ES2938044T3

ES2938044T3 - Estructura a base de epiplón y sistema de suministro

Info

Publication number: ES2938044T3
Application number: ES14741411T
Authority: ES
Inventors: Tal Dvir; Dan Peer; Michal Shevach; Tsur Neta Soffer
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: WO2014207744A1; EP3013380A1; EP3013380B1; US20150202348A1; US20180000990A1; US20200101198A1

Abstract

Se describen composiciones de materia que comprenden epiplón descelularizado. Las composiciones pueden ser estructuras, hidrogeles o composiciones precursoras de hidrogel. Se describen métodos para generar las composiciones así como sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Estructura a base de epiplón y sistema de suministro

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende epiplón descelularizado, liofilizado y solubilizado, como se define por las reivindicaciones.

La incapacidad del miocardio para curarse a sí mismo después de un infarto y la escasez de donantes cardíacos han motivado a los científicos a explorar nuevas tecnologías para la regeneración del corazón. Las terapias celulares, tales como la inyección de células intracoronaria, evolucionaron para repoblar el tejido cicatricial con células contráctiles. Sin embargo, dos inconvenientes principales de este enfoque son la falta de control sobre el sitio de acumulación celular y la muerte celular antes de formar interacciones con su entorno. Estas deficiencias motivaron el desarrollo del concepto de ingeniería tisular cardíaca, en donde se fabrican estructuras de tipo MEC tridimensionales (3D) a partir de biomateriales, que brindan soporte mecánico al tejido de ensamblaje.

Durante los últimos años, se han usado diversos tipos de biomateriales como estructuras para el alojamiento de células cardíacas, incluidos los sintéticos (por ejemplo, poli(ácido láctico-co-glicólico), poli(sebacato de glicerol)) y naturales (por ejemplo, colágeno, alginato). Aunque se informó una mejora significativa en la función del corazón infartado después de la implantación de parches cardíacos diseñados basados en estas estructuras de biomaterial, aún no se ha alcanzado todo el potencial terapéutico de la ingeniería tisular cardíaca. Uno de los desafíos restantes es la falta de una vasculatura adecuada, necesaria para una anastomosis eficiente con el huésped después del trasplante. Otro inconveniente es la falta de un verdadero microambiente de apoyo, que imite las condiciones naturales y fomente el ensamblaje de un tejido cardíaco funcional.

Además del soporte mecánico, la MEC nativa proporciona a las células una gran cantidad de señales instructivas para inducir el ensamblaje tisular funcional. Estos incluyen señales topográficas proporcionadas por la intrincada malla de fibras de colágeno y elastina, proteínas de adhesión tales como fibronectina y laminina, citocinas y factores de crecimiento. Estos últimos pueden almacenarse por los reservorios de glucosaminoglucanos (GAG), para liberarse de manera controlada al microambiente celular, promoviendo procesos fisiológicos esenciales.

Para suplir muchas de estas necesidades a las células en crecimiento, se descelularizaron diversos tejidos, tales como válvulas cardíacas, vasos sanguíneos, vejigas urinarias, músculos cardíacos y otros, y las matrices restantes se usaron como estructuras para la ingeniería tisular. La importancia de las propiedades intrínsecas de la matriz de origen natural en el cultivo exitoso de células cardíacas ha llevado a los ingenieros de tejidos a desarrollar técnicas eficientes de eliminación de células de corazones de cerdo y rata. Las estructuras obtenidas tenían morfología fibrilar interna, MEC de vasculatura inherente y propiedades mecánicas adecuadas. Sin embargo, después del trasplante en seres humanos, las matrices xenogénicas o incluso los biomateriales alogénicos pueden provocar una respuesta inmunitaria, lo que perjudica la función del injerto. Además, las células aisladas de una fuente pueden estar expuestas a un microambiente ventajoso cuando crecen en una matriz aislada del mismo individuo. En otras palabras, las propias células del paciente pueden crecer mejor en una matriz autóloga.

El epiplón es una lámina doble de peritoneo que se extiende desde la curvatura mayor del estómago y recubre la mayoría de los órganos abdominales. Este tejido está muy vascularizado y su matriz extracelular fibrilar es rica en colágenos, proteínas adhesivas y GAG. Dado que los GAG se unen a una diversidad de ligandos de proteínas, pueden servir como depósitos de factores de crecimiento y regular una amplia diversidad de actividades biológicas, incluidos los procesos de desarrollo, la angiogénesis y la cardioprotección. Debido a su composición única, el epiplón también sirve como depósito de células madre adultas con potencial regenerativo. Estas células madre se basan en la matriz del epiplón y, según las señales, migran para curar los órganos lesionados. La capacidad regenerativa general del epiplón, su capacidad para mantener la viabilidad de las células progenitoras, absorber grandes cantidades de fluidos de edema y limitar la formación de tejido cicatricial en el sitio de la lesión, se han demostrado durante mucho tiempo.

Dvir, T., et al. (Proc Natl Acad Sci U S A 106, 14990-14995 (2009)) enseña la utilización del epiplón para inducir la migración celular y la formación de redes de vasos sanguíneos en una estructura sintética implantada. A continuación, estas estructuras vascularizadas se reimplantaron en el corazón infartado y atenuaron completamente su deterioro.

La Solicitud de Patente Internacional N.° WO2009/085547 enseña la generación de armazones de epiplón descelularizados para la ingeniería tisular. La Solicitud de Patente Internacional N.° WO2009/085547 no enseña el uso de estructuras de epiplón descelularizadas para ingeniería cardíaca.

La Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20050013870 enseña una estructura que comprende una matriz extracelular descelularizada de una serie de tejidos corporales, incluido el epiplón. Los tejidos del cuerpo han sido acondicionados para producir un material biológico tal como un factor de crecimiento.

Porzionato et al. (Italian Journal of Anatomy and Embryology, Volumen 116, 2011 y Eur J Histochem. 24 de enero de 2013;57(1):e4. doi: 10.4081/ejh.2013.e4) enseñan epiplón descelularizado.

La técnica antecedente adicional incluye Gilbert et al., Biomaterials 27 (2006) 3675-3683 y Flynn et al., Biomaterials 31 (2010), 4715-4724.

La Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20090163990/EP2229191 enseña métodos para descelularizar el epiplón.

Las formas solubles de matriz extracelular descelularizada se conocen en la técnica como se describe en Acta Biomaterialia, Volumen 9, Edición 8, agosto de 2013, páginas 7865-7873 y Singelyn et al., J Am Coll Cardiol. 21 de febrero de 2012; 59(8): 751-763.

Sumario de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona una composición de materia para su uso en la regeneración tisular, en donde la composición de materia es líquida a temperatura ambiente y es capaz de formar un gel a 37 grados centígrados, en donde la composición de materia comprende epiplón descelularizado, liofilizado y solubilizado.

De acuerdo con un aspecto, se proporciona un método para descelularizar el epiplón que comprende:

(a) exponer el epiplón a una solución hipotónica;

(b) deshidratar el epiplón después de la etapa (a);

(c) extraer grasa del epiplón deshidratado usando agentes de extracción polares y no polares después de la etapa (b);

(d) rehidratar el epiplón deshidratado siguiendo la etapa (c); y

(e) extraer células del epiplón rehidratado después de la etapa (d), para generar epiplón descelularizado que comprende menos de 50 ng de ADN por mg de epiplón seco, con un diámetro medio de fibra de al menos 1 micrómetro, en donde la porosidad de dicho epiplón descelularizado es de al menos el 50 %;

(f) liofilizar dicho epiplón después de la etapa (e) para generar epiplón descelularizado liofilizado; y

(g) someter dicho epiplón descelularizado y liofilizado a una enzima proteolítica.

Breve descripción de los dibujos

En el presente documento se describen algunas realizaciones de la invención, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de las realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Figura 1. Actores clave del epiplón. A. Fibras de colágeno por tinción tricrómica de Masson (azul) B. Alto contenido de GAG en todo el tejido por tinción con azul alcián (azul claro). C. Tinción con actina de músculo liso de células de músculo liso que comprenden vasos sanguíneos (marrón). D. Tinción conjunta de VEGF (rosa) y la molécula de adhesión laminina (verde). Barra: A = 100 pm, B = 100 pm, C = 100 pm. D = 100 pm.

Figura 2. Proceso de descelularización y eliminación celular. A. Epiplón fresco antes de la extracción celular. Epiplón durante (B) y después de la descelularización completa (C). La matriz al final del proceso. La infraestructura de los vasos sanguíneos está señalada por flechas de color negro. D. Mayor aumento de la infraestructura de los vasos sanguíneos. E, F. Tinción de núcleos de epiplón fresco (E) y descelularizado (F) (Hoechst 33258; azul). G. Gel de ADN de bromuro de etidio. De izquierda a derecha: escalera, epiplón descelularizado (DC) y epiplón fresco (Natural). No se encontró ninguna banda asociada al epiplón descelularizado. Barra: E = 200 mm, F = 200 mm. Figura 3. Análisis de matriz descelularizada. A. Imagen SEM del epiplón nativo. B. Imagen SEM de epiplón descelularizado. C. Imagen HRSEM de una MEC de vaso sanguíneo conservada dentro de la matriz descelularizada. D. Distribución del diámetro de las fibras en la matriz descelularizada. Barra: A = 50 pm, B = 20 pm, C = 2 pm.

Figura 4. Análisis de componentes de la matriz. A. Fibras de colágeno en la matriz descelularizada por tinción tricrómica de Masson (azul). B. Inmunotinción de la matriz descelularizada para colágeno IV (verde) e I (rosa). C. Gag dentro de la matriz descelularizada mediante tinción con azul alcián (azul claro). D. Cuantificación de GAG sulfatados en epiplón nativo y descelularizado (DC) usando el ensayo Blyscan. Barra: A = 100 pm, B = 50 pm, D = 50 pm.

Figura 5. Propiedades mecánicas del epiplón descelularizado. A. Tensión cíclica. B. Relajación de la tensión. C. Deformación de rotura. Rojo - epiplón descelularizado (epiplón DC), azul - corazón descelularizado (corazón DC). Figura 6. Siembra y viabilidad de células cardíacas. A. La estructura epiploica antes (izquierda) y después (derecha) de la siembra celular. Barra = 5 mm. B. Ensayo Live/Dead el día 7. El color verde y el color rojo representan células vivas y muertas, respectivamente. C. El ensayo de viabilidad XTT reveló un mantenimiento durante todo el período de cultivo.

Figura 7. Ensamblaje y función del tejido cardíaco. A. Ensamblaje de células cardíacas en las fibras de la matriz epiploica según lo determinado por la tinción de troponina I (verde) y colágeno I (rosa) el día 3. B. Tinción de células cardíacas con troponina I el día 7. C, D. Tinción con a actinina sarcomérica cardíaca de cardiomiocitos dentro de la matriz epiploica (C) y la matriz cardíaca descelularizada (D). E. Imagen SEM de alta resolución del alargamiento de células cardíacas en la matriz. F. Proteínas de la MEC secretadas por las células cardíacas cultivadas que reducen el tamaño de poro. G, H. Función del tejido diseñado en el día 3. I. Tasa de contracción. J. Amplitud de contracción. Tejidos diseñados dentro de la matriz epiploica (Om), la matriz cardíaca (Corazón), la estructura de la submucosa del intestino delgado porcino (SIS) y la esponja de alginato (Alg). Barra: A = 500 pm, B, C y D = 20 um, E = 50 pm, F = 1 pm.

Figura 8. Vascularización del parche cardíaco. A, B. HUVEC sembradas en la matriz, teñidas para CD31 (rosa) ubicadas en fibras de colágeno IV (verde). C,D. HUVEC sembradas conjuntamente con células cardíacas el día 7, teñidas para CD31 (rosa) y troponina I (verde). E. Tasa de contracción de la matriz vascularizada (día 7). F. Amplitud de contracción de la matriz vascularizada (día 7). Los parches se diseñaron con porcentajes variables de células endoteliales (10, 25, 50 %). Barra: A = 100 pm, B = 100 pm, C = 100 pm, D = 100 pm.

Figura 9. Crecimiento de células madre mesenquimatosas e iP en la estructura epiploica. A. Tinción de MSC de rata para Sca-1 (verde) el día 7. B. Tinción de MSC de rata para vimentina (rosa) y marcador de proliferación Ki-67 (verde) el día 7. Las flechas indican células Ki67 positivas. C. Ensayo de viabilidad XTT de MSC cultivadas en matrices epiploicas. Los valores se multiplican por encima del número de células inicial. D. Las células iPS forman cuerpos embrioides cuando se cultivan en la matriz epiploica. E. Tinción de células iPS el día 7 para SSEA-4 (rosa), Nanog (verde) y núcleos (azul). Barra: A = 20 pm, B = 20 pm, D = 100 pm, E = 100 pm.

Figuras 10A-E Matrices descelularizadas. A: Imágenes macroscópicas del epiplón nativo y de las matrices descelularizadas obtenidas por los diferentes protocolos. B: Una solución de digestión centrifugada de 20 mg de cada estructura y el tejido nativo. Los lípidos que quedaron en las estructuras son visibles como una fase superior. C-E: Pérdida de masa después de la descelularización. (C) Porcentajes de las masas húmedas restantes de los tejidos durante y después de los procesos de descelularización. (D) Porcentajes de la masa seca restante después de la descelularización. (E) La relación entre la masa húmeda y la masa seca de los tejidos nativos y descelularizados al final del proceso, como una indicación de la propiedad de absorción de agua de las estructuras. Figuras 11A-B - Eliminación de núcleos. A: Tinción Hoechst del tejido nativo y las matrices descelularizadas obtenidas por los diferentes métodos para la demostración del ADN restante (barra de escala = 100 pm). B: Secciones teñidas con hematoxilina y eosina del tejido nativo y las matrices descelularizadas obtenidas por los diferentes métodos. Núcleos teñidos de azul, citoplasma y proteínas extracelulares teñidos de rosa (barra de escala = 100 pm).

Figuras 12A-B Contenido de glucosaminoglucanos (GAG). A: Secciones teñidas con azul alcián y rojo rápido del tejido nativo y las matrices descelularizadas obtenidas por los diferentes métodos. GAG teñidos de azul claro, núcleos teñidos de rojo y proteínas teñidas de rosa pálido (barra de escala = 100 pm). B: Medición de GAG sulfatados en las matrices descelularizadas obtenidas por los diferentes métodos. Los resultados se presentan como la media de pg de GAG sulfatados por mg de masa seca ± error estándar.

Figuras 13A-C. Morfología. A: Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) de las matrices obtenidas por los diferentes métodos (barra de escala = 100 pm). B-C: B-C: Mediciones de las propiedades estructurales de las distintas matrices observadas en las imágenes SEM: (I) Área media de poros en pm2 ± error estándar (II) Diámetro medio de fibra en pm ± error estándar.

Figura 14. Fijación celular a las estructuras. Las células NIH-3T3 se sembraron en las estructuras obtenidas por los diferentes protocolos. La fijación celular a las estructuras se midió mediante la D.O. del ensayo XTT 3 horas después de la siembra. Los resultados se representan como densidad óptica media (D.O.) a 450 nm.

Figuras 15A-B. Proliferación celular en las estructuras. A: Imágenes fluorescentes de EGFP que expresan células NIH-3T3 en las estructuras obtenidas por los diferentes protocolos después de 2 (arriba) u 8 (abajo) días de cultivo (barra de escala = 100 pm). B: Ensayo de actividad metabólica XTT. Los resultados se presentan como densidad óptica media (D.O.) a 450 nm.

Figuras 16A-B. Organización de cardiomiocitos dentro de las estructuras. A: Imágenes fluorescentes de cardiomiocitos teñidos en las estructuras obtenidas por los diferentes protocolos. Núcleos teñidos de azul y actinina teñida de rosa. B: Relación de aspecto de los cardiomiocitos.

Figuras 17A-D. Proceso de descelularización. (A) Epiplón fresco antes de la extracción celular. Epiplón durante (B) y después (C) descelularización completa. (D) Polvo de epiplón molido liofilizado.

Figuras 18A-B. Gelificación de hidrogel de matriz de epiplón. (A) El solubilizado de matriz de epiplón (líquido a TA); (B) En condiciones fisiológicas, la matriz de epiplón forma un gel que mantiene la forma del molde;

Figura 19. Análisis histológico de hidrogel de epiplón. La tinción H&E confirma la ausencia de núcleos.

Figura 20. Cinética de gelificación turbidimétrica. El hidrogel al 15 % de concentración ha alcanzado la meseta más rápido que el hidrogel al 10 %.

Figura 21. Viscosidad compleja a diversas frecuencias entre 0,04 y 5 Hz.

Figuras 22A-E. El módulo elástico (G') y el módulo de pérdida (G'') cambian con el tiempo. (A) G' y G'' durante el tiempo de gelificación. (B) G' al comienzo de la gelificación (C) G'' al comienzo de la gelificación (D) G' al 95 % del tiempo de gelificación. (E) G'' al 95 % del tiempo de gelificación.

Figura 23. Relación de hinchamiento en masa para hidrogeles al 15 %. No se observó ninguna diferencia significativa en el índice de hinchamiento entre el hinchamiento durante 0,5 y 72 h.

Figuras 24A-B. (A) Imágenes SEM de hidrogel liofilizado. (B) Misma imagen, mayor aumento.

Figura 25. Análisis SDS PAGE de un hidrogel que comprende epiplón descelularizado.

La figura 26 es un gráfico de barras que ilustra que el hidrogel soporta células durante al menos siete días.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden matriz de epiplón descelularizada, liofilizada y solubilizada para su uso en la regeneración tisular, como se define por las reivindicaciones. En una realización más específica, la composición es para ingeniería tisular cardíaca.

Las matrices a base de epiplón fabricadas por descelularización tienen el potencial de servir como estructuras autólogas para la ingeniería tisular. Los presentes inventores compararon cinco protocolos distintos para la descelularización del epiplón, utilizando procesos químicos, físicos y biológicos. Analizaron la eficacia de la eliminación celular, la macroestructura y microestructura, la composición bioquímica y la capacidad de las células sembradas para adherirse y proliferar en la matriz. Además, evaluaron la capacidad de las distintas estructuras para promover la organización del tejido cardíaco.

Al comparar los métodos para la descelularización, los presentes inventores encontraron que solo los protocolos particulares eran eficaces en la generación de un epiplón descelularizado que podía usarse como estructura para la propagación de células cardíacas.

En particular, se encontró que el uso de acetona para la eliminación de grasa no es suficiente por sí solo (protocolo 3), sino que se requiere una combinación de un agente de extracción polar y no polar. Además, los presentes inventores encontraron que una breve exposición a tensión hipertónica y detergentes suaves no es eficaz para la eliminación celular (protocolo 5). Más bien, se requiere un procesamiento más agresivo del epiplón (tal como la digestión con tripsina y/o la congelación y descongelación) para obtener una matriz acelular que sea compatible para el cultivo celular y el ensamblaje tisular. Los presentes inventores dedujeron además que el grado de extracción de lípidos del tejido se correlaciona con la capacidad de inducir la fijación celular, mantener la viabilidad celular y promover el ensamblaje adecuado de las células en los tejidos.

