JP2024506954A - ワクチン作製用の遺伝子改変細菌 - Google Patents

Abstract

少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された腫瘍ホーミング細菌と、薬学的に許容される担体とを含むワクチンが開示される。それらの用途も開示される。【選択図】 図８－２

Description

関連出願
本出願は、２０２１年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５０，６８１号の優先権を主張し、その内容のすべてを本参照により本願に援用する。

配列表に関する陳述
本出願の出願と同時に提出された、２０２２年２月１５日付作成の「９１２４８ ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題された５６７，４５８バイトのＡＳＣＩＩファイルを本参照により本願に援用する。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、疾患関連抗原を含むように操作され得る細菌ワクチンに関する。

分子生物学、次世代シーケンシング及び予測アルゴリズムによって免疫原性ネオアンチゲンを予測する能力、病原性細菌の生活様式、細菌工学、並びに合成生物学ツールの理解における進歩は、抗原運搬ベクターとしての細菌の合理的設計を著しく加速した。強力な免疫原であるため、細菌は、自身に対する、ひいては運搬したネオアンチゲンに対する、非常に大規模な免疫応答を誘発し得る。実際に、抗原情報（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍｅｓｓａｇｅｓ）を運搬する細菌ベクターは、リポ多糖類、リポタンパク質、フラジェリン、及びＣｐＧなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）によって介在される強力な危険シグナルを送達することもできる。異なるクラスの病原体に由来するＰＡＭＰは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン様受容体（ＣＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子（ＲＩＧ）様受容体（ＲＬＲ）、及びヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）を含む、病原体認識受容体（ＰＲＲ）の多様なファミリーに結合する。それぞれの病原体によるこれらの相互作用は、異なるシグナル伝達経路を活性化して抗原提示細胞（ＡＰＣ）を差次的に活性化し、微生物によって、ひいては細菌によって運搬される抗原に対して特異的に適応させる様式で適応的なエフェクター応答を指示する。さらに、細菌が自身の病原性のために使用する固有の毒素は、エフェクター応答又は記憶応答を強化することができる。

背景技術としては、米国特許出願第２０２０００８７７０３号明細書、同第２０２０００５４７３９号明細書、及び同第２０１９０３６５８３０号明細書、Gopalakrishnan V et al, Science. 2018 Jan 5; 359(6371): 97-103、Geller et al., Science, Vol 357, Issue 6356 15 September 2017、Riquelme E et al Cell. 2019 Aug 8;178(4):795-806.e12. doi: 10.1016/j.cell.2019.07.008、Straussman R et al., Nature. 2012 Jul 26;487(7408):500-4. doi: 10.1038/nature11183が挙げられる。

本発明の一態様によると、少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された腫瘍ホーミング細菌と、薬学的に許容される担体とを含むワクチンが提供される。

本発明の一態様によると、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の、請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチンを投与し、がんを治療する方法が提供される。

本発明の一態様によると、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の下記成分（ｉ）を投与し、続いて下記成分（ｉｉ）を投与し、がんを治療する方法が提供される。
（ｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第１の細菌を含む第１のワクチン、及び
（ｉｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第２の細菌を含む第２のワクチン。

本発明の一態様によれば、がんを治療する必要がある対象において、がんを治療する方法であって、治療有効量の本願に記載のワクチンを対象に投与してがんを治療することを含む方法が提供される。

本発明の実施形態によれば、細菌はグラム陽性細菌である。

本発明の実施形態によれば、細菌はグラム陰性細菌である。

本発明の実施形態によれば、細菌は好気性である。

本発明の実施形態によれば、細菌は、嫌気性である。

本発明の実施形態によれば、細菌は生細菌である。

本発明の実施形態によれば、細菌は弱毒化細菌である。

本発明の実施形態によれば、細菌は、表１～表３のいずれかに記載の種又は属の細菌である。

本発明の実施形態によれば、細菌のゲノムは、配列番号２４～３１０のいずれか１つに記載の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含む。

本発明の実施形態によれば、がん関連抗原はネオアンチゲンである。

本発明の実施形態によれば、細菌は、治療用タンパク質を発現するように遺伝子改変されたものである。

本発明の実施形態によれば、治療用タンパク質はサイトカインである。

本発明の実施形態によれば、ワクチンはアルミニウム塩を不含有である。

本発明の実施形態によれば、担体はアジュバントを不含有である。

本発明の実施形態によると、第１の細菌は生細菌であり、第２の細菌は死細菌である。

本発明の実施形態によると、第１の細菌はがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第１の細菌株を含み、第２の細菌は第１の細菌株と非同一な第２の細菌株を含み、第２の細菌はがん関連抗原を発現するように遺伝子改変されている。

本発明の実施形態によれば、がんは、乳がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、骨がん、及び脳がんからなる群から選択される。

本発明の実施形態によれば、脳がんは膠芽腫を含む。

本発明の実施形態によると、第１のワクチンの少なくとも１種のがん関連抗原は、第２のワクチンの少なくとも１種のがん関連抗原と同一である。

本発明の実施形態によると、第１のワクチンの少なくとも１種のがん関連抗原は、第２のワクチンの少なくとも１種のがん関連抗原と非同一である。

本発明の実施形態によれば、がんは、乳がん、黒色腫、結腸直腸がん胃がん、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、骨がん及び脳がんからなる群から選択される。

本発明の実施形態によれば、脳がんは膠芽腫を含む。

特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本願に記載のものと同様の又は均等な方法及び材料を、本発明の実施形態の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含め、本願特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。

本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本願に記載する。以下、特に図面に詳細に言及するが、示される詳細は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の例証的説明を目的とすることを強調する。この点に関して、図面を用いて説明することで、当業者には、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが明らかとなる。

図１の１Ａ～１Ｂ．Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルに対するＯＶＡ発現細菌によるワクチン接種の長期有効性。（Ａ）実験のタイムライン。（Ｂ）治療開始からの腫瘍増殖曲線。 図２の２Ａ～２Ｇ．Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルに対するＯＶＡ発現細菌によるワクチン接種の短期有効性及び免疫原性。（Ａ）実験のタイムライン。（Ｂ）治療開始からの腫瘍増殖曲線。全マウスコホートにおいてＮ＝５。（Ｃ）０日目に対する１６日目の腫瘍体積のパーセント。Ｐ値は両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で求めた。コホート当たりの完全治癒したマウスのパーセンテージを下に示した。（Ｄ）抗ＰＤ１で、又は抗ＰＤ１と共にＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡで治療したコホートのマウス。ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡで治療したマウスの腫瘍は徐々に消失したが、抗ＰＤ１単独で治療したマウスの腫瘍は指数関数的に増殖を続けた。（Ｅ）腫瘍及び肝臓抽出物のＣＦＵ計数値。ワクチン接種後１６日目に、腫瘍由来及び肝臓由来の細菌をＡＭＰ耐性用のＬＢプレートに植え付けた。各マウスに付き、ＣＦＵ計数値及び腫瘍体積を得た。注目すべきは、ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡコホートの５匹のマウスの内の４匹が細菌の完全なクリアランスを示した。最も大きな腫瘍のマウスには細菌が存在し、腫瘍組織が細菌増殖を可能にすることを示唆している。（Ｆ）マウスコホートの血清をＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡに付した。ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡコホートは、最も高いＩＦＮｇ血清レベルを発揮し、高い全身性免疫活性を示した。緑の点は、Ｆ内のマウス８３６を表す。マウス８３６は細菌が肝臓に存在した唯一のケースであり、おそらくはＩＦＮｇの最も高い血清レベルをもたらした。（Ｇ）フローサイトメトリーによるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）特異的ＴＣＲの定量。ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞クローンを定量するために、脾細胞をＯＶＡネオアンチゲン（ＳＩＩＮＦＥＫＬ－配列番号１１））を提示するテトラマーと共にインキュベートし、蛍光染料に結合させた。よって、テトラマー染料に対して陽性の脾細胞は、ＯＶＡネオアンチゲンに結合可能なＴＣＲを保有する。ＦＡＣＳに続き、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋集団中のＳＩＩＮＦＥＫＥＬ（配列番号１１）陽性Ｔ細胞のパーセンテージは、ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡのワクチン接種を受けたマウス間で最も高かった。Ｐ値は両側Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で得た。 同上 同上 図３の３Ａ～３Ｄ．異なる細菌ワクチンによる交互接種は獲得免疫を克服する。（Ａ）実験のタイムテーブル。（Ｂ）腫瘍増殖曲線。（Ｃ）処置開始後２４日間における体重変化（初期体重に対するパーセンテージ）。マウスコホートは、ＳＴＭ３２１０＋ａＰＤ１（Ｎ＝３）、ＳＴＭ－ｐａｇＣ－ＳｓｐＨ１－ＯＶＡ＋ａＰＤ１（Ｎ＝３）、ＳＴＭ－ＳｓｐＨ２－ＯＶＡ＋ａＰＤ１（Ｎ＝５）である。破線は細菌投与日の境界を定める。（Ｄ）処置開始後４０日間における体重変化（初期体重に対するパーセンテージ）。マウスコホートは、ＳＴＭ３２１０＋ａＰＤ１（Ｎ＝３）、ＳＴＭ－ｐａｇＣ－ＳｓｐＨ１－ＯＶＡ＋ａＰＤ１（Ｎ＝３）、ＳＴＭ－ＳｓｐＨ２－ＯＶＡ＋ａＰＤ１（Ｎ＝５）、ＣＨＡ－ＯＳＴである。破線は細菌投与日の境界を定める。 同上 同上 同上 図４の４Ａ～４Ｂ．Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルに対するＯＶＡ発現細菌によるワクチン接種の免疫記憶。（Ａ）実験のタイムテーブル。（Ｂ）腫瘍増殖曲線。 図５の５Ａ～５Ｃ．ＭＣ３８ ＣＲＣ腫瘍モデルに対するＡｄｐｇｋ発現細菌によるワクチン接種の長期有効性。（Ａ）実験のタイムテーブル。（Ｂ）処置開始からの腫瘍増殖曲線。ここに示されるように、ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋコホートにおいて、他のマウスコホートと比べて有意に腫瘍増殖が阻害された。２サイクルの免疫後に、ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋコホートの１匹のマウスは完全治癒した。（Ｃ）ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋのワクチン接種を受けたマウスの免疫記憶を試験するために、ＰＡＣＫＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ又はＶＮＰ２０００９（ａｄｐｇｋ無し）のワクチン接種後に完全治癒したマウスに対して、１０^５個のＭＣ３８細胞を再度抗原投与し、その腫瘍増殖を同量の細胞を注射したナイーブマウスと比較した。ナイーブマウスは注射の直後に指数関数的な腫瘍の増殖を示したが、ＰＡＣＫＭＡＮ－Ａｄｐｇｋのワクチン接種を行った再抗原接種マウスは、腫瘍が無いままであり、ＭＣ３８細胞に対する長期免疫記憶の確立を示した。注目すべき点は、ＶＮＰ２０００９のみによるワクチン接種後に完全治癒したマウスは、再抗原接種に続いて腫瘍増殖を示し、免疫記憶が細菌によるＡｄｐｇｋ提示の結果に過ぎないことを示した。 同上 図６は、弱毒化（ＳＴＭ３１２０）サルモネラ菌の腫瘍ホーミングを示すグラフである。 図７は、弱毒化（ＳＴＭ３１２０）サルモネラ及び親（１４０２８）サルモネラのｉ．ｖ．投与における毒性を比較して示すグラフである。 図８の８Ａ～８Ｂは、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍モデルに対するＯＶＡ発現細菌によるワクチン接種に続く、脾細胞の免疫プロファイリングを図示するグラフである。８Ａは、ＦＡＣＳによるＩＦＮｇ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の定量。８Ｂは、Ｔ細胞の殺腫瘍能力の定量。 同上 図９の９Ａ～９Ｃは、ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＡｄｐｇｋ発現P. Aeruginosaによるワクチン接種の長期有効性を図示する。９Ａは実験のタイムテーブル。９Ｂは腫瘍増殖曲線。ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫの静脈注射によって処置したマウスは、かなり遅延した腫瘍増殖を示した。処置ごとに完全治癒したマウスの数を示した。９Ｃは、９Ｂのマウスコホートの平均腫瘍増殖曲線である。ひげは標準誤差を示す。 同上 図１０の１０Ａ～１０Ｂは、ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＡｄｐｇｋ発現Bacillus Subtilis胞子によるワクチン接種の長期有効性を図示する。１０Ａは実験のタイムテーブル。１０Ｂは腫瘍増殖曲線。ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫ胞子の経口投与又は静脈注射によって処置したマウスは、かなり遅延した腫瘍増殖を示した。処置ごとに完全治癒したマウスの数を示した。 図１１の１１Ａ～１１Ｂは、ＭＣ３８腫瘍モデルに対するＡｄｐｇｋ発現弱毒化サルモネラ（ＳＴＭ３１２０）によるワクチン接種の長期有効性を図示する。１１Ａは実験のタイムテーブル。１１Ｂは腫瘍増殖曲線。ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫによって処置したマウスは、かなり遅延した腫瘍増殖を示した。処置ごとに完全治癒したマウスの数を示した。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、外表面上に疾患関連抗原を含むように操作され得る細菌ワクチンに関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途は、以下の発明を実施するための形態に示される詳細又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は他の実施形態が可能であり、又はさまざまな方法で実施若しくは実現することが可能である。

