropogon <robber fly> Species 0.000 description 1
- 102100033636 Histone H3.2 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101100321942 Homo sapiens AAR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000902754 Homo sapiens ATM interactor Proteins 0.000 description 1
- 101000878213 Homo sapiens Inactive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP6 Proteins 0.000 description 1
- 101001130308 Homo sapiens Ras-related protein Rab-21 Proteins 0.000 description 1
- 101100396051 Hordeum vulgare HVA22 gene Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 244000284937 Hyparrhenia rufa Species 0.000 description 1
- 241000782597 Hypericum erectum Species 0.000 description 1
- 101150053510 ITR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036984 Inactive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP6 Human genes 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 241001092400 Leptarrhena pyrolifolia Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001329168 Loudetia simplex Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 description 1
- 241000219822 Macrotyloma axillare Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000004456 Manihot esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000362816 Miscanthus sinensis var. purpurascens Species 0.000 description 1
- 101000777470 Mus musculus C-C motif chemokine 4 Proteins 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 108010029782 Nuclear Cap-Binding Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 102100024372 Nuclear cap-binding protein subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 101710163084 Oleosin 18 kDa Proteins 0.000 description 1
- 241000219830 Onobrychis Species 0.000 description 1
- 241001446528 Ornithopus Species 0.000 description 1
- 108700025855 Oryza sativa oleosin Proteins 0.000 description 1
- 101000742226 Oryza sativa subsp. japonica B3 domain-containing protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 101100036899 Oryza sativa subsp. japonica Ub-CEP52-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 description 1
- 241001148142 Pectobacterium atrosepticum Species 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 241001618237 Peltophorum africanum Species 0.000 description 1
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000011236 Persea americana var americana Nutrition 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 240000008340 Phormium cookianum Species 0.000 description 1
- 241001092035 Photinia Species 0.000 description 1
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 1
- 235000018794 Podocarpus totara Nutrition 0.000 description 1
- 240000003145 Podocarpus totara Species 0.000 description 1
- 241000133788 Pogonarthria Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 101710136728 Probable UDP-arabinopyranose mutase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101100063794 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) Pro_0198 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100185722 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) murG gene Proteins 0.000 description 1
- 101100243679 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) pgk gene Proteins 0.000 description 1
- 101100198609 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) rnhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100037187 Prochlorococcus marinus (strain SARG / CCMP1375 / SS120) rplL gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000037 Prosopis spicigera Species 0.000 description 1
- 235000006629 Prosopis spicigera Nutrition 0.000 description 1
- 102100020958 Protein AAR2 homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010052646 Protein Translocation Systems Proteins 0.000 description 1
- 102000018819 Protein Translocation Systems Human genes 0.000 description 1
- 241001646398 Pseudomonas chlororaphis Species 0.000 description 1
- 241001645955 Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000394642 Pseudomonas marginalis pv. marginalis Species 0.000 description 1
- 241000259045 Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 Species 0.000 description 1
- 241001464820 Pseudomonas viridiflava Species 0.000 description 1
- 235000008572 Pseudotsuga menziesii Nutrition 0.000 description 1
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 241000350492 Pterolobium stellatum Species 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 102100027505 RANBP2-like and GRIP domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 102000020146 Rab21 Human genes 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 101100476899 Ralstonia solanacearum (strain GMI1000) sctC gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930189077 Rifamycin Natural products 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 229930193941 Rothin Natural products 0.000 description 1
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 description 1
- 241001116461 Sciadopitys Species 0.000 description 1
- 241001138418 Sequoia sempervirens Species 0.000 description 1
- 241000422846 Sequoiadendron giganteum Species 0.000 description 1
- 108700023678 Shigella MxiH Proteins 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 description 1
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 description 1
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 description 1
- 101100020617 Solanum lycopersicum LAT52 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 description 1
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 description 1
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 1
- 241000847989 Sporobolus fimbriatus Species 0.000 description 1
- 241000408201 Stiburus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710156775 Sucrose synthase 3 Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000505911 Tadehagi Species 0.000 description 1
- 241001138405 Taxodium distichum Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 244000152045 Themeda triandra Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 240000003021 Tsuga heterophylla Species 0.000 description 1
- 235000008554 Tsuga heterophylla Nutrition 0.000 description 1
- 102100028262 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm4 Human genes 0.000 description 1
- 235000012511 Vaccinium Nutrition 0.000 description 1
- 241000736767 Vaccinium Species 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 241000596981 Watsonia Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010081181 calcium-binding protein (brain) Proteins 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- 229940098900 cefotaxime 500 mg Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 108010040093 cellulose synthase Proteins 0.000 description 1
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 102000006533 chordin Human genes 0.000 description 1
- 108010008846 chordin Proteins 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 244000195896 dadap Species 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 101150091511 glb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000000687 hydroquinonyl group Chemical group C1(O)=C(C=C(O)C=C1)* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006917 intersubunit interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N isatin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(=O)NC2=C1 JXDYKVIHCLTXOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 101150109310 msrAB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 108010003099 nodulin Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000005080 plant death Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108010048762 protochlorophyllide reductase Proteins 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229960003292 rifamycin Drugs 0.000 description 1
- HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N rifamycin SV Chemical compound OC1=C(C(O)=C2C)C3=C(O)C=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@@H](OC)\C=C\O[C@@]1(C)OC2=C3C1=O HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000026492 vascular transport Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
- 239000001841 zingiber officinale Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к вектору экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую секретируемый доминантно негативный белок HrpY. Также раскрыты выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую указанный белок, растительная клетка, которая экспрессирует указанный белок, генетически модифицированное растение, содержащее заявленный вектор экспрессии. Раскрыты способы получения указанного растения, оценки устойчивости указанного растения. Изобретение позволяет получить модифицированное растение, обладающее устойчивостью к Ralstonia solanacearum. 9 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 ил., 7 табл., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение в некоторых вариантах своего осуществления связано с растениями, устойчивыми к бактериям, и способами создания таких растений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ralstonia solanacearum (Rs), широко распространенная грамотрицательная почвенная патогенная бактерия, относящаяся протеобактериям β-класса, вызывает заболевания и приводит к гибели более чем 200 видов растений, в том числе экономически важных сельскохозяйственных культур, таких как томат, картофель и банан. Бактерия проникает через раны на корнях растения, внедряется в сосуды ксилемы и быстро распространяется по надземным органам растения посредством сосудистого транспорта. Вскоре обнаруживаются популяции более чем из 1010 бактериальных клеток на растение. Основной фактор вирулентности Rs - это экзополисахарид (ЭПС), длинный (более 106 Да) углеводный полимер, который закупоривает сосуды ксилемы, вызывает симптомы увядания и приводит в конечном итоге к гибели растения.
Rs демонстрируют удивительную способность секретировать более чем 100 белков. Например, система секреции II типа (T2SS) выделяет факторы, которые включают пектиназы, эндоглюканазы, разрушающие клеточную стенку растений, а позднее и вирулентный ЭПС (Фиг.1А-С). Система секреции III типа (T3SS) выделяет вызывающие инфекцию эффекторные белки (ТЗЕ) в клетки хозяина, чтобы изменить внутреннюю среду хозяина и подавить защитный ответ при заражении (Фиг.1А-С).
Система секреции III типа (T3SS) - это сложная молекулярная машина грамотрицательных бактерий, используемая для того, чтобы «впрыскивать» (переносить) бактериальные белки (эффекторы) в эукариотические клетки. Для этого T3SS должна собраться в мультибелковый комплекс, который состоит из различных частей: базальной части, соединяющей две бактериальные мембраны, связанной с цитоплазматическим пространством; закрепленной игольчатой структуры, сравнимой с молекулярным шприцем (инжектисома/пили); и дистального наконечника игольчатой структуры, преобразующегося затем в «транслокон», белковый комплекс, который вводится в мембрану клетки хозяина. Пили построены из белковых субъединиц только одного типа. Многочисленные субъединицы олигомеризуются в структуру пил ей. Такая игольчатая структура обеспечивает транспорт бактериальных белков по внутреннему каналу, «трубопроводу» инжектисомы на пути в клетку хозяина (Фиг.1А-С).
Таким образом, самым большим внеклеточным компонентом T3SS является инжектисома, которая тянется от участка молекулярной машины, расположенного на внешней мембране, а внутри нее проходит канал диаметром 25 Å, образующий секреторный «трубопровод» (параметры спирали инжектисомы: 5,5 субъединиц на оборот, увеличение длины спирали составляет 4,6 Å на субъединицу). Инжектисома формируется как спиральный комплекс из множества (порядка 100-150) копий единственного небольшого (9 кДа) белка. Несмотря на то, что между первичными последовательностями строительных блоков пилей большинства грамотрицательных бактерий наблюдается низкая степень гомологии, предполагается, что они имеют высокую степень структурной гомологии. У бактерий, патогенных для растений, T3SS кодируется генами hrp (hypersensitive response and pathogenicity, реакции гиперчувствительности и патогенности), которые получили такое название в связи с тем, что они необходимы бактериям, чтобы индуцировать заболевания у чувствительных к ним растений и вызывать реакцию гиперчувствительности у резистентных растений. Hrp гены были обнаружены почти во всех основных грамотрицательных патогенных для растений бактериях (например, Pseudomonas syringae, Xanthomonas spp., Ralstonia solanacearum и Erwinia spp.), что подтверждает ключевую роль T3SS как посредника во взаимодействии различных бактерий и растений. Таким образом, обычно внеклеточная игольчатая структура T3SS собирается в ходе пошаговой полимеризации основного компонента (например, HrpY у R. solanacearum, HrpA у P. syringae и Е. amylovora, HrpE у Xanthomonas campestris, MxiH у Shigella, PrgI у Salmonella и YscF у Yersinia).
Как упоминалось ранее, несмотря на то, что основная функция эффекторов III типа заключается в стимулировании чувствительности растений, некоторые эффекторы распознаются белками устойчивости растений, которые, в свою очередь, запускают защитные ответные реакции, в том числе, реакцию гиперчувствительности. Один из способов предлагает возможность борьбы со смертельными растительными инфекциями с помощью грамотрицательных бактерий, несущих в своем составе факторы, усиливающие иммунитет растений к таким патогенам.
В патентной заявке США №20090258825 (Не et al.) раскрыты композиции и способы для усиления защиты растений против патогенов, например, бактериальных патогенов. В соответствии с их методиками, усиление устойчивости растений к вирулентному белку HopM1 Pseudomonas syringae обеспечивается повышением активности ATMIN-ассоциированного защитного белка растений, такого как ATMIN7.
В патентной заявке США №20090044296 (Веег et al.) описываются способы усиления роста растений или передачи устойчивости растений к болезням посредством использования молекул нуклеиновых кислот, направленных на повышение или понижение экспрессии молекул нуклеиновых кислот, кодирующих Невзаимодействующий белок (например, HIPM). Способом делеционного анализа было показано, что 198-аминокислотный N-концевой участок HrpN (harpin) Erwinia amylovora, первый бесклеточный индуктор реакции гиперчувствительности, играющий решающую роль для вирулентности этого патогена, необходим для взаимодействия с HIPM.
Кроме того, увядание, вызванное бактериями, трудно контролировать из-за почвенного происхождения возбудителей. В растениях, инфицированных Rs, развитие заболевания зависит от активности систем секреции типов II и III, и мутации в одной из этих систем приводит к отсутствию патогенности у бактерий [Poueymiro et al., Curr. Opin. Microbiol. (2009) 12:44-52].
Roine и соавторы [Roine et al., FEBS Letters (1997) 417(2): 168-172] показали, что очищенный HrpA, структурный белок пилей Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, уже сам по себе достаточен для образования нитчатых структур путем самосборки.
Taira и соавторы [Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44] произвели мутации путем вставки в гене hrpA (например, пентапептидные вставки) и создали мутантные бактерии, экспрессирующие такие гены. Согласно их исследованиям, С-концевой участок hrpA является ключевым для сборки пилей и для бактериального взаимодействия с поражаемым растением. Кроме того, Wei и соавторы [Wei et al., PNAS (2000) 97(5):2247-2252] определили три единичные аминокислотные мутации в С-концевом участке HrpA, которые влияют на секрецию или регуляторную функцию белка HrpA. Эти результаты демонстрируют важнейшую роль гена структурного белка пилей Hrp в белковой секреции и согласованной регуляции системы секреции III типа Pseudomonas syringae. Более того, Lee и соавторы [Lee et al., J. Bio. Chem. (2005) 280: 21409-17] обнаружили, что некоторые пентапептид-содержащие нефункциональные белки HrpA при экспрессии в бактериях оказывают сильный доминантно негативный эффект на функцию HrpA дикого типа, блокируя способность Pseudomonas syringae вызывать ответ растения-хозяина и болезнь in vivo. Доминантные негативные мутанты HrpA также были способны препятствовать самосборке пилей из HrpA дикого типа in vitro.
Weber и соавторы [Weber and Koebnik, J. Bacteriology (2005) 187(17): 6175-6186] провели анализ гидрофобности нескольких белков пилей Hrp, таких как HrpE и HrpA из Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria и HrpY из R. Solanacearum, и обнаружили общий структурный домен. Учитывая эти данные, можно предположить, что патогенные для растений бактерии создавали структурно схожие белки для преодоления барьера клеточной стенки независимо друг от друга. Weber и соавторы далее сообщают, что мутанты HrpE с пентапептидными вставками в С-концевом участке ингибируют сборку пилей из Hrp у X. campestris pv. Vesicatoria. Морфологические исследования обнаружили, что мутанты со вставкой имеют укороченные Hrp-пили. Этот доминантно негативный эффект наводит на мысль, что мутантные варианты могут препятствовать сборке Hrp-пилей. Патентная заявка США №20100249234 (Yang et al.) описывает способы снижения вирулентности бактерий, такие как системы HrpX/HrpY-типа или T3SS-THna. Данный способ предполагает взаимодействие бактерии с эффективным количеством ингибитора фенилпропаноидного типа.