Al reducir la presente invención a la práctica, los presentes inventores sembraron células cardíacas en epiplón óptimamente descelularizado. Descubrieron que las células cardíacas estaban ubicadas en las fibras de colágeno del tejido descelularizado, lo que sugiere una interacción célula-matriz (figura 7A). Las células se ensamblaron en haces de células alargadas y alineadas (figura 7B). La tinción de a-actinina sarcomérica (rosa) reveló una estriación masiva, lo que indica el potencial de contracción del tejido (figura 7C). Las células dentro de la matriz epiploica adquirieron una morfología similar a la de las células cultivadas en el corazón descelularizado (figura 7D) y típicas de las células cardíacas nativas. La amplitud y la tasa de contracción fueron del mismo orden que el tejido cardíaco diseñado dentro de la matriz cardíaca descelularizada (figuras 7G y 7H), mientras que las células sembradas en estructuras de alginato y membranas SIS, que sirvieron como grupos de control, no pudieron inducir la contracción de la construcción.

A continuación, los presentes inventores intentaron evaluar la capacidad de la matriz a base de epiplón para soportar el tejido cardíaco vascularizado. En relaciones particulares de células endoteliales:cardíacas, se observaron estructuras que se asemejaban a redes de vasos sanguíneos entre haces de células cardíacas (figura 8C y D).

Mientras reducían aún más la presente invención a la práctica, los presentes inventores encontraron que la solubilización del epiplón descelularizado conducía a la generación de una composición precursora que, tras la activación térmica, generaba un hidrogel, como se ilustra en las figuras 18A-B. Se demostró que el hidrogel posee muchos de los componentes naturales que se encuentran en la MEC epiploica, tales como proteínas y glucosaminoglucanos. El hidrogel se encuentra en forma líquida a temperatura ambiente y a temperatura corporal (37 °C) forma un gel sólido. Puede suministrarse en el cuerpo usando dispositivos inyectables tales como una aguja y puede moldearse en una diversidad de formas durante el proceso de gelificación.

Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para descelularizar el epiplón que comprende:

(a) exponer el epiplón a una solución hipotónica;

(b) deshidratar el epiplón después de la etapa (a);

(d) rehidratar el epiplón deshidratado siguiendo la etapa (c); y

(e) extraer células del epiplón rehidratado después de la etapa (d), para generar epiplón descelularizado que comprende menos de 50 ng de ADN por mg de epiplón seco, con un diámetro medio de fibra de al menos 1 micrómetro, en donde la porosidad de dicho epiplón descelularizado es de al menos el 50 %; (f) liofilizar dicho epiplón después de la etapa (e) para generar epiplón descelularizado liofilizado; y (g) someter dicho epiplón descelularizado y liofilizado a una enzima proteolítica.

El epiplón puede recogerse de especies de mamíferos, tal como un ser humano, cerdos, bóvidos, caprinos y similares. Después de la recogida tisular, el tejido puede colocarse en solución salina al 0,9 % para su procesamiento inmediato o almacenarse para su uso posterior, preferentemente a una temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 80 °C.

De acuerdo con una realización preferida, el epiplón se obtiene de un ser humano.

Una solución hipotónica es aquella en la que la concentración de electrolito está por debajo de la de las células. En esta situación, la presión osmótica conduce a la migración de agua hacia el interior de las células, en un intento de igualar la concentración de electrolitos dentro y fuera de las paredes celulares.

Preferentemente, el tampón hipotónico usado por el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención es una solución 10 mM de Tris a un pH de aproximadamente 8,0 e incluye aproximadamente el 0,1 % de EDTA (p/v) (EDTA 5 mM).

El tampón hipotónico puede comprender agentes adicionales tales como inhibidores de serina proteasa (por ejemplo, fluoruro de fenilmetanosulfonilo o fluoruro de fenilmetilsulfonilo, PMSF) y/o detergentes aniónicos tales como dodecilsulfato de sodio (SDS).

De acuerdo con este aspecto de la presente invención, el tejido se somete al tampón hipotónico durante un período de tiempo que conduce al efecto biológico, es decir, la hinchazón y la ruptura celular.

Después del choque hipotónico, el tejido puede someterse opcionalmente a ciclos de congelación-descongelación. El proceso de congelación/descongelación comprende preferentemente congelar el tejido a, por ejemplo, entre -10 y -80 °C, y típicamente a -80 °C durante entre 2-24 horas y, posteriormente, descongelar el tejido durante aproximadamente 2, 3 o 4 horas hasta que alcance la temperatura ambiente o superior (por ejemplo, a 37 °C). Este proceso se realiza al menos una vez y preferentemente dos o tres veces en presencia de un tampón hipotónico. La deshidratación implica el tratamiento del epiplón con uno o más disolventes de deshidratación, tales como uno o más tratamientos del epiplón con uno o más disolventes de deshidratación y/o uno o más disolventes de este tipo en solución con agua. El uno o más tratamientos pueden ser etapas secuenciales en el método realizado con soluciones que tienen diferentes relaciones de uno o más disolventes de deshidratación con respecto a agua, tal como tener cantidades gradualmente reducidas de agua en la solución para cada tratamiento sucesivo y el tratamiento final puede involucrar el uso de disolvente puro, es decir, disolvente no disuelto en agua.

Se pueden usar disolventes orgánicos de bajo peso molecular para el disolvente de deshidratación. En una realización, el disolvente de deshidratación es uno o más alcoholes, tales como los seleccionados del grupo que consiste en metanol, etanol, isopropanol, propanol y combinaciones de los mismos.

De acuerdo con una realización particular, el epiplón se deshidrata mediante un aclarado de una vez con etanol al 70 % (por ejemplo, durante 10-60 minutos) y de dos a tres veces en etanol al 100 % durante 10-60 minutos cada vez. Después de la deshidratación, la grasa puede extraerse del epiplón usando al menos un disolvente polar y un disolvente no polar, lo que puede tener lugar en una o más etapas de extracción.

Los ejemplos de disolventes no polares son disolventes orgánicos no polares tales como hexano, xileno, benceno, tolueno, acetato de etilo y combinaciones de los mismos. Los disolventes polares útiles para el disolvente de extracción incluyen acetona, dioxano, acetonitlo y combinaciones de los mismos. En una realización, el disolvente de extracción se selecciona de acetona, hexano, xileno y combinaciones de los mismos. Los disolventes no polares incluyen, por ejemplo, hexano, xileno y combinaciones de los mismos.

La extracción de grasa se puede realizar en etapas de extracción de grasa poniendo en contacto el epiplón deshidratado con los disolventes de extracción durante periodos de tiempo variables.

Preferentemente, los lípidos polares del tejido se extraen mediante lavado en el agente de extracción polar (por ejemplo, acetona al 100 %) entre 10 minutos y 60 minutos. Esto puede repetirse varias veces (por ejemplo, tres veces). A continuación, los lípidos no polares pueden extraerse incubando en una mezcla de agentes no polares:polares (por ejemplo, solución 60/40 (v/v) de hexano:acetona (con 3 cambios) o solución 60/40 (v/v) de hexano:isopropanol (con 3 cambios)) durante aproximadamente 24 horas.

Después de la extracción de grasa, el epiplón desgrasado se rehidrata opcionalmente. El epiplón desgrasado puede rehidratarse poniendo en contacto el epiplón desgrasado con un disolvente de rehidratación, tal como alcohol o una solución de alcohol en agua, tal como una solución de alcohol que tenga de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 % de alcohol. Pueden usarse alcoholes de bajo peso molecular, tales como metanol, etanol, isopropanol, propanol y combinaciones de los mismos.

A continuación, el epiplón desgrasado se descelulariza. Puede aplicarse cualquier proceso de descelularización conocido por un experto en la materia para descelularizar el epiplón desgrasado. En una realización, el epiplón desgrasado puede descelularizarse por solubilización de los componentes nuclear y citoplasmático. Por ejemplo, el epiplón desgrasado se puede sumergir en un tampón de descelularización, tal como uno que tenga un detergente no iónico y una sal metálica disuelta en ácido durante un período de tiempo, típicamente al menos aproximadamente 30 minutos. Los detergentes no iónicos útiles en la invención incluyen polisorbatos, tales como TWEEN 80, alcoholes etoxilados, tales como TRITON® X-100, y polietanoles, tales como HP 40 e IGEPAL CA-630 y combinaciones de los mismos. Las sales metálicas que se pueden usar incluyen cloruro, fosfato, acetato y citrato de magnesio, y combinaciones de los mismos, y estas sales metálicas se disuelven típicamente en Tris-HCl.

De acuerdo con otra realización, el epiplón desgrasado puede descelularizarse mediante digestión proteolítica enzimática que digiere los componentes celulares dentro del tejido pero conserva los componentes de la MEC (por ejemplo, colágeno y elastina) y, por lo tanto, da como resultado una matriz que exhibe las propiedades mecánicas y estructurales de la MEC del tejido original. Se apreciará que deben tomarse medidas para conservar los componentes de la MEC mientras se digieren los componentes celulares del tejido. Estas medidas se describen con más detalle a continuación en el presente documento e incluyen, por ejemplo, ajustar la concentración del principio activo (por ejemplo, tripsina) dentro de la solución de digestión, así como el tiempo de incubación.

La digestión proteolítica de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede efectuar usando una diversidad de enzimas proteolíticas. Los ejemplos no limitantes de enzimas proteolíticas adecuadas incluyen tripsina y pancreatina que están disponibles en diversas fuentes, tales como Sigma (St Louis, MO, EE.UU.). De acuerdo con una realización preferida de este aspecto de la presente invención, la digestión proteolítica se realiza usando tripsina.

La digestión con tripsina se realiza preferentemente a una concentración de tripsina que varía del 0,01-0,25 % (p/v), más preferentemente, 0,02-0,2 % (p/v), más preferentemente, 0,05-0,1 (p/v), incluso más preferentemente, una concentración de tripsina de aproximadamente el 0,05 % (p/v). Por ejemplo, se puede usar una solución de tripsina que contenga el 0,05 % de tripsina (p/v; Sigma), 0,02 % de EDTA (p/v) y antibióticos (penicilina/estreptomicina, 250 unidades/ml), pH = 7,2] para digerir de manera eficiente todas las células componentes del tejido.

Preferentemente, mientras están en la solución de digestión, los segmentos tisulares se agitan lentamente (por ejemplo, a aproximadamente 150 rpm) para permitir la penetración completa de la solución de digestión en todas las células del tejido.

Cabe señalar que la concentración de la solución de digestión y el tiempo de incubación en la misma dependen del tamaño de los segmentos tisulares utilizados y los expertos en la materia son capaces de ajustar las condiciones según el tamaño y tipo de tejido deseado.

Preferentemente, los segmentos de tejido se digieren durante al menos 1 hora y se pueden digerir durante hasta 24 horas.

Después de la descelularización, el epiplón puede volver a desgrasarse opcionalmente (por ejemplo, usando una combinación de disolventes polares y no polares).

El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluye opcional y preferentemente una etapa adicional de eliminación de ácidos nucleicos (así como ácidos nucleicos residuales) del tejido para obtener de este modo un tejido libre de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, la expresión "tejido libre de ácido nucleico" se refiere a un tejido que está libre en más del 99 % de cualquier ácido nucleico o fragmentos del mismo según se determina usando métodos convencionales (por ejemplo, espectrofotometría, electroforesis). Tal etapa utiliza una solución de DNasa (y opcionalmente también una solución de RNasa). Las nucleasas adecuadas incluyen DNasa y/o RNasa [Sigma, Bet Haemek Israel, 20 pg/ml en solución salina equilibrada de Hank (HBSS)] o combinaciones de ambas, por ejemplo, benzonase.

A continuación, los componentes celulares típicamente se eliminan del tejido. La eliminación de los componentes digeridos del tejido se puede efectuar usando diversas soluciones de lavado, tales como soluciones de detergente (por ejemplo, detergentes iónicos y no iónicos tales como SDS Triton X-100, Tween-20, Tween-80) que se pueden obtener por ejemplo, en Sigma (St Louis, MO, EE.UU.) o Biolab (Atarot, Israel, Merck Alemania).

Preferentemente, la solución de detergente usada por el método de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluye TRITON-X-100 (disponible en Merck). Para la eliminación eficiente de todos los componentes celulares digeridos, se proporciona TRlTON-X-100 en un intervalo de concentración del 0,05-2,5 % (v/v), más preferentemente, al 0,05-2 % (v/v), más preferentemente al 0,1-2 % (v/v), incluso más preferentemente a una concentración del 1 % (v/v).

Opcionalmente, la solución de detergente incluye también hidróxido de amonio, que junto con el TRITON-X-100, ayuda a romper y disolver núcleos celulares, proteínas y membranas esqueléticas.

Preferentemente, se proporciona hidróxido de amonio a una concentración del 0,05-1,5 % (v/v), más preferentemente, a una concentración del 0,05-1 % (v/v), incluso más preferentemente, a una concentración del 0,1-1 % (v/v) (por ejemplo, 0,1 %).

Las concentraciones de TRITON-X-100 e hidróxido de amonio en la solución de detergente pueden variar, dependiendo del tipo y tamaño del tejido a tratar y los expertos en la materia son capaces de ajustar dicha concentración según el tejido usado.

La incubación del tejido (o segmentos de tejido) con la solución de detergente puede durar desde unos pocos minutos hasta horas e incluso varios días, dependiendo del tipo y tamaño del tejido y la concentración de la solución de detergente usada y las habilidades en la materia son capaces de ajustar dichos períodos de incubación. Preferentemente, la incubación con la solución de detergente se realiza durante al menos 1 hora. De acuerdo con una realización, se realizan 1-4 ciclos de incubación con la solución de detergente hasta que no se observa espuma.

La solución de detergente descrita anteriormente se elimina preferentemente sometiendo la matriz a varios lavados en agua o solución salina (por ejemplo, al menos 3 lavados), hasta que no haya evidencia de solución de detergente en la matriz.

Opcionalmente, a continuación, la MEC descelularizada se esteriliza. La esterilización de la MEC descelularizada puede realizarse usando métodos conocidos en la técnica. En una realización, el epiplón descelularizado se pone en contacto con una solución desinfectante durante un período de tiempo suficientemente eficaz para desinfectar el epiplón descelularizado, tal como al menos aproximadamente 0,5 horas, típicamente de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas. El epiplón descelularizado puede sumergirse completamente en la solución desinfectante. La solución desinfectante puede comprender alcohol o una solución de alcohol en agua, y también puede incluir ácido. La solución desinfectante puede incluir uno o más de los siguientes etanol, metanol, isopropanol, propanol, peróxido de hidrógeno, ácido peracético y combinaciones de los mismos. En una realización, la solución desinfectante tiene etanol, tal como una solución de etanol al 70 %. Opcionalmente, el epiplón descelularizado se puede lavar una o más veces con agua ultrapura.

Después del lavado y la esterilización opcional, a continuación, el tejido descelularizado puede deshidratarse, por ejemplo, mediante liofilización.

Los presentes inventores han demostrado que la descelularización del epiplón de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento dan como resultado la generación de epiplón descelularizado que comprende menos de 50 ng de ADN por mg de epiplón seco, que tiene un diámetro medio de fibra de aproximadamente 1-2 pm, en donde el la porosidad de la composición es de al menos el 50 %.

Como se usa en el presente documento, la expresión "epiplón descelularizado" se refiere a la matriz extracelular que soporta la organización del tejido de epiplón que ha experimentado un proceso de descelularización (es decir, una eliminación de todas las células del tejido) y, por lo tanto, está desprovista de componentes celulares.

El epiplón descelularizado obtenido de acuerdo con los métodos descritos actualmente comprende menos del 20 % de las células en comparación con la cantidad de células en el epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 15 % de las células en comparación con la cantidad de células en el epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 10 % de las células en comparación con la cantidad de células en el epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 5 % de las células en comparación con la cantidad de células en el epiplón antes de la descelularización, más preferentemente menos del 2 % de las células en comparación con la cantidad de células en el epiplón antes de la descelularización.

Como se usa en el presente documento, la expresión "desprovista de componentes celulares" se refiere a estar en más del 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, (por ejemplo, 100 %) desprovista de los componentes celulares presentes en el epiplón natural (por ejemplo, nativo). Como se usa en el presente documento, la expresión "componentes celulares" se refiere a componentes de la membrana celular o componentes intracelulares que constituyen la célula. Los ejemplos de componentes celulares incluyen estructuras celulares (por ejemplo, orgánulos) o moléculas comprendidas en las mismas. Los ejemplos de estos incluyen, pero sin limitación, núcleos celulares, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos residuales

(por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos fragmentados), membranas celulares y/o membranas celulares residuales (por ejemplo, membranas fragmentadas) que están presentes en las células del tejido. Se apreciará que debido a la eliminación de todos los componentes celulares del tejido, dicha matriz descelularizada no puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se implanta en un sujeto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "matriz extracelular (MEC)" se refiere a una red compleja de materiales producidos y secretados por las células del tejido en el espacio y/o medio extracelular circundante y que, típicamente, junto con las células del tejido, imparte al tejido sus propiedades mecánicas y estructurales. Generalmente, la MEC incluye elementos fibrosos (particularmente colágeno, elastina o reticulina), polipéptidos de adhesión celular (por ejemplo, fibronectina, laminina y glucoproteínas adhesivas) y moléculas de relleno de espacio [normalmente glucosaminoglucanos (GAG), proteoglucanos].

Típicamente, el epiplón descelularizado de acuerdo con este aspecto de la presente invención comprende menos de 50 ng de ADN por mg de epiplón seco, más preferentemente menos de 45 ng de ADN e incluso más preferentemente menos de 40 ng de ADN por mg de epiplón seco.

Como ya se ha mencionado, el diámetro de fibra medio del epiplón descelularizado está normalmente entre aproximadamente 1-2 pm.

Como se usa en el presente documento, el término "porosidad" se refiere a la medición tridimensional del espacio vacío o volumen vacío por volumen total.

Típicamente, la porosidad de la composición es superior al 50 %.

El área de poros promedio de la composición es típicamente mayor que un área de poros de más de 200 pm2, 300 pm2, 400 pm2, 500 pm2, 600 pm2 o incluso 700 pm2.

Al descelularizar el epiplón usando los métodos descritos en el presente documento, los presentes inventores han obtenido una composición de materia que está esencialmente desprovista de lípidos. Los presentes inventores han encontrado que el grado de extracción de lípidos del tejido se correlaciona con la capacidad de inducir la fijación celular, mantener la viabilidad celular y promover el ensamblaje adecuado de las células en los tejidos. Por lo tanto, al descelularizar el epiplón de acuerdo con los métodos actualmente desvelados, los presentes inventores han obtenido un material que es útil como estructura celular para la construcción de tejido.

Como se usa en el presente documento, la expresión "desprovista de lípidos" se refiere a una composición que comprende menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % de los lípidos presentes en el epiplón natural (por ejemplo, nativo).

