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Die
Erfindung betrifft eine Trägerplatte zum Einsatz als Träger
einer Zellsuspension bei der Elektroporation, eine Vorrichtung zur
Elektroporation einer Zellsuspension mit einer derartigen Trägerplatte sowie
ein Verfahren zur Elektroporation einer Zellsuspension.
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Molekularbiologische
Laboratorien verwenden Elektroporationen klassischerweise im „Einzelbatchverfahren”,
also mit einer Zellsuspension pro Träger. Ein Vorteil der
Elektroporation ist die Möglichkeit, prinzipiell alle Zelltypen
transfizieren zu können. Dies macht die Technologie für
das Hochdurchsatzscreening von ansonsten nicht oder schwierig zu transfizierenden
Zellen interessant.
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Vor
diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine
Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die eine schnelle
und effiziente Durchführung der Elektroporation ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird durch den Gegenstand der nebengeordneten Ansprüche
gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen
und in dem hier nachfolgenden Beschreibungstext angegeben.
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Die
Erfindung geht von dem Grundgedanken aus, die Oberflächenspannung
der Zellsuspension zur Bildung der Probenkompartimente zu nutzten,
innerhalb der die Elektroporation durchgeführt werden soll.
Erfindungsgemäß wird hierzu eine Trägerplatte vorgeschlagen,
die eine Trägeroberfläche aufweist, die zumindest
einen Benetzungsbereich aufweist, der mit einer Zellsuspension benetzbar
ist, und die zumindest einen den Benetzungsbereich umgebenden Abweisungsbereicht
aufweiset, der nicht mit der Zellsuspension benetzbar ist. Werden – wie
in der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen – zwei derartige
Trägerplatten einander gegenüberliegend angeordnet,
so kann ein Probenkompartiment dadurch ausgebildet werden, dass
die Zellsuspension den Benetzungsbereich der einen Trägerplatte
benetzt, den Benetzungsbereich der gegenüberliegenden Trägerplatte
benetzt und in dem zwischen dem Trägerplatten vorgesehen
Fluid aufgrund der Oberflächenspannung der Zellsuspension
die weiteren Begrenzungen des Probenkompartiements ausgebildet werden.
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Die
erfindungsgemäße Trägerplatte weist eine
Elektrode auf, über die an den Benetzungsbereich ein elektrisches
Potential angelegt werden kann. Dies ermöglicht es, bei
zwei gegenüberliegend angeordneten Trägerplatten
ein elektrisches Feld über die zwischen den Trägerplatten
gehaltene Zellsuspension zu erzeugen und damit die Elektroporation
durchzuführen.
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Der
mit der Zellsuspension benetzbare Benetzungsbereich der Trägeroberfläche
kann sowohl durch die Oberflächenchemie als auch durch
die topographische Strukturierung der Oberfläche oder durch
eine Kombination beider Maßnahmen ausgebildet werden. So
kann der Benetzungsbereich dadurch gebildet werden, dass er durch
eine erste Teiloberfläche gebildet wird und dass der an
diese Teiloberfläche angrenzende Abweisungsbereich durch eine
Oberfläche gebildet wird, die sich unter Bildung einer
Kante im Winkel zu der dem Benetzungsbereich bildenden Teiloberfläche
erstreckt, beispielsweise in einem Winkel von 90° zu der
Ebene, in der die Teiloberfläche liegt. Bei dieser Ausführungsform der
Erfindung, bei der der Benetzungsbereich dadurch gebildet wird,
dass der den Abweisungsbereich bildende Oberflächenbereich
unter Bildung einer Kante im Winkel zu der den Benetzungsbereich bildenden
Teiloberfläche verläuft, ist die Oberfläche des
Abweisungsbereichs vorzugsweise in einem Winkel von > 15°, insbesondere
bevorzugt einen Winkel von > 30°,
besonders bevorzugt in einem Winkel von > 45° und insbesondere in einem
Winkel von im wesentlichen 90°, bzw. 90° zu der
Teiloberfläche ausgebildet, die den Benetzungsbereich bildet.