Патентная заявка США №20100099674 (Elofsson et al.) раскрывает способы снижения бактериальной вирулентности в растениях посредством ингибирования системы секреции III типа N-замещенным 7-хинолилметиламином и, особенно, производным этого вещества, замещенным по 5-му и 8-му положениям хинольного кольца.
Дополнительно уровень техники включает патентную заявку США №20050076406.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую доминантно негативный T3SS белок и цис-регуляторный элемент, который способен запускать транскрипцию нуклеотидной последовательности в растительной клетке; где доминантно негативный T3SS белок обеспечивает сборку нефункционального комплекса иглы.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрены клетки-хозяева, содержащие экспрессионный вектор.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, содержащее экспрессионный вектор.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, экспрессирующее экзогенный полинуклеотид, кодирующий доминантно негативный T3SS белок, приведенный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения растений, имеющих повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированными растениями; этот способ подразумевает введение в растение или растительную клетку экспрессионного вектора, создавая, таким образом растение, имеющее повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением.
Предусмотрен способ оценки устойчивости растения к бактериальным патогенам, где способ подразумевает: (а) экспрессию в растении экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей доминантно негативный T3SS белок и цис-регуляторный элемент, позволяющий запускать транскрипцию нуклеотидной последовательности в растительной клетке; (б) воздействие на растение бактериальных патогенов; (в) сравнение течения заболевания в полученном растении и растении дикого типа при заражении бактериальными патогенами в одних и тех же условиях, что позволяет оценивать, таким образом, устойчивость данного растения к бактериальным патогенам.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9 или 11.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность содержит SEQ ID NO:20-65.В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, приведенный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения экспрессионный вектор, кроме того, содержит перед началом последовательности целевого гена дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид эндоплазматического ретикулума.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения цис-регуляторный элемент содержит последовательность промотора.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения промоторная последовательность является конститутивным промотором.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения конститутивным промотором является CaMV 35S промотор.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения доминантно негативный белок T3SS получают путем введения мутации, выбранной из группы, состоящей из вставки, делеции и замены.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения мутация вставкой включает интеркалирующий блокирующий элемент.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения под белком T3SS подразумевается структурный белок T3SS.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения структурный белок T3SS является белком HRP.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок T3SS выбран из группы, состоящей из белков HrpY Ralstonia solanacearum, HrpA Pseudomonas syringae, HrpA Erwinia amylovora, HrpE Xanthomonas campestris, HrpA Erwinia pyrifoliae и HrpE Xanthomonas oryzae.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок T3SS представляет собой белок транслокона Ralstonia solanacearum.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения белок транслокона Ralstonia solanacearum выбран из группы, состоящей из PopF1 и PopF2.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин относится к растительным клеткам.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение, имеющее повышенную устойчивость к бактериальным патогенам, сравнивают с немодифицированным растением.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения бактериальным патогеном являются грамотрицательные бактерии. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения грамотрицательные бактерии выбраны из группы, состоящей из Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris и Xanthomonas oryzae.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения грамотрицательные бактерии представляют собой Proteobacteria species. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения Proteobacteria представляют собой Ralstonia solanacearum. В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение выбрано из группы сельскохозяйственных растений, декоративных растений и деревьев.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения выбранное растение принадлежит семейству Solanaceae.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения растение выбрано из группы, включающей томат, картофель, баклажан, банан, сладкий перец, маслину, яблоню, грушу, пираканту, цветущую дикую яблоню, боярышник, кизильник, айву, рябину, арабидопсис, герань, имбирь, табак и эвкалипт.
В соответствии с одним аспектом некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения выбранным растением является томат.
Если не оговорено иное, то все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое они обычно имеют в той области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что при практическом применении и тестировании вариантов осуществления этого изобретения могут использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе способам и материалам, примеры способов и/или материалов описаны ниже. В случае конфликтных ситуаций должно быть учтено описание патента, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для обязательного ограничения изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны только в качестве примеров со ссылкой на прилагаемые Фигуры. Что касается непосредственно Фигур, следует подчеркнуть, что они приведены в качестве примера и с целью пояснительного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. Вследствие этого, описание изобретения вместе с Фигурами делает очевидным для специалиста в этой области, как варианты осуществления настоящего изобретения могут быть осуществлены на практике.
Фиг.1А представляет собой изображение, иллюстрирующее системы секреции II типа (T2SS), III типа (T3SS) и пили IV типа грамотрицательных бактерий. Источник: Donnenberg M.S., Nature (2000) 406: 768-774, с изменениями.
Фиг.1В-С представляет собой изображения с изменениями из Buttner and Не, Plant Physiology (2009) 150: 1656-64, иллюстрирующие T3SS комплекс растительных (Фиг.1В) и животных (Фиг.1С) патогенных бактерий. Секреторный аппарат соединяет обе бактериальные мембраны и сопрягается с цитоплазматической АТФазой. Патогенные бактерии растений используют пили, которые, вероятно, пробивают растительную клеточную стенку. Патогенные бактерии животных имеют короткую игольчатую структуру, которая соединяется с транслоконом посредством так называемого верхушечного комплекса (отсутствует у патогенов растений). Этот транслокон формирует канал в плазматической мембране и обеспечивает транспорт эффекторных белков в цитоплазму клетки хозяина.
Фиг.2A-F представляет собой изображения, иллюстрирующие выравнивание белка HrpY Ralstonia solanacearum (Rs) с мономером MxiH инжектисомы T3SS Shigella (SEQ ID NO:15, Фиг.2A), структурные модели белка MxiH Shigella (Фиг.2B-E) и полную структуру инжектисомы (Фиг.2F). Изображения MxiH и инжектисомы взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.
Фиг.3А-Е иллюстрируют интеркалирующие блокирующие элементы (IBE) 1 (Фиг.3А, SEQ ID NO:2) и 2 (Фиг.3С, SEQ ID NO:4) доминантных негативных белков T3SS, предполагаемую модель структуры IBE1 и 2 T3SS (Фиг.3В и 3D, соответственно), модель взаимодействия с инжектисомой и ее каналом (Фиг.3Е) и растительные сигналы секреции из sp|Q56YT0|LAC3_At лакказы или tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR секреторной лакказы Gossypium arboreum (SEQ ID NO:16 и 17, соответственно). Фиг.3В, 3D, и 3Е взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.
Фиг.4А-С являются изображениями интеркалирующего блокирующего элемента 3 (IBE3) доминантного негативного белка T3SS (Фиг.4А, SEQ ID NO:6), предполагаемой модели структуры IBE3 T3SS (Фиг.4В) и модели взаимодействия с инжектисомой (Фиг.4С). Фиг.4В и 4С взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.
Фиг.5A-C представляет собой это изображения, иллюстрирующие интеркалирующий блокирующий элемент 4 доминантного негативного белка T3SS (Фиг.5А, SEQ ID NO:8), предполагаемую модель блокирующего элемента (Фиг.5С) и инжектисому (Фиг.5В). Фиг.5В и 5С взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33. Известно, что дуплицированные концевые участки могут взаимодействовать с различными мономерами, разрушая и блокируя канал инжектисомы.
Фиг.6A-D иллюстрируют интеркалирующие блокирующие элементы 5 (Фиг.6А, SEQ ID NO:10) и 6 (Фиг.6С, SEQ ID NO:12) доминантного негативного белка T3SS и, предполагаемую модель структуры IBE5 и 6 T3SS (Фиг.6 В и 6D, соответственно). Известно, что «головка» и концевая α-спираль белка HrpY деструктурируются пролинами, и такие деформации могут блокировать канал и нарушать функциональность инжектисомы. Фиг.6 В и 6D взяты с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.
Фиг.7A-C представляет различные доминантные негативные белки HrpY Ralstonia solanacearum (Rs). На Фиг.7А изображена карта клонирования T-DNA. Каждый IBE был заклонирован между промотором CaMV 35S и терминатором NOS по сайтам Xbal и Sacl. На Фиг.7В представлена модель взаимодействия с инжектисомой, а на Фиг.7С - различные мутантные варианты HrpY (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 и 12). Фиг.7 В взята с изменениями из Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33.
Фиг.8 взята с изменениями из Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44; на ней изображены интеркалирующие мутации и их положение в гене hrpA (SEQ ID NO:2). Кратко, положение вставок во фрагменте из 496 пар оснований BamHI±EcoRI, кодирующем HrpA пилей, отмечено кружками с номерами мутаций над ними. Каждая вставка состоит из 10 пар оснований из транспозона и дуплицированной 5-нуклеотидной последовательности идентичной последовательности, расположенной до вставки, вставленной после 10 пар оснований. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:19) приведена под нуклеотидной последовательностью. Hrp-боксы в промоторе помещены в рамку; предполагаемый участок связывания рибосомы подчеркнут. N-концевой сайт процессинга белка помечен стрелками ниже аминокислотной последовательности. Помещенные в рамку номера мутаций со стрелками указывают начальную и конечную точки четырех делеционных мутаций.
Фиг.9 представляет собой выравнивание вариантов полипептида HrpY Ralstonia solanacearum (то есть небольшие отличия в последовательностях различных штаммов, SEQ ID NO:14 и 70-86).
Фиг.10А-С иллюстрируют анализ методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 6 белка HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 6 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.
Фиг.11А-С представляют собой результаты анализа методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 1 HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 1 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.
Фиг.12А-С представляют собой результаты анализа методом ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР растений томата, экспрессирующих мутант 2 HrpY, обеспечивающий устойчивость к увяданию (WiltR). Растения томата были трансформированы конструкциями, содержащими мутант 2 HrpY, а затем растения были проанализированы методом геномной ПЦР и полу количественной ОТ-ПЦР. Были детектированы случаи экспрессии этих мутантов HrpY.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в некоторых вариантах своего осуществления относится к растениям, устойчивым к бактериям, и способам создания таких растения.
Принципы и действие настоящего изобретения могут быть лучше поняты с помощью Фигур и прилагаемого описания.
Прежде чем описывать в деталях хотя бы один вариант осуществления настоящего изобретения, должно быть понятно, что это изобретение не обязательно ограничено своим применением в деталях, приведенных в последующем описании, или приведенных в качестве Фиг. в разделе «Примеры». Данное изобретение может быть исполнено в других вариантах или осуществляться на практике или выполняться различными способами. Также должно быть ясно, что формулировки и терминология, используемая в настоящем документе, приведена с целью описания, и их не следует толковать с точки зрения ограничения изобретения.
Приводя некоторые варианты настоящего изобретения к практическому применению, изобретатели сконструировали бактериальные доминантные негативные белки системы секреции III типа (T3SS), которые экспрессируются в растительных клетках и секретируются из них. Новые доминантные негативные белки T3SS настоящего изобретения включаются в структуру инжектисомы T3SS во время ее сборки и блокируют канал бактериальной инжектисомы, защищая, таким образом, растения от бактериальной инфекции.
Конструкция доминантных негативных белков T3SS настоящего изобретения основывается на сохранении и использовании нативных сайтов взаимодействия между субъединицами белков T3SS (например, HrpY), и одновременном встраивании слитых во время трансляции блокирующих канал полипептидов или деформирующих структур в белок T3SS (например, в α-спирали HrpY), которые препятствуют процессу секреции бактериальных эффекторов из бактерий в растительные клетки. Растительные сигналы секреции, добавленные для этой цели, запускают экспрессию доминантных негативных белков в растительных клетках, секрецию из них и доступность доминантных негативных белков T3SS во время сборки бактериальных пилей в пространственной близости к растительной клеточной стенке. Таким образом, например, и, как это указано в разделе «Примеры», следует, что авторы настоящего изобретения производят интеркалирующие блокирующие элементы канала инжектисомы T3SS (IBE-T3SS) грамотрицательных бактерий. IBE-T3SS Ralstonia solanacearum (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 и 12) были сконструированы с применением структурных модификаций мономера белка HrpY (SEQ ID NO:14), строительного блока инжектисомы Rs. Изобретатели далее для трансформации растительных клеток создали экспрессионные векторы, содержащие эти IBE-T3SS. Кроме того, изобретатели проиллюстрировали трансформацию растений томата мутантами 1, 2, и 6 белка HrpY Ralstonia solanacearum и их экспрессию (см. Фиг.11А-С, 12А-С и 10А-С, соответственно). Дополнительно изобретатели провели сверхэкспрессию модифицированных белков транслокона Rs (PopF1) в трансгенных растениях. Сверхэкспрессия этих белков приводит к остановке сборки T3SS из-за взаимодействий с «незрелой» иглой и, следовательно, прекращению этого процесса. Таким образом, модифицированные белки PopF1 встраиваются в ворота транслокона и блокируют его. Просуммировав вышесказанное, можно считать данное изобретение мощным средством в области сельскохозяйственных трансгенных технологий для создания растений, устойчивых к бактериям.
Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается способ получения растения, имеющего повышенную устойчивость к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением; этот способ включает введение в растение или растительную клетку экспрессионного вектора, в результате чего получают растение с повышенной устойчивостью к бактериальным патогенам в сравнении с немодифицированным растением.