Como ya se ha mencionado, el epiplón descelularizado de este aspecto de la presente invención se puede aplicar en la ingeniería tisular y la regeneración de órganos internos, tales como corazón, riñón, hígado, bazo y vejiga. El epiplón descelularizado también se puede usar para reparar y regenerar tejidos esqueléticos, tales como hueso, cartílago y tendón. Otros usos del epiplón descelularizado incluyen el refuerzo y la reparación de tejidos blandos en combinación con mallas biocompatibles, tal como el injerto de duramadre, la reparación de hernias y la reparación del suelo pélvico; la regeneración de nervios, tal como una estructura tubular para la regeneración de nervios periféricos; el aumento de tejido; el suministro de células y bioactivos; la reparación de heridas crónicas; y la reparación ósea. Estos usos y aplicaciones del epiplón descelularizado son ilustrativos de varios usos potenciales y no deben interpretarse como limitantes de los tipos de usos y aplicaciones del epiplón descelularizado preparado mediante los métodos y procesos descritos en el presente documento.

El epiplón descelularizado se puede combinar con construcciones sintéticas para hacer construcciones reforzadas. Por ejemplo, la matriz de epiplón descelularizada se puede usar como una estructura de andamiaje para la implantación en el cuerpo de un mamífero, tal como una estructura para la reparación tisular. Se puede mejorar aún más con bioactivos, células, moléculas pequeñas, tejido molido y lisados celulares.

Como se usa en el presente documento, el término "estructura" se refiere a una matriz tridimensional sobre la que se pueden cultivar las células (es decir, sobrevivir y preferentemente proliferar durante un período de tiempo predeterminado).

La estructura de este aspecto de la presente invención puede estar compuesta únicamente por epiplón descelularizado o puede comprender polímeros adicionales.

Por lo tanto, en otras realizaciones, los materiales de andamiaje estructural comprenden además un polímero o material "bioerosionable" o "biodegradable".

Como se usa en el presente documento, la expresión "polímero biodegradable" se refiere a un polímero o polímeros que se degradan in vivo, y en donde la erosión del polímero o polímeros a lo largo del tiempo ocurre simultáneamente con o después de la liberación de los islotes. Los términos "biodegradable" y "bioerosionable" son equivalentes y se usan indistintamente en el presente documento.

Dichos materiales de andamiaje bioerosionables o biodegradables pueden usarse para fabricar estructuras temporales. En realizaciones de ejemplo, los materiales de andamiaje estructural biodegradables o bioerosionables pueden ser biocompatibles. Los ejemplos de polímeros biodegradables biocompatibles que son útiles como materiales de andamiaje incluyen, pero sin limitación, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, policaprolactona y copolímeros de la misma, poliésteres tales como poliglicólidos, polianhídridos, poliacrilatos, cianoacrilatos de polialquilo tales como cianoacrilato de n-butilo y cianoacrilato de isopropilo, poliacrilamidas, poliortoésteres, polifosfacenos, polipéptidos, poliuretanos, poliestirenos, ácido poliestirensulfónico, ácido poliestirencarboxílico, óxidos de polialquileno, alginatos, agarosas, dextrinas, dextranos, polianhídridos, biopolímeros tales como colágenos y elastina, alginatos, quitosanos, glucosaminoglucanos y mezclas de dichos polímeros. En aún otras realizaciones, se puede usar una mezcla de materiales de andamiaje no biodegradables y bioerosionables y/o biodegradables para formar una estructura biomimética de la cual una parte es permanente y otra parte es temporal.

También se pueden incorporar compuestos o agentes terapéuticos que modifiquen la actividad celular (por ejemplo, fijados a, que recubran, incrustados o impregnados) en el material de andamiaje. Campbell et al. (Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20030125410) desvela métodos para la fabricación de estructuras tridimensionales para el crecimiento de células madre, teniendo las estructuras gradientes preformados de compuestos terapéuticos. Los materiales de andamiaje, según Campbell et al., se encuentran dentro de la categoría de "biotintas". Dichas "biotintas" son adecuadas para su uso con las composiciones y métodos de la presente invención.

Los agentes de ejemplo que pueden incorporarse en la estructura de la presente invención incluyen, pero sin limitación, aquellos que promueven la adhesión celular (por ejemplo, fibronectina, integrinas), la colonización celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la extravasación celular y/o la migración celular. Por lo tanto, por ejemplo, el agente puede ser un aminoácido, un agente químico de molécula pequeña, un péptido, un polipéptido, una proteína, un ADN, un ARN, un lípido y/o un proteoglucano.

Las proteínas que pueden incorporarse en las estructuras de la presente invención incluyen, pero sin limitación, proteínas de matriz extracelular, proteínas de adhesión celular, factores de crecimiento, citocinas, hormonas, proteasas y sustratos de proteasa. Por lo tanto, las proteínas de ejemplo incluyen factor de crecimiento derivado del endotelio vascular (VEGF), activina-A, ácido retinoico, factor de crecimiento epidérmico, proteína morfogenética ósea, TGFp, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, TGFa, IGF-I y II, factores de crecimiento hematopoyético, factor de crecimiento de unión a heparina, factores de crecimiento peptídicos, eritropoyetina, interleucinas, factores de necrosis tumoral, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento de fibroblastos básicos y ácidos, factor de crecimiento nervioso (NGF) o factor morfogénico muscular (MMP). El factor de crecimiento particular empleado debe ser apropiado para la actividad celular deseada. Los efectos reguladores de una gran familia de factores de crecimiento se conocen bien por los expertos en la materia.

La presente invención contempla sembrar cualquier tipo de célula en las estructuras descritas en el presente documento.

Las células pueden obtenerse a partir de cualquier organismo, incluyendo, por ejemplo, células de mamífero (por ejemplo, un ser humano), células vegetales, células de alga, células fúngicas (por ejemplo, células de levadura), células procarióticas (por ejemplo, células bacterianas).

De acuerdo con una realización particular, las células comprenden células madre, por ejemplo, células madre adultas tales como células madre mesenquimatosas o células madre pluripotentes tales como células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas. Las células madre pueden modificarse para experimentar una diferenciación ex vivo.

De acuerdo con una realización particular, las células están preferentemente intactas (es decir, enteras) y preferentemente viables, aunque se apreciará que el pretratamiento de las células, tal como la generación de extractos celulares o células no intactas, también se contempla por la presente invención.

Las células pueden ser frescas, congeladas o estar conservadas de cualquier otra forma conocida en la técnica (por ejemplo, crioconservadas).

Los presentes inventores han encontrado que las estructuras generadas a partir de epiplón descelularizado caracterizados como se detalla en el presente documento, son particularmente eficaces para soportar las células cardíacas.

Por lo tanto, de acuerdo con otra realización, las células que se siembran en la estructura son células cardíacas (por ejemplo, cardiomioctos humanos).

Como se usa en el presente documento, el término "cardiomiocitos" se refiere a cardiomiocitos total o al menos parcialmente diferenciados. Por lo tanto, los cardiomiocitos pueden obtenerse de tejido cardíaco o de células madre (tales como células madre embrionarias o células madre adultas, tales como células madre mesenquimatosas). Los métodos para diferenciar células madre a lo largo de un linaje cardíaco se conocen bien en la técnica -[Muller-Ehmsen J, et al., Circulation. 2002;105:1720-6; Zhang M, et al., J Mol Cell Cardiol. 2001;33:907-21, Xu et al., Circ Res.

2002;91:501-508, y Sol. de Pat. de EE.UU. N.° 20050037489.

De acuerdo con una realización, hecho que no forma parte de la invención, las células madre se obtienen a partir de líneas de células madre humanas, tal como H9.2 (Amit, M. et al., 2000. Dev Biol. 227:271).

De acuerdo con una realización, los cardiomiocitos de la presente invención son al menos capaces de contraerse espontáneamente. De acuerdo con otra realización, los cardiomiocitos de la presente invención expresan al menos un marcador (más preferentemente al menos dos marcadores e incluso más preferentemente al menos tres marcadores) de cardiomiocitos inmaduros tempranos (por ejemplo, factor natriurético atrial (ANF), Nkx2.5, MEF2C y a-actina esquelética). De acuerdo con otra realización, los cardiomiocitos de la presente invención expresan al menos un marcador (más preferentemente al menos dos marcadores e incluso más preferentemente al menos tres marcadores) de cardiomiocitos completamente diferenciados (por ejemplo, MLC-2V, a-MHC, a-actina cardíaca y troponina I).

El cribado de cardiomiocitos parcialmente diferenciados puede realizarse mediante un método que permite la detección de al menos una característica asociada con un fenotipo cardíaco, como se describe a continuación en el presente documento, por ejemplo, a través de la detección de contracción mecánica específica cardíaca, la detección de estructuras cardíacas específicas, la detección de proteínas cardíacas específicas, la detección de ARN cardíaco específico, detección de actividad eléctrica cardíaca específica, y la detección de cambios cardíacos específicos en la concentración intracelular de un ion fisiológico.

Se pueden usar diversas técnicas para detectar cada una de las contracciones mecánicas cardíacas específicas, las estructuras cardíacas específicas, las proteínas cardíacas específicas, los ARN cardíacos específicos, la actividad eléctrica cardíaca específica, y los cambios cardíacos específicos en la concentración intracelular de un ion fisiológico. Por ejemplo, la detección de la contracción mecánica cardíaca específica puede efectuarse visualmente usando un microscopio óptico. Como alternativa, dicha detección puede efectuarse y registrarse usando un microscopio equipado con un sistema de detección de movimiento automatizado adecuado. La detección de estructuras cardíacas específicas puede realizarse mediante microscopía óptica, marcaje por afinidad de fluorescencia y microscopía de fluorescencia, o microscopía electrónica, dependiendo del tipo de estructura cuya detección se desee. La detección de proteínas cardíacas específicas puede efectuarse mediante marcaje por afinidad de fluorescencia y microscopía de fluorescencia. Como alternativa, pueden emplearse técnicas tales como inmunotransferencia de Western o micromatrices de hibridación ("chips de proteínas"). La detección de los ARN cardíacos específicos se realiza preferentemente mediante RT-PCR. Como alternativa, pueden emplearse otros métodos usados comúnmente, tales como micromatriz de hibridación ("chip de ARN") o transferencia de Northern. La RT-PCR se puede usar para detectar ARN cardíacos específicos. La detección de cambios cardíacos específicos en la concentración intracelular de un ion fisiológico, tal como calcio, se realiza preferentemente usando ensayos basados en colorantes de unión a iones fluorescentes, tal como el colorante de unión a calcio fura-2 (por ejemplo, véase Brixius, K. et al., 1997. J Appl Physiol.

83:652). Dichos ensayos pueden usarse ventajosamente para detectar cambios en la concentración intracelular de iones de calcio, tales como los transitorios de calcio. La detección de la actividad eléctrica cardíaca específica de las células puede efectuarse controlando la actividad eléctrica de las mismas a través de una matriz multielectrodo. Se pueden obtener matrices multielectrodo adecuadas en Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemania. Para detectar la actividad eléctrica cardíaca específica en las células parcialmente diferenciadas, estas últimas pueden cultivarse ventajosamente en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación cardíaca directamente en una matriz multielectrodo, lo que permite controlar convenientemente la actividad eléctrica de dichas células y tejidos. Las regiones de cuerpos embrioides que muestran diferenciación cardíaca, preferentemente en forma de contracción mecánica cardíaca específica, se pueden microdiseccionar ventajosamente a partir de cuerpos embrioides y cultivarse en conjuntos de microelectrodos.

Las células se pueden sembrar en una estructura mediante carga estática, o mediante siembra en biorreactores de matraz agitado (típicamente, la estructura se suspende de un soporte sólido), en un recipiente de pared giratorio o usando perfusión directa de las células en medio en un biorreactor. La densidad celular más alta en todo la estructura se logra mediante la última técnica (perfusión directa).

Las células se pueden sembrar directamente en la estructura o, como alternativa, las células se pueden mezclar con un gel que a continuación se absorbe en las superficies interior y exterior de la estructura y que puede llenar algunos de los poros de la estructura. Las fuerzas capilares retendrán el gel en la estructura antes del endurecimiento, o se puede permitir que el gel se endurezca en la estructura para que sea más autosuficiente. Como alternativa, las células pueden combinarse con un sustrato de soporte celular en forma de gel que incluye opcionalmente componentes de la matriz extracelular. Un gel de ejemplo es Matrigel™, de Becton-Dickinson. Matrigel™ es una matriz de membrana basal solubilizada extraída del tumor de ratón EHS (Kleinman, H. K., et al., Biochem. 25:312, 1986). Los componentes principales de la matriz son laminina, colágeno I, entactina y proteoglucano de sulfato de heparán (perlecano) (Vukicevic, S., et al., Exp. Cell Res. 202:1, 1992). Matrigel™ también contiene factores de crecimiento, metaloproteinasas de matriz (MMP [colagenasas]) y otras proteinasas (activadores de plasminógeno [PA]) (Mackay, A. R., et al., BioTechniques 15:1048, 1993). La matriz también incluye varios compuestos no definidos (Kleinman, H. K., et al., Biochem. 25:312, 1986; McGuire, P. G. y Seeds, N. W., J. Cell. Biochem. 40:215, 1989), pero no contiene ningún nivel detectable de inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) (Mackay, A. R., et al., BioTechniques 15:1048, 1993). Como alternativa, el gel puede ser Matrigel con factor de crecimiento reducido, producido eliminando la mayoría de los factores de crecimiento del gel (véase Taub, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990); 87 (10:4002-6). En otra realización, el gel puede ser un gel de colágeno I, alginato o agar. Tal gel también puede incluir otros componentes de la matriz extracelular, tales como glucosaminoglucanos, fibrina, fibronectina, proteoglucanos y glucoproteínas. El gel también puede incluir componentes de la membrana basal tales como colágeno IV y laminina. Se pueden añadir al gel enzimas tales como proteinasas y colagenasas, así como modificadores de la respuesta celular tales como factores de crecimiento y agentes quimiotácticos.

En una realización, el epiplón descelularizado se siembra con una combinación de células cardíacas (por ejemplo, cardiomiocitos) y células endoteliales en las que el epiplón desvitalizado sirve como estructura de fijación celular y sustrato promotor del crecimiento. La célula endotelial sembrada en epiplón descelularizado tiene utilidad como material de componente básico para la reconstrucción vascular.

Las relaciones contempladas de células cardíacas: células endoteliales incluyen 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 y 50:50.

De acuerdo con una realización que no forma parte de la presente invención, las células endoteliales pueden ser células endoteliales obtenidas de células madre embrionarias humanas (hESC) (Levenberg, et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99, 4391-4396, o células endoteliales primarias cultivadas a partir de, por ejemplo, vena umbilical humana (HUVEC), o células endoteliales obtenidas de biopsia tales como de la aorta o la arteria umbilical. Las células endoteliales de la presente invención también pueden obtenerse de seres humanos (ya sean autólogas o no autólogas), por ejemplo, de la sangre o la médula ósea. Además, las células endoteliales pueden obtenerse de otros mamíferos, por ejemplo, seres humanos, ratones o vacas. Por ejemplo, las células endoteliales pueden recuperarse del tejido aórtico bovino. Preferentemente, las células endoteliales no se obtienen del tejido cardíaco del que se aislaron las células cardíacas.

En una realización, las células endoteliales embrionarias humanas se producen cultivando células madre embrionarias humanas en ausencia de LIF y bFGF para estimular la formación de cuerpos embrionarios y aislando las células positivas para PECAM1 de la población. Pueden aislarse HUVEC de tejido de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia o adquirirse en laboratorios de cultivo celular tales como Cambrex Biosciences o Cell Essentials.

La promoción de estructuras endoteliales tridimensionales también puede mejorarse mediante la adición de células de fibroblastos (por ejemplo, fibroblastos embrionarios humanos). Los fibroblastos pueden aislarse del tejido de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, obtenerse de embriones E-13 ICR) o adquirirse en laboratorios de cultivo celular tales como Cambrex Biosciences o Cell Essentials. De acuerdo con una realización, las células de fibroblastos se siembran conjuntamente con los cardiomiocitos y las células endoteliales. Por consiguiente, se puede generar y sembrar en la estructura un conjunto de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos (en presencia o ausencia de un gel apropiado).

Los presentes inventores han demostrado que la siembra conjunta de células cardíacas y células endoteliales en el epiplón descelularizado descrito en el presente documento da como resultado una composición de materia que comprende células cardíacas vascularizadas sembradas en una estructura de epiplón descelularizado, pudiendo las células cardíacas vascularizadas contraerse más de 20 veces por minuto, preferentemente más de 25 veces por minuto, preferentemente más de 30 veces por minuto, preferentemente más de 35 veces por minuto y preferentemente más de 40 veces por minuto.

La amplitud de contracción de las células cardíacas vascularizadas es típicamente superior a 3 pm, 4 pm o incluso superior a 5 pm.

El epiplón descelularizado puede liofilizarse con polímeros para fabricar una espuma tridimensional o fundirse con calor en una película o malla. Además, las fibras pueden hilarse electrostáticamente sobre el epiplón y usarse "tal cual" o con construcciones sintéticas para fabricar estructuras reforzadas.

De acuerdo con otra realización, el epiplón descelularizado puede solubilizarse y formarse en un hidrogel como se describe más adelante en el presente documento.

Se desvela un método para generar una composición precursora, que, tras la activación por temperatura, es capaz de formar un hidrogel, comprendiendo el método:

(a) descelularizar epiplón para generar epiplón descelurizado;

(b) liofilizar el epiplón descelularizado para generar epiplón liofilizado; y

(c) solubilizar el epiplón liofilizado, generando así la composición de materia.

La primera etapa en la generación de la composición precursora es la descelularización del epiplón. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, la descelularización se realiza usando cualquier método en la técnica siempre que los lípidos se eliminen del epiplón. Por lo tanto, en el proceso de descelularización se usa preferentemente un agente de extracción tanto polar como no polar.

De acuerdo con una realización particular, la descelularización se realiza mediante las siguientes etapas:

(a) exponer el epiplón a una solución hipotónica;

(b) congelar/descongelar el epiplón después de la etapa (a)

(c) deshidratar el epiplón después de la etapa (b);

(d) extraer grasa del epiplón deshidratado usando un agente de extracción polar y no polar después de la etapa (c);

(e) rehidratar el epiplón deshidratado después de la etapa (d);

(f) extraer células del epiplón rehidratado después de la etapa (e) y

(g) liofilizar el epiplón después de la etapa (f).

Cada una de estas etapas se ha descrito anteriormente en su totalidad en el presente documento.

De acuerdo con otra realización, el epiplón se descelulariza siguiendo las siguientes etapas:

(a) exponer el epiplón a una solución hipotónica;

(b) congelar/descongelar el epiplón después de la etapa (a)

(c) deshidratar el epiplón después de la etapa (b);

(e) rehidratar el epiplón deshidratado después de la etapa (d); y

(f) degradar los ácidos nucleicos del epiplón rehidratado después de la etapa (e) y

Otros métodos contemplados por los presentes inventores para descelularizar el tejido incluyen los descritos en las Patentes de EE.UU. N.° 4.776.853, 4.801.299 y la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2009163990.