抗原又は抗原をコードする核酸をＡＰＣの細胞質ゾルに直接送達する細菌ベクターに基づくインビボ治療用がんワクチンのストラテジーは、それらの使用が容易であることから、学術研究所及び製薬産業において開発されている。典型的には、細菌は、疾患抗原を発現（さらには分泌）するように遺伝子改変される。代替的に、細菌は、疾患抗原をコードするプラスミドｃＤＮＡを免疫系に送達するために使用され得る。

本発明者らは、ここで腫瘍ホーミング細菌を含む新規ワクチンを想到した。細菌は、疾患関連抗原を発現するように遺伝子改変されている。これらワクチンを本願においては、個別化抗がんマイクロバイオーム支援ワクチン接種（Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＶａｃｃｉｎａｔｉｏＮ、ＰＡＣＭＡＮ）と称する。

後述し、続く実施例で説明するように、本発明者らは腫瘍抗原を発現させるための細菌の遺伝的修飾が可能であることを示す。遺伝子改変細菌は以下の２つの目的を果たす： １）標的化用のベヒクルとして腫瘍部位へのホーミング、及び２）アジュバントとして免疫系の促進。

発明者らはSalmonella Typhimurium（図１の１Ａ～１Ｂ、図２の２Ａ～２Ｇ、図３の３Ａ～３Ｄ、図４の４Ａ～４Ｂ、図５の５Ａ～５Ｃ）、P. aeruginosa（図９の９Ａ～９Ｂ）及びB. Subtilis（図１０の１０Ａ～１０Ｃ）を含む数々の異なる細菌を用いた、効果的なワクチン製造を行う能力について説明した。ＯＶＡ（図１の１Ａ～１Ｂ、図２の２Ａ～２Ｇ、図３の３Ａ～３Ｄ、図４の４Ａ～４Ｂ）及びＡＤＰＧＫ（図５の５Ａ～５Ｃ、図９の９Ａ～９Ｂ、図１０の１０Ａ～１０Ｃ及び図１１の１１Ａ～１１Ｂ）を含む種々の腫瘍特異的抗原を発現するように細菌を遺伝子改変した。

本発明を実用化する一方で、本発明者らは異なる細菌性ワクチンの交互投与が獲得免疫を克服できることを示した（図３の３Ａ～３Ｃ参照）。

よって、本発明の一態様によると、少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された腫瘍ホーミング細菌と、薬学的に許容される担体とを含むワクチンが提供される。

本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、投与されると免疫応答、特にがん細胞を認識して攻撃する細胞性免疫応答を誘導する医薬製剤（医薬組成物）を指す。好ましくは、ワクチンは、標的抗原に対する長期免疫記憶の形成をもたらす。本発明のワクチンはまた、好ましくは、薬学的に許容される担体（例えば、細菌を保持する液状組成物）。一実施形態においては、担体は細菌の生存率を維持するものである。

細菌は、グラム陽性細菌でも、グラム陰性細菌でもよく、２種の組み合わせでもよい。

細菌は、好気性細菌でも、嫌気性細菌でもよい。

既に述べたように、細菌は腫瘍部位へホーミング可能である。

他の実施形態においては、腫瘍へのホーミング可能な細菌は、対象の腫瘍マイクロバイオーム内に存在する。

「腫瘍マイクロバイオーム」という用語は、限定的な環境、例えば、ホストの腫瘍内における、微生物（細菌、真菌、原生生物）や、それらの遺伝的成分の全体を意味する。特定の実施形態においては、マイクロバイオームは、限定的な環境、例えば、ホストの腫瘍内における、細菌全体のみを意味する。腫瘍は、原発腫瘍又は二次腫瘍（即ち、転移腫瘍）のいずれでもよい。

乳腺腫瘍のマイクロバイオームに存在することが知られている細菌の例を、本明細書の下記表１に記載する。このような細菌は、乳がんを処置するためのワクチンにおける使用に特に適切であり得る。提供する配列は、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに対応する。

表２は、乳がん、肺がん、又は卵巣がんを処置するためのワクチンにおける使用に特に適切であり得る細菌分類群を含む。細菌は、腫瘍型ごとの濃縮のために、それらのｐ値（最低から最高）に従ってソートした。

表３は、特定の腫瘍型において優勢である様々な細菌種をまとめる。

特定の実施形態によれば、細菌は、Salmonella Typhimurium（例えば、Salmonella Typhimuriumの弱毒株VNP20009、Salmonella Typhimurium 14028のSTM3120株、Salmonella Typhimurium 14028のSTM1414株）、Pseudomonas aeruginosa（CHA-OST株）及び／又はBacillus Subtillis（PY79株）である。

「単離された」又は「濃縮された」という用語は、（１）産生された当初（天然であっても実験環境であっても）に関連していた成分の少なくとも一部から分離された、並びに／又は（２）人工的に産生、調製、精製、及び／若しくは製造された細菌を包含する。単離微生物は、それらが当初関連していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離微生物は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。「精製する」、「精製している」及び「精製された」という用語は、微生物又は他の物質が、産生若しくは作製された当初（例えば、天然であっても実験環境であっても）又はその最初の産生後の任意の時間の間のいずれかで関連していた成分の、少なくとも一部から分離されていることを指す。微生物又は微生物集団が、産生時又は産生後に、例えば微生物又は微生物集団を含む材料又は環境から単離されている場合、精製されているとみなすことができ、精製微生物又は精製微生物集団は、最大約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約９０％超の他の材料を含んでいてもよく、それでも「単離されている」とみなすことができる。いくつかの実施形態では、精製微生物又は精製微生物集団は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超純粋である。本明細書で提供される微生物組成物の場合、組成物中に存在する１種類以上の微生物系統（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｙｐｅ）は、かかる微生物系統を含む材料又は環境中で産生される及び／又は存在する１種類以上の他の微生物とは別に精製することができる。微生物組成物及びその微生物成分は、概して、生息環境からの持ち込み作製物から精製される。

ある特定の実施形態では、ワクチン中の細菌の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％は、本明細書の表１～表３に掲載される属、種又は株のものである。

特定の実施形態によれば、細菌のゲノムは、配列番号２４～３１０に示される配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含む。

本明細書で使用される場合、「相同性パーセント」、「同一性パーセント」、「配列同一性」若しくは「同一性」、又は文法上の等価物は、２つの核酸配列又はポリペプチド配列に関して本明細書中で使用される場合、整列させた場合に同じである２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質を参照して配列同一性のパーセンテージが使用されるとき、同一ではない残基位置は、多くの場合、類似した化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する別のアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換された保存的アミノ酸置換により異なっているため、分子の機能特性には変化がないものと認識される。保存的置換により配列が異なる場合、この置換の保存的性質について補正するために配列同一性パーセントを上方に調整してもよい。このような保存的置換の点で異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するとみなされる。この調整を行うための手法は当業者に周知である。典型的には、この調整は、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコア付けして、配列同一性のパーセンテージを上げることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１が与えられ、非保存的置換にはスコア０が与えられる場合、保存的置換には０～１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えばHenikoff S and Henikoff JG［Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9］のアルゴリズムに従って計算される。

同一性パーセントは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含む任意の相同性比較ソフトウェアを使用して、例えばデフォルトパラメータを利用することによって決定することができる。

２つの配列間の相同性％又は同一性％を決定するために使用され得る他の例示的な配列アライメントプログラムとしては、ＦＡＳＴＡパッケージ（精密（ＳＳＥＡＲＣＨ、ＬＡＬＩＧＮ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ及びＧＬＳＥＡＲＣＨ）及びヒューリスティック（ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＸ／Ｙ、ＴＦＡＳＴＸ／Ｙ及びＦＡＳＴＳ／Ｍ／Ｆ）を含む）アルゴリズム、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｎｅｅｄｌｅ、ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、ｗａｔｅｒ及びｍａｔｃｈｅｒ）、ＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮを含むがこれらに限定されない）、メガブラスト及びＢＬＡＴが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、配列アライメントプログラムはＢＬＡＳＴＮである。例えば、９５％相同性は、ＢＬＡＳＴＮによって、すべての非重複アライメントセグメントを組み合わせ（ＢＬＡＳＴ ＨＳＰ）、それらの同一マッチ数を合計し、この合計をより短い配列の長さで割ることによって決定される９５％配列同一性を指す。

いくつかの実施形態では、配列アライメントプログラムは、基本的な局所アライメントプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴである。いくつかの実施形態では、配列アライメントプログラムは、ペアワイズグローバルアライメントプログラムである。いくつかの実施形態では、ペアワイズグローバルアライメントプログラムは、タンパク質－タンパク質アライメントのために使用される。いくつかの実施形態では、ペアワイズグローバルアライメントプログラムはＮｅｅｄｌｅである。いくつかの実施形態では、配列アライメントプログラムはマルチプルアライメントプログラムである。いくつかの態様において、マルチプルアライメントプログラムはＭＡＦＦＴである。いくつかの実施形態では、配列アライメントプログラムは、全ゲノムアライメントプログラムである。いくつかの実施形態では、全ゲノムアライメントは、ＢＬＡＳＴＮを使用して実施される。いくつかの実施形態では、ＢＬＡＳＴＮは、デフォルトパラメータに対するいかなる変更もなしに利用される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、同一性は、全体的な同一性すなわち、本発明の核酸配列全体にわたる同一性であり、その一部にわたる同一性ではない。

腫瘍マイクロバイオーム内に存在する細菌を調べる方法は後述する。コンタミネーションを最小化し、制御するためには、マイクロバイオーム内にどの細菌が存在するか解析する際に、十分な数の測定を行うよう注意が必要である。

いくつかの実施形態において、１以上の細菌又はその成分又はその産物の存在を決定することは、１以上のＤＮＡ配列のレベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することを含む。いくつかの実施形態において、１以上のＤＮＡ配列は、異なる種類の細菌を区別するために使用可能な任意のＤＮＡ配列を含む。ある実施形態においては、１以上のＤＮＡ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を含む。ある実施形態においては、１以上のＤＮＡ配列は１８Ｓ ＤＮＡ遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態においては、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１，０００、５，０００又はそれ以上の配列を増幅する。

いくつかの実施形態において、１以上のＤＮＡ配列の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせについて、微生物叢サンプル（例：腫瘍サンプル）を直接解析する。いくつかの実施形態においては、腫瘍微生物叢サンプルからＤＮＡを単離し、１以上のＤＮＡ配列の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせについて、単離したＤＮＡを解析する。微生物ＤＮＡの単離方法は当業界で広く知られている。その例としては、フェノール－クロロホルム抽出、及びＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カリフォルニア州、バレンシア、Ｑｉａｇｅｎ）を含む種々の市販のキットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態において、１以上のＤＮＡ配列の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせについて、ＰＣＲ（例：標準的なＰＣＲ、半定量的又は定量的ＰＣＲ）を用いてＤＮＡ配列を増幅することで決定する。いくつかの実施形態においては、１以上ＤＮＡ配列のレベル又は複数のレベルの組み合わせは、定量的ＰＣＲを用いてＤＮＡ配列を増幅することで決定する。これら及び他の基本的なＤＮＡ増幅手順は当業界の実務者には広く知られており、Ausebel et al.（Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York）に記載されている。

いくつかの実施形態において、他の異なる種類の微生物から個別の種類の微生物を差別化する１以上配列に対して特異的なプライマーを用いて、ＤＮＡ配列を増幅する。いくつかの実施形態においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその断片を、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて増幅する。いくつかの実施形態においては、１８Ｓ ＤＮＡ遺伝子配列又はその断片を、１８Ｓ ＤＮＡ遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて増幅する。

いくつかの実施形態において、１以上の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせは、ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ技術を用いて決定する。Ｐｈｙｌｏｃｈｉｐの使用は当業界では広く知られ、Hazen et al.（"Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria." Science, 330, 204-208, 2010）に記載されており、本参照をもってその全内容を援用する。まとめると、微生物叢サンプルのＤＮＡ抽出物から１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅し、標識する。増幅したＤＮＡを、次に、微生物１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対するプローブを含むアレイにハイブリダイズさせる。各プローブに対する結合レベルを次に定量化して、プローブ化した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に対応する種類の微生物のサンプルレベルを提供する。いくつかの実施形態においては、ｐｈｙｌｏｃｈｉｐ解析は、一般的な事業者によって実施される。一例はＳｅｃｏｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サンフランシスコ）であるが、ここに限定されるものではない。