Понятие «растение», используемое в этом документе, подразумевает растения целиком, их родительские поколения и потомство, а также части растения, включая семена, побеги, стебли, корни (в том числе, клубни) и растительные клетки, ткани и органы. Этим растением может быть любая форма, в том числе суспензионные культуры, эмбрионы, меристемные области, ткани каллуса, листья, гаметофиты, спорофиты, пыльца и микроспоры. Растения, которые особенно применимы в способах настоящего изобретения, включают все растения, принадлежащие надсемейству Viridiplantae (Зеленые растения), в особенности однодольные и двудольные растения, в том числе фуражные культуры и кормовые бобовые, декоративные растения, сельскохозяйственные культуры, деревья или кустарники, выбранные из следующего списка: Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp., Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp., Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japónica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp., Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia vilosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp., Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp., Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canadensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sápida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp., Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, амарант, артишок, спаржа, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, морковь, цветная капуста, сельдерей, листовая капуста, лен, кале, чечевица, рапс, окра, лук, картофель, рис, соевые бобы, культуры для соломы, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, томат, тыква, чай, деревья. В качестве альтернативы для данных способов настоящего изобретения могут быть использованы водоросли и другие растения, не относящиеся к над семейству Viridiplantae (Зеленые растения).
В соответствии с определенными вариантами осуществления выбранное растение относится к семейству Пасленовые.
В соответствии с определенными вариантами осуществления выбранное растение относится к роду Паслен.
В соответствии с другими определенными вариантами осуществления выбранное растение - это томат (Lycopersicum esculentum).
В соответствии с другими определенными вариантами осуществления выбранное растение включает картофель (Solanum tuberosum); томат (Lycopersicum esculentum); баклажан (Solanum melongena); банан (Musa spp.); герань (Pelargonium); имбирь (Zingiber officinale); табак (Nicotiana tabacum); сладкий перец (Capsicum spp.); маслину (Olea europea), арабидопсис, эвкалипт, яблоню, цветущую дикую яблоню, грушу, пираканту, боярышник, кизильник, айву или рябину.
Поскольку используемое в настоящем документе понятие «бактериальный патоген» относится к любому типу вирулентных бактерий, то бактериальные виды или штаммы, которые инфицируют растение, включают, но не ограничиваются, Pseudomonas spp., Erwinia-related strains, Ralstonia solanacearum и Xanthomonas campestris. Этой бактерией могут быть Pseudomonas spp., включая P. aureofaciens, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. marginalis, Pseudomonas syringae, P. tolaasii, P. agarici и P. viridiflava. Этой бактерией могут быть родственные Erwinia штаммы, в том числе Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi), Erwinia carotovora, Erwinia atroseptica и Erwinia amylovora. Этой бактерией могут быть родственные Xanthomonas campestris штаммы, в том числе Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) and Xanthomonas oryzae.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения под бактериями подразумеваются грамотрицательные бактерии.
Согласно определенному варианту осуществления грамотрицательные бактерии представляют собой Proteobacteria species.
Согласно другому определенному варианту осуществления Proteobacteria представляют собой Ralstonia solanacearum.
Согласно другому определенному варианту осуществления грамотрицательные бактерии выбраны из группы, состоящей из Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Erwinia Psidii, Erwinia pyrifoliae, Xanthomonas campestris и Xanthomonas oryzae.
Так как используемое в настоящем документе понятие «повышенная устойчивость» имеет отношение к понижению вирулентности бактерий и, следовательно, понижению чувствительности растения-хозяина, то эффект сравнивается с немодифицированным растением, зараженным тем же бактериальным патогеном. Согласно сути настоящего изобретения понижение бактериальной вирулентности обеспечивается экспрессией доминантных негативных белков, связанных с бактериальной вирулентностью (например, комплексом иглы, что детально описано ниже), и может влиять на любой этап жизненного цикла бактерии во время ее ассоциации с хозяином, включая (но не ограничиваясь) адгезию, инвазию, репликацию, уклонение от защитных механизмов и передачу новому хозяину.
Повышенная устойчивость к бактериальным патогенам может проявляться в виде уменьшения симптомов у зараженного растения и, таким образом, может быть детектирована в процессе наблюдения за сниженной реакцией растения на соответствующие бактерии. Повышение устойчивости может проявляться как снижение симптомов, связанных с бактериальными патогенами, по меньшей мере, на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, что измеряется любым способом анализа, известным в этой области техники, и это измерение проводят против подходящего контроля (например, немодифицированного растения, выращиваемого в тех же условиях).
Способы настоящего исследования осуществляют при введении в растение экспрессионного вектора, кодирующего доминантно негативный белок T3SS и цис-регуляторный элемент, способный управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности в растительной клетке; где доминантно негативный белок T3SS обеспечивает сборку нефункциональной инжектисомы.
Понятие «T3SS», используемое в настоящем документе, подразумевает под собой систему секреции III типа бактерий (например, грамотрицательных), которая обычно функционирует как игольчатая структура для выделения белков непосредственно из бактериальной клетки. Игольчатая структура T3SS обычно берет начало в цитоплазме бактерии, пересекает две мембраны и выступает из клетки (Фиг.1А). Та часть, что закреплена в мембране, является основанием, или базальным телом, T3SS. Внеклеточная часть представляет собой игольчатую структуру (пили). Конечная структура, выполняющая функцию «ворот» в клетку хозяина, является транслоконом (Фиг.1В-С). Так называемый внутренний стержень соединяет игольчатую структуру с основанием.
Используемое в настоящем документе понятие «белок T3SS» подразумевает под собой белок, который составляет комплекс T3SS. Это понятие включает структурные белки, то есть те, из которых строится основание, внутренний стержень, игольчатая структура, наконечник и транслокон. Игольчатая структура сама по себе обычно состоит из множества субъединиц единственного белка T3SS. Таким образом, большинство разнообразных белков T3SS представляют собой белки, из которых состоит основание, и белки, которые секретируются в клетку хозяина.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения белок T3SS представляет собой такой белок, как HRP (белок реакции гиперчувствительности и патогенности), из которого состоит игольчатая структура T3SS. Типичные белки HRP включают (но не ограничиваются) белки HrpY Ralstonia solanacearum, HrpA Pseudomonas syringe, HrpA Erwinia amylovora, HrpA Erwinia pyrifoliae и HrpE Xanthomonas campestris (Таблица 1, Buttner and Не, Plant Physiology (2009) 150:1656-1664).
Таблица 1. | ||
Типичные белки T3SS. | ||
Вид бактерии | Предполагаемая функция | Белок |
Erwinia amylovora | Белок пилей | HrpA |
Белок транслокона | HrpK | |
Pseudomonas syringae pv tomato | Белок пилей | HrpA |
Белок транслокона | HrpK1 | |
Ralstonia solanacearum | Белок пилей | HrpY |
Белок транслокона | PopF1 | |
PopF2 | ||
Xanthomonas spp. | Белок пилей | HrpExcv |
Белок транслокона | HrpFxcv | |
HrpFxoo | ||
Erwinia pyrifoliae | Белок пилей | HrpA |
где xcv - X. campestris pv vesicatoria, xoo - X. oryzae pv oryzae. |
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpY дикого типа Ralstonia solanacearum соответствует SEQ ID NO:14.
Согласно другому варианту осуществления полипептид белка HrpY Ralstonia solanacearum включает варианты, приведенные в SEQ ID NO:70-86.
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpA дикого типа Pseudomonas syringae соответствует SEQ ID NO:19.
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpA дикого типа Erwinia amylovora соответствует SEQ ID NO:88.
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpE дикого типа Xanthomonas campestris соответствует SEQ ID NO:90.
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpE дикого типа Xanthomonas oryzae соответствует SEQ ID NO:92.
Согласно другому варианту осуществления белок T3SS представляет собой белок транслокона, такой как белки PopF1 и PopF2 Ralstonia solanacearum (SEQ ID NO:67 и 69, соответственно).
Согласно определенному варианту осуществления полипептид белка HrpA дикого типа Erwinia pyrifoliae соответствует SEQ ID NO:100.Сочетание «доминантно негативный белок T3SS», используемое в настоящем документе, подразумевает белок T3SS, являющийся продуктом структурно измененного гена, который взаимодействует с секретируемым бактериями белком дикого типа T3SS, но приводит к формированию нефункциональных комплексов иглы (например, таких, которые не способны проникать в клетку-хозяина или транспортировать эффекторные белки в клетку-хозяина или имеют сниженную в сравнении с белками дикого типа способность проникать в клетку-хозяина или транспортировать эффекторные белки в клетку-хозяина). Такой бактериальный нефункциональный комплекс иглы может быть структурно деформирован (например, частично или полностью блокирован или искривлен таким образом, что проявляет меньшую способность к переносу эффекторных белков в клетку-хозяина) или может собираться частично или не собираться вообще. Обычно доминантно негативный белок T3SS настоящего изобретения понижает инфекционность и патогенность бактерий. Способы измерения инфекционности хорошо известны в соответствующей области техники.
Таким образом, доминантно негативный белок T3SS ухудшает сборку и функциональность комплекса иглы и, следовательно, патогенность бактерий примерно на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% в сравнении с бактериями, имеющими игольчатую структуру, состоящую из белка T3SS дикого типа. Согласно определенному варианту осуществления, доминантно негативный белок экспрессируется экзогенно растительной клеткой для бактериальной клетки.
Обычно доминантно негативный белок T3SS кодируется геном, содержащим одну или несколько мутаций в кодирующей последовательности белка дикого типа, таких как вставка, делеция или замена. Эти мутации могут включать единственное изменение в нуклеотидной последовательности белка дикого типа T3SS (например, включение аминокислоты, нарушающей β-структуру, такой как пролин или синтетический аналог такового) или, в других случаях, мутации могут в включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25 или более изменений нуклеотидной последовательности. В других случаях мутация может включать вставку единственного пептида (3, 4, 5, 10 аминокислот) или нескольких пептидов (например, пентапептидную вставку) в белке T3SS.
Типичные единичные аминокислотные мутации, которые могут быть введены в пептиды в настоящем изобретении, включают замены в гене hrpA: лейцина в 23-й позиции на аланин, аланина в 54-й позиции на глутаминовую кислоту, лизина в 93-й позиции на изолейцин, аспарагиновой кислоты в 95-й позиции на серии, изолейцина в 101-й позиции на треонин, изолейцина в 111-й позиции на пролин.
Типичные пентапептидные вставки, которые могут быть добавлены в пептиды настоящего изобретения, соответствуют SEQ ID NO:20-65 (Таблица 2).
Необходимо отметить, что мутации можно вводить в любое положение в гене T3SS, которое приводят к образованию доминантного негативного белка. Типичные положения нуклеотидных вставок и делеций для гена HrpA отражены на Фиг.8 и в Таблице 2 [Taira et al., Mol Microbiol. (1999) 34(4):737-44].
Как указывалось ранее и в соответствии с определенным вариантом осуществления, доминантно негативный белок T3SS настоящего изобретения обладает свойствами поддерживать белок-белковые взаимодействия, которые позволяют ему связываться с высокой аффинностью с родственным бактериальным белком дикого типа и формировать игольчатую структуру, являющуюся, однако, нефункциональной из-за мутаций в доминантных негативных белках.
Таким образом, настоящее изобретение предполагает любую мутацию в T3SS гене, которая делает комплекс иглы нефункциональным.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения мутация вставки включает интеркалирующий блокирующий элемент (IBE). Доминантные негативные белки T3SS, содержащие IBE, обычно участвуют в межсубъединичных взаимодействиях с родственными белками, в то время как трансляционно слитые интеркалирующие элементы, блокирующие канал (например, пептиды) или деформирующие структуры белка T3SS (например, α-спирали HrpY), не позволяют бактериальным эффекторам секретироваться из бактерий в растительные клетки (Пример 1 в разделе «Примеры»).
Согласно одному варианту осуществления этого аспекта настоящего изобретения нуклеотидная последовательность кодирует пептид, соответствующий SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
Согласно другому варианту осуществления эти доминантные негативные белки T3SS обладают способностью останавливать сборку T3SS за счет взаимодействий с незрелой игольчатой структурой (например, доминантные негативные белки транслокона взаимодействуют с игольчатой структурой раньше времени, мешая, таким образом, сборке T3SS и инактивируя ее (Пример 3 в разделе «Примеры»)).
Таблица 2 | ||
Типичные пентапептидные вставки и положения вставок и делеций в нуклеотидной последовательности гена HrpA | ||
19 | ||
39 | ||
49 | ||
19 | ||
39 | ||
49 | ||
52 | ||
58 | ||
59 | ||
61 | ||
70 | ||
72 | ||
86 | ||
91 | ||
122 | MRPHS | SEQ ID NO:20 |
138 | GAAAI | SEQ ID N0:21 |
139 | CGRIG | SEQ ID NO:22 |
148 | CGRSA | SEQ ID NO:23 |
153 | GAAAV | SEQ ID NO:24 |
163 | CGRIG | SEQ ID NO:25 |
166 | CGRSG | SEQ ID NO:26 |
176 | VRPQQ | SEQ ID NO:27 |
177 | GAAAQ | SEQ ID NO:28 |
183 | NAAAV | SEQ ID NO:29 |
186 | TAAAN | SEQ ID NO:30 |
197 | MRPHS | SEQ ID NO:31 |
204 | TAAAA | SEQ ID NO:32 |
206 | LRPHT | SEQ ID NO:33 |
226 | CGRTF | SEQ ID NO:34 |
227 | VRPHL | SEQ ID NO:35 |
230 | MRPQG | SEQ ID NO:36 |
235 | CGRTG | SEQ ID NO:37 |
238 | CGRSD | SEQ ID NO:38 |
248 | VRPQS | SEQ ID NO:39 |
249 | VAAAS | SEQ ID NO:40 |
252 | DAAAV | SEQ ID NO:41 |
264 | NAAAA | SEQ ID NO:42 |
271 | CGRTS | SEQ ID NO:43 |
308 | MRPHA | SEQ ID NO:44 |
314 | VRPQQ | SEQ ID NO:45 |
319 | CGRTQ | SEQ ID NO:46 |
322 | CGRKE | SEQ ID NO:47 |
330 | NAAAM | SEQ ID NO:48 |
345 | DAAAM | SEQ ID NO:49 |
357 | AAAAN | SEQ ID NO:50 |
365 | VRPHQ | SEQ ID NO:51 |
369 | AAAAG | SEQ ID NO:52 |
383 | MRPHS | SEQ ID NO:53 |
384 | TAAAS | SEQ ID NO:54 |
388 | CGRTN | SEQ ID NO:55 |
405 | ААААТ | SEQ ID NO:56 |
408 | ААААТ | SEQ ID NO:57 |
409 | CGRTA | SEQ ID NO:58 |
411 | ААААТ | SEQ ID NO:59 |
413 | MRPQT | SEQ ID NO:60 |
417 | AAAAN | SEQ ID NO:61 |
418 | CGRNA | SEQ ID NO:62 |
430 | CGRIS | SEQ ID NO:63 |
432 | YAAAS | SEQ ID NO:64 |
433 | CGRSY | SEQ ID NO:65 |
451 | ||
453 | ||
455 | ||
461 | ||
464 | ||
479 | ||
493 | ||
Положение делеции | ||
138-177 | ||
138-204 | ||
137-249 | ||
138-264 |
Нуклеотидные последовательности в соответствии с этим свойством настоящего изобретения могут быть комплементарными нуклеотидными последовательностями (кДНК), геномными полинуклеотидными последовательностями и/или смешанными полинуклеотидными последовательностями (например, комбинация из представленных выше).