La solubilización de la MEC descelularizada se puede realizar como se describe en Freytes et al., Biomaterials 29 (2008) 1630-1637 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20120156250.

Típicamente, para realizar la solubilización del epiplón descelularizado, primero se deshidrata, por ejemplo, se liofiliza.

El epiplón descelularizado y liofilizado se puede cortar en trozos pequeños, por ejemplo, desmenuzarse o molerse en polvo y a continuación someterse a una segunda ronda de digestión proteolítica. La digestión se realiza en condiciones que permiten que la enzima proteolítica digiera y solubilice la MEC. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la digestión se realiza en presencia de un ácido (por ejemplo, HCl) para obtener un pH de aproximadamente 3-4.

La digestión proteolítica de acuerdo con este aspecto de la presente invención se puede efectuar usando una diversidad de enzimas proteolíticas. Los ejemplos no limitantes de enzimas proteolíticas adecuadas incluyen tripsina, pepsina, colagenasa y pancreatina que están disponibles a partir de varias fuentes, tales como Sigma (St Louis, MO, EE.UU.) y combinaciones de las mismas. También se contemplan las enzimas que degradan la matriz tales como las metaloproteinasas de la matriz.

Cabe señalar que la concentración de la solución de digestión y el tiempo de incubación en la misma dependen del tipo de tejido que se está tratando y el tamaño de los segmentos tisulares utilizados y los expertos en la materia son capaces de ajustar las condiciones según el tamaño y tipo de tejido deseado.

Preferentemente, los segmentos de tejido se incuban durante al menos aproximadamente 20 horas, más preferentemente, al menos aproximadamente 24 horas. Preferentemente, la solución de digestión se reemplaza al menos una vez de modo que el tiempo total de incubación en la solución de digestión sea de al menos 40-48 horas.

Una vez que se solubiliza la MEC descelularizada, se aumenta el pH de la solución para inactivar irreversiblemente la enzima proteolítica (por ejemplo, a aproximadamente pH 7). El epiplón descelularizado y solubilizado puede almacenarse en esta etapa a temperaturas inferiores a 20 °C, por ejemplo 4 °C, de modo que la MEC descelularizada permanezca en solución.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición precursora que comprende epiplón descelularizado solubilizado que es capaz de formar un gel por activación térmica.

El epiplón descelularizado y solubilizado es capaz de formar un gel a una temperatura superior a 30 °C, superior a 31 °C, superior a 32 °C, superior a 33 °C, superior a 34 °C, superior a 35 °C, superior a 36 °C, o superior a 37 °C.

El hidrogel generado a partir de la composición precursora descrita en el presente documento es viscoelástico, termosensible, tiene un índice de hinchamiento bajo (entre el 0-20 %), alta porosidad (típicamente superior al 30 %, 40 % o incluso superior al 50 %), tiene un diámetro de poro entre 10-180 pm y es biocompatible y degradable.

Típicamente, comprende los siguientes componentes: colágeno tipo I, II, III, IV, V, VI, laminina, elastina, fibronectina y glucosaminoglucanos (sulfatados y no sulfatados).

Preferentemente, la concentración de las moléculas precursoras en el hidrogel está entre el 0,5 y el 35 %, y más preferentemente entre el 5 y el 20 %.

Como se describe en el presente documento, a continuación, la composición precursora de hidrogel se puede administrar en el cuerpo usando un dispositivo de inyección (por ejemplo, aguja, catéter) para proporcionar soporte mecánico a la pared cardíaca. El hidrogel precursor puede contener y liberar factores de crecimiento o agentes terapéuticos (como se ha descrito anteriormente en el presente documento) de manera controlada y/o como sustrato/portador para las células.

Por lo tanto, los presentes inventores consideran la administración a los pacientes de la composición precursora (como un líquido) en presencia o ausencia de poblaciones celulares. Dichas poblaciones celulares se han descrito anteriormente en el presente documento.

Otro uso contemplado del hidrogel precursor es como agente de encapsulación. Por lo tanto, el hidrogel precursor puede añadirse a un agente de polimerización para generar una mezcla para generar cápsulas.

El agente polimerizante de este aspecto de la presente invención es preferentemente hidrosoluble y puede incluir polímeros tales como quitosano y ácido polimetacrílico o hidrogeles compuestos por polisacáridos (tales como alginato, ácido hialurónico y agarosa) u otros polímeros tales como polietilenglicol (PEG) y metacrilato de polihidroxietilo (HEMA)).

De acuerdo con una realización particular, el agente polimerizante es quitosano o alginato.

De acuerdo con otra realización, el agente polimerizante es alginato. El alginato está disponible comercialmente a partir de una diversidad de fuentes, por ejemplo, Novamatrix, Noruega. El alginato puede tener una viscosidad inferior a 20 hasta superior a 200 mPa.s con diferente contenido de G/M (por ejemplo, de menos de 1 a más de 1,5).

Las relaciones típicas de volúmenes de agente polimerizante: MEC descelularizada que se mezclan para generar la mezcla se encuentran entre 50:50-70:30.

Se añaden células a la mezcla descrita anteriormente. Por lo tanto, por ejemplo, para una mezcla de 2 ml, se pueden añadir aproximadamente dos millones de células.

En el documento WO 2014/037942 se proporciona información adicional sobre el uso de MEC descelularizada como agente de encapsulación.

En cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, el epiplón descelularizado puede obtenerse del propio paciente (es decir, autólogo del paciente) u obtenerse de un sujeto distinto del paciente (es decir, no autólogo) y/o las poblaciones celulares que se administran al paciente junto con el epiplón descelularizado se obtienen del propio paciente (es decir, autólogas del paciente) o se obtienen de un sujeto distinto del paciente (es decir, no autólogas).

Las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar cualquier trastorno asociado con la degeneración tisular. De acuerdo con una realización específica, las composiciones se usan para tratar un trastorno cardíaco que está asociado con un miocardio defectuoso o ausente.

En el presente documento se desvela, pero no forma parte de la invención, un método para tratar un trastorno cardíaco asociado con un miocardio defectuoso o ausente en un sujeto, comprendiendo el método trasplantar una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones de la presente invención en el sujeto, tratando así el trastorno cardíaco.

El método se puede aplicar para reparar tejido cardíaco en un sujeto humano que tiene un trastorno cardíaco para así tratar el trastorno. El método también se puede aplicar para reparar tejido cardíaco susceptible de estar asociado con el inicio o desarrollo futuro de un trastorno cardíaco para inhibir de este modo dicho inicio o desarrollo.

La composición de la presente invención puede usarse ventajosamente para tratar trastornos asociados con, por ejemplo, un miocardio necrótico, apoptótico, dañado, disfuncional o morfológicamente anormal. Dichos trastornos incluyen, pero sin limitación, cardiopatía isquémica, infarto cardíaco, cardipatía reumática, endocarditis, cardiopatía autoinmune, cardiopatía valvular, cardiopatías congénitas, trastornos del ritmo cardíaco, conductividad miocárdica alterada e insuficiencia cardíaca. Dado que la mayoría de las cardiopatías implican un miocardio necrótico, apoptótico, dañado, disfuncional o morfológicamente anormal, y dado que el tejido cardíaco vascularizado de la presente invención muestra un fenotipo cardiomiocítico altamente diferenciado, altamente funcional y proliferante, el método de reparación del tejido cardíaco del la presente invención se puede usar para tratar la mayoría de los casos de cardiopatías.

El método desvelado se puede usar ventajosamente para revertir, inhibir o prevenir eficientemente el daño cardíaco causado por la isquemia resultante de un infarto de miocardio.

El método desvelado se puede usar para tratar cardiopatías caracterizadas por un ritmo cardíaco anormal, tal como, por ejemplo, arritmia cardíaca.

Como se usa en el presente documento, la expresión "arritmia cardíaca" se refiere a cualquier variación del ritmo normal del latido cardíaco, incluyendo, pero sin limitación, arritmia sinusal, latido prematuro, bloqueo cardíaco, fibrilación auricular, aleteo auricular, pulso alternante y taquicardia paroxística.

El método desvelado se puede usar para tratar la función cardíaca deteriorada resultante de la pérdida o disfunción tisular que se produce en sitios críticos en el sistema de conducción eléctrica del corazón, que puede conducir a un inicio de ritmo o conducción de impulsos ineficientes que dan como resultado anomalías en la frecuencia cardíaca.

El método desvelado se realiza trasplantando una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de la presente invención al corazón del sujeto (ya sea junto con las células cardíacas sembradas o sin las células cardíacas). Cuando la composición está en forma líquida (por ejemplo, una composición de hidrogel precursora), puede inyectarse en el cuerpo en un sitio preferible. Cuando la composición está en forma sólida, se puede trasplantar al cuerpo en un sitio preferible.

Como se usa en el presente documento, "trasplantar" se refiere a proporcionar las células soportadas en estructuras de la presente invención, usando cualquier ruta adecuada.

Como se usa en el presente documento, una dosis terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico beneficioso o deseado, cuya dosis podría administrarse en una o más administraciones. De acuerdo con una realización, se emplea una única administración. La inyección se puede administrar en varias regiones del corazón, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se requiera. La administración intramiocárdica es particularmente ventajosa para reparar el tejido cardíaco en un sujeto que tiene una cardiopatía caracterizada por arritmia cardíaca, deterioro del tejido conductor cardíaco o isquemia miocárdica.

Tal trasplante directamente al tejido cardíaco asegura que las células/tejidos administrados no se perderán debido a los movimientos contráctiles del corazón.

Las composiciones de la presente invención se pueden trasplantar mediante inyección transendocárdica o transepicárdica, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se realice, y el contexto fisiológico en el que se realice la reparación cardíaca. Esto permite que las células o tejidos administrados penetren en las capas protectoras que rodean la membrana del miocardio.

Preferentemente, se usa un enfoque basado en catéter para suministrar una inyección transendocárdica. El uso de un catéter excluye métodos de suministro más invasivos en donde sería necesaria la apertura de la cavidad torácica.

Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para regular la tasa de contracción de un corazón en respuesta al estado fisiológico o metabólico del individuo receptor, sirviendo así como un marcapasos biológico.

En el caso de reparar tejido cardíaco en un sujeto que tiene una cardiopatía caracterizada por arritmia cardíaca, se puede realizar ventajosamente el mapeo electrofisiológico del corazón y/o la inactivación del tejido cardíaco por tratamiento de radiofrecuencia en combinación con la administración de las células y tejidos de la presente invención, si es necesario.

Para reparar el tejido cardíaco dañado por isquemia, por ejemplo, debido a un infarto cardíaco, la composición de la presente invención se administra preferentemente en el área límite del infarto. Como entenderá un experto en la materia, el área infartada es visible a simple vista, lo que permite que sea posible tal localización específica de la aplicación de células terapéuticas. La determinación precisa de una dosis eficaz en este caso particular puede depender, por ejemplo, del tamaño de un infarto y del tiempo transcurrido desde el inicio de la isquemia miocárdica.

De acuerdo con una realización, el trasplante de las composiciones de la presente invención para la reparación del miocardio dañado se realiza después de una reducción suficiente de la inflamación de los tejidos cardíacos afectados y antes de la formación de un excesivo tejido cicatricial.

La presente invención se puede usar para generar células y tejidos cardiomiocíticos que muestren una capacidad proliferativa deseada, por lo que se seleccionan preferentemente células y tejidos que muestren una capacidad proliferativa adecuada para la administración, dependiendo del tipo de reparación del tejido cardíaco que se realice. La administración de células altamente proliferativas puede ser particularmente ventajosa para revertir el daño miocárdico resultante de la isquemia ya que, como se ha descrito previamente, es la incapacidad esencial de proliferar de los cardiomiocitos adultos normales lo que causa la irreversibilidad del daño miocárdico inducido por isquemia.

Dado que los modelos porcinos se consideran ampliamente como modelos excelentes para los protocolos terapéuticos humanos y dado que dichos modelos se han empleado y caracterizado ampliamente, está dentro del alcance del experto en la materia determinar una dosis terapéuticamente eficaz para un ser humano basándose en la guía proporcionada en el presente documento, y en la proporcionada por la extensa bibliografía de la técnica.

La determinación de una dosis eficaz se realiza típicamente en función de factores individuales de cada sujeto, incluyendo, por ejemplo, el peso, la edad, el estado fisiológico, el historial médico y los parámetros relacionados con la cardiopatía, tales como, por ejemplo, el tamaño del infarto y el tiempo transcurrido desde el inicio de la isquemia. Un experto en la materia, específicamente un cardiólogo, podría determinar la cantidad y el número de células comprendidas en la composición de la presente invención que constituirían una dosis eficaz y el modo óptimo de administración de la misma sin demasiada experimentación.

El experto reconocerá que cuando se administran células o tejidos no singénicos a un sujeto, existe un rechazo inmunológico rutinario de dichas células o tejidos por parte del sujeto. Por lo tanto, el método de la presente invención también puede comprender tratar al sujeto con un régimen inmunosupresor, preferentemente antes de dicha administración, para inhibir dicho rechazo. Los protocolos inmunosupresores para inhibir el rechazo de injertos alogénicos, por ejemplo, a través de la administración de ciclosporina A, anticuerpos inmunosupresores y similares, son una práctica generalizada y estándar en la clínica.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el epiplón descelularizado se puede administrar per se o como parte de una composición farmacéutica que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los conjugados químicos descritos en el presente documento, con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes farmacéuticamente adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un sujeto.

En lo sucesivo en el presente documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa a un sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Los ejemplos, sin limitaciones, de portadores son propilenglicol, solución salina, emulsiones y mezclas de disolventes orgánicos con agua.

En el presente documento, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el portador farmacéutico es una solución acuosa de solución salina.

Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de fármacos en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, última edición.

Se puede administrar la composición farmacéutica de manera sistémica (como se ha detallado anteriormente en el presente documento). Como alternativa, se puede administrar la composición farmacéutica localmente, por ejemplo, mediante inyección de la composición farmacéutica directamente en una región tisular de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsionado, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse de manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y adyuvantes, que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Para inyección, los principios activos de la composición farmacéutica pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente, en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Dependiendo de la afección médica, al sujeto se le pueden administrar fármacos químicos adicionales (por ejemplo, inmunomoduladores, quimioterapia, etc.) o células.

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero sin limitación, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNF.alfa., un agente biológico que se dirige a una citocina inflamatoria y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero sin limitación, ácido acetilsalicílico, salicilato de magnesio y colina, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de la Cox-2 y tramadol.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ±10 %.

Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye pero sin limitación".

La expresión "que consiste en" significa "que incluye y limitado a".

La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición reivindicada, el método o la estructura.

Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "un/a" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha develado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "que varía/varía entre" un primer número indicador y un segundo número indicador y "que varía/varía de" un primer número indicador "a" un segundo número indicador se usan indistintamente en el presente documento y se entiende que incluyen los números indicadores primero y segundo, y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada incluyendo, pero sin limitación, aquellas formas, medios, técnicas y procedimientos tanto conocidos como desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los especialistas de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, aliviar sustancialmente síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

A continuación, se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de una manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías expuestas en las Pat. de EE.UU. N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); se describen ampliamente inmunoensayos disponibles en la bibliografía científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las Pat. de e E.UU. N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos de los mismos se conocen bien en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector.

EJEMPLO 1 (no según la invención)

Matriz a base de epiplón para diseñar tejidos cardíacos vascularizados autólogos

MATERIALES Y MÉTODOS

Descelularización.

Descelularización del tejido epiploico porcino: Se adquirieron epiplones de cerdos sanos de 6 meses en el instituto de investigación animal en Kibutz Lahav, Israel. Se agitó tejido epiploico fresco durante 1 hora en un tampón hipotónico de Tris 10 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 pM a pH 8,0. A continuación, el tejido se sometió a tres ciclos de congelación (-80 °C) y descongelación (37 °C) usando el mismo tampón. Después del último ciclo, el tejido se deshidrató gradualmente lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 minutos y tres veces con etanol al 100 % durante 30 minutos cada vez. A continuación, se extrajeron los lípidos polares del tejido mediante tres lavados de 30 minutos con acetona al 100 %. Posteriormente, los lípidos a-polares se extrajeron mediante 3 incubaciones en una solución 60:40 de hexano:acetona (8 h cada vez). A continuación, el tejido desgrasado se rehidrató gradualmente y se sometió a degradación con tripsina al 0,25 %-EDTA (Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel) durante una noche a temperatura ambiente (TA). A continuación, el tejido se lavó minuciosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y con tampón Tris 50 mM con MgCb 1 mM a pH 8,0. Después de esto, el tejido se agitó suavemente en una solución de degradación de ácido nucleico de Tris 50 mM, MgCl²1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y 40 U/ml de nucleasa Benzonase® (Novagen, Madison, WI) a pH 8,0 durante 20 h a 37 °C. Finalmente, el tejido se lavó con un tampón que contenía Tris 50 mM, triton-X100 al 1 % (v/v) (pH 8,0), posteriormente con tampón Tris 50 mM (pH 8,0), tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada estéril (DDW, por sus siglas en inglés). El tejido descelularizado se congeló durante una noche (-20 °C) y se liofilizó.

Descelularización del tejido cardíaco porcino: Se adquirieron corazones de cerdos sanos de 6 meses en el instituto de investigación animal en Kibutz Lahav, Israel. El ventrículo izquierdo se cortó horizontalmente en cortes de tejido de 3 mm de espesor y se sometió a un protocolo de descelularización como se describe en el presente documento. Brevemente, el tejido se incubó en un tampón de lisis (tampón Tris 10 mM y EDTA al 0,1 % p/vol, pH 8,0) durante 24 h, seguido de la solubilización en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,5 % con mezcla orbital (4 días, el medio se cambió cada 8 h). A continuación, las secciones se lavaron en PBS y se incubaron en mezcla orbital con 40 U/ml de Benzonase en Tris 50 mM, MgCb 1 mM, BSA al 0,01 %, pH 8,0 a 37 °C durante 20 h, se lavaron 4 veces en DDW estéril, se congelaron durante una noche (-20 °C) y se liofilizaron.

Histología, inmunotinción e inmunofluorescencia. Se deshidrataron tejidos frescos o descelularizados en etapas graduadas de etanol (70-100 %), se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina. Se obtuvieron secciones de 5 pm y se fijaron a portaobjetos de vidrio adhesivos X-tra™ (Leica Biosystems). Las secciones se tiñeron con tricrómico de Masson (Bio-Optica, Milán, Italia) para la detección de células y colágeno, y con azul alcián (Merck, Ginebra, Suiza) para la detección de GAG.

Para la inmunohistoquímica, la recuperación de antígeno mediada por calor se realizó después de la desparafinización. Las peroxidasas endógenas se inhibieron incubando los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 3 % en PBS durante 5 min. A continuación, los portaobjetos se bloquearon en tampón a base de DMEM que contenía suero bovino fetal (FBS) al 2 % durante 1 h a TA y se tiñeron con anticuerpo de actina de músculo liso antihumano monoclonal de ratón primario (Dako, Glostrup, Dinamarca) durante 1 h a TA. El marcaje de anticuerpos se detectó usando anticuerpo anti ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante secundario (Dako), visualizado usando sustrato cromógeno DAB (Dako).