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Alternativ
oder ergänzend wird der Benetzungsbereich der Trägeroberfläche
durch einen Oberflächenbereich gebildet, der derart ausgestaltet ist,
dass die Zellsuspension beim Benetzen dieses Benetzungsbereichs
einen ersten Kontaktwinkel ausbildet und dass die Oberfläche
des Abweisungsbereichs derart ausgebildet ist, dass die Zellsuspension beim
Kontakt mit dem Abweisungsbereich einen zweiten Kontaktwinkel ausbildet,
wobei der erste Kontaktwinkel kleiner ist als der zweite Kontaktwinkel.
Unter einem Kontaktwinkel wird dabei der Winkel bezeichnet, den
die Oberfläche eines Flüssigkeitstropfens auf
einer Oberfläche eines Feststoffs zu dieser Feststoff-Oberfläche
bildet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind der Benetzungsbereich
und der Abweisungsbereich derart aufeinander abgestimmt, dass ein
im Bereich des Benetzungsbereichs auf die Trägeroberfläche aufgetropfter
Tropfen der Zellsuspension sich nicht weiter über die Trägeroberfläche
ausdehnt, als die Grenze zwischen dem Benetzungsbereich und dem Abweisungsbereich.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Benetzungsbereich
derart angeordnet, daß er sich nicht in einer Ausnehmung
der Trägerplatte befindet.
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Für
die Möglichkeit, den Benetzungsbereich durch Wahl der Oberflächenchemie
oder der topographischen Struktur der Oberfläche für
die Benetzung geeignet auszugestalten, wird insbesondere auch auf
EP 1 257 046 A1 ,
WO 03/070364 A1 und
WO 03/071274 A1 verwiesen,
deren Inhalt durch Bezugnahme als Beschreibung der Möglichkeit
der Ausgestaltung der Oberfläche des Benetzungsbereichs
einer erfindungsgemäßen Trägerplatte
Teil dieser Erfindungsbeschreibung bildet. Gleiches gilt für
die Herstellung ortsdefinierter benetzter Bereiche in einer ansonsten
unbenetzbaren Umgebung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Trägerplatte
aus einem transparenten Material. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Trägerplatte aus Glas oder aus Kunststoff, insbesondere
bevorzugt transparentem Glas oder transparentem Kunststoff.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist der Benetzungsbereich
der Trägerfläche derart ausgebildet, dass eine
Zellsuspension an diesem Benetzungsbereich einen hängenden
Tropfen ausbilden kann, die Trägerplatte die Zellsuspension
somit auch hängend tragen kann.
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Die
erfindungsgemäße Trägerplatte weist eine
Elektrode auf, über die an den Begrenzungsbereich ein elektrisches
Potential angelegt werden kann. Die Elektrode kann beispielsweise
Teil der Trägeroberfläche sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist die Elektrode jedoch durch einen innerhalb
der Trägerplatte vorgesehenen Materialbereich gebildet
und bildet nicht einen Teil der Trägeroberfläche
der Trägerplatte. Hierdurch wird die Elektrode geschützt.
Ferner wird es hierdurch konstruktiv einfacher, einen Benetzungsbereich
an der Trägeroberfläche auszubilden. Als Elektrode
kann eine leitfähige Schicht dienen. Diese kann unmittelbar
unterhalb derjenigen Schicht ausgebildet sein, die die Trägeroberfläche
ausbildet.
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Als
Materialien der leitfähigen Schichten dienen vorzugsweise
leitfähige transparente Schichten wie beispielsweise dotierte
Oxidschichten aus der Gruppe Zinkoxid ZnO, Indiumoxid In2O3 und Zinnoxid SnO2. Ein Vertreter dieser Gruppe ist Zinn-dotiertes Indiumoxid
(ITO, In2O3:Sn).
Weitere Beispiele sind Aluminium- oder Gallium-dotiertes Zinkoxid
(AZO, ZnO:Al bzw. GZO, ZnO:Ga). Ein Überblick über
Materialien dieser Art findet sich in der Schrift von P.