Используемое в настоящем документе сочетание «комплементарная нуклеотидная последовательность» означает такую последовательность, которая получена в результате обратной транскрипции информационной РНК с использованием обратной транскриптазы или любой другой РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Такая последовательность может быть затем амплифицирована in vivo или in vitro с использованием ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.
Используемое в настоящем документе сочетание «геномная полинуклеотидная последовательность» означает такую последовательность, которая получена (выделена) из хромосомы и, таким образом, представляет собой непрерывный участок хромосомы.
Используемое в настоящем документе сочетание «смешанная полинуклеотидная последовательность» означает такую последовательность, которая, по меньшей мере, частично является комплементарной и, по меньшей мере, частично является геномной. Смешанная последовательность может включать некоторые последовательности экзонов, необходимые для кодирования полипептида настоящего изобретения, а также некоторые последовательности интронов, находящиеся между экзонами. Последовательности интронов могут быть любого происхождения, включая другие гены, и обычно содержат консервативные последовательности сигналов сплайсинга. Такие интронные последовательности могут, кроме того, содержать цис-регуляторные экспрессионные элементы, что детально описано ниже.
Согласно определенному варианту осуществления нуклеотидная последовательность содержит вставку, такую как указано в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9 и 11.
Конструкции, применяемые в соответствующих настоящему изобретению способах, могут быть созданы с использованием технологии рекомбинантной ДНК, широко известной специалистам в данной области техники. Генетические конструкции могут быть вставлены в векторы, которые, в свою очередь, могут быть коммерчески доступными, пригодными для трансформации растений и экспрессии целевых генов в трансформированных клетках. Генетическая конструкция может быть экспрессионным вектором, в котором гетерологичная нуклеотидная последовательность функционально связана с цис-регуляторным элементом, обеспечивающим экспрессию в растительных клетках.
Используемое в настоящем документе сочетание «цис-регуляторный элемент» соответствует полинуклеотидной последовательности, предпочтительно промотору, которая связывает trans-регулятор и регулирует транскрипцию кодирующей последовательности, расположенной ниже.
Используемое в настоящем документе сочетание «функционально связанный» соответствует функциональному расположению цис-регуляторного элемента (например, промотора), так как он позволяет регулировать экспрессию выбранной нуклеотидной последовательности. Например, промоторная последовательность может быть расположена перед выбранной нуклеотидной последовательностью относительно направления транскрипции и трансляции.
Предпочтительно промотором в конструкции нуклеиновой кислоты в рамках настоящего изобретения является растительный промотор, который обеспечивает экспрессию чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетках растений.
Следует заметить, что новые нуклеотидные последовательности, кодирующие интеркалирующие элементы, такие как приведенные в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12, предусмотрены самостоятельно или как часть вектора экспрессии нуклеиновой кислоты, предназначенного для экспрессии в бактериальных клетках или клетках растений.
Используемый в настоящем документе термин «растительный промотор» обозначает промоторную последовательность, включая любые регуляторные элементы, добавленные или уже содержащиеся в последовательности, способную активировать, поддерживать и усиливать экспрессию в растительной клетке, ткани или органе, предпочтительно в клетке, ткани или органе однодольного или двудольного растения. Данный промотор может быть растительного, бактериального, вирусного, грибного или животного происхождения. Данный промотор может быть конститутивным, т.е. способным поддерживать высокий уровень экспрессии генов во множестве растительных тканей, тканеспецифичным, т.е. способным поддерживать экспрессию генов в конкретной растительной ткани или тканях, индуцибельным, т.е. способным поддерживать экспрессию генов под воздействием стимула, или химерным, т.е. включать в себя части, по меньшей мере, двух разных промоторов.
Примерами конститутивных промоторов являются CaMV35S и CaMV19S промоторы, FMV34S промотор, промотор баднавируса палочковидности сахарного тростника, CsVMV промотор, промотор актина АСТ2/АСТ8 Арабидопсиса, промотор убиквитина UBQ1 Арабидопсиса, промотор тионина ВТН6 из листьев ячменя, промотор актина риса и др.
При осуществлении конкретных вариантов термин «промотор» обозначает конститутивный промотор, такой, как CaMV 35S.
Другие примеры промоторов, полезные для способов по некоторым вариантам настоящего изобретения, представлены в Таблицах 3, 4, 5 и 6.
Таблица 3 | ||
Примеры конститутивных промоторов для применения в некоторых вариантах настоящего изобретения | ||
ссылка | вид экспрессии | ген источник |
McElroy et al, Plant Cell, 2: 163-171, 1990 | конститутивный | актин |
Odell et al, Nature, 313: 810-812, 1985 | конститутивный | CAMV 35S |
Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997 | конститутивный | CaMV 19S |
de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992 | конститутивный | GOS2 |
Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992 | конститутивный | убиквитин |
Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994 | конститутивный | циклофилин риса |
Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992 | конститутивный | гистон Н3 маиса |
An et al, Plant J. 10(1); 107-121, 1996 | конститутивный | актин 2 |
Таблица 4 | ||
Примеры промоторов для предпочтительной экспрессии в семенах для применения в некоторых вариантах настоящего изобретения | ||
ссылка | вид экспрессии | ген источник |
Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield,et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990. | семя | специфичные для семян гены |
Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18:235- 245, 1992. | семя | альбумин бразильского ореха |
Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988 | семя | легумин |
Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEB S Letts. 221:43-47, 1987 | семя | глютеин (рис) |
Matzke et al Plant Mol Biol, 143). 323-32 1990 | семя | зеин |
Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996 | семя | парА |
Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, | эндосперм | LMW и HMW пшеницы, глютенин-1 |
Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997 | семя | SPA пшеницы |
EMBO3:1409-15, 1984 | эндосперм | глиадины a, b и g пшеницы |
эндосперм | ltrl промотор ячменя | |
Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996 | эндосперм | хордеин В1, С, D ячменя |
Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998 | эндосперм | DOF ячменя |
EP99106056.7 | эндосперм | Biz2 |
Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13:629-640, 1998 | эндосперм | синтетический промотор |
Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998 | эндосперм | проламин риса NRP33 |
Wu et al, Plant Cell Physiology 398) 885-889, 1998 | эндосперм | глобулин Glb-1 риса |
Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122 | зародыш | OSH1 риса |
Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997 | эндосперм | альфа-глобулин риса REB/OHP-1 |
Trans Res 6:157-68, 1997 | эндосперм | АДФ-глюкоза пирофосфатаза риса |
Plant J 12:235-46, 1997 | эндосперм | семейство генов ESR маиса |
PMB 32:1029-35, 1996 | эндосперм | гамма-кафирин сорго |
Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999 | зародыш | KNOX |
Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998 | зародыш и алейрон | олеозин риса |
Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992 | семя (зародыш и сухая часть семени) | олеозин подсолнечника |
Таблица 5 | ||
Примеры специфичных для цветков промоторов для применения в некоторых вариантах настоящего изобретения | ||
ссылка | вид экспрессии | ген источник |
www.salus.medimri.edu/mmg/tiemey/htm | цветки | AtPRP4 |
Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990. | цветки | халкон-синтаза (chsA) |
Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245 (1989) | пыльники | LAT52 |
цветки | apetala- 3 |
Таблица 6 | ||
Альтернативные промоторы риса для применения в осуществлении изобретении | ||
экспрессия | ген | PRO# |
слой переносящих клеток зародыша + каллус | металлотиенин Mte | PR00001 |
слой переносящих клеток зародыша | предпочтительно бета-амилаза | PR00005 |
слабая в корнях | предположительно целлюлоза синтаза | PR00009 |
липаза (предположительно) | PR00012 | |
трансфераза (предположительно) | PR00014 | |
пептидил пролил цис-трансизомераза (предположительно) | PR00016 | |
неизвестно | PR00019 | |
белок prp (предположительно) | PR00020 | |
нодулин (предположительно) | PR00029 | |
семя | ингибитор протеиназы Rgpi9 | PR00058 |
слабая в молодых цветках | бета экспансии ЕХРВ9 | PR00061 |
молодые ткани+каллус+зародыш | структурный белок | PR00063 |
ксилозидаза (предположительно) | PR00069 | |
сильная в эндосперме | проламин 10 кДа | PR00075 |
сильная в эндосперме | аллерген RA2 | PR00076 |
сильная в эндосперме | проламин RP7 | PR00077 |
СВР80 | PR00078 | |
фермент ветвления крахмала I | PR00079 | |
слой переносящих клеток зародыша+каллус | металлотенин-подобный белок ML2 | PR00080 |
побег | предположительно каффеоил-СоА 3-0 метитрансфераза | PR00081 |
сильная в эндосперме | проламин RM9 | PR00087 |
сильная в эндосперме | проламин RP6 | PR00090 |
сильная в эндосперме | проламин RP5 | PR00091 |
аллерген RA5 | PR00092 | |
зародыш | предположительно метионин аминопептидаза | PR00095 |
ras-подобный ГТФ-связывающий белок | PR00098 | |
бета экспансии ЕХРВ1 | PR00104 | |
глицин-богатый белок | PR00105 | |
металлотиенин-подобный белок (предположительно) | PR00108 | |
ген RCc3 strong root | PR00110 | |
слабая дискриминация к центру/ меристема побега | uclacyanin 3-подобный белок | PR00111 |
очень слабая специфичная в меристеме | не АТФазная субъединица 11 регуляторной частицы 26S протеасомы |
PR00116 |
слабая в эндосперме | предположительно 40S рибосомальный белок | PR00117 |
очень слабая в побеге | предшественник хлорофилл а/b-связывающего белка (Cab27) | PR00122 |
сильная в листьях | предположительно протохлорофиллид редуктаза | PR00123 |
сильная дискриминация к центру, меристема побега | металлотиенин RiCMT | PR00126 |
сильная конститутивная | GOS2 | PR00129 |
GOS9 | PR00131 | |
очень слабая специфичная в меристеме | хитиназа Cht-3 | PR00133 |
Сильная в эндосперме | альфа-глобулин | PR00135 |
Слабая в эндосперме | аланин аминотрансфераза | PR00136 |
Циклин А2 | PR00138 | |
Циклин D2 | PR00139 | |
Циклин D3 | PR00140 | |
побег и семя | циклофиллин 2 | PR00141 |
умеренная конститутивная | сахароза синтаза SS1 (ячмень) | PR00146 |
слабая в эндосперме | ингибитор трипсина ITR1 (ячмень) | PR00147 |
сильная конститутивная | убиквитин 2 с интроном | PR00149 |
зародыш и при стрессе | WSI18 | PR00151 |
гомолог HVA22 (предположительно) | PR00156 | |
EL2 | PR00157 | |
умеренная конститутивная в молодых растениях | аквапорин | PR00169 |
Сильная конститутивная | группа белков с высокой подвижностью | PR00170 |
слабая конститутивная | обратимогликозилированный белок RGP1 | PR00171 |
побег | цитозольный MDH | PR00173 |
зародыш и при стрессе | RAB21 | PR00175 |
CDPK7 | PR00176 | |
очень слабая в меристеме | Cdc2-1 | PR00177 |
сахароза синтаза 3 | PR00197 | |
OsVP1 | PRO0198 | |
очень слабая в меристеме молодых растений | OSH1 | PRO0200 |
предположительно хлорофилл аза | PRO0208 | |
OsNRT1 | PRO0210 | |
ЕХР3 | PRO0211 | |
транспортер фосфата OjPT1 | PRO0216 | |
алейрон+зародыш | олеозин 18 кДа | PRO0218 |
убиквитин 2 без интрона | PRO0219 | |
RFL | PRO0220 | |
не выявлено | UBI без интрона маиса | PRO0221 |
глютелин-1 | PRO0223 | |
фрагмент промотора проламина RP6 | PRO0224 | |
4xABRE | PRO0225 | |
глютелин OSGLUA3 | PRO0226 | |
BLZ-2_KopoTKaH форма (ячмень) | PRO0227 | |
BL7-2_длинная форма (ячмень) | PR00228 |
Конструкция нуклеиновой кислоты, описанная в настоящем документе, может включать дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие сигнальный пептид эндоплазматического ретикулума, наличие которого позволяет транспортировать доминантный негативный пропептид T3SS в эндоплазматический ретикулум и направить его через секреторный путь. Данный сигнальный пептид обычно слит в рамке с N-концом полипептида (т.е. располагается до полипептида) и направляет закодированный полипептид по секреторному пути клетки, конечной точкой которого является секреция (например, в апопласт).