Para la inmunofluorescencia, se fijaron estructuras acelulares nativas o construcciones sembradas con células y se permeabilizaron en metanol frío, se bloquearon durante 8 min a TA en Super Block (ScyTek Laboratories, West Logan, UT). Después de 3 lavados con PBS, las muestras se incubaron con anticuerpos primarios: anti colágeno monoclonal de ratón I (Sigma, St Louis, MO), anti colágeno policlonal de conejo 4 (Abcam, Cambridge, MA), anti laminina policlonal de conejo (Abcam), anti VEGF monoclonal de ratón (Abcam), anti troponina I cardíaca policlonal de conejo primario (Abcam), anti a-actinina monoclonal de ratón (Sigma), anti conexina 43 de conejo (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti CD31 monoclonal de ratón (Abcam), anti Ki67 monoclonal de conejo (Abcam), anti Sca-1 policlonal de conejo (Millipore), anti vimentina de ratón (Invitrogen), anti SSEA-4 de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN), anti Nanog de conejo (Peproteck, Rocky Hill, NJ). Después de la incubación, las muestras se lavaron y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios: anti conejo de cabra Alexa Fluor 488 (Jackson, West Grove, PA), anti ratón de cabra Alexa Fluor 647 (Jackson). Para la detección de núcleos, las células se incubaron durante 5 min con 5 |jg/ml de Hoechst 33258 (Sigma).

Las muestras se analizaron usando un microscopio confocal LSM 510 Meta (Zeiss, Alemania) o un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse TI).

Evaluación de los componentes de la matriz. Para la cuantificación de ADN, los ácidos nucleicos se aislaron mediante el método de fenol-cloroformo y se visualizaron mediante electroforesis en gel de bromuro de etidio.

El contenido total de GAG se cuantificó en tejidos naturales y descelularizados usando un ensayo de unión de colorante azul de dimetilmetileno (DMMB; Blyscan, Biocolor Ltd., Carrickfergus, Reino Unido), con un estándar de sulfato de condroitina, según las directrices del fabricante y normalizado con respecto al peso seco.

Las muestras descelularizadas se analizaron mediante espectrometría de masas (MS) realizada por un espectrómetro de masas de trampa de iones orbitrap (MS, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los datos de MS se analizaron usando el software MaxQuant 1.2.2.5 (Laboratorio de Mathias Mann, instituto Maxplanq) buscando la parte de cerdo de la base de datos NCBI-nr.

Microscopía electrónica de barrido. Las células se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la fijación, los cultivos se aclararon con PBS y se trataron con una solución de guanidina-HCl:ácido tánico (4:5) (2 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cultivos se aclararon de nuevo con PBS y se incubaron en una solución de OsO4 al 2 % en PBS durante 1 h. A continuación, los cultivos se lavaron y se deshidrataron en series graduadas de etanol (50, 70, 80, 90 y 100 %). Finalmente, las preparaciones se pulverizaron con oro para su examen con microscopio electrónico de barrido (SEM, JSM 840A, JEOL), o con carbono para examen HR-SEM (Magellan 400L, FEI, Hillsboro, OR, EE.UU.).

Propiedades mecánicas de estructuras descelularizadas. Se realizaron tres ensayos mecánicos uniaxiales (deformación cíclica, relajación de la tensión y deformación de rotura) en muestras de epiplón y corazón descelularizadas usando un marco de carga universal Instron, instrumento de prueba universal modelo 5582 con una celda de carga de 100N. El control del dispositivo, la adquisición y el procesamiento de datos se realizaron con el software de prueba de materiales BlueHill 2.0 (Instron). Las muestras se hidrataron con PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente durante todo el ensayo.

Carga cíclica. Las muestras se preacondicionaron mediante 10 ciclos de liberación de deformación. Las estructuras se estiraron a una velocidad fija de 0,05 mm/s a una deformación del 15 % y a continuación se liberaron a la misma velocidad hasta el punto de inicio. Después de un descanso de 3 min en el punto de inicio, se realizaron tres ciclos más de liberación de deformación.

Relajación de tensión. Las muestras se estiraron rápidamente (0,5 mm/s) a una deformación del 20 % y se mantuvieron en un desplazamiento constante durante 10 min, lo que permitió la relajación de la tensión.

Deformación de rotura. Las muestras se estiraron a una velocidad de 0,05 mm/s hasta que se rasgaron. Se usaron al menos 3 muestras para cada prueba.

Aislamiento y cultivo de células cardíacas. Se aislaron miocitos de ventrículo neonatal (tomados de ratas Sprague-Dawley de 1 a 3 días de edad) usando 6-7 ciclos de digestión enzimática, como se describe en el presente documento. Brevemente, los ventrículos izquierdos se extrajeron, se trituraron y las células se aislaron mediante digestión enzimática con colagenasa tipo II (95 U/ml; Worthington, Lakewood, NJ) y pancreatina (0,6 mg/ml; Sigma) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, (CaCte2H2O (1,8 mM), KCl (5,36 mM), MgSO4-7H2O (0,81 mM), NaCl (0,1 M), NaHCO3 (0,44 mM), NaH2PO4 (0,9 mM)). Después de cada ronda de digestión, las células se centrifugaron (600 g, 4 °C, 5 min) y suspendieron de nuevo en medio de cultivo compuesto por M-199 complementado con CuSO4-5H2O 0,6 mM, ZnSO4-7H2O 0,5 mM, vitamina B12 1,5 mM, 500 U/ml de penicilina (Biological Industries) y 100 mg/ml de estreptomicina (Biological Industries) y FBS al 0,5 % (v/v). Para enriquecer la población de cardiomiocitos, las células se suspendieron en medio de cultivo con FBS al 5 % y se sembraron previamente en placas dos veces (30 min). El número de células y la viabilidad se determinó mediante hemocitómetro y ensayo de exclusión con azul de tripano. Se sembraron 5 x 105 células cardíacas en estructuras de 5 mm de diámetro añadiendo 10 j l de las células suspendidas, seguido de un período de incubación de 40 min (37 °C, CO²al 5 %). Después de esto, las construcciones celulares se complementaron con medio de cultivo (con FBS al 5 %) para una incubación adicional.

Como grupo de control se usaron células cardíacas sembradas en estructuras Surgisis SIS (Cook Biotech Inc.), o estructuras de alginato.

Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Se cultivaron HUVEC (pase 4; Lonza, Basilea, Suiza) en medio de células endoteliales (EGM-2, PromoCell, Heidelberg, Alemania). Las HUVEC y las células cardíacas se cultivaron en diversas relaciones de células endoteliales:cardíacas (HUVEC al 10 %, 25 % y 50 %) en EGM-2.

Aislamiento y cultivo de células madre mesenquimatosas. Se aislaron células madre mesenquimatosas (MSC) de los fémures de ratas Sprague-Dawley de 4-6 semanas de edad, como se describe a continuación. Brevemente, se aspiraron células de cada hueso, se sembraron por separado en placas de cultivo y se cultivaron en medio completo (DMEM de alto contenido en glucosa, complementado con FBS al 10 % (v/v), penicilina-estreptomicina al 1 % (p/v) y 1-glutamina al 1 % (p/v), todos materiales de Biological Industries). Al día siguiente, las células no adherentes se eliminaron mediante varios lavados con un medio recién calentado. Las MSC se identificaron por la adherencia al matraz. Se permitió que las MSC crecieran hasta una confluencia del 70 % y a continuación se recogieron, se volvieron a colocar en placas y se cultivaron durante una semana más antes de sembrarlas en la estructura de epiplón.

Cultivo de iPSC humanas. Las hiPSC se eliminaron de la capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón, se dispersaron en grupos de células usando colagenasa tipo IV (300 U/ml, Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ), se sembraron en las estructuras epiploicas y se cultivaron.

Evaluación de la viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó mediante un ensayo colorimétrico XTT para la cuantificación de la proliferación y la viabilidad celular (Biological Industries) según las instrucciones del fabricante. A continuación, la absorbancia de cada muestra (475 nm) se midió frente a un control de fondo (665 nm) usando un fotómetro de microplacas SynergyHT.

Ensayo Live/Dead: Las estructuras sembradas con células cardíacas se sometieron a un ensayo de tinción con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI). Las estructuras sembradas se sumergieron durante 20 min en 5 |jg/ml de FDA (Sigma) y 4 jg/m l de PI (Sigma) en medio de cultivo a 37 °C. Las muestras se lavaron con PBS y se tomaron imágenes usando un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse TI, invertido).

Análisis de la función tisular. La contracción de las construcciones de células cardíacas se registró usando un microscopio invertido. La amplitud de la contracción se analizó usando el software ImageJ (NIH). Se contó la tasa de contracción.

Análisis estadístico. Los datos se presentan como la media ± SEM. Las diferencias univariadas entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de la t de Student. Todos los análisis se realizaron usando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software). P<0,05 se consideró significativo.

RESULTADOS

Antes del proceso de descelularización, los presentes inventores intentaron detectar la presencia de varios actores clave en el tejido epiploico, importantes para diseñar tejidos cardíacos vascularizados. Estos factores incluyen la malla fibrosa de colágeno subyacente, la infraestructura de los vasos sanguíneos, las moléculas de adhesión y los GAG.

La tinción tricrómica de Masson de cortes de epiplón fijados reveló un alto contenido de fibras de colágeno (azul) dentro del tejido, que sirve como matriz subyacente que soporta las células (figura 1A). Para evaluar la presencia de GAG, se tiñeron con azul alcián cortes fijos de tejido epiploico. La figura 1B reveló un alto contenido de GAG sulfatados (azul claro) en todo el tejido, principalmente alrededor de los vasos sanguíneos. La tinción de actina del músculo liso, que marca las células del músculo liso, reveló una densa red vascular compuesta por vasos sanguíneos de varios tamaños (figura 1C; marrón) con un alto contenido de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a su alrededor (figura 1D; rosa). La molécula de adhesión laminina se encontró en las fibras de colágeno en todo el tejido (figura 1D; verde).

Descelularización del epiplón y análisis de matriz

Para evaluar el potencial de la matriz de epiplón para servir como estructura para la ingeniería tisular cardiaca, los presentes inventores primero se centraron en la eliminación celular. Los tejidos epiploicos se sometieron a diversos procesos (descritos en detalle en la sección de métodos) para lograr la eliminación eficiente de las células adiposas y de los vasos sanguíneos y sus fragmentos (figura 2A-D). La eliminación completa de ADN/ARN se validó mediante tinción con Hoechst 33258. Se detectaron núcleos en epiplón fresco pero no en la matriz descelularizada (figuras 2E y F, respectivamente). La electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio no mostró bandas de ADN asociadas con el tejido epiploico descelularizado, mientras que el epiplón fresco mostró una banda grande por encima de 9400 pb (figura 2G). El análisis SEM realizado en epiplón nativo (figura 3A) y descelularizado (figura 3B) indicó además una eliminación celular eficiente y la conservación de una malla fibrosa con infraestructura de vasos sanguíneos (figura 3C). En general, la matriz descelularizada contenía fibras que variaban de 150 nm a varios micrómetros de diámetro (figura 3D).

A continuación, los presentes inventores intentaron analizar la composición de la matriz. La tinción tricrómica de Masson reveló una estructura fibrosa rica en colágeno (figura 4A). Se observó tinción positiva para colágeno I y IV (figura 4B). El análisis proteómico de MS proporcionó una indicación adicional del contenido proteico dentro del epiplón descelularizado. Entre las proteínas de colágeno de la matriz se identificaron en su mayoría proteínas de colágeno estructural tales como colágeno tipo I (52 %) y III (15 %), que brindan soporte mecánico a la matriz, colágeno tipo II (12 %) que interactúa con los proteoglucanos y proporciona resistencia a la tracción a los tejidos y colágeno tipo V (7 %), asociado con el inicio del ensamblaje de las fibrillas de colágeno. Asimismo, también se detectaron colágeno IV (2 %) y VI (2 %), que comprenden la membrana basal de los vasos sanguíneos, lo que sugiere que los componentes básicos de la infraestructura de los vasos se conservaron durante el proceso de descelularización.

Además de su capacidad para unirse al agua y formar así matrices hidratadas, los GAG sulfatados se unen electrostáticamente a proteínas de unión a heparina y controlan su liberación en el microambiente celular. La conservación de GAG dentro de la matriz de epiplón descelularizada se detectó cualitativamente mediante tinción con azul alcián (figura 4C). A continuación, se cuantificaron los GAG sulfatados dentro de la matriz usando el ensayo Blyscan. Como se muestra, se conservaron 1,7 |jg de GAG sulfatados en 1 mg de matriz seca durante el proceso de descelularización (figura 4D).

Para evaluar si las propiedades mecánicas del epiplón descelularizado pueden soportar la función cardíaca, la matriz se analizó mediante 3 ensayos mecánicos: deformación cíclica, relajación de la tensión y deformación de rotura. Se presentan gráficos representativos en las figuras 5A-C. Se encontró que las estructuras exhibieron baja histéresis y alta elasticidad, como resulta evidente por la distancia entre las curvas ascendentes y descendentes en el ensayo de deformación cíclica. Casi no se observó en las estructuras epiploicas una reducción de los valores máximos de tensión para los ciclos consiguientes o una reducción de la tensión mínima en el punto de inicio (figura 5A). En el ensayo de relajación de la tensión, las estructuras epiploicas exhibieron un comportamiento viscoelástico (figura 5B), que se asemeja a los resultados de relajación de la tensión descritos anteriormente del tejido cardíaco nativo. Aunque las estructuras epiploicas exhibieron, como era de esperar, una resistencia final más baja que la MEC cardíaca, tanto la MEC epiploica como la cardíaca tuvieron un fallo inicial al 20 % de estiramiento en el ensayo de deformación de rotura (figura 5C).

Ingeniería de parches cardíacos funcionales

Se evaluó el potencial de las matrices para soportar el cultivo de células cardíacas y el ensamblaje tisular a lo largo del tiempo. Las células cardíacas se aislaron de los ventrículos de ratas recién nacidas y se sembraron con una sola gota en las matrices (figura 6A). La viabilidad celular se evaluó a lo largo del tiempo mediante la tinción Live/Dead y el ensayo de viabilidad XTT, lo que reveló una muerte celular y un mantenimiento insignificantes durante todo el período de cultivo (figura 6B y C).

Para evaluar la morfología de las células cardíacas dentro de las estructuras, las construcciones se tiñeron dos veces para troponina I y colágeno I. Las imágenes confocales de las construcciones sembradas de células el día 3 revelaron que las células están ubicadas en las fibras de colágeno (rosa), lo que sugiere una interacción célula-matriz (figura 7A). El día 7, las células se ensamblaron en haces de células alargadas y alineadas (figura 7B). La tinción de a-actinina sarcomérica (rosa) reveló una estriación masiva, lo que indica el potencial de contracción del tejido (figura 7C). Las células dentro de la matriz epiploica adquirieron una morfología similar a la de las células cultivadas en el corazón descelularizado (figura 7D) y típicas de las células cardíacas nativas. Las imágenes SEM de alta resolución de células cardíacas cultivadas dentro de la matriz epiploica proporcionaron más indicaciones para el alargamiento y la alineación celular, y para las interacciones célula-célula y célula-matriz (figura 7E). Se observó que, durante el período de cultivo, los poros de las matrices se llenaron gradualmente, probablemente con proteínas de la MEC secretadas por fibroblastos cardíacos (figura 7F).

Dado que es esencial una fuerte contracción del tejido diseñado para crear un parche cardíaco eficaz, se midió la amplitud y la tasa de contracción de los parches. La amplitud y la tasa eran del mismo orden que el tejido cardíaco diseñado dentro de la matriz cardíaca descelularizada (figura 7G y 7H). Las células sembradas en estructuras de alginato y membranas SIS, que sirvieron como grupos de control, no pudieron inducir la contracción de la construcción, aunque se observaron contracciones de los agregados celulares individuales.

Vascularización del parche cardíaco

La prevascularización del parche es esencial para su adecuada integración con el miocardio huésped después de la implantación. En ausencia de una vasculatura adecuada, después del trasplante, el oxígeno no puede llegar a las células implantadas y las células cardíacas que comprenden el parche no pueden sobrevivir. Por lo tanto, los presentes inventores intentaron evaluar la capacidad de la matriz a base de epiplón para inducir el ensamblaje de células endoteliales en vasos sanguíneos. Se sembraron HUVEC en la matriz para formar redes de vasos sanguíneos en la infraestructura de los vasos sanguíneos. Como se muestra, las células endoteliales, teñidas positivamente para el marcador CD31 (rosa), se ubicaron en las fibras de colágeno IV (verde) dentro de la matriz, formando estructuras tubulares (figura 8A y B).

A continuación, se cultivaron conjuntamente HUVEC con células cardíacas en diversas relaciones de células endoteliales:cardíacas (descrito en la sección de métodos). Se observaron estructuras que se asemejaban a redes de vasos sanguíneos (CD31; rosa) entre haces de células cardíacas (troponina I; verde) en los diferentes cultivos (figura 8C y D). Se evaluaron las propiedades de contracción de los parches cardíacos vascularizados. Como se muestra en las figuras 8E y F, se observaron una mayor amplitud y tasa de contracción en los parches cardíacos sembrados con un mayor porcentaje de células cardíacas. Se observó además que cuando las construcciones celulares se cultivaron en medio EGM-2 (figura 8E), la tasa de contracción fue significativamente mayor que la de las construcciones cultivadas en medio M199 (figura 7H). Esto probablemente se deba a complementos del factor de crecimiento en el medio EGM-2 enriquecido (GF epidérmico, G^fendotelial vascular, factor básico de fibroblastos, IGF-1).

Matriz de epiplón como plataforma para diseñar tejidos autólogos

A continuación, los presentes inventores intentaron evaluar el potencial de la matriz para alojar células MSC y hiPS, que tienen el potencial de regenerar el corazón infartado. Teóricamente, estas células pueden aislarse de un paciente, sembrarse y cultivarse dentro de la matriz obtenida del paciente y volver a trasplantarse en lugar del tejido lesionado. Este enfoque puede representar un nuevo concepto para diseñar tejidos personalizados.

Se aislaron MSC de médula ósea de rata y se cultivaron dentro de matrices de epiplón. El día 7, las células exhibieron una fuerte tinción para Sca-1 (figura 9A, verde). La tinción conjunta con vimentina (rosa) y el marcador de proliferación Ki67 (verde), junto con el ensayo de viabilidad XTT han indicado proliferación celular dentro de la estructura (figura 9B y C).

También se cultivaron células hiPS en la matriz de epiplón. Previamente se ha demostrado que estas células pueden aislarse de pacientes y manipularse para diferenciarse en cardiomiocitos contráctiles. Por lo tanto, las células iPS son relevantes para el diseño de un parche cardíaco autólogo. Las figuras 9D y E revelaron que 7 días después de la siembra celular, se formaron cuerpos embrioides en la matriz de epiplón. Las células se tiñeron positivamente para Nanog (verde) y SSEA-4 (rosa), lo que indica el mantenimiento de su pluripotencialidad.