いくつかの実施形態において、１以上の種類の微生物、又はその成分又はその産物の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することは、１以上の微生物ＲＮＡ分子（例：転写産物）の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することを含む。ＲＮＡ転写産物のレベルを定量するための方法は当業界広く知られており、ノーザン解析、半定量的逆転写酵素ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、及びマイクロアレイ解析が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施形態においては、１以上の種類の微生物、又はその成分又はその産物の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することは、１以上の微生物ポリペプチドの存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することを含む。ポリペプチドレベルを定量するための方法は当業界広く知られており、ウエスタン解析及び質量分析が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これら及び他の全ての基本的ポリペプチド検出手法は、Ausebel et al.に記載されている。

いくつかの実施形態において、１以上の種類の微生物、又はその成分又はその産物の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することは、１以上の微生物代謝産物の存在、レベル又は複数のレベルの組み合わせを決定することを含む。いくつかの実施形態において代謝産物のレベルは、質量分析によって決定する。いくつかの実施形態において代謝産物のレベルは、核磁気共鳴法によって決定する。いくつかの実施形態において代謝産物のレベルは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定する。いくつかの実施形態において代謝産物のレベルは、比色定量法によって決定する。いくつかの実施形態において代謝産物のレベルは、分光光度測定によって決定する。

ある特定の実施形態では、ワクチンは、本明細書の表１～表３に掲載する科／属／種／株の細菌を少なくとも１×１０^３コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^４コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^５コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^６コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^７コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^８コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）、１×１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）で含む。

細菌を産生するための方法は、３つの主要なプロセス工程を含み得る。この工程とは、生物のバンキング、生物の生産、及び保存である。

バンキングのために、細菌に含まれる株は、（１）検体から直接単離するか、又はバンキングされたストックから取り出したもの、（２）任意選択で、生存しているバイオマスを作製するために、増殖を支持する栄養寒天又はブロス上で培養したもの、（３）任意選択で、長期保存用に複数のアリコートで保存されたバイオマスのいずれかであり得る。

培養工程を用いる実施形態では、寒天又はブロスは、増殖を可能にする必須要素及び特定の因子を提供する栄養素を含有してもよい。一例は、２０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１０ｇ／Ｌのダイズペプトン、２ｇ／Ｌのクエン酸、１．５ｇ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌのクエン酸鉄アンモニウム、８０ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍｇ／Ｌの塩化ヘミン、２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム、１ｍｇ／Ｌのメナジオンから構成される培地である。別の例は、ｐＨ６．８で、１０ｇ／Ｌの牛肉抽出物、１０ｇ／Ｌのペプトン、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌのデキストロース、３ｇ／Ｌの酵母エキス、３ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム、１ｇ／Ｌの可溶性デンプン、及び０．５ｇ／ＬのＬ－システインＨＣｌから構成される培地である。さまざまな微生物用培地及びバリエーションが、当該分野で周知である（例えば、R. M. Atlas, Handbook of Microbiological Media (2010) CRC Press）。培養培地は、開始時に培養物に添加することができ、培養中に添加してもよく、又は培養物中に断続的／連続的に流入させてもよい。ワクチン中の株は、単独で、微生物組成物のサブセットとして、又は微生物組成物を含む全コレクションとして培養することができる。例えば、第１の株と第２の株を、混合連続培養において、培養から培養微生物がウォッシュアウトされることを防ぐために、いずれかの微生物の最大増殖速度よりも低い希釈率にて一緒に培養してもよい。

接種した培養物は、バイオマスを形成させるのに十分な時間、好ましい条件下でインキュベートする。ヒトに使用する微生物組成物の場合、このようなインキュベートは、３７℃の温度、正常なヒトにおける微小環境（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｎｉｃｈｅ）と同様の値を有するｐＨ、及びその他のパラメータ下で行われることが多い。環境は、能動的に制御されてもよく、（例えば、緩衝剤を介して）受動的に制御されてもよく、又はドリフトしてもよい。例えば、嫌気性細菌組成物については、無酸素／還元環境を用いることができる。このような環境は、システインなどの還元剤をブロスに添加すること、及び／又はブロスから酸素を除去することによって得ることができる。一例として、細菌組成物の培養物は、１ｇ／Ｌのシステイン－ＨＣｌで予め還元した上記培地中、３７℃、ｐＨ７で増殖させることもできる。

培養物が十分なバイオマスを作製したら、かかるバイオマスをバンキングのために保存することができる。対象生物を、凍結から保護（「抗凍結剤」の添加）、乾燥から保護（「凍結乾燥保護剤」）、及び／又は浸透圧ショックから保護（「浸透圧調節剤」）する化学環境中に置き、複数の（任意選択で同一の）容器中に分配して均一なバンクを作製し、次いで保存のために培養物を処理してもよい。容器は、概して不透過性であり、環境からの隔離を確保する閉鎖性を有する。凍結保存処理は、超低温（例えば、－８０℃以下）で液体を凍結することによってなされる。乾燥保存は、蒸発（噴霧乾燥又は「冷却乾燥（ｃｏｏｌ ｄｒｙｉｎｇ）」の場合）又は昇華（例えば、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥の場合）によって培養物から水分を除去する。水分の除去は、極低温より高い温度での微生物組成物の長期貯蔵安定性を改善する。微生物組成物が、例えば、胞子形成微生物種を含み、胞子の産生をもたらす場合、最終組成物は、上記の技術を使用して保存される密度勾配遠心分離などの追加の手段によって精製され得る。微生物組成物のバンキングは、株を個々に培養及び保存することによって、又は株を一緒に混合して組合せバンクを作製することによって行うことができる。凍結保存の例としては、微生物細胞を遠心分離によって培養培地からペレット化し、上清をデカントして１５％のグリセロールを含む新鮮な培養ブロスに置き換えて微生物組成物培養物を回収し、次いでこの培養物を１ｍＬのクライオチューブに分注し、密封し、長期生存性保持のために－８０℃に置いてもよい。この手順では、凍結保存からの回復時に、許容可能な生存率が得られる。

微生物の産生は、培地組成及び培養条件を含む、バンキングと同様の培養工程を用い行われてもよい。このような産生は、特に臨床開発又は商業生産のために、より大規模な運用で行うこともできる。大規模下では、最終的な培養の前に微生物組成物の継代培養が複数回あってもよい。培養の終わりに、投与のための剤形へとさらに製剤化するために培養物を回収する。これには、濃縮、望ましくない培地成分の除去、及び／又は微生物組成物を保存して選択経路による投与に許容可能なものとする化学環境への導入、が含まれる。乾燥後、粉末を適切な効力にブレンドし、他の培養物及び／又は充填剤と混合することができ、例えば、均一性及び取り扱いの容易さのための微結晶性セルロースと、本明細書において提供されるように製剤化された細菌組成物とを混合することができる。

特定の態様では、対象に投与するためのワクチン（すなわち、細菌組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、細菌は、単回用量単位又は複数回用量形式であり得る最終作製物を作製するために、追加の活性材料及び／又は不活性材料と組み合わせる。

ワクチン中に存在する細菌は、生細菌（ｖｉａｂｌｅ）であってもよい（例えば、投与後に、適切な培地中又は体内で培養されたときに増殖することができる）。

別の実施形態では、ワクチン中に存在する細菌は死細菌（ｎｏｎ－ｖｉａｂｌｅ）である。

さらに別の実施形態では、細菌は、疾患を引き起こすことがないように弱毒化される。

言及したように、本明細書に開示されるワクチンの細菌は、少なくとも１種のがん関連抗原を発現する。

がん関連抗原は、典型的には、タンパク質の１つ以上の抗原決定基に相当する短いペプチドである。がん関連抗原は、典型的には、クラスＩ又はＩＩのＭＨＣ受容体と結合して三量複合体を形成する。この三量複合体は、適当な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体を結合するのに適したＴ細胞受容体を担持しているＴ細胞によって認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的には約８～１４アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＴ細胞エピトープは、典型的には約１２～３０アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの場合、同じペプチド及び対応するＴ細胞エピトープは共通のコア部分を共有し得るが、それぞれ、コア配列のアミノ末端の上流及びそのカルボキシ末端の下流の隣接配列の長さが異なることに起因して全長が異なり得る。Ｔ細胞エピトープは、免疫応答を引き起こす場合、抗原として分類され得る。

がんに対する抗原は、精巣がん、卵巣がん、膠芽腫などの脳がん、膵臓がん、黒色腫、肺がん、前立腺がん、肝臓がん、乳がん、直腸がん、結腸がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、肉腫、膠芽細胞腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫並びに白血病に由来する抗原であり得る。

一実施形態では、がん関連抗原は、がん精巣抗原（例えば、黒色腫抗原タンパク質（ＭＡＧＥ）ファミリーのメンバー、扁平上皮細胞がん－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ＢＡＧＥ（Ｂ黒色腫抗原）、ＬＡＧＥ－１抗原、Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ（ＢＯＲＩＳ）及びＧＡＧＥファミリーのメンバー）である。

別の態様において、がん関連抗原は、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａタンパク質、例えば、ＭＡＲＴ１ ＭＨＣクラスＩペプチド（Ｍｅｌａｎ－Ａ：２６－３５（Ｌ２７）、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号１）及びＭＨＣクラスＩＩペプチド（Ｍｅｌａｎ－Ａ：５１－７３（ＲＲ－２３）ＲＮＧＹＲＡＬＭＤＫＳＬＨＶＧＴＱＣＡＬＴＲＲ；配列番号２）に由来する。

別の実施形態では、がん関連抗原は、糖タンパク質７０、糖タンパク質１００（ｇｐ１００：２５－３３（ＭＨＣクラスＩ（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ－配列番号７）又はｇｐ１００：４４－５９ ＭＨＣクラスＩＩ（ＷＮＲＱＬＹＰＥＷＴＥＡＱＲＬＤ－配列番号８）ペプチド）に由来する。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）又はＴＲＰ－２／ＩＮＴ２（ＴＲＰ－２／イントロン２）に由来する。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、ＭＵＴ３０（キネシンファミリーメンバー１８Ｂにおける変異、Ｋｉｆ１８ｂ－ＰＳＫＰＳＦＱＥＦＶＤＷＥＮＶＳＰＥＬＮＳＴＤＱＰＦＬ－配列番号９）又はＭＵＴ４４（ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒ ３－ｌｉｋｅ、Ｃｐｓｆ３ｌ－ＥＦＫＨＩＫＡＦＤＲＴＦＡＮＮＰＧＰＭＶＶＦＡＴＰＧＭ－配列番号１０）を含む。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、前立腺がん特異的Ｔ細胞－ＳＰＡＳ－１の刺激因子に由来する。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）又はｈＴＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）に由来する。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、オボアルブミン（ＯＶＡ）、例えば、ＯＶＡ_{２５７－２６４} ＭＨＣＩ Ｈ－２Ｋｂ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ－配列番号１１）及びＯＶＡ_{３２３－３３９} ＭＨＣＩＩ Ｉ－Ａ（ｄ）（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ－配列番号１２）、ＲＡＳ変異、ｐ５３の発ガン性変異（ＴＰ５３）（ｐ５３ｍｕｔ（マウス変異ｐ５３_{Ｒ１７２Ｈ}配列であるＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ－配列番号４（ヒト変異ｐ５３_{Ｒ１７５Ｈ}配列であるＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥ－配列番号５）のペプチド抗原）、又はＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅペプチド（ＧＤＦＧＬＡＴＥＫＳＲＷＳＧＳ－配列番号１３）に由来する。

特定の実施形態によれば、がん関連抗原は配列番号１１に記載されている。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、α－ラクトアルブミン（α－Ｌａｃ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＢＲＣＡ－２又はＢＲＣＡ－１（ＲＮＦ５３）、ＫＮＧ１Ｋ４３８－Ｒ４５７（キニノーゲン－１ペプチド）及びＣ３ｆＳ１３０４－Ｒ１３２０（変異型ＢＲＣＡ１を他のＢＣ及び非発がん性変異型ＢＲＣＡ１から区別するペプチド）を含むがこれらに限定されない乳がん関連疾患抗原である。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、ＭＵＣ１、ＫＲＡＳ、ＣＥＡ（ＣＡＰ－１－６－Ｄ［Ａｓｐ６］；ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ－配列番号１４）及びＡｄｐｇｋ_{Ｒ３０４Ｍ} ＭＣ３８（ＭＨＣＩ－Ａｄｐｇｋ：ＡＳＭＴＮＭＥＬＭ－配列番号１５；ＭＨＣＩＩ－Ａｄｐｇｋ：ＧＩＰＶＨＬＥＬＡＳＭＴＮＭＥＬＭＳＳＩＶＨＱＱＶＦＰＴ－配列番号１６）を含むがこれらに限定されない結腸直腸がん関連疾患抗原である。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、ＣＥＡ、ＣＡ １９－９、ＭＵＣ１、ＫＲＡＳ、ｐ５３ｍｕｔ（マウスｐ５３_{Ｒ１７２Ｈ}変異配列ＶＶＲＨＣＰＨＨＥＲ－配列番号４のペプチド抗原（ヒトｐ５３_{Ｒ１７５Ｈ}変異配列ＥＶＶＲＨＣＰＨＨＥ－配列番号５）及びＭＵＣ４又はＭＵＣ１３、ＭＵＣ３Ａ又はＣＥＡＣＡＭ５、ＫＲＡＳペプチド（例えば、ＫＲＡＳ－Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ－Ｇ１３Ｄ、ｐ５－２１配列ＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩ（配列番号１７）、ｐ５－２１ Ｇ１２Ｄ配列ＫＬＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫＳＡＬＴＩ（配列番号１８）、ｐ１７－３１配列ＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥ（配列番号１９）、ｐ７８－９２配列ＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤ（配列番号２０）、ｐ１５６－１７０配列ＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭ（配列番号２１）、ＮＲＡＳ（例えばＮＲＡＳ－Ｑ６１Ｒ）、ＰＩ３Ｋ（例えばＰＩＫ３ＣＡ－Ｈ１０４７Ｒ）、Ｃ－Ｋｉｔ－Ｄ８１６Ｖ、及びＢＲＣＡ変異エピトープＹＩＨＴＨＴＦＹＶ（配列番号２２）及びＳＱＩＷＮＬＮＰＶ（配列番号２３）ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ネオエピトープを含むが、これらに限定されない膵臓がん関連疾患抗原である。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、精子タンパク質１７（ＳＰ１７）、Ａ－キナーゼアンカープロテイン４（ＡＫＡＰ４）及び下垂体腫瘍形質転換遺伝子１（ＰＴＴＧ１）、オーロラキナーゼＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、及びｐ５３ｍｕｔを含むがこれらに限定されない肺がん関連疾患抗原である。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、前立腺がん抗原（ＰＣＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）などの前立腺がん関連疾患抗原である。