Примерами сигнальных последовательностей для секреции, которые направляют полипептиды через ЭР во внеклеточное пространство являются растительный лидерный секреторный пептид из sp|Q56YT0|LAC3_At лакказы (SEQ ID NO:16) и растительный лидерный секреторный пептид из tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR (SEQ ID NO:17).
Кроме представленных ранее сигнальных последовательностей могут быть использованы сигнальная последовательность родственного белка патогенеза табака (PR-S) (Sijmons et al, 1990, Bio/technology, 8:217-221), сигнальная последовательность лектина (Boehn et al., 2000, Transgenic Res, 9(6):477-86), сигнальная последовательность из гидроксипролин-богатого гликопротеина из Phaseolus vulgaris (Yan et al, 1997, Plant Phyiol. 115(3):915-24 and Corbin et al, 1987, Mol Cell Biol 7(12):4337-44), сигнальная последовательность пататина картофеля (Iturriaga, G et al, 1989, Plant Cell 1:381-390 и Bevan et al, 1986, Nue. Acids Res. 41:4625-4638.) и сигнальная последовательность альфа-амилазы ячменя (Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2):423-7).
В соответствии с одним вариантом настоящего изобретения, конструкция нуклеиновой кислоты может включать трансляционный энхансер, такой как трансляционный энхансер омега.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды согласно вариантам настоящего изобретения, могут быть оптимизированы для экспрессии в растениях. Примерами таких модификаций последовательностей являются изменение G/C-состава, приближая его к часто встречающемуся в интересующих нас видах растений, а также удаление кодонов, не характерных для видов растений, обычно обозначаемое как оптимизация кодонов.
Термин «оптимизация кодонов» обозначает выбор конкретных нуклеотидов в ДНК для использования в структурном гене или его фрагменте, который согласуется с частотой встречаемости кодонов в интересующем растении. Оптимизированным геном или последовательностью нуклеиновой кислоты называется ген в растении, нуклеотидная последовательность которого была преобразована с использованием статистически-предпочтительных ко донов. Нуклеотидную последовательность обычно исследуют на уровне ДНК, и кодирующий фрагмент оптимизируют для экспрессии в конкретных видах растений с использованием методик, например, описанных Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). В данной методике стандартное отклонение использования ко донов, мера «использования ко донов», может быть рассчитано как квадрат пропорционального отклонения использования каждого кодона в нативном гене по отношению к высокоэкспрессирующимся растительным генам, а затем рассчитывается общее среднеквадратическое отклонение. Используемая формула: 1 SDCU=n=1Ν[(Χn-Υn)/Υn]2/Ν, где Xn - это частота использования кодона n в высокоэкспрессируемых растительных генах, Υn - частота использования кодона n в целевом гене, N - общее число кодонов в целевом гене. Таблица использования кодонов из высокоэкспрессируемых генов двудольных растений составлена с использованием данных Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498). Другой способ оптимизации нуклеотидной последовательности в соответствии с использованием конкретных выбранных кодонов в каждом отдельном типе растительных клеток основан на прямом использовании, без каких-либо статистических расчетов, таблиц для оптимизации кодонов, таких как он-лайн таблица в базе данных Codon Usage Database банка ДНК-последовательностей NIAS (Национальный институт агробиологических наук), Япония (vvrww.kazusa.or.jp/codon/). База данных по использованию кодонов содержит таблицы по использованию кодонов для множества различных видов, причем каждая таблица создается на основе данных, содержащихся в базе данных Genbank.
Применяя описанные таблицы, содержащие кодоны для каждой аминокислоты, предпочтительно используемые в конкретных видах растений (например, рисе), ученые могут оптимизировать кодоны в целевых природных кодирующих белок последовательностях конкретных видов растений. Это может достигаться путем замены кодонов, статистически редко встречающихся в геномах конкретных видов организмов, на статистически более предпочтительные кодоны. Тем не менее, один или несколько менее предпочтительных кодонов могут быть выбраны для удаления существующих рестриктных сайтов, создания новых сайтов для потенциально полезных соединений (на 5'- и 3'-концах, чтобы добавить сигнальный пептид или терминирующие кассеты, внутренние сайты, которые могут быть использованы для разрезания и соединения фрагментов для создания правильной полноразмерной последовательности) или для элиминирования нуклеотидных последовательностей, наличие которых может негативно сказаться на стабильности или экспрессии мРНК. Природная кодирующая белок последовательность может изначально до всякой модификации содержать некоторое число кодонов, которые являются статистически предпочтительными в данных видах растений. Таким образом, оптимизация кодонов в нативной нуклеотидной последовательности может включать определение того, какие кодоны в нативной нуклеотидной последовательности не являются статистически предпочтительными в данном растении, и изменение таких кодонов в соответствии с таблицей использования кодонов в конкретном растении для создания производного с оптимизированным набором кодонов. Измененная нуклеотидная последовательность может быть полностью или частично оптимизирована для использования кодонов в растениях, таким образом, что продукция белка, кодируемого модифицированной нуклеотидной последовательностью, может быть выше продукции белка, кодируемого соответствующей нативной последовательностью. Создание синтетических генов с помощью изменения использования кодонов описано, например, в патентной заявке РСТ 93/07278.
Настоящее изобретение охватывает нуклеотидные последовательности, описанные выше, их фрагменты, последовательности, гибридизуемые с описанными последовательностями, гомологичные им последовательности, ортологи описанных последовательностей, последовательности, кодирующие сходные полипептиды с различным использованием кодонов, последовательности, измененные посредством мутаций, таких, как делеций, вставки или замены одного или более нуклеотидов, природных или индуцированных, в том числе случайных или направленных. Клетки растений могут быть трансформированы стабильно или временно конструкциями нуклеиновых кислот согласно способам, описанным в рамках настоящего изобретения. При стабильной трансформации молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения встраивается в растительный геном и, как следствие, становится стабильной и наследуемой. При временной трансформации молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется в трансформированной клетке, но не интегрирована в геном и представляет собой временный компонент.
Существуют различные методы введения чужеродных генов в однодольные и двудольные растения (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276). Среди методов стабильного внедрения экзогенной ДНК в растительную геномную ДНК выделяют два основных подхода:
(i) Перенос генов с использованием агробактерий: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers в Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, ред. Schell, J., и Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) c. 2-25; Gatenby, в Plant Biotechnology, ред. Kung, S. и Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) c. 93-112.
(ii) прямое поглощение ДНК: Paszkowski et al., в Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes ред. Schell, J., и Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) c. 52-68; включая методы прямого внедрения ДНК в протопласты, Toriyama, К. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. ДНК внедряется при помощи краткого электрического шока растительных клеток: Zhang et al. Plant Cell Rep.(1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. Внедрение ДНК в растительные клетки при помощи бомбардировки частицами, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; с использованием микропипеток: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; трансформация культур клеток, эмбрионов или каллусной ткани с помощью стеклянных нитей или нитей из карбида кремния, патент США №5,464,765 или с помощью прямой инкубации ДНК с прорастающей пыльцой, De Wet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, ред. Chapman, G. P. и Mantell, S. H. и Daniels, W. Longman, London, (1985) c. 197-209; и Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.
Агробактериальные системы включают использование плазмидных векторов, содержащих определенные сегменты ДНК, которые интегрируют в растительную геномную ДНК. Методы работы с растительными тканями варьируют в зависимости от видов растений и агробактериальной системы доставки. Широко используемый подход - метод листовых дисков, который может быть применен к любому эксплантату растительной ткани и способствует началу дифференцировки целого растения (Horsch et al. в Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) c.1-9). Дополнительный подход состоит в использовании агробактериальной системы доставки в сочетании с вакуумной инфильтрацией. Агробактериальную систему особенно часто используют для создания трансгенных двудольных растений. Существуют разнообразные методы внедрения ДНК в растительные клетки. При электропорации протопласты помещают в сильное электрическое поле на короткое время. При микроинъекции ДНК механически внедряют в клетки с помощью очень тонких микропипеток. При бомбардировке микрочастицами ДНК абсорбируется на мелкие частицы, например, на кристаллы сульфата магния или частицы вольфрама, которые физически попадают в клетки и ткани растений.
За стабильной трансформацией следует размножение. В основном растения размножают семенами. Недостатком семенного размножения является то, что вследствие гетерозиготности наблюдается отсутствие единообразия в потомстве, так как семена образуются растениями с генетическими вариациями, определяемыми правилами Менделя. В основном, все семена генетически различны и каждое семя вырастет в индивидуальное растение со своими определенными чертами. Желательно, чтобы трансформированное растение было получено таким образом, чтобы регенерированное растение обладало идентичными чертами и характеристиками родительских трансгенных растений. Таким образом, предпочтительно размножение трансформированных растений путем микроразмножения, что обеспечивает быструю и единообразную репродукцию трансформированных растений.
Микроразмножение - это процесс выращивания нового поколения растений из кусочка ткани, взятого из конкретного, выбранного родительского растения или растения нужного сорта. Этот процесс позволяет массовую репродукцию растений, обладающих нужными исследователю тканями и экспрессирующих слитый белок. Новое поколение растений генетически идентично и обладает всеми характеристиками родительского растения. Микроразмножение дает возможность массовой продукции качественного растительного материала в короткий период времени и способствует быстрой амплификации выбранных сортов, обладающих характеристиками исходного трансгенного или трансформированного растения. Преимуществами клонирования растений являются скорость размножения, а также качество и единообразность полученных потомков.
Микроразмножение представляет собой многоступенчатый процесс, требующий изменение состава культуральной среды или условий роста между стадиями. Процесс вегетативного размножения включает четыре основных стадии: стадия первая - первичное культивирование ткани, стадия вторая - размножение культуры ткани, стадия третья - дифференцировка и формирование растения, и стадия четвертая - тепличное культивирование и закаливание. Во время первой стадии, первичного культивирования ткани, создается культура ткани и гарантируется отсутствие контаминации. Во время второй стадии первичную культуру ткани размножают до нужного для целей производства количества образцов ткани. Во время третьей стадии образцы ткани, полученные на стадии два, разделяют и выращивают в отдельные ростки. На четвертой стадии трансформированные ростки переносят в теплицу для закалки, где выносливость растения постепенно возрастает таким образом, что оно становится способным к существованию в естественной среде.
Хотя в настоящее время предпочтительной является стабильная трансформация, временная трансформация клеток листа, клеток меристемы или целого растения также может применяться в некоторых вариантах изобретения.
Временная трансформация может быть осуществлена любым из описанных методов прямого переноса ДНК или с помощью вирусной инфекции с использованием модифицированных вирусов растений.
Показано, что для трансформации растительных хозяев могут быть использованы вирусы, включая CaMV, TMV и BV. Трансформация растений с использованием вирусов растений описана в патенте США №4,855,237 (BGV), ЕР-А 67,553 (TMV), опубликованной заявке Японии №63-14693 (TMV), ЕРА 194,809 (BV), ЕРА 278,667 (BV); и Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, cc. 172-189 (1988). Использование частиц псевдовируса для экспрессии чужеродной ДНК в различных хозяевах, включая растения, описано в WO 87/06261.
Использование РНК-вирусов растений для внедрения и экспрессии невирусных экзогенных нуклеотидных последовательностей в растениях показано в приведенных выше ссылках, а также, например, в Dawson, W. О. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; и Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.
Если вирус является ДНК-вирусом, то нужные модификации могут быть внесены непосредственно в вирус. В противном случае, вирус может быть сначала клонирован в бактериальную плазмиду для облегчения конструирования требуемого вирусного вектора, содержащего чужеродную ДНК. Вирус может быть затем выделен из плазмиды. Если вирус является ДНК-вирусом, то к вирусной ДНК может быть присоединен бактериальный ориджин репликации, после чего она сможет реплицироваться в бактериях. Транскрипция и трансляция данной ДНК будет обеспечивать синтез белка оболочки, который, в свою очередь, будет инкапсидировать вирусную ДНК. Если вирус является РНК-вирусом, то с его нуклеиновой кислоты синтезируют кДНК, которую далее клонируют в плазмиду. Плазмиду затем используют для всех дальнейших манипуляций. Вирусная последовательность с плазмиды транскрибируется и транслируется, синтезируется белок (белки) оболочки, который инкапсидирует вирусную РНК, формируя новые вирусные часицы. Использование РНК-вирусов растений для введения и экспрессии в растениях экзогенных невирусных нуклеотидных последовательностей, таких, как последовательности, включенные конструкции по некоторым вариантам изобретения проиллюстрировано примеденными выше ссылками, а также патентом США №5,316,931.
В некоторых случаях используют нуклеотидную последовательность вируса растений, в которой нативная последовательность, кодирующая белок оболочки, заменена на ненативную последовательность, кодирующую белок оболочки вируса растений, и ненативный промотор, обычно субгеномный промотор ненативной последовательности, кодирующей белок оболочки, способной экспрессироваться в растении-хозяине, обеспечивать упаковку рекомбинантных вирусных частиц в растении-хозяине и поддерживать системную инфекцию в хозяине рекомбинантными вирусными нуклеиновыми кислотами. Ген белка оболочки может быть инактивирован путем вставки в него ненативной нуклеотидной последовательности. Рекомбинантные нуклеотидные последовательности вирусов растений могут содержать один или более добавочных субгеномных промоторов. Все ненативные субгеномные промоторы способны обеспечивать транскрипцию и экспрессию соседних генов или нуклеотидных последовательностей в растении-хозяине, но не способны к рекомбинации друг с другом и с нативными субгеномными промоторами. Ненативные (чужеродные) нуклеотидные последовательности могут быть введены вблизи нативных субгеномных промоторов вирусов растений или вюлизи нативных и ненативных субгеномных промоторов вирусов растений, если вводят более одной нуклеотидной последовательности. Ненативные нуклеотидные последовательности транскрибируются или экспрессируются с образованием нужных продуктов в растении-хозяине под контролем субгеномного промотора. Второй вариант предусматривает рекомбинантные нуклеиновые кислоты вирусов растений, такие же, как в первом варианте, за исключением того, что вместо ненативной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок оболочки, вблизи от одного из ненативных субгеномных промоторов белка оболочки помещают нативную последовательность, кодирующую белок оболочки вируса.