Análisis

El epiplón es un tejido muy vascularizado y su MEC fibrilar colagenosa es rica en GAG sulfatados y proteínas adhesivas. La capacidad de eliminar fácilmente partes de este tejido sin afectar negativamente a la salud del paciente y el proceso de descelularización rápido y sencillo permiten su uso como estructura autóloga para la ingeniería tisular y la medicina regenerativa.

En este estudio, los presentes inventores investigaron la capacidad de la matriz de epiplón para servir como estructura para inducir el ensamblaje funcional de parches cardíacos vascularizados. Las células se eliminaron de manera eficiente del tejido adiposo mientras se conservaba la matriz subyacente. El diámetro de las fibras de colágeno que comprenden la matriz varío entre 150 nm y varios micrómetros. Una matriz compuesta por dichas fibras puede servir como una estructura apropiada para el diseño de tejidos cardíacos, ya que estas dimensiones son según las fibras endomisiales y perimisiales de la matriz cardíaca nativa, envolviendo cardiomiocitos individuales y haces de células, respectivamente.

Como en el miocardio, la matriz de epiplón está compuesta principalmente por una red fibrilar de colágeno tipo I y III. La matriz también está compuesta por colágeno tipo IV y VI, que se encuentran en la membrana basal de los vasos sanguíneos, lo que sugiere que la infraestructura básica de los vasos se conservó durante el proceso de descelularización.

La matriz epiploica también contenía GAG sulfatados. Estas moléculas pueden ser útiles para el almacenamiento y la liberación de GF de unión a heparina en el microambiente celular, promoviendo procesos fisiológicos tales como la cardioprotección, la migración celular y la vascularización. Recientemente se demostró que la liberación controlada eficiente de VEGF en el microambiente de un tejido cardíaco diseñado podía promover la vascularización rápida después de la implantación del parche. Por lo tanto, la capacidad de utilizar los GAG conservados para liberar dichos factores es beneficiosa para la integración del tejido manipulado con el huésped después del trasplante. La prevascularización del parche cardíaco permitiría una anastomosis rápida entre los vasos sanguíneos diseñados y la vasculatura del huésped, lo que reduciría significativamente el tiempo que el tejido permanece sin oxígeno ni nutrientes y, por lo tanto, podría mejorar la viabilidad del injerto.

Un requisito previo de las matrices para la ingeniería tisular cardíaco es resistir las condiciones de trabajo fisiológicas del corazón. El ensayo de relajación de la tensión reveló que la matriz de epiplón descelularizada exhibió un comportamiento similar al informado para el corazón nativo. Las estructuras exhibieron una baja disipación de energía (histéresis reducida) durante la carga cíclica, lo que sugiere que las estructuras obtenidas pueden retirar la carga cíclica fisiológica. El ensayo de deformación de rotura reveló que tanto la MEC epiploica como la cardíaca fallaron inicialmente al 20 % de estiramiento, lo que sugiere un potencial para resistir la deformación fisiológica (es decir, <20 %) después del trasplante.

Las señales topográficas, bioquímicas y mecánicas proporcionadas por la matriz de epiplón mantuvieron la viabilidad de las células cardíacas durante todo el período de cultivo. La ligera elevación de los valores de XTT a lo largo del período de cultivo puede atribuirse a la proliferación de fibroblastos cardíacos dentro de la estructura. Se pudo observar una tinción masiva de troponina I y a-actinina sarcomérica en las células que comprendían el parche tan pronto como 3 días después de la siembra. Estos marcadores están asociados con la contracción muscular, lo que sugiere, por lo tanto, un fuerte potencial de contracción. Las imágenes SEM revelaron que las células cardíacas interactuaban con las fibras de colágeno y obtenían una morfología alargada y alineada en distintos planos de las estructuras. El nivel de porosidad de las estructuras disminuyó, probablemente debido a la alta tasa de secreción de proteínas de la MEC por parte de los cardiofibroblastos. En general, estas características moleculares fueron responsables de una fuerte fuerza de contracción de los parches cardíacos a base de la matriz de epiplón. Los estudios de contractilidad no revelaron diferencias significativas entre los tejidos cardíacos diseñados dentro de un epiplón o matrices cardíacas. En ausencia de una diferencia funcional entre estas matrices, el epiplón tiene una ventaja para el diseño de parches cardíacos personalizados.

Otra cuestión crítica en los parches cardíacos para la medicina regenerativa es la capacidad del biomaterial para inducir la formación de redes de vasos sanguíneos. El día 3 después de la siembra de células endoteliales, las células se organizaron en estructuras tubulares en fibras de colágeno IV dentro de la matriz, lo que indica la formación inicial de redes de vasos sanguíneos. Las células endoteliales se cocultivaron adicionalmente con células cardíacas y el día 7 se ensamblaron en estructuras tubulares sin afectar a la capacidad de contracción del parche. Dicha prevascularización de un parche cardíaco puede promover una anastomosis rápida con la red de vasos sanguíneos del huésped, lo que permite la transferencia adecuada de oxígeno y nutrientes al injerto y el mantenimiento de la viabilidad celular.

La matriz de epiplón puede extraerse de pacientes y usarse para mantener de manera eficiente la viabilidad de las células autólogas. Se ha demostrado previamente que las m Sc tienen un efecto terapéutico en el corazón infartado tanto cuando se implantan tejidos diseñados a base de MSC como cuando las células se inyectan directamente en el infarto. En este caso, los presentes inventores han demostrado que la matriz de epiplón es capaz de soportar el cultivo y la proliferación de MSC. Asimismo, la matriz de epiplón pudo mantener el fenotipo indiferenciado de las células iPS sin el uso de células de la capa alimentadora. El potencial de estas células para diferenciarse en cardiomiocitos contráctiles se ha informado previamente, por lo tanto, su combinación con la matriz epiploica representa una plataforma para diseñar parches cardíacos funcionales y personalizados para el trasplante posterior al infarto.

EJEMPLO 2 (no según la invención)

Comparación de protocolos de descelularización

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtuvieron dos epiplones porcinos diferentes del instituto de investigación animal en Kibutz Lahav, Israel. Los tejidos frescos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y los desechos. A continuación, cada órgano se dividió en cinco trozos de 30-50 g. Cada trozo de cada epiplón se trató con un protocolo diferente para la descelularización. En general, cada protocolo de descelularización se realizó en dos epiplones diferentes. Después de pesar los tejidos descelularizados, las muestras se mantuvieron congeladas para su posterior análisis. Se investigaron cinco métodos de descelularización diferentes. Todas las etapas de incubación y lavado se obtuvieron a temperatura ambiente en un agitador orbital, a menos que se indique lo contrario.

Protocolo n.° 1. Se agitó epiplón fresco durante 1 h en un tampón hipotónico de Tris 10 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 pM a pH 8,0. A continuación, el tejido pasó por tres ciclos de congelación (-80 °C) y descongelación (37 °C) usando el mismo tampón. Después de la última descongelación, el tejido se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 min y tres veces con etanol al 100 % durante 30 min cada vez. A continuación, los lípidos polares del tejido se extrajeron mediante tres lavados de 30 min con acetona al 100 %. Los lípidos apolares se extrajeron finamente mediante incubación de 24 h en una solución 60/40 (v/v) de hexano:acetona (con 3 cambios). El tejido desgrasado se rehidrató mediante un lavado de 30 min en etanol al 100 % e incubación durante una noche en etanol al 70 % a 4 °C. A continuación, el tejido se lavó cuatro veces con PBS a pH 7,4 y se incubó durante una noche en una solución de tripsina al 0,25 %-EDTA (Biological Industries, Kibbutz Bcit-Hacmck, Israel). A continuación, el tejido se lavó minuciosamente con PBS y después con tampón Tris 50 mM con MgCb 1 mM a pH 8,0 durante 30 min. A continuación, el tejido se agitó suavemente en una solución de degradación nucleica de Tris 50 mM, MgCb 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y 40 unidades/ml de nucleasa Benzonase® (Novagen, Madison, WI) a pH 8,0 durante 20 h a 37 °C. Finalmente, el tejido se lavó con una solución Tris 50 mM Triton-X100 al 1 % a pH 8,0 durante 1 h. El tejido descelularizado se lavó una vez con Tris 50 mM a pH 8,0, tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada. El tejido descelularizado se congeló (-20 °C) y se liofilizó.

Protocolo n.° 2. Se agitó epiplón fresco durante 1 h en un tampón hipotónico de Tris 10 mM, EDTA 5 mM y PMSF 1 pM a pH 8,0. A continuación, el tejido pasó por un ciclo de congelación (-80 °C) y descongelación (37 °C) usando el mismo tampón. El tejido se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 min y tres veces con etanol al 100 % durante 30 min cada vez. A continuación, los lípidos polares del tejido se extrajeron mediante tres lavados de 30 min con isopropanol al 100 %. Los lípidos apolares se extrajeron finamente mediante incubación de 24 h en una solución 60/40 (v/v) de hexano:isopropanol (con tres cambios). El tejido desgrasado se rehidrató mediante un lavado de 30 min en etanol al 100% e incubación durante una noche en etanol al 70 % a 4 °C. A continuación, el tejido se lavó 4 veces con PBS a pH 7,4 y se incubó en una solución de tripsina al 0,25 %-EDTA durante 1 h a 37 °C. A continuación, el tejido se lavó minuciosamente con PBS y después con tampón Tris 50 mM con MgCb 1 mM y Triton-X100 al 1 % a pH 8,0 durante 1 h. El tejido se lavó dos veces en Tris 50 mM-MgCb 1 mM a pH 8,0 durante 30 min cada vez. A continuación, el tejido se agitó suavemente en una solución de degradación nucleica de T ris 50 mM, MgCb 1 mM, BSA al 0,1 % y 40 unidades/ml de nucleasa Benzonase® a pH 8,0 durante 20 h a 37 °C. Finalmente, el tejido se lavó con una solución Tris 50 mM, Triton-X100 al 1 % a pH 8,0 durante 1 h. El tejido descelularizado se lavó una vez con Tris 50 mM a pH 8,0, tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada. El tejido descelularizado se congeló (-20 °C) y se liofilizó.

Protocolo n.° 3. Se agitó epiplón fresco durante 24 h en un tampón hipotónico de Tris 10 mM, EDTA 5 mM y PMSF 1 |jM a pH 8,0 (con 3 cambios). El tejido se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 min y 3 lavados de etanol al 100 % durante 30 min cada vez. A continuación, el tejido se incubó durante 24 h en acetona al 100 % (con 3 cambios) para la extracción de lípidos. El tejido se rehidrató mediante un lavado de 30 min en etanol al 100 % e incubación durante una noche en etanol al 70 % a 4 °C. A continuación, el tejido se lavó cuatro veces con PBS a pH 7,4 y después se incubó durante 2 h en la solución hipotónica. El tejido se procesó adicionalmente con una solución al 1 % de SDS durante 24 h (con 2 cambios) después de dos incubaciones de 2 h en desoxicolato de sodio 2,5 mM en PBS. El tejido se deshidrató de nuevo, se incubó durante 24 h en acetona al 100 % y se rehidrató. A continuación, el tejido se trató de nuevo con el tampón hipotónico durante 2 h, seguido de 24 h en SDS al 1 % y dos incubaciones de 2 h en desoxicolato de sodio 2,5 mM. A continuación, el tejido se lavó minuciosamente con PBS y después con Tris 50 mM-MgCl²1 mM a pH 8,0 durante 1 h. El tejido se agitó suavemente en una solución de degradación nucleica de Tris 50 mM, MgCb 1 mM, BSA al 0,1 % y 40 unidades/ml de nucleasa Benzonase® a pH 8,0 durante 20 h a 37 °C. Finalmente, el tejido se lavó dos veces con Tris 50 mM a pH 8,0 (1 h cada vez), tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada. El tejido descelularizado se congeló (-20 °C) y se liofilizó.

Protocolo n.° 4. Primero se trató epiplón fresco exactamente como en el protocolo n.° 3, solo con un ciclo de extracción de grasa con acetona al 100 %. Después de la etapa de degradación nucleica, el tejido se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 min y 3 lavados de etanol al 100 % durante 30 min cada vez. A continuación, el tejido se lavó 3 veces en acetona al 100 %. Los lípidos apolares se extrajeron finamente mediante incubación de 24 h en una solución 60/40 (v/v) de hexano:acetona (con 3 cambios). El tejido desgrasado se rehidrató mediante un lavado de 30 min en etanol al 100 % y un lavado de 30 min en etanol al 70 % a 4 °C. A continuación, el tejido procesado se lavó tres veces con PBS y tres veces con agua bidestilada. El tejido descelularizado se congeló (-20 °C) y se liofilizó.

Protocolo n.° 5. El epiplón fresco se deshidrató lavándolo una vez con etanol al 70 % durante 30 min y tres lavados de etanol al 100 % durante 30 min cada vez. A continuación, el tejido se lavó tres veces con 100 %; acetona durante 1 h y una vez con una solución 50/50 (v/v) de acetona:hexano. El tejido se incubó durante 24 h en una solución 20/80 (v/v) de acetona:hexano (con tres cambios) para la extracción de lípidos. El tejido se rehidrató mediante un lavado de 30 min en etanol al 100 % e incubación durante una noche en etanol al 70 % a 4 °C. El tejido desgrasado se lavó con tampón T ris 50 mM con MgCb 1 mM y T riton-X100 al 1 % a pH 7,4 durante 30 min y a continuación se incubó durante 20 h en una solución fresca que contenía 40 unidades/ml de nucleasa Benzonase®. A continuación, el tejido se lavó dos veces con Tris 50 mM, MgCb 5 mM y Triton-X100 al 1 % a pH 7,4 durante 2 h y a continuación durante 1 h en NaCl 1 M, EDTA 20 mM y Triton-X100 al 0,2 % a pH 7,0. Finalmente el tejido se lavó con agua bidestilada y se almacenó en etanol al 70 % a 4 °C.

Evaluación de los lípidos restantes:

Se digirieron 20 mg de muestras secas de los tejidos que se procesaron por cada método en 1 ml de solución de digestión que contenía 1,7 mg/ml de papaína durante 4 horas a 65 °C. Las muestras digeridas se centrifugaron, de modo que los componentes grasos de los tejidos digeridos permanecieron en la parte superior de los tubos y se investigaron.

Tinción y cuantificación de ADN:

Se tiñeron trozos pequeños de los tejidos procesados con 5 jg/m l de Hoechst para la detección de ácido nucleico durante 3 minutos y a continuación se lavaron minuciosamente con PBS. Las muestras se observaron bajo un microscopio fluorescente. El ADN se extrajo de tres muestras secas aleatorias (25-30 mg) de los tejidos nativos y descelularizados usando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) según la guía del manual. El ADN obtenido se cuantificó mediante mediciones de la D.O. a una longitud de onda de 260 nm usando un espectrofotómetro (Nanodrop 1000, Thermo Scientific).

Cuantificación de glucosaminoglucanos sulfatados:

Los glucosaminoglucanos sulfatados (GAG) en los tejidos procesados se cuantificaron usando el kit de ensayo de GAG sulfatados Blyscan (Biocolor Ltd.) Las muestras secas de los tejidos procesados de cada epiplón se digirieron en una solución de digestión que contenía 1,7 mg/ml de papaína durante 4 horas a 65 °C. Las muestras digeridas se centrifugaron y el sobrenadante se analizó siguiendo el protocolo del fabricante. Cada ensayo se realizó por duplicado (en total hubo cuatro repeticiones para cada método; dos de cada epiplón).

Histología:

Las muestras de los tejidos nativos y procesados (del mismo animal) se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina. Se obtuvieron secciones de 5 pm y se fijaron a portaobjetos de vidrio adhesivos X-tra® (Leica Biosystems). Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para confirmar la descelularización y con azul alcián y rojo rápido para obtener imágenes de GAG.

Microscopía electrónica de barrido:

Para las imágenes con microscopio electrónico de barrido (SEM), se seleccionaron punzones de cada estructura que contenían áreas tanto translúcidas como grasas. Los tejidos procesados del mismo animal se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % en tampón de fosfato 0,2 M a pH 7,4 durante 2 horas. A continuación, los tejidos se deshidrataron usando una serie graduada de soluciones de etanol-agua (50 %-100 %). Finalmente, las muestras se secaron en el punto crítico y se recubrieron por pulverización con oro antes de observarlas con un microscopio electrónico de barrido (Jeol JSM840A). Las propiedades de las fibras y los poros de las estructuras se midieron a partir de cinco fotos diferentes para cada método usando el programa ImageJ.

Evaluación de la viabilidad de los fibroblastos:

Con el fin de evaluar la biocompatibilidad de los tejidos procesados, se obtuvieron estructuras de 8 mm de cada método para la incubación con células NIH-3T3 que se transfectaron de manera estable con un ADN plasmídico que codificaba proteína verde fluorescente mejorada (EGFP). Las estructuras se esterilizaron con luz ultravioleta durante 2 horas. Se sembraron 105 células en cada estructura o en pocillos vacíos para el control positivo por triplicado para cada punto temporal que se midió. Las estructuras se lavaron una vez y a continuación se incubaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal y una mezcla de antibióticos. Las estructuras se observaron con un microscopio fluorescente para obtener imágenes. La viabilidad de las células se midió usando el kit de ensayo de proliferación celular XTT (ATCC) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las estructuras que contenían células se incubaron con el reactivo XTT durante 10 horas a 37 °C. Se retiraron las estructuras y se midió la densidad óptica del medio a 450 nm y 630 nm. Todas las estructuras eran productos del mismo epiplón.

Cultivo de cardiomiocitos: Se aislaron miocitos de ventrículo neonatal (tomados de ratas Sprague-Dawley de 1 a 3 días de edad) usando 6-7 ciclos de digestión enzimática, como se ha descrito previamente. Brevemente, los ventrículos izquierdos se extrajeron, se trituraron y las células se aislaron mediante digestión enzimática con colagenasa tipo II (95 U/ml; Worthington, Lakewood, NJ) y pancreatina (0,6 mg/ml) en DMEM. Después de cada ronda de digestión, las células se centrifugaron (600 g, 4 °C, 5 min) y suspendieron de nuevo en medio de cultivo compuesto por M-199 complementado con CuSo4-5H2O 0,6 mM, ZnSO4-7H2O 0,5 mM, vitamina B12 1,5 mM, 500 U/ml de penicilina (Biological Industries) y 100 mg/ml de estreptomicina (Biological Industries) y FBS al 0,5 % (v/v). Para enriquecer la población de cardiomiocitos, las células se suspendieron en medio de cultivo con FBS al 5 % y se sembraron previamente en placas dos veces durante 30 min. El número de células y la viabilidad se determinó mediante hemocitómetro y ensayo de exclusión con azul de tripano. Se sembraron células cardíacas (5 x 105) en estructuras de 5 mm de diámetro añadiendo 10 pl de las células suspendidas, seguido de un período de incubación de 40 min (37 °C, CO²al 5 %). A continuación, las construcciones celulares se complementaron con medio de cultivo (con FBS al 5 %) para una incubación adicional.