P. Edwards, A. Porch, M. O. Jones, D. V. Morgan und R. M. Perks; „Basic
materials physics of transparent conducting oxides", Dalton
Trans., 2004, 2995–3002, die durch Bezugnahme
als Beschreibung der Möglichkeit der Ausbildung leitfähiger
Schichten bei der erfindungsgemäßen Trägerplatte
Teil dieser Erfindungsbeschreibung bildet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform weist eine Trägerplatte
eine Mehrzahl von Benetzungsbereichen auf, die jeweils von einem
Abweisungsbereich umgeben sind. Derartig ausgebildete Trägerplatten
lassen sich in Vorrichtungen einsetzten, mit denen mehrere Zellsuspension
pro Trägerplatte einer Elektroporation unterzogen werden.
Dies führt zu einer schnellen und effizienten Durchführung
der Elektroporation bei einer Vielzahl von Proben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist die Mehrzahl von
Benetzungsbereichen in einem regelmäßigen Muster
auf der Trägeroberfläche ausgebildet. Es ist möglich,
dass die Benetzungsbereiche auf Kreislinien um einen gemeinsamen
Mittelpunkt ausgebildet sind. Auch andere Muster sind denkbar. Besonders
bevorzugt sind die Benetzungsbereiche jedoch an den Schnittpunkten
der Linien eines quadratischen oder rechteckigen Gitternetzmusters
vorgesehen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind die Benetzungsbereiche
in einem Muster ausgebildet, dass eine Anzahl von parallel zueinander
angeordneten Reihen aufweist, wobei bei dieser Ausführungsform
eine der Anzahl von Reihen entsprechende Anzahl von Elektroden vorgesehen
sein kann, die parallel zueinander angeordnet sind. Beispielsweise können
die Elektroden bei einem quadratischem oder rechteckigen Gitternetzmuster
den Gitternetzlinien folgend angeordnet sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind in dem Muster pro
Reihe gleich viele Benetzungsbereiche vorgesehen. Es ist aber auch
möglich, ein Muster mit einer Anzahl von parallel zueinander
angeordneten Reihen von Benetzungsbereichen vorzusehen, bei denen
pro Reihe eine unterschiedliche Zahl von Benetzungsbereichen vorgesehen
ist, beispielsweise um die Oberfläche einer Trägerplatte möglichst
effizient zu nutzen, wenn die Trägerplatte keine quadratische
oder rechteckige Oberfläche aufweist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Benetzungsbereiche
die gleiche Form auf. Beispielsweise sind alle Benetzungsbereiche
quadratisch oder beispielsweise alle Benetzungsbereiche ringförmig
oder alle Benetzungsbereiche kreisförmig ausgebildet. In
einer bevorzugen Ausführungsform weisen alle Benetzungsbereiche
die gleiche Fläche auf.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Trägerplatte
eine sie umgreifende oder in sie eingreifende Führungsschiene
und/oder eine Aufnahme für eine Führungsschiene
aufweisen. Eine an der Trägerplatte vorgesehene oder an
der Trägerplatte angreifende Führungsschiene kann
dazu verwendet werden, den Abstand zwischen einer ersten Trägerplatte
und einer zweiten Trägerplatte auf ein gewünschtes
Maß einzustellen und/oder die Trägerplatten in
der jeweiligen Lage zueinander zu halten. Allerdings sind auch andere
Möglichkeiten zur relativen Positionierung einer ersten
Trägerplatte relativ zu einer zweiten Trägerplatte
denkbar. Ferner kann eine Führungsschiene dazu dienen,
eine erste Trägerplatte und eine zweite Trägerplatte
genau so zueinander auszurichten und ggf. zu halten, dass die Benetzungsbereiche
der beiden Trägerplatten einander genau gegenüberliegend
angeordnet sind.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung zur Elektroporation
einer Zellsuspension weist mindestens zwei erfindungsgemäße
Trägerplatten auf. Die Trägerplatten sind vorzugswei se
lösbar mit einem Grundkörper der Vorrichtung verbunden.
Die Trägerplatten werden derart in der Vorrichtung gehalten, daß sie
einander gegenüberliegend angeordnet sind, so dass die
Trägeroberfläche einander zugewandt sind und ein
Benetzungsbereich auf der einen Trägerplatte einem Benetzungsbereich
auf der gegenüberliegenden Trägerplatte gegenüberliegend
angeordnet ist.
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Die
Verbindung der Trägerplatten mit dem Grundkörper
der Vorrichtung kann zum einen dadurch erfolgen, dass jede Trägerplatte
mit einem eigenen Halter an dem Grundköper gehalten wird.