さらに別の実施形態では、がん関連抗原は、脳がん、特にＧＬ２６１ネオアンチゲン（ｍＩｍｐ３ Ｄ８１Ｎ ＡＡＬＬＮＫＬＹＡ－配列番号６）などの膠芽腫がん関連疾患抗原である。

別の実施形態では、がん関連抗原はネオアンチゲンである。

本明細書で使用される場合、「ネオアンチゲン」という用語は、例えば、対応する野生型親抗原とは、腫瘍細胞における変異又は腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾により異なるものにする、少なくとも１つの変更を有するエピトープである。ネオアンチゲンは、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列を含み得る。変異は、フレームシフト若しくは非フレームシフト型のインデル（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンス若しくはナンセンス置換、スプライス部位の変更、ゲノム再編成若しくは遺伝子融合、又はネオＯＲＦを生じる、任意のゲノム若しくは発現における変更を含み得る。変異はまた、スプライスバリアントを含み得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾には、異常なリン酸化が含まれ得る。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームにより作製されるスプライシングされた抗原を含み得る。

ＡＰＣ変異抗原の例は、ＱＡＴＥＡＥＲＳＦ（配列番号３）である。

ＢＲＣＡ変異エピトープの例は、ＹＩＨＴＨＴＦＹＶ（配列番号２２）及びＳＱＩＷＮＬＮＰＶ（配列番号２３）ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ネオエピトープである。

ユニバーサルＨＬＡ－ＤＲ結合性ヘルパーＴ細胞合成エピトープ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ、配列番号３１１）の例は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化する１３アミノ酸ペプチドである、汎ＤＲ結合エピトープ（ｐａｎ ＤＲ－ｂｉｄｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ、ＰＡＤＲＥ）である。

別の企図されるがん関連ネオアンチゲンは、ＧＬ２６１ネオアンチゲン（ｍＩｍｐ３ Ｄ８１Ｎ、配列ＡＡＬＬＮＫＬＹＡ－配列番号６）である。

本願に記載の細菌は、がん関連抗原を細胞内に発現する及び／又は細菌表面に発現する（即ち、遺伝子表面提示する）ように遺伝子改変されている。他の実施形態においては、細菌は、がん関連抗原を分泌するように遺伝子改変されている。

例えば、いくつかの実施形態では、細菌は、細菌プロモーターなどの転写調節エレメントに作動可能に連結させたがん関連抗原をコードする核酸を含む。転写調節エレメントは、分泌シグナルをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、がん関連抗原は、細菌によって恒常的に発現される。いくつかの実施形態では、がん関連抗原は、誘導的により細菌で発現される（例えば、糖又は低ｐＨ環境若しくは嫌気性環境のような環境刺激に曝露されると発現される）。いくつかの実施形態では、細菌は、同じ細菌細胞によって発現され得る複数の異なるがん関連抗原をコードする複数の核酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、細菌は、細菌表面提示システムにより組換え産生がん治療薬を表面上に提示する。細菌表面提示システムの例としては、外膜タンパク質システム（例えば、ＬａｍＢ、ＦｈｕＡ、ＯｍｐＩ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＴ、ＯｍｐＸに由来するｅＣＰＸ、ＯｐｒＦ、及びＰｇｓＡ）、表面付属システム（例えば、Ｆ ｐｉｌｌｉｎ、ＦｉｍＨ、ＦｉｍＡ、ＦｌｉＣ、及びＦｌｉＤ）、リポタンパクシステム（例えば、ＩＮＰ、Ｌｐｐ－ＯＭＰａ、ＰＡＬ、Ｔａｔ依存性、及びＴｒａＴ）、並びに病原性因子に基づくシステム（例えば、ＡＩＤＡ－１、ＥａｅＡ、ＥｓｔＡ、ＥｓｐＰ、ＭＳＰ１ａ、及びインベイシン）が挙げられる。例示的な表面提示システムは、例えば、参照により本明細書に援用する、van Bloois, E., et al., Trends in Biotechnology, 2011, 29:79-86に記載されている。

細菌プロモーターの例としては、ＳＴＭ１７８７プロモーター、ｐｅｐＴプロモーター、ｐｆｌＥプロモーター、ａｎｓＢプロモーター、ｖｈｂプロモーター、ＦＦ＋２０＊プロモーター又はｐ（ｌｕｘＩ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本願に記載した遺伝子改変細菌は、がん治療薬を含む（例えば、対象への投与前にがん治療薬を細菌に導入する、又はがん治療薬を発現するように遺伝子改変する）。

いくつかの実施形態では、がん治療薬は、細菌細胞生育中のがん治療薬の組み込み又は細菌の外側へのがん治療薬の結合のいずれかをもたらす高濃度（例えば、少なくとも１ｍＭ）でがん治療薬を含有する培地で細菌を生育させることによって細菌にロードされる。がん治療薬は、受動的に（例えば、親油性細胞膜への拡散及び／又は分配によって）、又は膜チャネル若しくは輸送体を介して能動的に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、薬物のローディングは、対象分子の組み込みを増加させる（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７）か、又は細菌による組み込み後の分子の放出を防止する（例えば、ベラパミル、レセルピン、カルノシン酸（Ｃａｒｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、又はピペリンのような排出ポンプ阻害剤）さらなる物質を増殖培地に添加することによって改善される。いくつかの実施形態では、例えば、参照により本明細書に援用する、Sustarsic M., et al., Cell Biol., 2014, 142(1):113-24に記載されているように、細菌をがん治療剤と混合し、次いで混合物をエレクトロポレーション法に供することによって、細菌にがん治療剤をロードする。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション後に細胞を排出ポンプ阻害剤（上記を参照されたい）で処理して、ロードした分子の放出を防止することもできる。

更に別の実施形態において、細菌はがん治療薬を発現するように遺伝子改変されている。

いくつかの実施形態では、ワクチンの細菌は、免疫チェックポイントタンパク質－例えば抗ＣＴＬＡ４、抗ＣＤ４０、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ１及び抗ＰＤＬ１に対する阻害性の抗体又は小分子を含む。

本発明者らは、ワクチン用の細菌が、クリック（ＣＬＩＣＫ）ケミストリー等の結合方法を用いて細菌の外側に結合した治療薬を含んでもよいことをさらに想到する。このような方法は、米国特許出願第２０２０００８７７０３号明細書及び米国特許出願第２０２０００５４７３９号明細書にさらに記載されており、本参照をもってこれらの記載を援用する。