Inmunotinción: Las construcciones de células cardíacas se fijaron y se permeabilizaron en metanol frío al 100 % durante 10 min, se lavaron tres veces en tampón a base de DMEM y a continuación se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente en tampón a base de DMEM que contenía FBS al 2 %, después de lo cual las muestras se lavaron tres veces con PBS. A continuación, las muestras se incubaron con anticuerpos primarios para detectar aactinina sarcomérica (1:750, Sigma), se lavaron tres veces y se incubaron durante 1 h con anticuerpo anti ratón de cabra conjugado con Alexa Fluor 647 (1:500; Jackson, West Grove, PA, EE.UU.). Para la detección de núcleos, las células se incubaron durante 3 min con 5 pg/ml de Hoechst 33258 y se lavaron tres veces. Las muestras se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse TI). Todas las estructuras eran productos del mismo epiplón.

Análisis estadístico: Los datos del análisis estadístico se presentan como promedio ± error estándar. Las diferencias entre los grupos se evaluaron con ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Todos los análisis se realizaron usando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software). P<0,05 se consideró significativo. NS representa P>0,05, * representa P<0,05, " representa P<0,01, *** representa p<0,001.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Con el fin de obtener estructuras descelularizadas que sean adecuadas para diseñar tejidos funcionales, se deben mantener dos condiciones principales. En primer lugar, es fundamental que las células y los fragmentos de ADN se eliminen de la matriz para evitar la toxicidad in vitro y la respuesta inmunitaria después del trasplante. El segundo objetivo es la conservación de las biomoléculas esenciales de la MEC, incluidas las fibras de colágeno, los GAG y las proteínas de adhesión.

El epiplón es una lámina doble de peritoneo altamente vascularizada que se extiende desde la curvatura mayor del estómago que recubre la mayor parte de los órganos abdominales. Tiene una composición celular y extracelular única, que contiene adipocitos que están incrustados en un tejido conectivo bien vascularizado y una región translúcida que incluye células mesoteliales y colágeno.

Después de procesar el tejido con cinco protocolos, los presentes inventores intentaron evaluar el efecto de los diferentes protocolos sobre la eliminación celular y la conservación de la MEC (véanse la Tabla 1 a continuación y Materiales y Métodos).

Tabla 1

Etapa N.° de protocolo Protocolo n.° 2 Protocolo n.° 3 Protocolo n.° 4 Protocolo n.° 5

Choque Tris 10 mM Tris 10 mM Tris 10 mM Tris 10 mM EDTA X hipotónico EDTA 5 mM EDTA 5 mM EDTA 5 mM - 5 mM PMSF 1 uM

PMSF 1 uM pH PMSF 1 uM pH PM SF1 uM pH pH 8,0 - 1 h x2 y

8,0 - 1 h 8,0 - 1 h 8,0 - 1 h x2 y durante una noche

durante una

noche

Congelación- En tampón En tampón X X X descongelación hipotónico, -80 °C hipotónico, -20 °C

a 37 °C x3 a -80 °C a 37 °C

Deshidratación Etanol al 70 % Etanol al 70 % Etanol al 70 % Etanol al 70 % Etanol al 70 % Etanol al 100 % Etanol al 100 % Etanol al 100 % Etanol al 100 % x3 Etanol al 100 % x3 x3 x3 x3

Extracción de Acetona x340:60 Isopropanol x3 Acetona - 24 h Acetona - 24 h Acetona x3 grasa de 40:60 de 50:50 de acetona:hexano - isopropanol: acetona:hexano, 24 h hexano - 24 h 20:80 de acetono:hexano - 24 h

Rehidratación Etanol al 100 % Etanol al 100 % Etanol al 100 % Etanol al 100 % Etanol al 100 %

Etanol al 70 % Etanol al 70 % Etanol al 70 % etanol al 70 % Etanol al 70 % Extracción Tripsina - durante Tripsina 1 h a Tris 10 mM Tris 10 mM EDTA Tris 50 mM celular una noche a TA 37 °C Tris 50 mM EDTA 5 mM - 5 mM - 2 h SDS al MgCl²al 1 %

MgCl²1 mM 2 h SDS al 1 % 1 % en ddw - 24 h triton al 1 % pH Triton al 1 % pH en ddw - 24 h Desoxicolato de 7,4 - 30 min 8,0 - 1 h Desoxicolato de sodio 2,5 mM en

sodio 2,5 mM en PBS - 2 h x2

PBS - 2 h x2 ***

Degradación Tris 50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM MgCb Tris 50 mM nucleica MgCl²1 mM pH MgCl²1 mM pH MgCl²1 mM pH 1 mM pH 8,0 - MgCl²al 1 %

8,0 - 30 min Tris 8,0 - 30 min x2 8,0 - 30 min Tris 30 min Tris 50 mM triton al 1 % pH 50 mM MgCl²Tris 50 mM 50 mM MgCl²MgCl²1 mM BSA 7,4 41,8 U/ml 1 mM BSA al MgCl²1 mM 1 mM BSA al al 0,1 % 40 U/ml de benzonase -0,1 % 40 U/ml BSA al 0,1 % 0,1 % 40 U/ml de benzonase - 20 h 20 h de benzonase - 40 U/ml de de benzonase - a 37 °C

20 h a 37 °C benzonase - 20 h 20 h a 37 °C

a 37 °C

Continuación Tris 50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM Tris 50 mM triton al Tris 50 mM de la triton al 1 % - 1 h triton al 1 % - 1 h triton al 1 % - 1 h 1 % - 1 h Tris 50 mM MgCl²5 mM extracción y el Tris 50 mM PBS Tris 50 mM PBS Tris 50 mM PBS * Segunda etapa de triton al 1 % pH lavado celular x3 Ddw x3 x3 Ddw x3 x3 Ddw x3 extracción de grasa: 7,4 - 2 h x2 Deshidratación NaCl 1 M Acetona x340:60 de EDTA 20 mM acetona:hexano 24 h triton al 0,2 % Rehidratación PBS pH 7,0 - 1 h x3 Ddw x3 Ddw x4 (continuación)

Liofilización Congelación a - Congelación a - Congelación a - Congelación a X

20 °C Liofilización 20 °C Liofilización 20 °C -20 °C Liofilización

Liofilización

El primer protocolo se desarrolló para maximizar la eliminación de componentes celulares sin considerar la conservación de la MEC y, por lo tanto, fue el más agresivo. El protocolo combinó enfoques mecánicos, físicos, químicos y biológicos para la descelularización. El protocolo 2 se diseñó para reducir los daños a la MEC obtenidos por el protocolo 1. Constituyó las mismas etapas del protocolo 1, sin embargo, varias de las etapas fueron menos agresivas. Por ejemplo, la etapa de digestión con tripsina fue más corto y la etapa de extracción de grasa se realizó con isopropanol, que es menos reactivo que la acetona usada en el protocolo 1. Los protocolos 3 y 4 se basaron principalmente en detergente y presión osmótica para la descelularización a fin de reducir aún más los daños a la MEC, y se diferencian entre sí por la etapa de extracción de grasa. Para la etapa de extracción de grasa en el protocolo 4, se añadió el uso del disolvente a-polar hexano para disolver también los lípidos a-polares en el tejido, mientras que en el protocolo 3 solo se usó el disolvente polar acetona. Finalmente, en el protocolo 5, la descelularización comenzó con la extracción de grasa seguida de la degradación de ácido nucleico y una breve exposición a un entorno hipertónico y detergente iónico que estaba destinado a romper las membranas celulares.

Estructura macroscópica

El efecto macroscópico de los diferentes protocolos se muestra en las figuras 10A-C. El protocolo 1, que implicó 3 ciclos de congelación y descongelación y una larga digestión con proteasa, condujo a la interrupción de la macroestructura epiploica (figura 10A). El protocolo 2 involucró solo un ciclo de congelación y descongelación y 1 h de digestión con proteasa. Como se muestra, este protocolo dio como resultado una macroestructura menos interrumpida. El protocolo 3 implicó un tratamiento hipotónico más prolongado y el uso del tensioactivo aniónico SDS, que lisa las células. Como se muestra en la figura 10A, se conservó la estructura natural y se pudo detectar fácilmente la infraestructura de los vasos sanguíneos. Sin embargo, todavía se podía observar tejido graso alrededor de los vasos sanguíneos. Para eliminar eficazmente la grasa de los tejidos, se añadió hexano, un disolvente a-polar (protocolo 4). Como se muestra, la adición de esta etapa dio como resultado una mejor eliminación del tejido graso. Las etapas de extracción de células en el protocolo 5 se basaron principalmente en el uso del detergente no iónico Triton X-100 y una breve exposición al entorno hipertónico que provoca la lisis celular debido al flujo de agua. La estructura obtenida se parecía a la estructura del tejido nativo. Sin embargo, el color amarillo del tejido sugería la existencia de componentes celulares al final del proceso.

Extracción de lípidos: Otra indicación de la eficacia de la extracción de grasa fue la detección visual de los lípidos que se extraen de los tejidos después de la digestión enzimática (figura 10B). Como se muestra en la figura 10B, no se detectó una fase lipídica en los tejidos que se procesaron mediante los protocolos 1, 4 y 5. Como era de esperar, dado que el tejido se trató solo con acetona para la extracción de grasa, los lípidos a-polares no se disolvieron y se detectó un alto contenido lipídico en el tejido que se procesó mediante el protocolo 3. Además, se encontró un contenido de lípidos relativamente alto después de tratar el tejido con el protocolo 2, lo que indica que la combinación de acetona y hexano (protocolos 1,4, 5) es más eficiente que el uso de isopropanol y hexano (protocolo 2). Esa observación puede atribuirse al hecho de que el grupo cetona en la acetona es más reactivo que el hidroxilo en el isopropanol.

Reducción de masa: A continuación, los presentes inventores intentaron evaluar la eficiencia del proceso de descelularización mediante la reducción de masa tisular. Como se muestra en la figura 10C, todos los protocolos de descelularización produjeron una reducción significativa en la masa tisular, que se produjo después de la etapa de agotamiento de grasa. Los protocolos 1, 2 y 5 combinaron el uso de un disolvente polar (es decir, acetona o isopropanol) con el disolvente a-polar hexano. Los porcentajes de las masas húmedas restantes después de la etapa de agotamiento de grasa para estos protocolos fueron 37,4 ± 2,6, 35,8 ± 2,5 y 36,0 ± 0,32 de la masa inicial, respectivamente. La primera etapa de extracción de grasa en los protocolos 3 y 4 se realizó solo con acetona, por lo tanto, los lípidos a-polares no se disolvieron y los porcentajes de masa restantes fueron 58,9 ± 7,7 y 55,3 ± 8,7, respectivamente. El segundo proceso de extracción de grasa en el protocolo 4 involucró hexano y, por lo tanto, dio como resultado una extracción eficiente de los lípidos restantes y una reducción adicional de la masa húmeda del 36,8 % del peso inicial. Sin embargo, en el protocolo 3, las últimas etapas de descelularización (tratamientos con detergente y digestión nucleica por nucleasa) han producido una reducción de solo el 12,7 % en la masa húmeda. En los protocolos 1, 2 y 4, las etapas posteriores a la extracción de grasa produjeron una reducción de masa significativa adicional, lo que indica que se han eliminado más componentes de los tejidos. La falta de reducción de masa en el protocolo 5 indicó que los procesos que siguieron a la etapa de extracción de grasa (procesamiento Triton X-100 y un tratamiento hipertónico corto) tuvieron una contribución mínima al proceso de descelularización.

Al investigar las masas secas de los tejidos procesados, se esperaba obtener porcentajes similares de reducción de masa en comparación con la pérdida de masa húmeda. Sin embargo, las evaluaciones de masa seca revelaron que todos los protocolos indujeron una mayor reducción de masa que la pérdida de masa húmeda observada. Este fenómeno se puede atribuir al aumento de la absorción de agua de los tejidos procesados. Las masas húmedas restantes después de tratar los tejidos con los protocolos 1-5 fueron 19,83 ± 1,37, 16,91 ± 0,73, 46,19 ± 2,29, 18,5 ± 1,5 y 35,15 ± 1,22. Sin embargo, como se muestra en la figura 10D, las masas secas restantes después de tratar los tejidos con los protocolos 1-5 fueron solo del 2,74 % ± 0,19, 4,75 % ± 0,21, 13,08 % ± 0,649, 5,28 % ± 0,43 y 4,74 ± 0,164, respectivamente. Curiosamente, los resultados revelaron que el protocolo 1 dio como resultado una mayor reducción de masa seca que los protocolos 2 y 4, aunque la reducción de masa húmeda de estos protocolos fue similar. Esa observación indicó que el protocolo 1 ha eliminado más componentes del tejido, dando como resultado al mismo tiempo una matriz que absorbe más agua.

La relación entre la masa húmeda y la masa seca de la estructura indicó su capacidad para absorber agua. Como se muestra en la figura 10E, todos los protocolos dieron como resultado un aumento de la absorbancia de agua en comparación con el tejido nativo, sin embargo, se encontró una absorción significativamente mayor después de tratar los tejidos con los protocolos 1 y 5. Esto se puede atribuir a una disminución de los componentes hidrófobos, tales como los lípidos y un aumento en la concentración de componentes de MEC que absorben agua, tales como GAG y colágenos.

Eliminación celular

Se evaluó la eficacia de la eliminación de células y ácidos nucleicos. Las matrices descelularizadas se tiñeron para ácidos nucleicos con Hoechst 33258 o núcleos y citoplasma con H&E (figuras 11A y 11B, respectivamente). Asimismo, se cuantificó el ADN residual en las matrices (figura 11C). Como se muestra en la figura 11A, se detectó una tinción con Hoechst insignificante después de procesar los tejidos con los protocolos 1, 3 y 4. El tratamiento de los tejidos con los protocolos 2 y 5 no dio como resultado núcleos intactos; sin embargo, los ácidos nucleicos no se eliminaron de manera eficiente, lo que indica que las nucleasas no pudieron acceder de manera eficiente a las células.

Como se muestra en la figura 11C, la cuantificación de ADN residual reveló una reducción significativa en el ADN por todos los protocolos (menos de 100 ng de ADN por mg de tejido seco). Los protocolos 1-3 dieron como resultado menos de 50 ng de ADN por mg de tejido seco, lo que puede considerarse como estructuras completamente descelularizadas. Los protocolos 4 y 5 dieron como resultado un mayor contenido de ADN. La comparación de los resultados de tinción de las estructuras que se obtuvieron con los protocolos 4 y 5 sugiere que el ADN restante probablemente se degradó más en el protocolo 4 que el ADN que quedó en el protocolo 5 y, por lo tanto, no se pudo detectar con el microscopio.

Por consiguiente, la tinción con H&E reveló la presencia de células y núcleos en la matriz procesada por el protocolo 5, lo que respalda aún más la suposición de que el ADN no se degradó eficientemente por ese protocolo. La tinción con H&E de las matrices procesadas por los protocolos 1-4 no reveló residuos celulares.

Los cortes histológicos también revelaron diferencias en las morfologías de los tejidos procesados. La morfología del tejido adiposo nativo se asemeja a una estructura de panal debido a los grandes adipocitos cargados de grasa. En todos los tejidos procesados que se sometieron a extracción de grasa con disolventes apolares y polares (es decir, protocolos 1, 2, 4 y 5), la ausencia de lípidos dio como resultado cambios morfológicos. El hecho de que la estructura de la matriz obtenida por el protocolo 3 sea todavía similar a la del tejido nativo respalda aún más la afirmación de que un disolvente polar por sí solo no es suficiente para la eliminación de grasa. El examen de las morfologías obtenidas por los protocolos 1, 2 y 4 reveló que el protocolo 1 era de hecho más destructivo para la MEC que el protocolo 2. Esa observación sugiere que una digestión más corta con tripsina o menos ciclos de congelación y descongelación son menos perjudiciales para la MEC. Además, ambos protocolos provocaron más daños en la ^mE^cque el protocolo 4. Esto sugiere que un tratamiento que incluye congelación y descongelación y digestión con tripsina es más perjudicial para la MEC que la descelularización con tonicidad y detergentes suaves.

Contenido de GAG: Los GAG son polisacáridos largos no ramificados que son componentes principales de la MEC. Los GAG tienen numerosas actividades biológicas, concretamente, promueven la adhesión celular, controlan y regulan el crecimiento celular e inducen la proliferación. La alta carga negativa de los GAG sulfatados promueve interacciones electrostáticas con muchos factores de crecimiento y citocinas, proporcionando su conservación y liberación controlada en el microambiente celular. Por lo tanto, la conservación del contenido de GAG dentro de la matriz puede ser beneficiosa para diseñar tejidos complejos. Para evaluar cualitativamente el contenido de GAG al final del proceso de descelularización, se usó la tinción con azul alcián. La figura 12A reveló que todos los tratamientos conservaron los GAG hasta cierto punto, sin embargo, se detectó una tinción masiva con azul alcián después de procesar el tejido con el protocolo 5. Esa observación sugiere que la extracción de grasa con hexano y acetona seguida del tratamiento con nucleasas y detergentes suaves y tratamientos hipertónicos condujo a menos daño a los GAG que las demás etapas de extracción celular, tales como la digestión con tripsina, la agitación continua en detergentes o la congelación y descongelación. Sin embargo, estos procesos dieron como resultado una eliminación celular más eficiente. En general, se observó que los GAG estaban mejor conservados por los procesos que no implicaban la digestión con tripsina (es decir, los protocolos 3-5). Se encontró que las etapas de eliminación celular y extracción de lípidos condensaron los tejidos descelularizados. Por lo tanto, los tejidos procesados exhibieron una tinción más fuerte en comparación con el epiplón nativo.

A continuación, los presentes inventores intentaron cuantificar los GAG sulfatados restantes (figura 12B). Usando el ensayo Blyscan, se encontró que antes de la descelularización, el tejido nativo contenía 0,59 |jg ± 0,13 GAG sulfatados por mg de tejido seco. Como resultado de la descelularización y la extracción de grasa, aumentó el contenido de MEC por mg de tejido. En consecuencia, el contenido de GAG sulfatados en los tejidos procesados fue mayor que en el tejido nativo. La figura 12B reveló la cantidad de GAG sulfatados por mg después del procesamiento por los protocolos 1-5. La cantidad de GAG sulfatados por mg de tejido seco en la matriz obtenida por el protocolo 3 fue significativamente menor que en la matriz obtenida por el protocolo 4 debido al alto contenido de lípidos, que diluyó otros componentes de la MEC. El contenido de GAG sulfatados en los protocolos 4 y 5 fue significativamente más alto que en los protocolos 1 y 2. En general, estos resultados pueden sugerir que la combinación de detergentes y tonicidad es menos destructiva para los GAG en la MEC en comparación con la digestión con tripsina y la congelación y descongelación.