Третий вариант предусматривает рекомбинантные нуклеиновые кислоты вирусов растений, в которых нативный ген белка оболочки расположен вблизи его субгеномного промотора, и в которые были вставлены один или более ненативных субгеномных промоторов. Внедренные ненативные субгеномные промоторы способны вызывать транскрипцию и экспрессию соседних генов в растении-хозяине, но не способны к рекомбинации друг с другом, а также с нативными субгеномными промоторами. Ненативные нуклеотидные последовательности могут быть внедрены вблизи ненативных субгеномных промоторов вирусов растений, тогда данные последовательности будут транскрибироваться или экспрессироваться с образованием целевого белкового продукта в растении-хозяине под контролем субгеномных промоторов.
Четвертый вариант предусматривает рекомбинантные нуклеиновые кислоты вирусов растений, такие же, как в третьем варианте, за исключением того, что нативная последовательность, кодирующая белок оболочки, заменена на ненативную последовательность, кодирующую белок оболочки.
Вирусные вектора инкапсидируются белками оболочки, кодируемыми рекомбинантной нуклеотидной последовательностью вируса растения, образуя рекомбинантные вирусы растений. Рекомбинантные нуклеиновые кислоты вирусов растений или рекомбинантные вирусы растений используют для заражения соответствующих растений-хозяев. Рекомбинантная нуклеиновая кислота вируса растения способна к репликации в хозяине, системному распространению в хозяине, транскрипции или экспрессии чужеродных генов (выделенных нуклеиновых кислот), приводящей к синтезу нужных белков.
В добавление к описанному выше, молекулы нуклеиновых кислот согласно некоторым вариантам настоящего изобретения, могут быть введены в геном хлоропластов, способствуя экспрессии в хлоропластах.
Методика внедрения чужеродных нуклеотидных последовательностей в геном хлоропластов известна. Она включает в себя следующие процедуры. Во-первых, растительные клетки обрабатывают химическими реагентами для уменьшения количества хлоропластов на клетку до примерно одного. Затем экзогенные нуклеиновые кислоты внедряют в клетки при помощи бомбардировки микрочастицами с целью внедрения хотя бы одной молекулы экзогенной нуклеиновой кислоты внутрь хлоропласта. Экзогенную нуклеиновую кислоту подбирают таким образом, чтобы она могла быть внедрена в геном хлоропластов с помощью гомологичной рекомбинации, которая довольно эффективно идет в хлоропластах при помощи специальных ферментов. Для этой цели экзогенная нуклеиновая кислота включает, помимо целевого гена, по меньшей мере, один нуклеотидный фрагмент, выделенный из геномной ДНК хлоропластов. Кроме того, экзогенная нуклеиновая кислота должна содержать селективный маркер, который используют для отбора последовательностей, чтобы убедиться, что все или почти все копии хлоропластных геномов после такого отбора несут экзогенную нуклеиновую кислоту. Прочие детали, касающиеся данной методики, можно найти в патентах США №№4,945,050 и 5,693,507, которые включены в данный документ посредством ссылки. Полипептид может синтезироваться при помощи хлоропластной системы экспрессии и интегрироваться во внутреннюю мембрану хлоропласта.
Согласно дополнительному аспекту изобретения предусмотрена клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. «Клетка-хозяин» по настоящему изобретению относится к новой индивидуальной клетке, полученной в результате внедрения в клетку экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую доминантно негативный белок T3SS. В конкретном варианте клетка-хозяин представляет собой растительную клетку. Клетка-хозяин может содержать конструкции нуклеиновых кислот в виде внехромосомной (эписомной) реплицирующейся молекулы или может включать химерный ген, интегрированный в ядерный или пластидный геном клетки-хозяина.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, содержащее экспрессионные векторы по настоящему изобретению.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предусмотрено генетически модифицированное растение, экспрессирующее экзогенный полинуклеотид, кодирующий доминантный негативный белок T3SS, приведенный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 или 12.
В некоторых вариантах генетически модифицированные растения, экспрессирующие доминантный негативный белок T3SS, обладают повышенной устойчивостью к бактериальным патогенам по сравнению с модифицированными растениями (как описано в деталях в настоящем документе выше).
Следует учитывать, что когда речь идет о генетически модифицированных растениях или клетках растений, авторы настоящего изобретения также имеют в виду и потомство, полученное от этих растений и клеток.
Потомство, полученное при скрещивании или трансформации растенийможет быть отобрано по содержанию экзогенной мРНК и/или полипептида путем использования белковых проб (т.е. антител) или проб нуклеиновых кислот.
Еще одним способом проверки экспрессии доминантно негативных белков T3SS настоящего изобретения является измерение повышенной устойчивости к бактериальным патогенам с помощью инфицирования генетически модифицированных растений и растений дикого типа (т.е. немодифицированных растений того же сорта) и сравнения протекания заболевания в растениях (например, наблюдение увядания растений).
Настоящее изобретение также предусматривает способы увеличения устойчивости растений к бактериальным патогенам. Способ включает в себя: а) экспрессию в растении экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей доминантно негативный белок T3SS и содержащей цис-регуляторный элемент, способный вызывать транскрипцию нуклеотидной последовательности в клетке растения; б) обработку растения бактериальным патогенном и в) сравнение протекания заболевания в трансгенных растениях с протеканием заболевания в растениях дикого типа, выращенных и обработанных бактериальным патогеном в тех же условиях.
Бактериальные патогены, описанные в настоящем документе, могут обуславливать множество заболеваний растений. Так, например, R. solanacearum может приводить к увяданию, P. agarici обуславливает болезнь слабых гимениальных пластинок(например, в культивируемых грибах), P. tolaasii может привести к бактериальной пятнистости (например, в культивируемых грибах), X. Campestris обуславливает появление черной гнили (например, в крестоцветных, таких, как капуста и арабидопсис), X. oryzae может привести к бактериальному ожогу (например, в рисе), Е. amylovora может привести к бактериальному ожогу (например, яблок и груш), Е. carotovora может привести к возникновению бактериальной мягкой гнили.
Так, например, при увядании симптомы оценивают ежедневно на протяжении двух-четырех недель (в слепом исследовании) с использованием шкалы заболеваемости от 0 до 4, где 0 обозначает отсутствие болезни, 1 обозначает увядание от 1% до 25% листьев, 2 обозначает увядание от 25% до 50% листьев, 3 обозначает увядание от 51% до 75% листьев и 4 обозначает увядание от 76% до 100% листьев.
Используемый в настоящем документе термин «примерно» обозначает ±10%.
Термины «включает», «включающий», «содержит», «содержащий» обозначают«содержит какой-то элемент, но может включать и другие элементы».
Термин «состоящий из» обозначает «включает только перечисленные элементы». Термин «состоящий главным образом из» обозначает, чтокомпозиция, способ или структура могут включать дополнительные элементы, стадии и/или части, но только если добавочные элементы, стадии и/или части не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики заявленной композиции, способа или структуры. При использовании единственного числа подразумевается также использование множественного числа, за исключением случаев, когда в контексте ясно указано иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере, одно соединение» может обозначать множество соединений, включая смеси их друг с другом.
В настоящем документе различные варианты изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона представлено для удобства и краткости, и не должно восприниматься как жесткие ограничения настоящего изобретения. Соответственно, представление в виде диапазона должно рассматриваться как включающее все возможные поддиапазоны, а также все отдельные численные значения внутри диапазона. Например, описание диапазона от 1 до 6 должносчитаться включающим поддиапазоны, такие, как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., так же как и отдельные числа, например, 1, 2, 3, 4, 5, и 6. Это применяется независимо от ширины диапазона.
Когда в настоящем документе указан числовой диапазон, он предназначен для включения всех указанных чисел (дробных или целых) в пределах указанного диапазона. Фразы «в пределах/в диапазоне между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «начиная с/от» первого указанного числа «до» второго указанного числа используют в настоящем документе взаимозаменяемо для включения первого и второго указанных чисел, а также всех дробных и целых значений внутри интервала.
Используемый в настоящем документе термин «способ» обозначает способы, средства, методики и процедуры для осуществления конкретной задачи, включая те способы, средства, методики и процедуры, которые либо известны, либо могут быть разработаны из известных способов, средств, методик и процедур, используемых специалистами химиками, фармакологами, биологами, биохимиками, медиками.
Следует понимать, что отдельные черты изобретения, описанные для ясности в контексте отдельных вариантов, могут также сочетаться друг с другом. И наоборот, различные признаки изобретения, описанные для краткости в рамках одного варианта изобретения, могут быть представлены раздельно в любой возможной подкомбинации и в любом другом возможном варианте изобретения. Конкретные черты, описанные в рамках различных вариантов изобретения, не должны восприниматься как существенные признаки этих вариантов, если только вариант изобретения не является нефункциональным без описанных элементов.
Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, как это описано выше, и, как заявлено в формуле изобретения, находят экспериментальное подтверждение в следующих Примерах.
ПРИМЕРЫ
В данном разделе приводятся ссылки на следующие примеры, которые вместе с описанием изобретения выше иллюстрируют изобретение, не ограничивая его.
В целом номенклатура, использованная в настоящем документе и в лабораторных процедурах, проведенных для настоящего изобретения, включает молекулярные, биохимические, микробиологические техники и техники рекомбинантных ДНК. Эти методы подробно описаны в литературе. См., например, «Molecular Cloning: А laboratory Manual» Sambrook и др., (1989); «Current Protocols in Molecular Biology» книги I-III под ред. Ausubel, R.M., (1994); Ausubel et al., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley & Sons, New York (1988); Watson и др., «Recombinant DNA», Scientific American Books, New York; Birren и др. (ред.) «Génome Analysis: A Laboratory Manual Series», кн. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики как указано в патентах США NO 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 и 5,272,057; «Cell Biology: A Laboratory Handbook)), книги I-III Cellis, J. Ε., ред. (1994); «Current Protocols in Immunology» книги I-III Coligan J. Ε., ред. (1994); Stites et al. (eds), «Basic and Clinical Immunology» (8e издание), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell и Shiigi (ред.), «Selected Methods in Cellular Immunology», W.H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммунологические анализы подробно описаны в патентах и научной литературе, см., например, патенты США NO 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 и 5,281,521; «Oligonucleotide Synthesis» Gait, M.J., ред. (1984); "Nucleic Acid Hybridization)) Hames, B. D., и Higgins S. J., ред. (1985); «Transcription and Translation» Hames, В. D., и Higgins S. J., ред. (1984); «Animal Cell Culture» Freshney, R. I., ред. (1986); «Immobilized Cells and Enzymes» IRL Press, (1986); «A Practical Guide to Molecular Cloning» Perbal, В., (1984) и «Methods in Enzymology» тома 1-317, Academic Press; «PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications», Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak и др., «Stratégies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual» CSHL Press (1996); которые все включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. Прочие ссылки представлены в тексте документа. Методики, рассмотренные в этом документе, предполагаются известными для всех специалистов, работающих в данной области, и представлены для удобства читателя. Вся информация, содержащаяся здесь, включена в настоящий документ посредством ссылок во всей своей полноте.
ПРИМЕР 1
Получение и экспрессия интеркалирующих блокирующих элементов каналов иглы секреторной системы типа III (T3SS) Ralstonia solanacearum в растениях
МАТЕРИАЛЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
Синтез генов, экспрессия с использованием предпочтительных кодонов
Варианты системы T3SS-IBE были сконструированы на основании трехмерной модели иглы T3SS от Shigela flexneri (MxiH), описанной ранее [Deane et al., PNAS 2006 103:12529-33], представляющей гипотетическую модель природной структуры HrpY (Фиг.2A-F).
Гены интеркалирующего блокирующего элемента HrpY Ralstonia solanacearum (Rs) (hY-IBE) были синтезированы искусственным путем и кодоны были оптимизированы для использования в целевых растениях. Лидерные специфические пептиды секреции растений были слиты с 5'-концом каждого hY-IBE, чтобы транспортировать и локализовать зрелые белки в апопласте или клеточной стенке.
Клонирование в бинарном векторе и трансформация:
Синтетические фрагменты, состоящие из кодирующих областей IBE 1-6 с 5'-концевым нетранслируемым энхансером, были клонированы после 35S конститутивного промотора CaMV и перед терминатором NOS в вектор трансформации растений, основанный на плазмиде pBI121 (NCBI genebank ID# AF485783) с использованием сайтов рестрикции XbaI и SacI (Фиг.7А).
Протокол агротрансформации был использован для растений томата, арабидопсиса и эвкалипта так же, как было описано ранее для растений табака [см., например, Svab, Ζ., P. Hajdukiewicz and P. Maliga. (1975) Transgenic tobacco plants by co-cultivation of leaf disks with pPZP Agrobacterium binary vectors. "Methods in Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual", P. Maliga, D. Klessig, A. Cashmore, W. Gruissem and J. Varner, eds. Cold Spring Harbor Press: 55- 77] и для растений эв калипта [Spokevicius AV., Van Beveren K., Leitch MA and Bossinger G. (2005) Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Reports, Volume 23(9), 617-624].