治療剤の例としては、サイトカインなどの免疫調節タンパク質が挙げられる。免疫調節タンパク質の例としては、Ｂリンパ球化学誘引物質（「ＢＬＣ」）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１１（「エオタキシン－１」）、好酸球走化性タンパク質２（「エオタキシン－２」）、顆粒球コロニー形成刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、Ｉ－３０９、細胞間接着分子１（「ＩＣＡＭ－１」）、インターフェロンγ（「ＩＦＮ－γ」）、インターロイキン－１α（「ＩＬ－１α」）、インターロイキン－１β（「ＩＬ－１β」）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（「ＩＬ－１ｒａ」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－４（「ＩＬ－４」）、インターロイキン－５（「ＩＬ－５」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、インターロイキン－６可溶性受容体（「ＩＬ－６ ｓＲ」）、インターロイキン－７（「ＩＬ－７」）、インターロイキン－８（「ＩＬ－８」）、インターロイキン－１０（「ＩＬ－１０」）、インターロイキン－１１（「ＩＬ－１１」）、インターロイキン－１２のサブユニットβ（「ＩＬ－１２ ｐ４０」又は「ＩＬ－１２ ｐ７０」）、インターロイキン－１３（「ＩＬ－１３」）、インターロイキン－１５（「ＩＬ－１５」）、インターロイキン－１６（「ＩＬ－１６」）、インターロイキン－１７（「ＩＬ－１７」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＣＰ－１」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ－ＣＳＦ」）、γインターフェロンによって誘導されるモノカイン（「ＭＩＧ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２（「ＭＩＰ－１α」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド４（「ＭＩＰ－１β」）、マクロファージ炎症タンパク質１－δ（「ＭＩＰ－１δ」）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（「ＰＤＧＦ－ＢＢ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド５、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（「ＴＩＭＰ－１」）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２（「ＴＩＭＰ－２」）、腫瘍壊死因子、リンホトキシンアルファ（「ＴＮＦα」）、腫瘍壊死因子、リンホトキシンベータ（「ＴＮＦβ」）、可溶性ＴＮＦ受容体１型（「ｓＴＮＦＲＩ」）、ｓＴＮＦＲＩＩＡＲ、脳由来神経栄養因子（「ＢＤＮＦ」）、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）、骨形態形成タンパク質４（「ＢＭＰ－４」）、骨形成タンパク質５（「ＢＭＰ－５」）、骨形成タンパク質７（「ＢＭＰ－７」）、神経増殖因子（「ｂ－ＮＧＦ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、上皮増殖因子受容体（「ＥＧＦＲ」）、内分泌腺由来血管内皮増殖因子（「ＥＧ－ＶＥＧＦ」）、線維芽細胞増殖因子４（「ＦＧＦ－４」）、ケラチノサイト増殖因子（「ＦＧＦ－７」）、増殖分化因子１５（「ＧＤＦ－１５」）、グリア細胞由来神経栄養因子（「ＧＤＮＦ」）、成長ホルモン、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（「ＨＢ－ＥＧＦ」）、肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（「ＩＧＦＢＰ－１」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（「ＩＧＦＢＰ－２」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（「ＩＧＦＢＰ－３」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（「ＩＧＦＢＰ－４」）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（「ＩＧＦＢＰ－６」）、インスリン様増殖因子１（「ＩＧＦ－１」）、インスリン、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ－ＣＳＦ Ｒ」）、神経成長因子受容体（「ＮＧＦ Ｒ」）、ニューロトロフィン－３（「ＮＴ－３」）、ニューロトロフィン－４（「ＮＴ－４」）、破骨細胞形成阻害因子（「オステオプロテゲリン」）、血小板由来成長因子受容体（「ＰＤＧＦ－ＡＡ」）、ホスファチジルイノシトール－グリカン生合成（「ＰＩＧＦ」）、Ｓｋｐ、カリン、Ｆ－ｂｏｘ含有複合体（「ＳＣＦ」）、幹細胞因子受容体（「ＳＣＦ Ｒ」）、形質転換増殖因子アルファ（「ＴＧＦα」）、形質転換増殖因子ベータ－１（「ＴＧＦβ１」）、形質転換増殖因子ベータ－３（「ＴＧＦβ３」）、血管内皮細胞増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（「ＶＥＧＦＲ２」）、血管内皮細胞増殖因子受容体３（「ＶＥＧＦＲ３」）、ＶＥＧＦ－Ｄ ６Ｃｋｉｎｅ、
チロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯ（「Ａｘｌ」）、ベータセルリン（「ＢＴＣ」）、粘膜関連上皮ケモカイン（「ＣＣＬ２８」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２７（「ＣＴＡＣＫ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＣＸＣＬ１６」）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン５（「ＥＮＡ－７８」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２６（「エオタキシン－３」）、顆粒球走化性タンパク質２（「ＧＣＰ－２」）、ＧＲＯ、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＨＣＣ－１」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１６（「ＨＣＣ－４」）、インターロイキン－９（「ＩＬ－９」）、インターロイキン－１７Ｆ（「ＩＬ－１７Ｆ」）、インターロイキン１８結合タンパク質（「ＩＬ－１８ ＢＰａ」）、インターロイキン２８Ａ（「ＩＬ－２８Ａ」）、インターロイキン２９（「ＩＬ－２９」）、インターロイキン３１（「ＩＬ－３１」）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（「ＩＰ－１０」）、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３（「Ｉ－ＴＡＣ」）、白血病抑制因子（「ＬＩＦ」）、Ｌｉｇｈｔ、ケモカイン（Ｃモチーフ）リガンド（「リンホタクチン」）、単球走化性タンパク質２（「ＭＣＰ－２」）、単球走化性タンパク質３（「ＭＣＰ－３」）、単球走化性タンパク質４（「ＭＣＰ－４」）、マクロファージ由来ケモカイン（「ＭＤＣ」）、マクロファージ遊走阻害因子（「ＭＩＦ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２０（「ＭＩＰ－３α」）、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１９（「ＭＩＰ－３β」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２３（「ＭＰＩＦ－１」）、マクロファージ刺激タンパク質アルファ鎖（「ＭＳＰα」）、ＮＡＰ－２（Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １－ｌｉｋｅ ４）、分泌型リン酸化タンパク質１（「オステオポンチン」）、ＰＡＲＣ（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、血小板第４因子（「ＰＦ４」）、間質細胞由来因子１アルファ（「ＳＤＦ－１α」）、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１７（「ＴＡＲＣ」）、胸腺発現ケモカイン（「ＴＥＣＫ」）、胸腺間質リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ ４－ＩＢＢ」）、ＣＤ１６６抗原（「ＡＬＣＡＭ」）、分化抗原群８０（「Ｂ７－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（「ＢＣＭＡ」）、分化抗原群１４（「ＣＤ１４」）、分化抗原群３０（「ＣＤ３０」）、分化抗原群４０（「ＣＤ４０リガンド」）、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（胆汁糖タンパク質）（「ＣＥＡＣＡＭ－１」）、細胞死受容体６（「ＤＲ６」）、デオキシチミジンキナーゼ（「Ｄｔｋ」）、１型膜糖タンパク質（「エンドグリン」）、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ－３（「ＥｒｂＢ３」）、内皮白血球接着分子１（「Ｅ－セレクチン」）、アポトーシス抗原１（「Ｆａｓ」）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（「Ｆｌｔ－３Ｌ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１（「ＧＩＴＲ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（「ＨＶＥＭ」）、細胞間接着分子３（「ＩＣＡＭ－３」）、ＩＬ－１ Ｒ４、ＩＬ－１ Ｒ１、ＩＬ－１０ Ｒβ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－２１Ｒ、リソソーム膜タンパク質２（「ＬＩＭＰＩＩ」）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（「リポカリン－２」）、ＣＤ６２Ｌ（「Ｌ－セレクチン」）、リンパ内皮（「ＬＹＶＥ－１」）、
ＭＥＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（「ＭＩＣＡ」）、ＭＥＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（「ＭＩＣＢ」）、ＮＲＧ１－β１、β型血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ Ｒβ」）、血小板内皮細胞接着分子（「ＰＥＣＡＭ－１」）、ＲＡＧＥ、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（「ＴＩＭ－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーＩＯＣ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ３」）、トラッピンタンパク質トランスグルタミナーゼ結合ドメイン（「Ｔｒａｐｐｉｎ－２」）、ウロキナーゼ受容体（「ｕＰＡＲ」）、血管細胞接着タンパク質１（「ＶＣＡＭ－１」）、ＸＥＤＡＲＡｃｔｉｖｉｎ Ａ、アグーチ関連蛋白（「ＡｇＲＰ」）、リボヌクレアーゼ５（「アンジオゲニン」）、アンジオポエチン１、アンジオスタチン、カテプシンＳ、ＣＤ４０、クリプティックファミリータンパク質１Ｂ（「Ｃｒｉｐｔｏ－１」）、ＤＡＮ、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連蛋白１（「ＤＫＫ－１」）、Ｅ－カドヘリン、上皮細胞接着分子（「ＥｐＣＡＭ」）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ又はＣＤ９５Ｌ）、Ｆｃｇ ＲＩＩＢ／Ｃ、ＦｏＵｉｓｔａｔｉｎ、ガレクチン－７、細胞間接着分子２（「ＩＣＡＭ－２」）、ＩＬ－１３ Ｒ１、ＩＬ－１３Ｒ２、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－２ Ｒａ、ＩＬ－２ Ｒｂ、ＩＬ－２３、ＬＡＰ、神経細胞接着因子（「ＮｒＣＡＭ」）、プラスミノーゲン活性化抑制因子－１（「ＰＡＩ－１」）、血小板由来増殖因子受容体（「ＰＤＧＦ－ＡＢ」）、レジスチン、間質細胞由来因子１（「ＳＤＦ－１β」）、ｓｇｐ１３０、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（「ＳｈｈＮ」）、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（「Ｓｉｇｌｅｃ－５」）、ＳＴ２、形質転換増殖因子ベータ２（「ＴＧＦβ２」）、Ｔｉｅ－２、トロンボポエチン（「ＴＰＯ」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｄ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ４」）、ＴＲＥＭ－１（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ １）、血管内皮細胞増殖因子Ｃ（「ＶＥＧＦ－Ｃ」）、ＶＥＧＦＲ１アディポネクチン、アディプシン（「ＡＮＤ」）、アルファフェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、アンジオポエチン様４（「ＡＮＧＰＴＬ４」）、ベータ２マイクログロブリン（「Ｂ２Ｍ」）、基底細胞接着分子（「ＢＣＡＭ」）、炭水化物抗原１２５（「ＣＡ１２５」）、がん抗原１５－３（「ＣＡ１５－３」）、がん胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃＡＭＰ受容体タンパク質（「ＣＲＰ」）、ヒト上皮増殖因子受容体２（「ＥｒｂＢ２」）、フォリスタチン、卵胞刺激ホルモン（「ＦＳＨ」）、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１（「ＧＲＯα」）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（「βＨＣＧ」）、インスリン様増殖因子１受容体（「ＩＧＦ－１ ｓＲ」）、ＩＬ－１ ｓＲＩＩ、ＩＬ－３、ＩＬ－１８ Ｒｂ、ＩＬ－２１、レプチン、マトリックスメタロプロテアーゼ－１（「ＭＭＰ－１」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（「ＭＭＰ－２」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（「ＭＭＰ－３」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－８（「ＭＭＰ－８」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－９（「ＭＭＰ－９」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－１０（「ＭＭＰ－１０」）、マトリックスメタロプロテアーゼ－１３（「ＭＭＰ－１３」）、神経細胞接着分子（「ＮＣＡＭ－１」）、エンタクチン（「Ｎｉｄｏｇｅｎ－１」）、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、オンコスタチンＭ（「ＯＳＭ」）、プロカルシトニン、プロラクチン、前立腺特異抗原（「ＰＳＡ」）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９（「Ｓｉｇｌｅｃ－９」）、ＡＤＡＭ１７エンドペプチダーゼ（「ＴＡＣＥ」）、サイログロブリン、メタロプロテアーゼ阻害物質４（「ＴＩＭＰ－４」）、ＴＳＨ２Ｂ４、
ＡＤＡＭ－９（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ－９）、アンジオポエチン２、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３／酸性ロイシンリッチ核リンタンパク質３２ファミリーメンバーＢ（「ＡＰＲＩＬ」）、骨形成タンパク質２（「ＢＭＰ－２」）、骨形成タンパク質９（「ＢＭＰ－９」）、補体成分５ａ（「Ｃ５ａ」）、カテプシンＬ、ＣＤ２００、ＣＤ９７、ケメリン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６Ｂ（「ＤｃＲ３」）、脂肪酸結合タンパク質２（「ＦＡＢＰ２」）、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（「ＦＡＰ」）、線維芽細胞増殖因子１９（「ＦＧＦ－１９」）、ガレクチン－３、肝細胞増殖因子受容体（「ＨＧＦ Ｒ」）、ＩＦＮ－ガンマアルファ／ベータ Ｒ２、インスリン様増殖因子２（「ＩＧＦ－２」）、インスリン様増殖因子２受容体（「ＩＧＦ－２Ｒ」）、インターロイキン１受容体６（「ＩＬ－１Ｒ６」）、インターロイキン２４（「ＩＬ－２４」）、インターロイキン３３（「ＩＬ－３３」）、カリクレイン１４、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（「レグマイン」）、酸化型低密度リポタンパク質受容体１（「ＬＯＸ－１」）、マンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）、ネプリライシン（「ＮＥＰ」）、Ｎｏｔｃｈ－１（Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ １， ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、腎芽腫過剰発現タンパク質（「ＮＯＶ」）、オステオアクチビン、プログラム細胞死タンパク質１（「ＰＤ－１」）、Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニンアミダーゼ（「ＰＧＲＰ－５」）、セルピンＡ４、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（「ｓＦＲＰ－３」）、トロンボモジュリン、Ｔｏｌｌ様受容体２（「ＴＬＲ２」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ１」）、トランスフェリン（「ＴＲＦ」）、ＷＩＦ－１ＡＣＥ－２、アルブミン、ＡＭＩＣＡ、アンジオポエチン４、Ｂ細胞活性化因子（「ＢＡＦＦ」）、糖鎖抗原１９－９（「ＣＡ１９－９」）、ＣＤ１６３、クラステリン、ＣＲＴ ＡＭ、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１４（「ＣＸＣＬ１４」）、シスタチンＣ、デコリン（「ＤＣＮ」）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３（「Ｄｋｋ－３」）、デルタ様タンパク質１（「ＤＬＬ１」）、フェチュインＡ、ヘパリン結合性成長因子１（「ａＦＧＦ」）、葉酸受容体アルファ（「ＦＯＬＲ１」）、フーリン、ＧＰＣＲ関連ソーティングタンパク質１（「ＧＡＳＰ－１」）、ＧＡＳＰ－２（ＧＰＣＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、顆粒球コロニー刺激因子受容体（「ＧＣＳＦ Ｒ」）、セリンプロテアーゼヘプシン（「ＨＡＩ－２」）、インターロイキン１７Ｂ受容体（「ＩＬ－１７Ｂ Ｒ」）、インターロイキン２７（「ＩＬ－２７」）、リンパ球活性化遺伝子３（「ＬＡＧ－３」）、アポリポタンパク質Ａ－Ｖ（「ＬＤＬ Ｒ」）、ペプシノーゲンＩ、レチノール結合タンパク質４（「ＲＢＰ４」）、ＳＯＳＴ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（「シンデカン－１」）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ（「ＴＡＣＩ」）、組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）、ＴＳＰ－１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（「ＴＲＡＩＬ Ｒ２」）、ＴＲＡＮＣＥ、トロポニンＩ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（「ｕＰＡ」）、ＣＤ１４４としても知られるカドヘリン５タイプ２又はＶＥ－カドヘリン（血管内皮）（「ＶＥ－カドヘリン」）、ＷＩＳＰ－１（ＷＮＴ１－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、及び核因子κＢ活性化受容体（「ＲＡＮＫ」）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫調節タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて組換えにより作製することができる。免疫調節タンパク質は、細菌表面提示を利用して細菌の表面上に提示させることができる。細菌は、遺伝子操作による融合タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎ）、例えば膜タンパク質と免疫調節タンパク質との融合タンパク質を発現する。

本発明のワクチンの細菌は、アジュバントとして働くことができるため、追加のアジュバントの使用を伴わない（ｎｏｔ ｒｅｌｅｖａｎｔ）。

一実施形態では、ワクチンは、アジュバント（細菌そのもの以外）を不含有である。

別の実施形態では、ワクチンは、細菌に加えてアジュバントを含む。

アジュバントは、免疫原性部分の免疫刺激特性を増強するために免疫原又はワクチン製剤に添加することができる物質である。免疫原タンパク質の有効性を高め得るアジュバント又は作用物質の例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルション、及び水中油型エマルションが挙げられる。アジュバントの具体的な種類には、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）並びに種々のＭＤＰ誘導体及び製剤（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニル－（β１－４）－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＧＭＤＰ）（Hornung, R L et al. Ther Immunol 1995 2:7-14）又はＩＳＡＦ－１（０．４ｍｇのトレオニル－ムラミルジペプチドを含むリン酸緩衝化溶液中の５％のスクアレン、２．５％のプルロニックＬ１２１、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０；Kwak, L W et al. (1992) N. Engl. J. Med., 327:1209-1238を参照されたい）である。他の有用なアジュバントは、コレラ毒素、細菌エンドトキシン、ｌｉｐｉｄ Ｘ、細菌Propionobacterium acnes又はBordetella pertussisの全細胞又は細胞成分画分、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、ＱＳ２１（White, A. C. et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol., 303:207-210）等のサポニン及びサポニン誘導体といった現在臨床で使用されているもの（Helling, F et al. (1995) Cancer Res., 55:2783-2788、Davis, T A et al. (1997)Blood, 90: 509）、レバミゾール、ＤＥＡＥ－デキストラン、ブロックコポリマー又は他の合成アジュバントであるか又はそれらに基づくものである。多くのアジュバント、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５ （ニュージャージ州、ローウエイ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．）又は不完全／完全フロイントアジュバント（ミシガン州、デトロイト、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（水中油型）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（水酸化アルミニウム）、又はＡｍｐｈｉｇｅｎとＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとの混合物が、さまざまな供給源から市販されている。アルミニウムはヒトへの使用が承認されている。