Alternativ kann auch nur die eine Trägerplatte über
eine Halterung mit dem Grundkörper verbunden werden, während
die zweite Trägerplatte über eine Führungsschiene
oder andere Mittel fest mit der ersten Trägerplatte verbunden
wird. Dadurch ist die zweite Trägerplatte über
die erste Trägerplatte mit dem Grundkörper der
erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße
Vorrichtung elektrische Kontakte auf. Ein Kontakt kann mit der Elektrode,
bzw. den Elektroden einer Trägerplatte verbunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung
eine Treiberschaltung auf, die die Spannungsversorgung der elektrischen
Kontakte übernimmt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung werden Trägerplatten, bei denen die jeweilige
Trägerplatte mehrere parallel zueinander angeordnete Elektroden
aufweist, derart gegenüberliegend in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
angeordnet, dass die Elektroden der einen Trägerplatte
in einem Winkel von > 0° und < 180° zu
den Elektroden der anderen Trägerplatte angeordnet sind.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel sind
die Elektroden der einen Trägerplatte in einem Winkel von
90° zu den Elektroden der anderen Trägerplatte
angeordnet.
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Damit
bilden die Elektroden jeweils eine Spalte bzw. eine Reihe einer
matrixförmig angeordneten Mehrzahl von Benetzungsbereichen.
Dadurch können die einzelnen zwischen den gegenüberliegend
angeordneten Benetzungsbereichen ausgebildeten Probenkompartimenten
einzeln angesteuert werden. Dadurch lassen sich an den verschiedenen Probenkompartimenten
der Matrix nacheinander vorgewählte elektrische Felder
einstellen. Dieses Prinzip ist für die Adressierung von
Bildpixel in passiven Matrixdisplays bekannt. Für die Ansteuerung
wird auf die Schrift von D. Metzdorf, „Organische
passive Matrixdisplays", Couviler, 2003, verwiesen,
die durch Bezugnahme als eine Beschreibung der möglichen Ansteuerung
in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung Teil dieser
Erfindungsbeschreibung bildet.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden zwischen
den Zeilen – und Spalten-Elektroden hohe Isolationwiderstände
erzeugt. Somit lässt sich bei einem Pulsbetrieb erreichen, dass
nur die Kapazität des jeweils angesteuerten Probenkompartiments
auf eine vorgesehene Spannung aufgeladen wird. Die Kapazitäten
der übrigen Probenkompartimente einer jeweiligen Zeile
und einer jeweiligen Spalte, wie auch die der übrigen Zeilen und
Spalten, sind auch nach dem Spannungspuls praktisch noch nicht geladen
und besitzen eine Spannung viel kleiner als 1 Volt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Elektroporation
einer Zellsuspension weist die folgenden Schritte auf:
- a) Einbringen der Zellsuspension zwischen zwei erfindungsgemäße
Trägerplatten, so das die Zellsuspension einen Benetzungsbereich
auf der einen Trägerplatte und einen Benetzungsbereich auf
der gegenüberliegenden Trägerplatte benetzt und
- b) Erzeugen eines elektrischen Felds über die Zellsuspension
mittels der Elektroden.
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Für
das Einbringen der Zellsuspension zwischen zwei erfindungsgemäße
Trägerplatten sind verschiedene Vorgehensweisen möglich.
Diese Vorgehensweisen unterscheiden sich inbesondere dadurch, wie
die Zellsuspension auf der jeweiligen Trägerplatte aufgebracht
wird, bevor die Trägerplatten in die einander gegenüberliegende,
benachbarte Lage gebracht werden.
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Die
Zellsuspension kann als liegender Tropfen auf der einen Trägerplatte
vorliegen, während die zweite Trägerplatte zunächst
unbenetzt ist. Werden diese beiden Trägerplatten in die
einander gegenüberliegende, benachbarte Lage gebracht,
benetzt der zunächst nur auf der einen Trägerplatte
liegende Tropfen auch den Benetzungsbereich der zweiten Trägerplatte.