Morfología de la matriz: La morfología interna de la matriz puede dictar el crecimiento y ensamblaje del tejido diseñado. Por lo tanto, los presentes inventores intentaron a continuación evaluar la morfología de las matrices mediante SEM. Como se muestra en las figuras 13A-C, los diferentes procesos de descelularización dieron como resultado una morfología de matriz distinta. La matriz obtenida por el protocolo 1 tenía un diámetro de fibras promedio relativamente pequeño (1,1 jm ± 0,087), y el área media de poros de esa matriz fue significativamente la más grande (975,6 jm 2 ± 112,5, P<0,05). Mientras que los protocolos 2-4 dieron como resultado un diámetro de fibra promedio en el mismo intervalo, el protocolo 5 dio como resultado fibras de diámetro significativamente mayor (2,464 jm ± 0,104: P<0,0005). Dado que no todos los componentes celulares se eliminaron de manera eficiente mediante el protocolo 5, los poros obtenidos fueron más pequeños (389,6 jm 2 ± 41,63). Los protocolos 2 y 3 han producido matrices con dos regiones, similares al tejido nativo. Debido a la mala eliminación de grasa, la zona grasa estaba cubierta de lípidos y, por lo tanto, no era porosa; sin embargo, el área translúcida era más fibrosa y, por lo tanto, tenía más espacio abierto. En general, el área media de poros de las matrices obtenidas mediante los protocolos 2 y 3 fue relativamente pequeña (184,3 jm 2 ± 22,14 y 260,3 jm 2 ± 68,6, P<0,05, respectivamente). La matriz obtenida con el protocolo 4 tenía un área de poros de 619,1 jm 2 ± 107,2, significativamente mayor que el área de poros obtenida con los protocolos 2 y 3. En general, el tamaño de poro promedio fue significativamente menor que los valores obtenidos con el protocolo 1.

Todas las matrices descelularizadas exhibieron un diámetro de fibra de aproximadamente 1-2 jm , similar al de las fibras de colágeno que abundan en la MEC del epiplón. Los Protocolos 1,4 y 5 dieron como resultado estructuras con poros grandes y, por lo tanto, pueden ser más apropiados para la ingeniería tisular.

Adhesión y viabilidad celular: Las interacciones célula-matriz son esenciales para diseñar tejidos homogéneos. A continuación, los presentes inventores intentaron evaluar la capacidad de las células para adherirse a las diferentes estructuras. Las células NIH 3T3 se mezclaron con medio de cultivo y se sembraron en las estructuras con una sola gota. Tres horas después de la siembra (definida como el día 0), las construcciones celulares se lavaron cuidadosamente y se evaluó la existencia de células viables en las estructuras usando el ensayo metabólico XTT. Como se muestra en la figura 14, se detectó un número significativamente mayor de células viables dentro de las estructuras obtenidas por el protocolo 1 en comparación con las estructuras obtenidas por todos los demás protocolos. Se detectaron muy pocas células viables en las estructuras obtenidas por el protocolo 5. Esto puede atribuirse al proceso de descelularización ineficiente y a la existencia de materiales celulares tóxicos que quedan dentro de la estructura.

A continuación, los presentes inventores evaluaron la proliferación de fibroblastos que expresan EGFP en las diferentes estructuras. La figura 15A muestra imágenes de fluorescencia de fibroblastos en las diferentes estructuras el día 2 (panel superior) y el día 8 (panel inferior). Como se muestra, se observaron concentraciones de células más altas en las estructuras obtenidas por los protocolos 1, 2 y 4, en comparación con las estructuras preparadas por los protocolos 3 y 5. Para cuantificar el crecimiento celular durante el período de cultivo, se usó el ensayo XTT. Se observó un aumento significativo el día 8 en la D.O. promedio a 450 nm en las estructuras obtenidas por los protocolos 1, 2 y 4, mientras que se observó una tasa de expansión limitada en las estructuras obtenidas por los protocolos 3 y 5 (figura 15B). Aunque se observó una D.O. similar el día 8 en los protocolos 1, 2 y 4, considerando el bajo número inicial de células adheridas en el protocolo 4, la tasa de proliferación en estas estructuras fue mayor que la de las estructuras obtenidas por los protocolos 1 y 2. De manera similar, la tasa de proliferación limitada observada en las estructuras obtenidas por el protocolo 5 puede atribuirse a la inferior fijación celular inicial. Por lo tanto, se concluyó que las estructuras obtenidas por el protocolo 5 no son apropiadas para la ingeniería tisular. La alta absorbancia de agua de las estructuras obtenidas por el protocolo 1 probablemente esté relacionada con la alta capacidad de fijación celular. Debido a la alta adhesión observada, estas estructuras pueden ser adecuadas para el cultivo de células con potencial de proliferación limitado o nulo, tales como los cardiomiocitos.

Organización celular y ensamblaje tisular: A continuación, los presentes inventores intentaron evaluar el potencial de las matrices descelularizadas para servir como estructuras que dirigen el ensamblaje funcional de los tejidos cardíacos. En la ingeniería tisular cardíaca, un material de andamiaje óptimo debe promover el alargamiento y la alineación de las células cultivadas y dirigir su organización a parches cardíacos funcionales que generen fuertes fuerzas de contracción. Para evaluar la organización de células cardíacas dentro de las estructuras, se aislaron células de ventrículos de ratas recién nacidas y se sembraron en las diferentes matrices como se describe. La inmunotinción de cardiomiocitos con anticuerpos contra la actinina sarcomérica reveló distintas morfologías dentro de las diferentes estructuras. Mientras que los protocolos de descelularización 3-5 dieron como resultado células redondeadas con estriación de actinina limitada, las células sembradas dentro de las estructuras obtenidas por los protocolos 1 y 2 mostraron una morfología alargada. Asimismo, en estos cultivos se observó una expresión masiva y organizada de actinina. El análisis del alargamiento de los cardiomiocitos reveló una relación de aspecto significativamente mayor en las células cultivadas en matrices obtenidas por los protocolos 1 y 2 en comparación con las matrices obtenidas por los protocolos 3-5 (figura 16B). Una relación de aspecto más alta puede conducir a una contracción anisotrópica de los parches cardíacos.

Conclusiones

En este caso, los presentes inventores han optimizado el proceso de descelularización evaluando la eficiencia de eliminación celular, el contenido bioquímico y la morfología de la matriz. También evaluaron el efecto de los diferentes parámetros sobre la viabilidad y proliferación de las células sembradas, y sobre el ensamblaje de los tejidos cardíacos. Se demostró que varios de los protocolos de descelularización investigados no eran eficientes. Por ejemplo, el uso de acetona para la eliminación de grasa no es suficiente por sí solo (protocolo 3), y una breve exposición a tensión hipertónica y detergentes suaves para la eliminación celular no es eficaz en absoluto (protocolo 5). Se puede concluir que el procesamiento agresivo del epiplón, tal como la digestión con tripsina y la congelación y descongelación dan como resultado una matriz acelular completa que es compatible para el cultivo celular y el ensamblaje tisular. No obstante, los tejidos que se procesaron en condiciones más suaves, tales como detergentes y presión osmótica, dieron como resultado estructuras que se parecían más al tejido nativo, lo que indica que muchos componentes de la MEC estaban intactos. Asimismo, todos los lípidos deben extraerse del tejido para inducir la fijación celular, mantener la viabilidad celular y promover el ensamblaje adecuado de las células en los tejidos.

EJEMPLO 3

1. Descelularización de epiplón para preparación de matriz

Se adquirieron epiplones de cerdos sanos de seis meses en el instituto de investigación animal en Kibutz Lahav, Israel. El epiplón se trató con el siguiente protocolo de descelularización que implica ruptura mecánica, extracción con disolvente polar y digestión enzimática. Todas las acciones siguientes se realizaron con agitación constante a temperatura ambiente, a menos que se describa lo contrario.

El epiplón congelado (-20 °C) se calentó lentamente a temperatura ambiente y se cortó en cuatro trozos. Para separar las células, los tejidos se transfirieron a una solución de tampón hipotónico que contenía base Tris 10 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 pM a pH 8,0 dos veces durante una hora y a continuación durante una noche. Al día siguiente, los tejidos se aclararon en etanol al 70 % durante 30 min y dos veces en etanol al 100 % (30 min cada vez), a continuación, los lípidos polares del tejido se extrajeron mediante tres lavados de 30 minutos con acetona al 100 %. En las siguientes 24 horas, los lípidos a-polares se extrajeron mediante incubación en una solución 60:40 de hexano:acetona (con 3 cambios), seguido de un aclarado con etanol al 100 % durante 30 min. Posteriormente, las muestras se colocaron en etanol al 70 % durante una noche a 4 °C. A la mañana siguiente, después de 10 min de agitación con etanol, los tejidos se trataron de nuevo con el tampón hipotónico de base Tris 10 mM y EDTA 5 mM durante 2 horas (dos veces durante 1 hora), seguido de 16 horas en SDS al 0,5 %. A continuación, los tejidos se lavaron minuciosamente dos veces con PBS durante 30 min y a continuación se colocaron durante 30 min en una solución de Tris 50 mM-MgCb 1 mM a pH 8,0. A continuación, los tejidos se agitaron suavemente en una solución de degradación nucleica de Tris 50 mM, MgCb 1 mM, BSA al 0,1 % y 40 unidades/ml de nucleasa Benzonase® a pH 8,0 durante 20 horas a 37 °C. Finalmente, los tejidos se lavaron dos veces con Tris 50 mM a pH 8,0 (30 min cada vez), una vez con etanol al 70 % durante 10-15 min y tres veces con agua bidestilada estéril antes de la congelación durante una noche.

Al final del proceso de descelularización, el material celular se eliminó de manera eficaz, produciendo una MEC de epiplón de color blanco y translúcida (figura 17C). A continuación, la MEC de epiplón se liofilizó y se molió hasta obtener un polvo (figura 17D), y finalmente se solubilizó con digestión enzimática (figura 18A).

2. Preparación de MEC de epiplón solubilizada

El epiplón descelularizado se liofilizó, se molió en un polvo grueso con un molino básico IKA Analytical A-11 y a continuación se congeló hasta su uso posterior. Se digirió enzimáticamente una matriz de epiplón molida y seca añadiendo una solución de 1 mg/ml de pepsina en HCl 0,1 M de manera que la concentración final de matriz varió entre 10 y 20 mg/ml. La matriz de epiplón se digirió durante 64-72 horas a temperatura ambiente con agitación constante hasta que el líquido fue homogéneo sin partículas visibles. Posteriormente, el pH se elevó por encima de 7 usando NaOH 5 M y la concentración de sal se ajustó usando PBSx10. Para inducir la gelificación in vitro, la matriz de epiplón neutralizada y solubilizada se calentó a 37 °C en una incubadora humidificada con CO²al 5 %.

La gelificación del biomaterial de epiplón primero se confirmó en condiciones fisiológicas de pH 7,4, 1,0 x PBS y 37 °C. La matriz extracelular permaneció como un líquido viscoso después de la neutralización a pH 7,4 mientras se mantuvo a 4 °C o TA (figura 18A). Después de llevar la MEC líquida a 37 °C para inducir la gelificación, se creó un gel. La gelificación se confirmó por observación y mantenimiento de la forma del molde (figura 18B).

3. Caracterización de la composición del gel:

3.1 Análisis de glucosaminoglucanos (GAG) usando blyscan

El contenido de GAG por muestra se determinó usando el kit de ensayo de glucosaminoglucanos sulfatados (Biocolor Ltd.) Primero, las muestras de MEC de epiplón (10-20 mg) se digirieron durante 3 h a 65 °C en papaína (7,14 |jg ml-1) en tampón de fosfato de sodio 0,2 M, acetato de sodio 0,1 M, Na²EDTA 0,01 M, cistina HCl 0,005 M, pH 6,4. Una vez fundidas, las muestras digeridas se centrifugaron durante 10 minutos y el sobrenadante se analizó siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 j l de hidrogel digerido a 1 ml de reactivo colorante Blyscan. La solución se mezcló y se centrifugó. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se suspendió en 0,5 ml de reactivo de disociación. Se añadieron 200 j l de esta solución a cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 656 nm. Se usó el estándar de GAG (Biocolor Ltd, Reino Unido) para crear una curva estándar a partir de la cual se podrían calcular los valores de GAG para cada hidrogel.

La concentración total de GAG para la matriz de epiplón digerida con pepsina fue de 2,27 ± 0,5 jg/mg de polvo de epiplón liofilizado seco (media ± D.E.).

3.2 Histología

Se dejó gelificar una muestra del pregel de epiplón líquido durante 3 horas antes de congelarla. Se obtuvieron secciones de 7-10 jm y se fijaron a portaobjetos de vidrio (Lcica Biosystems). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para confirmar la descelularización.

Los resultados del análisis histológico se pueden ver en la figura 19.

3.3. Cinética de gelificación turbidimétrica

La cinética de gelificación turbidimétrica se determinó usando mediciones espectrofotométricas. Se añadió una solución de pregel de MEC de epiplón líquido a diferentes concentraciones (10 y 15 mg/ml) a placas de 48 pocillos y se leyó espectrofotométricamente en un lector de placas precalentado a 37 °C. Las muestras se mantuvieron en hielo hasta su colocación en el espectrofotómetro. Se midió la absorbancia a 405 nm cada 1 min durante 3 horas hasta que los datos alcanzaron la meseta. Los valores de absorbancia se promediaron dentro de cada grupo, se normalizaron y se trazaron a lo largo del tiempo, como se ilustra en la figura 20.

Ambas concentraciones de hidrogel han alcanzado una meseta de absorbancia en 3 horas. El hidrogel al 15 % de concentración alcanzó la meseta más rápido que el hidrogel al 10 %.

3.4 Reología: Módulo de almacenamiento, módulo de pérdida

La formación de hidrogel de MEC de epiplón se estudió usando reometría oscilatoria que mide el los módulos de almacenamiento (G') y de pérdida (G'') del material en función de la tensión de cizallamiento. Los métodos reológicos se han empleado a menudo para estudiar el comportamiento viscoelástico de materiales y G' se usa comúnmente como una indicación de la rigidez de un material viscoelástico dado.

Las mediciones reológicas de hidrogeles se realizaron usando un reómetro híbrido Discovery HR-2 de control de tensión. El gel preformado (24 h a 37 °C) se cortó usando hidrogeles de 8 mm y se sometió a una tensión de cizallamiento constante del 0,63 % a un intervalo de barrido de frecuencia de 0,04-16 Hz. La viscosidad compleja en la región lineal (de 0,04 hasta aproximadamente 5 Hz) se promedió para cada grupo y se trazó (figura 21).

Se realizó un experimento adicional para medir el módulo elástico (G') y de pérdida (G'') a lo largo del tiempo mientras la solución de pregel alcanzaba una meseta debido a la gelificación (figura 22A-E). Las soluciones de pregel se colocaron desde hielo a 37 °C. Se aplicó una capa de aceite mineral durante el experimento para evitar la evaporación. El experimento se realizó al 5 % de deformación y 1 Hz.

El módulo elástico en ambos grupos de concentración fue mayor que el módulo de pérdida en todos los puntos temporales medidos, incluso al principio y al final de la gelificación, lo que sugiere que incluso la solución de pregel es un gel blando. El módulo elástico y de pérdida fueron mayores en todos los puntos temporales para los hidrogeles al 15 % de concentración.

3.5. Aumento de peso seco

Se formaron muestras de hidrogel al 15 % de concentración usando moldes de 25 x 20 mm durante 24 h a 37 °C. A continuación, el hidrogel se cortó en discos de 8 mm y se dejó hinchar en PBS durante 0,5 y 72 h. A continuación, se extrajeron las muestras y se secaron cuidadosamente para eliminar el exceso de líquido superficial. Se midió el peso total hinchado (W^s). A continuación, las muestras se congelaron y se secaron usando un liofilizador. Se midió el peso seco total (W^d). Finalmente, el aumento de las relaciones en peso se calculó como:

relación en peso seco = w^ Wj Ec. (1) Después de 0,5 h, el peso seco de los hidrogeles hinchados aumentó en un 50,97 ± 3 %. No se observaron diferencias significativas en la relación en peso seco después de 0,5 y 72 h; véase la figura 23.

3.6. Microscopía electrónica de barrido

Se usó microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la topografía superficial del hidrogel. Los hidrogeles formados se congelaron (-80 °C), se liofilizaron y se recubrieron por pulverización con oro antes de observarlos con un microscopio electrónico de barrido (Jeol JSM840A). Las imágenes se ilustran en las figuras 24A-B.

3. 7. Análisis estadístico

Todos los valores se informan como media ± desviación estándar. Las diferencias univariadas entre los grupos se evaluarán mediante la prueba de la t de Student. Todos los análisis se realizarán con GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software). p<0,05 se considerará significativo.

3.8. Componentes proteicos del hidrogel

El tamaño de las proteínas y los péptidos en el hidrogel se determinó mediante electroforesis de proteínas (SDS-PAGE, gel de acrilamida al 12 %). Se detectaron proteínas y péptidos entre 250-130 kDa, 230-100 kDa, 100-70 kDa, 70-55 kDa, 55-35 kDa, 35-25 kDa, 25-15 kDa y menores de 15 kDa, como se ilustra en la figura 25.

3.9. Tamaño de poro

Se determinó el tamaño de poro en el hidrogel usando un microscopio electrónico de barrido. El diámetro de poro fue de aproximadamente entre 10-180 pm, con tamaños de poro de aproximadamente entre 70-18000 pm². En las figuras 24A-B se ilustra una imagen de ejemplo del hidrogel.

3.9. Biocompatibilidad

La biocompatibilidad del hidrogel se determinó usando el ensayo de viabilidad celular PrestoBlue (Molecular Probes, Invitrogen). La solución de prehidrogel se dejó durante 1,5 h en una incubadora de células humidificada para que solidificara. A continuación, se sembraron células de fibroblastos 3T3 en los hidrogeles establecidos. La viabilidad celular se mantuvo durante los días 3 y 7 como se ilustra en la figura 26.

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia. Por consiguiente, se pretende que abarque la totalidad de tales alternativas, modificaciones y variaciones que quedan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de materia para su uso en la regeneración tisular, en donde la composición de materia es líquida a temperatura ambiente y es capaz de formar un gel a 37 °C, en donde la composición de materia comprende epiplón descelularizado, liofilizado y solubilizado.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho epiplón descelularizado y solubilizado se genera mediante un método que comprende:

(a) exponer el epiplón a una solución hipotónica;

(b) deshidratar dicho epiplón después de la etapa (a);

(c) extraer grasa del epiplón deshidratado usando acetona y hexano después de la etapa (b);

(d) rehidratar el epiplón deshidratado siguiendo la etapa (c);

(e) extraer células de dicho epiplón rehidratado después de la etapa (d), para generar epiplón descelularizado que comprende menos de 50 ng de ADN por mg de epiplón seco, con un diámetro medio de fibra de al menos 1 pm, en donde la porosidad de dicho epiplón descelularizado es de al menos el 50 %;

3. La composición de la reivindicación 2, en donde dicho método comprende además moler dicho epiplón descelularizado y liofilizado hasta obtener un polvo antes de la etapa (g).