Трансформация растений томата
Растения томата были трансформированы, как описано ранее [Qiu et al., Scientia Horticulturae 112 (2007) 172-175]. Кратко:
Растительный материал
Семена томата L. esculentum cv М82 были поверхностно простерилизованы в течение 30 с в 70% спирте, промыты стерилизованной водой в течение 10 с и затем простерилизованы в течение 10 мин в 1% растворе гипохлорита и дважды промыты стерилизованной водой на протяжении 30 мин перед высеванием в Среду А (как описано в Таблице 7 ниже). Семена были высажены в вегетационный контейнер Magenta и их проращивали при температуре 24°С при 16-часовом световом и 8-часовом темновом периоде. Семядоли наполовину выпрямившихся саженцев были использованы на 4Й-5Й день вегетации.
Среда, антибиотики и гормоны
Среду MSB5 (М0404) приобретали в виде порошка от Sigma Chemical Со. и хранили при 2-8°С. Сахарозу и глюкозу хранили при комнатной температуре. Канамицин, карбенциллин, цефотаксим, рифамицин, ZR, IAA, IBA были в дальнейшем использованы в питательных средах (как описано в Таблице 7 ниже)
Таблица 7 | ||||||
Растительные среды, использованные в протоколе трансформации томатов (цитируются здесь по Qiu et al., Scientia Horticultwae 112 (2007) 172-175) | ||||||
Состав различных сред | ||||||
Соли MSB5 | Среда | |||||
А, 0,5× | В, 1× | B1, 1× | С, 1× | D, 1× | E, 1× | |
Глюкоза | Н | Н | Н | Н | 1% | Н |
Агар (Daichin) (%) | 0,60 | 0,60 | Н | 0,60 | 0,60 | 0,60 |
рН | 5,8 | 5,8 | 5,8 | 5,8 | 5,8 | 5,8 |
IAA 0,1 мг/л | - | + | - | + | + | - |
ZR 2 мг/л | - | + | - | + | + | - |
IBA ОД мг/л | - | - | - | - | - | + |
Цефотаксим 500 мг/л | - | - | - | + | + | + |
Карбенициллин 500 мг/л | - | - | - | - | + | - |
Канамицин (мг/л) | - | - | - | - | 100 | 30 |
Бактериальные штаммы и плазмиды
Для экспериментов по трансформации были использованы агробактерии, содержащие целевой ген. Бинарным вектором, использованным в данном исследовании, был рВН21, который содержал ген nptII как маркер селекции; штаммы агробактерий, применявшиеся в данной работе, содержали маркер для селекции на рифампицине. Бактерии выращивали в течение ночи на лизогенном бульоне с антибиотиками (рифампицин 30 мг/л, канамицин 100 мг/л), затем разводили до оптической плотности OD600=0,2 и доводили до ожидаемого показателя оптической плотности OD600 на лизогенном бульоне без антибиотиков. Бактериальные суспензии центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут в 50-миллилитровой пробирке Falcon. Бактерии ресуспендировали в среде с витамином В1 и использовали для экспериментов по кокультивации.
Протокол трансформации
Семядоли были приготовлены следующим образом: отрезание семядолей от саженцев было проделано с максимальной осторожностью для предотвращения повреждения тканей. Изолированные семядоли были разрезаны только на базальной и латеральной сторонах и помещены верхней стороной наверх в Среду В (описана в Таблице 7 выше). Примерно 50 эксплантатов были помещены в одну чашку Петри и поставлены на инкубацию на ночь. На следующий день эксплантаты были аккуратно погружены в культуру Agrobacterium inoculum на чашке Петри на 20 минут. Они были просушены на стерильной бумаге и перенесены в новую Среду В. Через 72 часа эксплантаты были перенесены на чашки Петри, содержащие Среду С (описана в Таблице 7 выше). После инкубации в течение следующих 72 часов эксплантаты были перенесены на селективную Среду D (описана в Таблице 7 выше). Каждые 3 недели эксплантаты пересевали на такую же среду. По прошествии примерно 6-8 недель проростки были вырезаны из питательной среды и перенесены на Среду Ε (описана в Таблице 7 выше). Частота трансформации была выражена как процентное соотношение числа семядолей, проростки от которых восстановились, к общему количеству инкубированных эксплантатов.
Экспрессия и подтверждение клонирования:
Интеграция T3SS-IBE в растительный геном и экспрессия этих генов была проанализирована с использованием стандартных методов молекулярной биологии, таких как ПЦР, ОТ-ПЦР [как описано ранее, см., например, Sambrook J. and Russell DW., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd edition (January 15, 2001)] со специфичными IBE праймерами 1-6 и вестерн-анализом с поликлональным антителом анти-IBE. В частности, праймерами для ПЦР, использованными для мутанта 1 HrpY, были прямой праймер TCTCTTTGCTCTCCTTTATAGCCCTAC и обратный праймер TCGCAGCGTCTAACATATCTTGTTGTC (SEQ ID NO:95-96, соответственно); праймерами для ПЦР, использованными для мутанта 2 HrpY, были прямой праймер GTCACATGGTTCGTTGGTGTACTCTTC и обратный праймер CATCTGGGTTCTATTCAGCGCATTTTG (SEQ ID NO:97-98, соответственно); а праймерами для ПЦР, использованными для мутанта 6 HrpY, были прямой праймер GTCTTGTTCCTGTCTACCTTGCTCC и обратный праймер GAGATTAGGTCTTTCGCAGCTTTGG (SEQ ID NO:93-94, соответственно).
Биотестирование:
Трансгенные растения были подвергнуты биотестированию для оценки уровня устойчивости каждой трансгенной линии по сравнению с диким типом (т.е. не экспрессирующим ген IBE). Применяли три метода биологического тестирования:
1. Пропитанная почва. Неповрежденные растения возрастом 19-21 день заражали путем полива почвы бактериальной суспензией до финальной плотности примерно 1×108 КОЕ/г почвы с последующей инкубацией при 28°С.Контрольные растения подвергли ложному заражению стерильной водой. Проявление симптомов заражения регистрировали ежедневно оценщиком, не осведомленным о принадлежности растения к контрольной или экспериментальной группе, по шкале заболевания от 0 до 4, где 0 указывает на отсутствие болезни, 1 соответствует 1-25% увядания листьев, 2 соответствует 25-50% увядания листьев, 3 соответствует 51-75% увядания листьев, 4 соответствует 76-100% увядания листьев. Каждый опыт включал 16 растений на экспериментальную группу, и опыты были повторены, по меньшей мере, 3 раза.
2. Заражение черешков. Нижние листья неповрежденных растений возрастом 19-21 день отрезали и 2 мкл бактериальной суспензии с финальной концентрацией 1×108 КОЕ/мл капали на срез черешка. Контрольные растения подвергли ложному заражению стерильной водой. Проявление симптомов заражения регистрировали ежедневно оценщиком, не осведомленным о принадлежности растения к контрольной или экспериментальной группе, по шкале заболевания от 0 до 4, где 0 указывает на отсутствие болезни, 1 соответствует 1-25% увядания листьев, 2 соответствует 25-50% увядания листьев, 3 соответствует 51-75%) увядания листьев, 4 соответствует 76-100%) увядания листьев. Каждый опыт включал 16 растений на экспериментальную группу, и опыты были повторены, по меньшей мере, 3 раза.
3. Заражение стебля. Неповрежденные растения возрастом 19-21 день заражали вертикальным надрезанием стебля стерильным ножом. В надрез длиной 1 см и глубиной 0,5 см инъецировали 100 мкл бактериальной суспензии с финальной плотностью примерно 1×108 КОЕ/мл. Контрольные растения подвергли ложному заражению стерильной водой. Проявление симптомов заражения регистрировали ежедневно оценщиком, не осведомленным о принадлежности растения к контрольной или экспериментальной группе, по шкале заболевания от 0 до 4, где 0 указывает на отсутствие болезни, 1 соответствует 1-25% увядания листьев, 2 соответствует 25-50% увядания листьев, 3 соответствует 51-75% увядания листьев, 4 соответствует 76-100% увядания листьев. Каждый опыт включал 16 растений на экспериментальную группу, и опыты были повторены, по меньшей мере, 3 раза.
Результаты
Изобретатели сконструировали экспрессируемые растением блокирующие элементы канала иглы секреторной системы типа III (T3SS) Ralstonia solanacearum (Rs) (интеркалирующие блокирующие элементы T3SS или T3SS-IBE) для защиты растений от увядания, используя структурные модификации белка HrpY, формообразующего мономера иглы. Структурно модифицированный HrpY (SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 и 12, также изображенный в деталях на Фиг.2A-F, 3A-D, 4А-С, 5А-С и 6A-D), экспрессированный в трансгенных растениях (сельскохозяйственных и древесных), внедряется в нативные пили Rs, дезактивируя их функционально и предотвращая либо снижая заражение бактериями Rs у трансгенных растений по сравнению с растениями дикого типа. Предполагается, что трансгенное растение, которое экспрессирует T3SS-IBE, выделяет T3SS-IBE наружу из клетки, где T3SS-IBE собирается в пилях атакующих Rs, приводя пили в нефункциональное или нефункциональное состояние. У бактерий со структурно модифицированными белками растительного происхождения интеркалировавшими в пили, T3SS перейдут в нефункциональное состояние и таким образом не будут способны преодолеть природную защиту растения. Такие трансгенные устойчивые растения могут противостоять инфицированию Rs.
Варианты T3SS-IBE были сконструированы на основании трехмерной модели T3SS иглы бактерии Shigela flexneri (MxiH), как описано ранее [Deane et al., PNAS 2006 103: 12529-33]. На основании этой модели были спланированы структурные модификации HrpY Ralstonia, приводящие к модифицированным мономерам T3SS иглы, которые интеркалируют в структуру иглы и блокируют канал этой иглы, через который пектиназы, разрушающие растительную клеточную стенку, эндоглюканазы, вирулентные экзополисахариды и эффекторные белки перемещаются внутрь клеточной стенки хозяина или сквозь нее (Фиг.1А-С). Таким образом, структурно модифицированные пили включают в себя белковые домены, которые расположены в канале пили и предположительно вследствие этого способны функционально и физически блокировать канал. Такие структурно нестабильные пили также заканчивают свою сборку раньше, что приводит к относительно коротким пилям, что усугубляет нарушение их функциональности и способности переносить белки в растение. Эта рациональная модель основана на сохранении и использовании нативных сайтов взаимодействий между субъединицами HrpY при включении трансляции гибридного белка, блокирующего канал, и/или деформирующего структур альфа-спиралей. Растительные сигналы секреции были включены в T3SS-IBE, чтобы сделать возможным выделение из растительных клеток в межклеточное пространство. Как описано в разделе «Материалы и экспериментальные процедуры» выше, устойчивые к увяданию (WiltR) растения томата были сконструированы путем трансформации растений томата конструктами, несущими мутанты HrpY 1, 2 или 6 Ralstonia solanacearum (SEQ ID NO:1, 3 и 11 соответственно). Эти растения были в дальнейшем проанализированы геномной ПЦР и полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров для мутанта 1 HrpY (SEQ ID NO:95-96), мутанта 2 HrpY (SEQ ID NO:97-98) или мутанта 6 HrpY (SEQ ID NO:93-94). Была определена экспрессия мутантов 1, 2 или 6 HrpY в трансформированных растениях томата (см. Фиг.11А-С, 12А-С и 10А-С соответственно).
ПРИМЕР 2
Получение и экспрессия T3SS-IBE различных бактерий в растениях В добавление к IBE, описанным в Примере 1 выше, с использованием описанных выше методов для других грамотрицательных бактерий были разработаны и идентифицированы другие IBE. Например, IBE были разработаны картированием областей связывания структурообразующих белков пилей, определением пептидов-кандидатов, которые связываются с нативными пилями и интегрируют в них во время образования последних in vivo, модифицированием пептида-кандидата для перевода канала в состояние неспособности к выделению эффекторных белков и получением модифицированные IBE кандидатов.
Модификации могут включать в себя модификации, основанные на любом из следующих принципов:
1. Нативные белки могут быть модифицированы на основании одного или более из нескольких различных подходов, включая следующие:
2. Добавление траснлируемой слитой последовательности к N-концевой области нативного белка как в IBE 1, 2 и 3 с (IBE 1&3) или без (IBE 2) и перед (IBE 1) или после (IBE 3) нативного N-концевого домена (см. Фиг.3A-D, 4А-С и 7С).Добавление траснлируемой слитой последовательности к С-концевой области нативного белка как в IBE 4 с аминокислотным мостиком, разрешающим вращательное движение транслируемого слитого фрагмента, или без него (см. Фиг.5А-С и 7С). Подобный мостик может состоять, например, из одного или нескольких остатков глицина или аланина.
3. Добавление аминокислоты пролина в случайно выбранные точки по всей длине последовательности структурообразующего блока, как в IBE 5 или 6 (см. Фиг.6A-D и 7С).
4. Пентапептидные вставки.
ПРИМЕР 3
Получение и экспрессия модифицированных белков транслоконов Ralstonia solanacearum (PopF1) в растениях
Другой подход, примененный изобретателями, состоит в сверхэкспрессии модифицированных белков и белков дикого типа (wt) транслокона Rs (например, PopF1 или PopF2) в трансгенных растениях. PopF1 и PopF2 являются структурообразующими элементами ворот иглы и играют важную роль в вирулентности и реакции гиперчувствительности у растений дикого типа Wt, а модифицированные белки PopF1/F2 останавливают сборку T3SS вследствие взаимодействия с незрелой иглой. Контролируемое удлинение иглы бактерий и белки транслокона в норме выделяются на завершающей стадии процесса. Трансгенные белки транслокона, которые взаимодействуют с иглой преждевременно, вмешиваются в контролируемую последовательную сборку T3SS и дезактивируют ее. Таким образом, модифицированные белки PopF1/F2 включаются в ворота транслокона и блокируют последние, либо деформируют их структуру, вызывая их нефункциональность. Вместе взятые, настоящие сведения обусловливают экспорт белков дикого типа и модифицированных белков PopF1 в апопласт/клеточную стенку трансгенными растениями.