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Die
Zellsuspension kann als hängender Tropfen auf der einen
Trägerplatte vorliegen, während die zweite Trägerplatte
zunächst unbenetzt ist. Werden diese beiden Trägerplatten
in die einander gegenüberliegende, benachbarte Lage gebracht,
benetzt der zunächst nur an der einen Trägerplatte
hängende Tropfen auch den Benetzungsbereich der zweiten
Trägerplatte.
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Die
Zellsuspension kann als hängender Tropfen auf der einen
Trägerplatte und als liegender Tropfen an der zweiten Trägerplatte
vorliegen. Werden diese beiden Trägerplatten in die einander
gegenüberliegende, benachbarte Lage gebracht, vermischen
sich die beiden Tropfen.
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Das
zu transfizierende Molekül, vornehmlich eine Nukleinsäure
(DNA, RNA, einzelsträngig oder doppelsträngig,
z. B. auch siRNA, aber auch ein anderes biologisch relevantes Molekül
wie Proteine, Peptide oder pharmazeutische Wirksubstanzen) kann sich
bereits in demselben Tropfen befinden. Alternativ kann sich das
zu transfizierende Molekül in einem auf der gegenüberliegenden
Trägerplatte vorgesehenen Tropfen befinden, so daß es
erst durch die Vermischung der Tropfen in eine Suspension mit der
gewünschten Zusammensetzung gelangt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wird das elektrische
Feld wiederholt und/oder impulsartig über die Zellsuspension
erzeugt.
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Durch
nacheinander durchgeführte Änderungen der Spannungspulse
an den Zeilen- und Spaltenelektroden sowie der hochohmigen Beschaltung
der obigen Elektroden lassen sich die elektrischen Felder aller
Probenkompartimente wahlweise einstellen, wie dies auch im Multiplexverfahren
der Adressierung von Matrixdisplays bekannt ist. Die technischen
Einzelheiten dieses speziellen Multiplex-Verfahrens, das sog. Triplex-Verfahren,
bei der als ein dritter Elektrodenzustand die „offene” hochohmige
Beschaltung verwendet wird, sind in der Schrift von U. Tietze,
C. Schenk: „Halbleiter – Schaltungstechnik",
12. Auflage, 2002 dargestellt, die durch Bezugnahme als
eine Beschreibung für eine mögliche Adressierung
der Zeilen- und Spaltenelektrode in einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung Teil dieser Erfindungsbeschreibung bildet.
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Für
die Betriebsweise der aus Benetzungsbereichen gebildeten Probenmatrix
ist es vorteilhaft, dass die Permeabilität der Zellmembranen
als Funktion der angelegten Feldstärke ein Schwellverhalten besitzt.
Erst ab einer bestimmten kritischen Feldstärke erhöht
sich mit zunehmender Feldstärke innerhalb eines kleinen
Intervalls die Permeabilität sehr stark, um anschließend
in ein Sättigungsverhalten überzugehen. Dies ist
beispielhaft für Ovariarzellen des Chinesischen Hamsters
in der Veröffentlichung von H. Wolf et al.; „Control
by pulse parameters of electric field-mediated gene transfer in
mammalian cells", Biophysical Journal 66, 524 (1994), Seite
526, 1 gezeigt, die durch Bezugnahme
als eine Beschreibung für eine mögliche Vorgehensweise
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Teil dieser
Erfindungsbeschreibung bildet. Durch dieses Schwellverhalten können
sich sehr niedrige elektrische Felder an Probenkompartimenten, die
u. U. nie ganz vermieden werden können, nicht nachteilig
im Sinne einer unkontrollierten Transfektion auswirken.
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Bei
der Elektroporation wird durch das Anlegen eines oder mehrerer kurz
aufeinander folgender elektrischer Impulse die Permeabilität
der Zellmembran reversibel kurzfristig so stark erhöht,
dass größere DNA-, bzw. RNA-Moleküle
in die Zellen eindringen können. Die Effizienz der Elektroporation
kann von verschiedenen Parametern abhängen. Diese sind beispielsweise:
Die Stärke des angelegten elektrischen Feldes, die Dauer
des elektrischen Impulses, die Anzahl der Pulse, die Verzögerung
von aufeinander folgenden Pulse, die verwendete DNA-, bzw. RNA-Konzentration
sowie das verwendete Elektroporationsmedium.