言及したように、本願に記載されるワクチンは、がんを治療及び／又は予防するために使用され得る。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を抑制し、実質的に阻害し、遅延、又は逆転させ、状態の臨床的若しくは審美的な症状を実質的に改善することを含む。

特定の実施形態によれば、予防するという用語は、状態の臨床的又は審美的症状の出現を実質的に予防することを指す。

処置される特定の対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒトである。

特定の実施形態によれば、対象はがんを有すると診断されている。

がん
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、宿主における異常な細胞増殖の原発部位に対して周辺にある組織及び遠位にある潜在的な組織（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｔｉｓｓｕｅ）の浸潤をもたらし得る、宿主自身の細胞の、制御されない異常な増殖を指す。主要なクラスとしては、上皮組織（例えば、皮膚、扁平上皮細胞）のがんであるがん腫；結合組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管など）のがんである肉腫；血液形成組織（例えば、骨髄組織）のがんである白血病；免疫細胞のがんであるリンパ腫及び骨髄腫；並びに脳及び脊髄組織由来のがんを含む中枢神経系のがんが挙げられる。「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」は、本明細書において交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「がん」は、初発であっても再発であっても、白血病、がん腫及び肉腫を含むすべてのタイプのがん又は新生物又は悪性腫瘍を指す。

本明細書中に記載される細菌を使用して処置され得るがんの具体例としては、副腎皮質腫瘍、遺伝性；膀胱がん；乳がん；乳がん、乳管；乳がん、浸潤乳性管内；乳がん、散発性；乳がん、感受性；乳がん、タイプ４；乳がん、タイプ４乳がん－１；乳がん－３；乳がん－卵巣がん；トリプルネガティブ乳がん、バーキットリンパ腫；子宮頸がん；結腸直腸腺腫；結腸直腸がん；結腸直腸がん、遺伝性非ポリポーシス、タイプ１；結腸直腸がん、遺伝性非ポリポーシス、タイプ２；結腸直腸がん、遺伝性非ポリポーシス、タイプ３；結腸直腸がん、遺伝性非ポリポーシス、タイプ６；結腸直腸がん、遺伝性非ポリポーシス、タイプ７；隆起性皮膚線維肉腫；子宮内膜がん；食道がん；胃がん；線維肉腫、多形神経膠芽腫；グロムス腫瘍、多発性；肝芽腫；肝細胞がん；肝細胞がん腫；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄性；白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄性；白血病、急性非リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；Ｌｉ－Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群；脂肪肉腫、肺がん；肺がん、小細胞；リンパ腫、非ホジキン； 家族性リンチ症候群ＩＩ（ｌｙｎｃｈ ｃａｎｃｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＩＩ）；男性の生殖細胞腫瘍；マスト細胞白血病；甲状腺髄様がん；髄芽腫； 黒色腫、悪性黒色腫、髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫、骨髄性悪性腫瘍、素因（ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｏ）；粘液肉腫、神経芽腫；骨肉腫；骨がん、卵巣がん；卵巣がん、漿液性；卵巣がん；卵巣性索腫瘍；膵臓がん；膵内分泌腫瘍；傍神経節腫、家族性非クロム親和性；毛母腫；下垂体腫瘍、浸潤性；前立腺腺がん；前立腺がん；腎細胞がん、乳頭状、家族性がん及び散発性；網膜芽細胞腫；ラブドイド素因症候群、家族性；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肺の小細胞がん；軟部肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、頭頸部；Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病；神経膠芽腫を伴うターコット症候群；食道がんを伴う胼胝腫；子宮頸がん、ウィルムス腫瘍、タイプ２；ウィルムス腫瘍、タイプ１などが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態によれば、がんは、乳がん、黒色腫、膵臓がん、卵巣がん、骨がん、及び脳がん（例えば、膠芽細胞腫）からなる群から選択されるがんである。

別の実施形態によれば、がんは、黒色腫である。

悪性黒色腫は、ＡＢＣＤ（Ｅ）システムに基づいて臨床的に認識される。このシステムでは、Ａは非対称性形状を表し、Ｂは不規則な境界を表し、Ｃは多彩な色調を表し、Ｄは直径５ｍｍ超を表し、Ｅは経過の変化を表す。さらに、顕微鏡評価を使用して診断を確証するために切除生検が行われ得る。浸潤性悪性黒色腫は、伝統的に４つの主要な病理組織学的サブグループ：表在拡大型黒色腫（ＳＳＭ）、結節性悪性黒色腫（ＮＭＭ）、悪性黒子黒色腫（ＬＭＭ）、及び末端黒子性黒色腫（ＡＬＭ）に分けられる。線維形成性悪性黒色腫（ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ）などの他の稀なタイプも存在する。悪性黒色腫の実質的な下位分類は、色素細胞性母斑から生じるようであり、浸潤性黒色腫の近傍には異形成母斑の特徴が見出されることが多い。黒色腫は、正常なメラノサイト又は母斑細胞から形成異常母斑の段階を経て、さらに浸潤性になる前のｉｎ ｓｉｔｕ段階へと進行する、複数の段階を経て生じると考えられている。サブタイプのいくつかは、水平増殖期（ＲＧＰ）及び垂直増殖期（ＶＧＰ）と呼ばれる異なる腫瘍進行期を通じて発達する。

特定の実施形態では、黒色腫は、ＢＲＡＦ及び／又はＭＥＫの阻害剤による治療に抵抗性である。

腫瘍は、原発性腫瘍又は続発性腫瘍（すなわち、転移腫瘍）であり得る。

組成物は、例えば経口投与、直腸投与、局所投与、吸入（経鼻）、又は注射などの任意の経路を使用して投与することができる。注射による投与としては、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、腫瘍内（ＩＴ）、腫瘍下（ＳＴ）、腫瘍周囲（ＰＴ）、及び皮下（ＳＣ）投与が挙げられる。本願に記載される医薬組成物は、腫瘍内、経口、非経口、経腸、静脈内、腹腔内、局所、経皮（例えば、任意の標準パッチを使用して）、皮内、眼、（鼻内）、局所、エアロゾルなどの非経口、吸入、皮下、筋肉内、バッカル、舌下、（経）直腸、膣、動脈内、及び髄腔内、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）バッカル、（経）尿道、膣（例えば、経膣及び膣周囲））、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、及び気管支内を含むがこれらに限定されない任意の有効な経路によって任意の形態で投与することができる。好ましい実施形態では、本願に記載される医薬組成物は、経口投与、直腸投与、腫瘍内投与、局所投与、膀胱内投与、流入領域リンパ節への若しくはリンパ節近傍への注射による投与、静脈内投与、吸入若しくはエアロゾルによる投与又は皮下投与がなされる。

本発明の他の態様によると、治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の下記成分（ｉ）を投与し、続いて下記成分（ｉｉ）を投与し、がんを治療する方法が提供される。
（ｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第１の細菌を含む第１のワクチン、及び
（ｉｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第２の細菌を含む第２のワクチン。

本発明は、がんの治療のための少なくとも２つの異なるワクチン接種サイクルを企図し、ワクチン接種サイクルの少なくとも１つは、遺伝子改変細菌の１つの株を含み、ワクチン接種サイクルの少なくとも別のものは、第２の（前記細菌と同一ではない）遺伝子改変細菌の株を含む。細菌の２つの株は、同じがん関連抗原又は異なるがん関連抗原を発現するように遺伝子改変されてもよい。加えて、又は代替的に、本発明者らは、ワクチン接種サイクルのうちの少なくとも１つが生細菌（例：第１のワクチン接種）を含み、ワクチン接種サイクルのうちの少なくとも別のもの（例えば、後続のワクチン接種）が弱毒化（又は死んだ）細菌を含むことを企図する。

本発明のワクチンは、追加の抗がん剤とともに投与され得る。

いくつかの実施形態では、追加の抗がん剤は免疫チェックポイントタンパク質－例えば抗ＣＴＬＡ４、抗ＣＤ４０、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＰＤ１及び抗ＰＤＬ１に対する阻害性の抗体又は小分子である。

本願に記載される細菌と組み合わせて対象に投与され得る他の企図される抗がん剤としては、アシビシン（Ａｃｉｖｉｃｉｎ）、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドリアマイシン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビスアントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブチル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソーマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、ドロモスタノロンプロピオネート、ズアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、塩酸エソルビシン（Ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン；ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イフォスファミド、イルモホシン、インターフェロンα－２ａ、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンα－ｎ１、インターフェロンα－ｎ３、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンγ１ｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メトレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスパー、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルフォスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサトロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、タキソール、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テルオキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフイリン（Ｔｉａｚｏｆｕｉｒｉｎ）、チラパザミン、塩酸トポテカン、トレミフェンクエン酸塩、トレストロン酢酸塩、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビンデシン硫酸塩、ビネピジン硫酸塩、ビングリシネート硫酸塩、ビンロイロシン硫酸塩、ビノレルビン酒石酸、ビンロシジン硫酸塩、ビンゾリジン硫酸塩、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる抗新生物薬としては、Goodman and Gilmanの“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division)中のChapter 52, Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner)及びIntroduction, 1202-1263に開示されるものが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を表す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物、方法又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部分を含み得るが、当該追加の成分、工程、及び／又は部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、又は構造の基本的及び新規な特徴を大きく変化させない場合に限られることを意味する。

本明細書で使用する場合、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１種の化合物」は、複数の化合物を含み、それらの混合物も含み得る。

本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限をなすものと解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するとみなされるべきである。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。

本明細書において数値範囲を示す場合は常に、示された範囲内の任意の記載された数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数と「の間の範囲」という語句と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句とは、本明細書で互換的に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、第１の指示数と第２の指示数との間の分数及び整数の全部とを含むことを意図する。

本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものを含むが、これらに限定されない。

明確さのために別個の実施形態との関連において記載した本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態との関連において記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせ、又は適宜、本発明の他の任意の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須の特徴であるとみなすべきではない。

本明細書に上記され、特許請求の範囲において特許請求される本発明のさまざまな実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。

以下では実施例を参照する。本実施例は、上記の説明とともに本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で例示するものである。

全般的に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学、及び組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号明細書、及び同第５，２７２，０５７号明細書に示される方法論、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８３９，１５３号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，８５０，５７８号明細書、同第３，８５３，９８７号明細書、同第３，８６７，５１７号明細書、同第３，８７９，２６２号明細書、同第３，９０１，６５４号明細書、同第３，９３５，０７４号明細書、同第３，９８４，５３３号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，０３４，０７４号明細書、同第４，０９８，８７６号明細書、同第４，８７９，２１９号明細書、同第５，０１１，７７１号明細書、及び同第５，２８１，５２１号明細書、“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)及び“Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)の特許及び科学文献に広く記載されている。これらのすべては参照によりそのすべてが本明細書に示されるように援用される。他の全般的な参考文献は、本明細書全体にわたって提供されている。これらの文献中の手順は当該技術分野で周知であると考えられるが、読者の便宜のために提供されている。上記文献に含まれるすべての情報は、参照により本明細書に援用する、。

材料及び方法
プラスミド：
Salmonella Typhimurium株用の基礎となるプラスミドの作製のために、Ｓｓｐｈ２プロモーターと分泌シグナル（ａａ：１～２００）、あるいはｐａｇＣプロモーターとＳｓｐｈ１分泌シグナル（ａａ：１～２０８）をSalmonella Typhimuriumの弱毒化株VNP20009から増幅した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングキット（ｃａｔ．Ｅ５５２０Ｓ）を用いてＳｓｐｈ２及びｐａｇＣ－Ｓｓｐｈ１をｐＱＥ６０に挿入した。

目的タンパク質をＳｓｐｈ１又はＳｓｐｈ２のいずれかに融合させた。Pseudomonas aeruginosa用の基礎となるプラスミドの作製のために、目的のタンパク質をプラスミドｐＥＡＩ３－Ｓ５４（Ｂｅｒｔｒａｎｄ Ｔｏｕｓｓａｉｎｔ寄贈、ＰＭＩＤ：１７０１０６７０）のＥｘｏＳのＮ末端５４アミノ酸に融合させた。Bacillus Subtilis胞子用の基礎となるプラスミドの作製のために、目的タンパク質をＣｏｔＣ（Bacillus Subtilis 168から増幅）と融合させ、ｐＤＧ３６４プラスミドにクローニングした。加えて、タンパク質産物の検出を可能にするために、６Ｈｉｓタグエレメントを挿入した。