Хотя изобретение было описано с конкретными вариантами его осуществления, очевидно, что многочисленные альтернативы, модификации и вариации будут очевидны специалистам в данной области. Соответственно существует намерение охватить все возможные альтернативы, модификации и вариации, которые соответствуют сущности и объему настоящей заявки.
Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в этом описании и включены во всей своей полноте в настоящее описание в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была специфично и индивидуально отмечена как включенная в настоящее описание посредством ссылки. В добавление к этому цитирование или идентификация любого источника в данной заявке не должно быть истолковано как допущение, что такой источник был доступен в качестве предшествующего уровня техники относительно настоящей заявки. До той степени, в какой использованы заголовки разделов, они не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение.
Claims (18)
1. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую секретируемый доминантно негативный белок HrpY Ralstonia solanacearum и гетерологичный цис-действующий регуляторный элемент, способный управлять транскрипцией указанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке, где указанная нуклеотидная последовательность является такой, как изложено в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 или 11, где указанный доминантно негативный белок T3SS вызывает сборку нефункционального комплекса иглы.
2. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую секретируемый доминантно негативный белок HrpY Ralstonia solanacearum и гетерологичный цис-действующий регуляторный элемент, способный управлять транскрипцией указанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, приведенный в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 или 12, где указанный доминантно негативный белок T3SS вызывает сборку нефункционального комплекса иглы.
3. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где указанный вектор дополнительно содержит дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид секреции, до и в рамке с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанный доминантно негативный белок T3SS, где указанный сигнальный пептид секреции выбран из группы, состоящей из sp|Q56YT0|LAC3_At лакказы (SEQ ID NO: 16) и tr|Q6TDS6|Q6TDS6_GOSAR (SEQ ID NO: 17).
4. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по п. 1 или 2, где указанный гетерологичный цис-действующий регуляторный элемент включает в себя промоторную последовательность.
5. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую доминантно негативный белок T3SS, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 и 12.
6. Вектор экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий полинуклеотид по п. 5.
7. Растительная клетка, экспрессирующая экзогенный полинуклеотид, кодирующий доминантный негативный белок T3SS, где растительная клетка содержит вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4 или 6.
8. Генетически модифицированное растение, обладающее повышенной устойчивостью к Ralstonia solanacearum по сравнению с немодифицированным растением, содержащее вектор экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4 или 6, где указанное растение является чувствительным к инфекции, вызванной указанной Ralstonia solanacearum, и выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного растения, декоративного растения или древесного растения.
9. Генетически модифицированное растение, обладающее повышенной устойчивостью к Ralstonia solanacearum по сравнению с немодифицированным растением, экспрессирующее экзогенный полинуклеотид, кодирующий доминантно негативный белок T3SS, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 и 12, где указанное растение является чувствительным к инфекции, вызванной указанной Ralstonia solanacearum, и выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного растения, декоративного растения или древесного растения.
10. Способ получения растения, обладающего повышенной устойчивостью к Ralstonia solanacearum по сравнению с немодифицированным растением, где указанное растение является чувствительным к инфекции, вызванной указанной Ralstonia solanacearum, и выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного растения, декоративного растения или древесного растения, включающий введение в растение или клетку растения вектора экспрессии нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4 или 6, таким образом создавая растение, обладающее повышенной устойчивостью к Ralstonia solanacearum по сравнению с немодифицированным растением.
11. Способ оценки устойчивости растения к Ralstonia solanacearum, где указанное растение является чувствительным к инфекции, вызванной указанной Ralstonia solanacearum, и выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного растения, декоративного растения или древесного растения, включающий:
(а) экспрессию в растении экзогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей секретируемый доминантно негативный белок T3SS и гетерологичный цис-действующий регуляторный элемент, способный управлять транскрипцией указанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке, и дополнительно содержащей дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид секреции, до и в рамке с указанной нуклеотидной последовательностью, кодирующей указанный доминантно негативный белок T3SS;
(б) заражение растения Ralstonia solanacearum; и
(в) сравнение проявлений болезни у указанного растения с растением дикого типа, выращенных и инфицированных упомянутым Ralstonia solanacearum в одинаковых условиях, и получение таким образом оценки устойчивости растений к Ralstonia solanacearum.
12. Генетически модифицированное растение по любому из пп. 8 или 9, где указанное растение представляет собой Solanaceae растение.
13. Генетически модифицированное растение по любому из пп. 8 или 9, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из растений томата, картофеля, баклажана, банана, сладкого перца, оливы, яблони, груши, пираканты, цветущей дикой яблони, боярышника, кизильника, айвы, рябины обыкновенной, арабидопсиса, герани, имбиря, табака и эвкалипта.
14. Способ по п. 10 или 11, где указанное растение представляет собой Solanaceae растение.
15. Способ по п. 10 или 11, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из растений томата, картофеля, баклажана, банана, сладкого перца, оливы, яблони, груши, пираканты, цветущей дикой яблони, боярышника, кизильника, айвы, рябины обыкновенной, арабидопсиса, герани, имбиря, табака и эвкалипта.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161448223P | 2011-03-02 | 2011-03-02 | |
US61/448,223 | 2011-03-02 | ||
PCT/IL2012/050069 WO2012117406A2 (en) | 2011-03-02 | 2012-03-01 | Bacterial resistant transgenic plants |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013143539A RU2013143539A (ru) | 2015-04-10 |
RU2640246C2 true RU2640246C2 (ru) | 2017-12-27 |
Family
ID=45937510
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013143539A RU2640246C2 (ru) | 2011-03-02 | 2012-03-01 | Устойчивые к бактериям трансгенные растения |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9856492B2 (ru) |
CN (2) | CN103597078B (ru) |
BR (1) | BR112013022331B1 (ru) |
RU (1) | RU2640246C2 (ru) |
UA (1) | UA113843C2 (ru) |
WO (1) | WO2012117406A2 (ru) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012117406A2 (en) | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Futuragene Israel Ltd. | Bacterial resistant transgenic plants |
KR102270069B1 (ko) * | 2013-03-14 | 2021-06-28 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 식물 조절 성분 및 이의 용도 |
CN105143243B (zh) | 2013-03-21 | 2020-03-13 | 国家科学和工业研究组织 | 三螺旋蛋白的纯化 |
TWI738631B (zh) | 2013-09-09 | 2021-09-11 | 德商贏創運營有限公司 | 經修飾之細菌類膠原蛋白蛋白質 |
CN111138518B (zh) * | 2019-12-30 | 2021-12-10 | 山东农业大学 | 细菌转位子组分蛋白及其截短体的表达和应用 |
CN111171122B (zh) * | 2020-01-07 | 2021-06-01 | 华中农业大学 | 一种来源于半夏的抗菌肽PtR946及其应用 |
CN113604490B (zh) * | 2021-08-12 | 2023-10-31 | 安徽农业大学 | 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008058944A1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-05-22 | Aeterna Zentaris Gmbh | Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof |
RU2406761C2 (ru) * | 2006-06-22 | 2010-12-20 | Квс Зат Аг | Патоген-индуцируемый синтетический промотор |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
CA1192510A (en) | 1981-05-27 | 1985-08-27 | Lawrence E. Pelcher | Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom |
JPS6054684A (ja) | 1983-09-05 | 1985-03-29 | Teijin Ltd | 新規dνa及びハイブリツドdνa |
US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
CA1288073C (en) | 1985-03-07 | 1991-08-27 | Paul G. Ahlquist | Rna transformation vector |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
GB8608850D0 (en) | 1986-04-11 | 1986-05-14 | Diatech Ltd | Packaging system |
JPS6314693A (ja) | 1986-07-04 | 1988-01-21 | Sumitomo Chem Co Ltd | 植物ウイルスrnaベクタ− |
ES2060646T3 (es) | 1987-02-09 | 1994-12-01 | Lubrizol Genetics Inc | Virus rna hibrido. |
US5316931A (en) | 1988-02-26 | 1994-05-31 | Biosource Genetics Corp. | Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes |
US5693507A (en) | 1988-09-26 | 1997-12-02 | Auburn University | Genetic engineering of plant chloroplasts |
US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
US5302523A (en) | 1989-06-21 | 1994-04-12 | Zeneca Limited | Transformation of plant cells |
US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
UA48104C2 (ru) | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя |
US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
US20100293669A2 (en) * | 1999-05-06 | 2010-11-18 | Jingdong Liu | Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
EP1288301A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-05 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Berlin | Plant-derived resistance gene |
US7985889B2 (en) | 2007-02-21 | 2011-07-26 | Board Of Trustees Of Michigan State University | AtMIN7 mediated disease resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis |
AU2008227216A1 (en) | 2007-03-21 | 2008-09-25 | Creative Antibiotics Sweden Ab | Method and means for preventing and inhibiting type III secretion in infections caused by gram-negative bacteria |
WO2008124836A2 (en) * | 2007-04-10 | 2008-10-16 | Uwm Research Foundation, Inc. | Methods of reducing virulence in bacteria |
US20090044296A1 (en) | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hrpn interactors and uses thereof |
WO2012117406A2 (en) | 2011-03-02 | 2012-09-07 | Futuragene Israel Ltd. | Bacterial resistant transgenic plants |
-
2012
- 2012-03-01 WO PCT/IL2012/050069 patent/WO2012117406A2/en active Application Filing
- 2012-03-01 BR BR112013022331-6A patent/BR112013022331B1/pt active IP Right Grant
- 2012-03-01 US US14/002,751 patent/US9856492B2/en active Active
- 2012-03-01 UA UAA201311593A patent/UA113843C2/uk unknown
- 2012-03-01 RU RU2013143539A patent/RU2640246C2/ru active
- 2012-03-01 CN CN201280021463.5A patent/CN103597078B/zh active Active
- 2012-03-01 CN CN201611021018.5A patent/CN106978437A/zh active Pending
-
2017
- 2017-05-28 US US15/607,498 patent/US10407692B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2406761C2 (ru) * | 2006-06-22 | 2010-12-20 | Квс Зат Аг | Патоген-индуцируемый синтетический промотор |
WO2008058944A1 (en) * | 2006-11-13 | 2008-05-22 | Aeterna Zentaris Gmbh | Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
GIJSEGEM F. V. and et al. The hrp gene locus of Pseudomonas solanacearum, which controls the production of a type III secretion system, encodes eight proteins related to components of the bacterial flagellar biogenesis complex, Molecular Microbiology, 1995 n.15, p.1095-1114. * |
GIJSEGEM F. V. and et al. The hrp gene locus of Pseudomonas solanacearum, which controls the production of a type III secretion system, encodes eight proteins related to components of the bacterial flagellar biogenesis complex, Molecular Microbiology, 1995 n.15, p.1095-1114. MUKAIHARA T. and et al. Genetic screening of Hrp type III-related pathogenicity genes controlled by the HrpB transcriptional activator in Ralstonia solanacearum, 2004, n.54, p.11-18. Gopalan S and et al. Expression of the Pseudomonas syringae Avirulence Protein AvrB in Plant Cells Alleviates Its Dependence on the Hypersensitive Response and Pathogenicity (Hrp) Secretion System in Eliciting Genotype-Specific Hypersensitive Cell Death, The Plant Cell, 1996, v.8, 1095-1105. * |
Gopalan S and et al. Expression of the Pseudomonas syringae Avirulence Protein AvrB in Plant Cells Alleviates Its Dependence on the Hypersensitive Response and Pathogenicity (Hrp) Secretion System in Eliciting Genotype-Specific Hypersensitive Cell Death, The Plant Cell, 1996, v.8, 1095-1105. * |
MUKAIHARA T. and et al. Genetic screening of Hrp type III-related pathogenicity genes controlled by the HrpB transcriptional activator in Ralstonia solanacearum, 2004, n.54, p.11-18. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170260542A1 (en) | 2017-09-14 |
US9856492B2 (en) | 2018-01-02 |
BR112013022331B1 (pt) | 2021-01-26 |
UA113843C2 (xx) | 2017-03-27 |
CN103597078A (zh) | 2014-02-19 |
US20130347141A1 (en) | 2013-12-26 |
RU2013143539A (ru) | 2015-04-10 |
CN103597078B (zh) | 2016-12-14 |
BR112013022331A2 (pt) | 2016-12-06 |
WO2012117406A2 (en) | 2012-09-07 |
CN106978437A (zh) | 2017-07-25 |
US10407692B2 (en) | 2019-09-10 |
WO2012117406A3 (en) | 2013-01-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3224363B1 (en) | Nucleic acid constructs for genome editing | |
US10829776B2 (en) | Use of MFS transporters for increasing biomass, growth rate, nitrogen use efficiency and low nitrogen tolerance in plants | |
US10407692B2 (en) | Bacterial resistant transgenic plants having dysfunctional T3SS proteins | |
US20170088854A1 (en) | MicroRNA Compositions and Methods for Enhancing Plant Resistance to Abiotic Stress | |
US9518267B2 (en) | Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance and/or biomass and/or yield in plants expressing same | |
KR101883803B1 (ko) | 식물 및 식물 세포에서 알파-갈락토시다제의 발현용 핵산 작제물 | |
EP1578976B1 (en) | Plants having modified growth characteristics and a method for making the same | |
US20140380523A1 (en) | Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant utility | |
US20230287446A1 (en) | Polynucleotides and polypeptides of plant and bacterial origin for protecting plants from pathogenic fungi | |
US20140068814A1 (en) | Method of improving abiotic stress tolerance of plants and plants generated thereby | |
US8648231B2 (en) | Wall-associated kinase-like polypeptide mediates nutritional status perception and response | |
IL224181A (en) | Methods for controlling plant acidity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HE9A | Changing address for correspondence with an applicant |