ネオアンチゲン：
Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍のネオアンチゲンを得るために、オボアルブミンのＣ末端（ａａ２５２～３８６）をｐｃＤＮＡ－ＯＶＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ ６４５９９）から増幅した。増幅されたオリゴは、オボアルブミンのエピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）に対応する配列を含む。

ＭＣ３８腫瘍のネオアンチゲンを得るために、Ａｄｐｇｋ（ａａ２８９～４２１）部分をＭＣ３８細胞のｃＤＮＡから増幅した。増幅されたオリゴは、Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．（ＰＭＩＤ： ２５４２８５０６）に基づいて検証されたＭＣ３８のネオアンチゲンに対応する配列を含む。

両方のネオアンチゲンを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングキットによってプラスミドバックボーンに挿入した。

細菌：
エレクトロポレーションにより、弱毒化Salmonella Typhimurium VNP20009株（ＹＳ１６４６とも命名、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．２０２１６５）及びSTM3210株を適切なプラスミドで形質転換した。まとめると、細菌をＯＤが０．６～０．８まで培養し、１ｍＭのＨｅｐｅｓで３回洗浄し、ＤＤＷ中の１０％グリセロールに懸濁した。懸濁液のエレクトロポレーションを０．２ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ、ＥＣ２）で行い、１ｍｌの冷たいＳＯＣに移動した。３７℃で１時間のインキュベーション後、細菌をアンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに植え付けた。選択されたコロニーをサンガー法のシーケンシング及び抗６Ｈｉｓタグ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、２３６５Ｓ）を用いたウエスタンブロットで立証した。

弱毒化pseudomonas aeruginosa (CHA-OST)は、Diver et al. PMID: 2126169
に記載のように形質転換を行った。Bacillus Subtilis PY79株は、コンピテントセルを誘導するための、最小培地及びＤＤＷ（ＭＣ：８０ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、３０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２％のグルコース、３０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、２２μｇ／ｍｌのクエン酸鉄アンモニウム、０．１％のカゼイン加水分解物（ＣＡＡ）、０．２％のグルタミン酸カリウム）中の０．０１ＭのＭＧＳＯ_４との３時間のインキュベーションの後に形質転換を行った。次に、ＣｏｔＣタンパク質に融合した抗原を含有するプラスミドｐＤＧ３６４をＸｂａで切断し、コンピテントな細菌と３時間インキュベートした。アミラーゼ遺伝子への導入の際には、５μｇ／ｍｌのクロランフェニコール耐性によってコロニーを選択した。

全ての形質転換において、選択したコロニーはサンガー法によるシーケンシングと抗６Ｈｉｓタグ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、２３６５Ｓ）を用いたウエスタンブロットとにより立証した。

Salmonella typhimuriumの凍結作業用ストック：
対数増殖期の培養物（ＯＤは０．６～０．８）を冷たいＰＢＳで２回洗浄した。細菌ペレットをＰＢＳ中の２５％ グリセロールに懸濁した。細菌ストックからのサンプルを段階希釈し、一部をＬＢ寒天プレートに植え付け、プールの残りを分注して－８０℃で保存した。細菌の生存を確認するために、凍結したアリコートを解凍し、ＬＢ寒天プレートに植え付けた。凍結後の回復率は、凍結／新鮮ＣＦＵ計数比を計算することで定量化した。マウス実験における細菌用量は、凍結培養物のＣＦＵ計数値に基づき計算した。

Bacillus Subtilis PY79の胞子形成：
ＰＹ７９を３７℃のＬＢでＯＤが０．８になるまで増殖させた。ＬＢ培地を除去し、半分の容量のＤＳＭ放出培地で置換した。培養物を３７℃、振盪下で６０時間インキュベートした。最後に細菌を冷たい水で２回洗浄した。胞子及び胞子形成率を定量するために、洗浄したサンプルから取り出したサンプルを、６５℃での加熱の前及び１時間後にＬＢ寒天プレートに植え付けた。加熱／非加熱ＣＦＵ計数値比は、胞子形成率の指標となる。放出培地調製物（１リットル当たり）： ８ｇのＤｉｆｃｏ栄養ブロス（ＢＤ、ｃａｔ．２３４０００）、１ｇのＫＣｌ及び１ｍＭのＭｇＳＯ_４をＤＤＷに溶解する。ＮａＯＨでｐＨ７．６に滴定し、オートクレーブする。使用前に１０μＭのＭｎＣｌ_２、１ｍＭのＣａ（ＮＯ_３）_２及び１ｍＭのＦｅＳＯ_４を添加する。

マウスモデル：
Ｂ１６－ＯＶＡマウス黒色腫細胞株（１０^６）又はＭＣ３８マウスＣＲＣ細胞株（１０^５）を、７週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６の右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積を、幅^２×長さ／２として計算した。

ＦＡＣＳによる脾細胞の免疫プロファイリング：
切除した新鮮な脾臓を７０ミクロンのストレーナーで冷ＰＢＳ中にすりつぶした。赤血球を溶解させるために、脾細胞をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１１８－１５６－１０１）にインキュベートし、次いでＰＢＳ中で十分に洗浄し、ＦＡＣＳ標識緩衝液中に懸濁した。１００μＬの脾細胞を、Ｆｃブロッカー（ＢＤ、カタログ番号５５３１４２、１：１００）、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）テトラマー（ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、１：５００）、抗ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４３８、１：８００）、抗ＣＤ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２０２１－０５－０５、１：４００）、抗ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２０２３－０７－３１、１：１０００）、及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ、カタログ番号５６６３４９、１：５）を含む混合物とともに４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を標識緩衝液で２回洗浄し、ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ溶液（ＢＤ、カタログ番号５１－２０９０ＫＺ）により４℃で２０分間固定した。最後に、細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ、カタログ番号５１－２０９１ＫＺ（ＤＤＷで１：１０に希釈））で２回洗浄し、標識緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳに供した。

ペプチド刺激による活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の定量
脾細胞を上述したように調製した。次に、脾細胞をＯＶＡペプチド（終濃度２．５μｇ／ｍｌ）と３７℃で２時間インキュベートした。次に、ブラフェルジンＡ（ＢＤ、５１－２３０１ｋｚ）を細胞に添加し、さらに４℃で４時間インキュベートした。翌日、ＣＤ３、ＣＤ８及びＩＮＦｇのＦＡＣＳ染色を上述したように実施した。

Ｅｘ ｖｉｖｏのキリングアッセイ
ＭＣ３８細胞又はＢ１６－ＯＶＡ細胞を４８穴プレートに植え付けた。細胞を３７℃で２０分間、ＣＦＳＥ（５μＭ）で染色し、その後、培養培地（１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ）により、３７℃で１０分間反応を停止させ、培養培地で２回洗浄した。

翌日、上述したように脾細胞を摘除し、細胞を計数した。次に１０^５個の脾細胞を腫瘍細胞と共培養し、３７℃で７２時間インキュベートした。

インキュベーションに続き、死亡／生存（ＤＥＡＤ／ＬＩＶＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３４９６２）及びＣＦＳＥ陽性（腫瘍細胞）のＦＡＣＳ染色を実施した。

ＥＬＩＳＡによるＩＦＮｇの定量：
血清ＩＦＮｇレベルを定量するために、マウスから、２０μＬのヘパリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むエッペンドルフチューブに採血した。１０，０００ｇで１０分間遠心分離した後、－２０℃での長期保存のために血清を新しいチューブに移した。製造業者の使用説明書（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ４８５）に従って１：４に希釈した血清を用いてＥＬＩＳＡを行った。

肝臓及び腫瘍における細菌の定量：
腫瘍及び肝臓の切片を、ＬＢ及び金属ビーズを含む滅菌チューブに懸濁した。最大速度で１０分間ボルテックスした後、２００μＬの上清を、適切な抗生物質を含むＬＢプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。

結果
個別化抗がんマイクロバイオーム支援ワクチン接種（ＰＡＣＭＡＮ）用のワクチンの効能を示すために、公知のネオアンチゲンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）である卵白アルブミンを発現する細菌を、卵白アルブミンタンパク質（Ｂ１６－ＯＶＡ）を発現するＢ１６黒色腫を保有するマウスに投与した。ＯＶＡ発現細菌ワクチンを作製するために、ＯＶＡネオアンチゲンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）を、Salmonella TyphimuriumのＳｓｐｈ２分泌シグナルに融合した。得られたオリゴマーをSalmonella Typhimuriumの弱毒化ＶＮＰ２０００９株（ＶＮＰ－ＯＶＡ）に形質転換した。Ｃ５７ＢＬ／６の右脇腹に１０^６個のＢ１６ ＯＶＡ発現細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを以下の処置コホートに振り分けた：無処置対照、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ１（マウス当たり７５μｇ、ｉ．ｐ．、週１回）を投与するマウス、及び抗ＰＤ１と共にＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡ（１０^６ ＣＦＵ、尾静脈）を投与するマウス。実験のタイムラインを図１の１Ａに示す。治療開始からの腫瘍増殖曲線を図１の１Ｂに示す。ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡコホートにおいて腫瘍増殖は２０日間停止したのに対し、他のマウスコホートにおいては対数増殖が観察された。２サイクルの免疫化に続き、ＶＮＰ－ＯＶＡコホート内の全てのマウスが他のコホー内のマウスよりも有意に長く生存した。

ワクチンの免疫原性を示すために、ＰＡＣＭＡＮワクチンの投与後にＢ１６－ＯＶＡ腫瘍を保有するマウスから脾細胞をプロファイリングした。ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡは、Salmonella Typhimuriumの弱毒化STM3210株のＳｓｐｈ２分泌シグナルに融合したＯＶＡネオアンチゲンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１１）を含んでいた。陰性の対照として、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞には存在しないＭＣ３８ネオアンチゲンであるＡｄｐｇｋ（ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ）でＯＶＡネオアンチゲンを置き換えた。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１０^６個のＢ１６ ＯＶＡ発現細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを以下の処置コホートに振り分けた：無処置対照、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ１（マウス当たり７５μｇ、ｉ．ｐ．、週１回）を投与するマウス、及び抗ＰＤ１と共にＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ（１０^６ ＣＦＵ、尾静脈）を投与するマウス。免疫化後１６日目に脾臓と肝臓をさらなる解析のために回収した。結果を図２の２Ａ～２Ｄに示す。

異なる弱毒化細菌に基づくＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡの交互投与の効果を試験するために、Ｂ１６－Ｏｖａ腫瘍を保有するマウスに、２種のＯＶＡネオアンチゲン発現弱毒化細菌の連続的なワクチン接種を行った。第１の細菌は、内在性プロモーター下にＳｓｈｐＨ２分泌シグナルと融合させたＯｖａネオアンチゲン、又はマクロファージによる食作用の際に誘導されるｐａｇＣプロモーター下にＳｓｐｈ１分泌シグナルと融合させたＯｖａネオアンチゲンのいずれかを発現するサルモネラの弱毒化株STM3210（ＳＴＭ－ＯＶＡ）である。第２の細菌は、３型分泌システム（ＴＴＳＳ）の毒物であるＥｘｏＳの分泌シグナルと融合させたＯｖａネオアンチゲンを発現するpseudomonas aeruginosaの弱毒化株CHA-OSTである。ＥｘｏＳプロモーターは、ＩＰＴＧによる誘導に続き、ＴＴＳＳ調節因子ＥｘｓＡによって活性化される（ＣＨＡ－ＯＳＴ－ＯＶＡ）。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１０^６個のＢ１６ ＯＶＡ発現細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを以下の処置コホートに振り分けた：無処置対照、チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ１（マウス当たり７５μｇ、ｉ．ｐ．、週１回）を投与するマウス、抗ＰＤ１と共にＳＴＭ－ＳｓｐＨ２－ＯＶＡを投与するマウス、及び抗ＰＤ１と共にＳＴＭ－ｐａｇＣ－ＳｓｐＨ１－ＯＶＡを投与するマウス。ワクチン接種したマウスを、３用量のＳＴＭ－ＯＶＡ（１０^６ ＣＦＵ、尾静脈）、続いて抗ＰＤ１（マウス当たり７５μｇ、ｉ．ｐ．、週１回）で処置した。最後のＳＴＭ－ＯＶＡワクチンから２週間後に、マウスを２用量のＣＨＡ－ＯＳＴ－ＯＶＡ（１０^７ ＣＦＵ、尾静脈、続いて０．５ｍＭのＩＰＴＧと３時間のインキュベーション）で処置した。図３の３Ｂに図示したように、ワクチン接種無しのマウスと比べて、ＳＴＭ－ＯＶＡによるワクチン接種を受けたマウスにおいて腫瘍増殖は有意に遅延した。ワクチン接種を受けたマウスの腫瘍の大部分はワクチン接種後２０～３０日で再び増殖し、同一細菌の追加注射は抗腫瘍免疫に十分には貢献しないことを示唆した。驚くべきことに、ＣＨＡ－ＯＳＴ－ＯＶＡによるマウスのワクチン接種は腫瘍増殖速度を低下させ、いくつかの例においては対数分解まで生じた。図３の３Ｃ及び３Ｄに示したように、各細菌投与に続き体重減少が認められたものの、同一細菌による追加ワクチン接種後には体重減少は少なくなり、これは、マウスが細菌に対して免疫を発達させ、その結果、クリアランスが速くなり、体重に対する影響が少なくなるという仮説を支持している。

ＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡのワクチン接種を受けたマウスの免疫記憶を試験するために、図３の３Ａに示した実験で完全治癒したマウスに１０^６個のＢ１６－Ｏｖａ細胞を再抗原接種し、その腫瘍増殖を、同量の細胞を注射したナイーブマウスと比較した。図４の４Ｂに図示したように、ナイーブマウスは注射後短期間で腫瘍の対数増殖を示したが、再抗原接種したマウスは腫瘍無しの状態を維持し、Ｂ１６－Ｏｖａ細胞に対する長期免疫記憶の確立を示した。

他のマウスモデルにおけるＰＡＣＭＡＮワクチンと天然のネオアンチゲンによる効能を示すために、ＭＣ３８モデルのＡｄｐｇｋネオアンチゲンを発現する細菌を、ＭＣ３８ ＣＲＣ腫瘍を保有するマウスで試験した。Ａｄｐｇｋ発現細菌ワクチンを作製するために、マクロファージによる食作用の際に誘導されるｐａｇＣプロモーター下に、ＡｄｐｇｋネオアンチゲンをSalmonella TyphimuriumのＳｓｐｈ１分泌シグナルと融合させた。次に弱毒化Salmonella Typhimurium株VNP20009をオリゴマーで形質転換した（ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１０^５個のＭＣ３８細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを以下の処置コホートに振り分けた：チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ１（マウス当たり７５μｇ、ｉ．ｐ．、週１回）を投与するマウス、抗ＰＤ１と共にＶＮＰ２０００９を投与するマウス、及び抗ＰＤ１と共にＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ（１０^６ ＣＦＵ、尾静脈）を投与するマウス。

ＰＡＣＭＡＮ－Ａｄｐｇｋのワクチン接種を受けたマウスの免疫記憶を試験するために、ＰＡＣＫＭＡＮ－Ａｄｐｇｋ又はＶＮＰ２０００９（ａｄｐｇｋ無）のワクチン接種に続いて完全治癒したマウスに対して、１０^５個のＭＣ３８細胞を再抗原接種し、その腫瘍増殖を、同量の細胞を注射したナイーブマウスと比較した。ナイーブマウスは注射後短期間で腫瘍の対数増殖を示したが、ＰＡＣＫＭＡＮ－Ａｄｐｇｋで再抗原接種したマウスは腫瘍無しの状態を維持し、ＭＣ３８細胞に対する長期免疫記憶の確立を示した。注目すべきは、ＶＮＰ２０００９のみによるワクチン接種に続いて完全治癒したマウスは、再抗原接種に続いて腫瘍増殖を示したが、これは、免疫記憶が細菌によるＡｄｐｇｋ提示の結果であることを示している（図５の５Ｃ）。

ＭＣ３８腫瘍に対するサルモネラの選択的ホーミングを実証するために、弱毒化サルモネラ（ＳＴＭ３１２０）を、記載の数でＭＣ３８ ＣＲＣ腫瘍を担持するマウスの尾静脈に注射した。９日後、腫瘍、肝臓及び脾臓を切除し、１ｍｌのＬＢ及び金属ボール中で激しく振とうした。上清をＬＢプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした後にコロニーを計数した。ＣＦＵを希釈係数及び組織質量に対して正規化した。１×１０^６、１×１０^５はＮ＝４であり、１×１０^４はＮ＝３である。図６に示すように、細菌は、肝臓及び脾臓と比較して腫瘍に選択的にホーミングした。

弱毒化サルモネラ（ＳＴＭ３１２０）対親サルモネラ（１４０２８）の最大耐容量を比較するために、サルモネラをさまざまな濃度で尾静脈に注射し、体重をモニターした。図７に示すように、ＳＴＭ３１２０の１０^６を除くすべての用量において、コホート（Ｎ＝４～図５）のすべてのマウスが死亡した（Ｘで示す）。

ＰＡＣＭＡＮワクチン接種に続く活性Ｔ細胞量を測定するために、脾細胞を以下のコホートから回収した：ナイーブマウス（Ｎ＝３）、Ｂ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウス（Ｎ＝５）、弱毒化サルモネラＳＴＭ３１２０を注射したマウス（Ｎ＝４）、非関連ネオアンチゲンであるＡＤＰＧＫを発現するＳＴＭ３１２０を注射したＢ１６ ＯＶＡ腫瘍保有マウス（Ｎ＝３）、ＯＶＡネオアンチゲンを発現するＳＴＭ３１２０を注射したＢ１６－ＯＶＡ腫瘍保有マウス（Ｎ＝５）。いずれの場合も、１０^６個（１ｅ６）の細菌を尾静脈に注射した。注射後１６日目に脾細胞を回収した。図８の８Ａは、適切なネオアンチゲンのワクチン接種に続くＩＦＮｇ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の増加を示す。

Ｔ細胞の殺腫瘍能力を定量するためのさらなる実験においては、ＭＣ３８腫瘍細胞又はＢ１６－ＯＶＡ腫瘍細胞を免疫細胞と区別するために、ＣＦＳＥ（緑色）とプレインキュベートした。回収した脾細胞を腫瘍細胞と共培養した。７２時間後、死んだ腫瘍細胞（ＣＦＳＥ陽性）を生存／死亡染色を用いたＦＡＣＳで定量した。有意なＢ１６－ＯＶＡ特異的な殺傷が、ＯＶＡネオアンチゲンを発現するＳＴＭ３１２０によるワクチン接種を受けたマウス由来の脾細胞に観察された（両側ｔ検定、Ｐｖａｌ＜０．００１）。

ＭＣ３８結腸直腸がんモデルにおいて、P. aeruginosaに基づくＰＡＣＭＡＮワクチンの免疫仲介効能を示すために、弱毒化P. aeruginosa、ナイーブＣＨＡ－ＯＳＴ、又はＡｄｐｇｋネオアンチゲン発現ＣＨＡ－ＯＳＴを尾静脈に注射し、続いて抗ＰＤ１処置を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１ｘ１０^５個のＭＣ３８結腸直腸がん細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスにＣＨＡ－ＯＳＴナイーブ又はＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫ（１ｘ１０^６ ＣＦＵ、ｉ．ｖ．）を注射し、続いて１５０μｇの抗ＰＤ１のｉ．ｐ．投与を毎週行った。図９の９Ａは、処置プロトコルを図示したものである。図９の９Ｂに図示したように、ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫワクチンの注射を受けたマウスのみが完全治癒を示した。注目すべきは、治癒したマウスにＭＣ３８細胞の再抗原接種を行っても、腫瘍増殖は見られなかった点である。

ＭＣ３８結腸直腸がんモデルにおいて、Bacillus Subtilisに基づくＰＡＣＭＡＮワクチンの免疫仲介効能を示すために、Ａｄｐｇｋネオアンチゲンを発現する実験株ＰＹ７９の胞子を尾静脈に注射又は経口投与（ｏｓ）し、続いてａＰＤ１処置を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に５ｘ１０^５個のＭＣ３８結腸直腸がん細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスに、ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫのバシルス胞子（５ｘ１０^８～１ｘ１０^９ ＣＦＵ、ｉ．ｖ．）を注射するか、又はその経口投与（５ｘ１０^９ ＣＦＵ、ｐ．ｏ．）を実施し、続いて１５０μｇの抗ＰＤ１のｉ．ｐ．投与を毎週行った。図１０の１０Ａは、処置プロトコルを図示したものである。図１０の１０Ｂに図示したように、ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫワクチンの注射を受けたマウスのみが完全治癒を示した。

ＭＣ３８結腸直腸がんモデルにおいて、サルモネラに基づくＰＡＣＭＡＮワクチン（凍結されていたもの）の免疫仲介効能を示すために、関連（Ａｄｐｇｋ）及び非関連（ＯＶＡ）のネオアンチゲンを発現する弱毒化Salmonella Typhimurium STM3210株を尾静脈に注射し、続いてａＰＤ１処置を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に１０^６個のＢ１６ ＯＶＡ発現細胞を注射した。腫瘍の体積が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスに、ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫ又はＰＡＣＭＡＮ－ＯＶＡ（３ｘ１０^６ ＣＦＵ、ｉ．ｖ．）を注射し、続いて７５μｇ／１５０μｇの抗ＰＤ１のｉ．ｐ．投与を毎週行った。図１１の１１Ａは、処置プロトコルを図示したものである。図１１の１１Ｂに図示したように、ＰＡＣＭＡＮ－ＡＤＰＧＫワクチンの処置を受けたマウスは腫瘍増殖のかなりの遅延を示した。

本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、このような代替、改変、及び変形はすべて、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるものとする。

本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により本明細書中に援用されることが言及されるときに具体的かつ個別に言及されているかのように、その全体が参照により本明細書中に援用されることは本出願人の意図である。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。章の見出しが使用される範囲において、当該見出しは必ずしも限定を加えるものと解釈されるべきではない。さらに、本出願の任意の優先権書類は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

配列番号１： がん関連抗原
配列番号２： がん関連抗原
配列番号３： 変異ＡＰＣ抗原の例
配列番号４： がん関連抗原
配列番号５： がん関連抗原
配列番号６： がん関連抗原
配列番号７： がん関連抗原
配列番号８： がん関連抗原
配列番号９： がん関連抗原
配列番号１０： がん関連抗原
配列番号１１： ＯＶＡネオアンチゲン
配列番号１２： がん関連抗原
配列番号１３： がん関連抗原
配列番号１４： がん関連抗原
配列番号１５： がん関連抗原
配列番号１６： がん関連抗原
配列番号１７： がん関連抗原
配列番号１８： がん関連抗原
配列番号１９： がん関連抗原
配列番号２０： がん関連抗原
配列番号２１： がん関連抗原
配列番号２２： ＢＲＣＡ変異エピトープの例
配列番号２３： ＢＲＣＡ変異エピトープの例
配列番号１７５： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号１９７： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号１９８： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号２１１： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号２２９： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号２５０： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号２５６： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号２９４： 未知の細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ
配列番号３１１： ユニバーサルＨＬＡ－ＤＲ結合Ｔヘルパー合成エピトープの例

Claims (25)

1. 少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された腫瘍ホーミング細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、ワクチン。
2. 前記細菌がグラム陽性細菌である、請求項１に記載のワクチン。
3. 前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載のワクチン。
4. 前記細菌が好気性細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
5. 前記細菌が嫌気性細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
6. 前記細菌が生細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
7. 前記細菌が弱毒化細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載のワクチン。
8. 前記細菌が、表１～表３のいずれかに記載の種又は属の細菌である、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン。
9. 前記細菌のゲノムが、配列番号２４～３１０のいずれか１つに記載の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン。
10. 前記がん関連抗原がネオアンチゲンである、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン。
11. 前記細菌が、治療用タンパク質を発現するための遺伝子改変を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチン。
12. 前記治療用タンパク質がサイトカインである、請求項１１に記載のワクチン。
13. アルミニウム塩を不含有である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン。
14. 前記担体がアジュバントを不含有である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のワクチン。
15. がんの治療が必要な対象において、がんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチンを前記対象に投与して前記がんを治療することを含む、方法。
16. 治療を必要とする対象のがんを治療する方法であって、対象に治療有効量の下記成分（ｉ）を投与し、続いて下記成分（ｉｉ）を投与し、がんを治療する方法。
    （ｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第１の細菌を含む第１のワクチン、及び
    （ｉｉ）少なくとも１種のがん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第２の細菌を含む第２のワクチン。
17. 前記第１の細菌が生細菌であり、前記第２の細菌が死細菌である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１の細菌が、がん関連抗原を発現するように遺伝子改変された第１の細菌株を含み、前記第２の細菌が、前記第１の細菌株と非同一な第２の細菌株を含み、前記第２の細菌が、前記がん関連抗原を発現するように遺伝子改変されている、請求項１６に記載の方法。
19. 前記がんが、乳がん、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、骨がん、及び脳がんからなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の方法。
20. 前記脳がんが、膠芽細胞腫である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１のワクチンの前記少なくとも１種のがん関連抗原が、前記第２のワクチンの前記少なくとも１種のがん関連抗原と同一である、請求項１６に記載の方法。
22. 前記第１のワクチンの前記少なくとも１種のがん関連抗原が、前記第２のワクチンの前記少なくとも１種のがん関連抗原と非同一である、請求項１６に記載の方法。
23. がんの予防が必要な対象において、がんを予防する方法であって、予防有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載のワクチンを前記対象に投与して前記がんを予防することを含む、方法。
24. 前記がんが、乳がん、黒色腫、結腸直腸がん、胃がん、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、骨がん、及び脳がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記脳がんが、膠芽細胞腫である、請求項２４に記載の方法。