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Um
eine maximale Elektroporationseffizienz zu erreichen, werden diese
Parameter vorzugsweise für den jeweiligen Zelltyp speziell
eingestellt. Die jeweiligen Parameter lassen sich insbesondere bevorzugt
durch Versuchsreihen ermitteln. Beispielhaft hierfür ist
die bereits genannte Veröffentlichung von H. Wolf
et al.; „Control by pulse parameters of electric field-mediated
gene transfer in mammalian cells", Biophysical Journal
66, 524 (1994).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wird nach dem Erzeugen
des elektrischen Feldes die Zellsuspension mit einem serumhaltigen
Kulturmedium versetzt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform werden die Trägerplatten
nach dem Erzeugen des elektrischen Feldes separiert. Anschließend
werden die Proben der Einzelträger mit serumhaltigen Kulturmedium
versetzt. Dazu werden bereits vorbereitete Trägerplatten,
in die Kulturmediumtropfen an ihren Benetzungsbereichen halten mit
den Zellproben haltenden Trägerplatten zu einem Verbund
verbunden.
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Im
Falle von suspendierten Zellen kann nach dem Verbinden mit einer
Trägerplatte mit Kulturmedium etwa hier die Hälfte
der behandelten Zellen auf je einer Trägerplatte in das
Kulturmedium überführt werden. Im Falle von adhärenten
Zellen kann durch die Auswahl der entsprechenden Trägerplatten
die Gesamtheit der Zellen jeder Probe in ein einzelnes Kompartiment
mit Kulturmedium überführt werden.
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Die
erfindungsgemäße Trägerplatte, die erfindungsgemäße
Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren
werden insbesondere bevorzugt für wäßrige
Zellsuspensionen verwendet.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand einer lediglich Ausführungsbeispiele
darstellenden Zeichnung näher erläutert. Darin
zeigen:
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1 zwei
erfindungsgemäße Trägerplatten mit einander
zugewandten Trägeroberflächen in einer schematischen
Seitenansicht;
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2 die
Trägerplatten gemäß 1 in
einer Anordnung, die es ermöglicht, dass die Zellsuspension
sowohl einen Benetzungsbereich auf der einen Trägerplatte
als auch einen Benetzungsbereich auf der gegenüberliegenden
Trägerplatte benetzt;
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3 eine
Detailansicht eines Benetzungsbereichs einer erfindungsgemäßen
Trägerplatte in Gegenüberlage zu einem Benetzungsbereich
einer zweiten erfindungsgemäßen Trägerplatte
in einer Seitenansicht;
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3a eine
Detailansicht eines alternative ausgestalteten Benetzungsbereichs
einer erfindungsgemäßen Trägerplatte
in Gegenüberlage zu einem Beneetzungsbereich einer zweiten
erfindungsgemäßen Trägerplatte in einer
Seitenansicht;
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4 eine
Draufsicht auf zwei erfindungsgemäße Trägerplatten
mit Elektroden, die in einem Winkel von 90° zueinander
angeordnet sind;
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5 eine
beispielhafte elektrische Beschaltung der Elektroden der in 4 gezeigten
Trägerplatten und
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6 eine
erfindungsgemäße Vorrichtung in einer schematischen
Ansicht.
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1 zeigt
zwei erfindungsgemäße Trägerplatten 2a, 2b.
An der Trägeroberfläche 20a, 20b der Trägerplatte 2a, 2b sind
vier Benetzungsbereiche 5 ausgebildet, die mit einer Zellsuspension 3a, 3b benetzbar
sind. Ferner sind Abweisungsbereiche 4 vorgesehen, die
die Benetzungsbereiche 5 umgeben und die nicht mit der
Zellsuspension benetzbar sind.
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2 zeigt
die Zusammenführung der erfindungsgemäßen
Trägerplatten 2a, 2b gemäß 1 entlang
der in 1 dargestellten Pfeile. Das Zusammenführen
der Trägerplatten 2a, 2b bewirkt, dass
die hängenden Tropfen 3a und die liegenden Tropfen 3b zusammengeführt
werden und ein Probenkompartiment 7 bilden. Die Probenkompartimente 7 sind durch
die Benetzungsbereiche 5 der Trägerplatten 2a und 2b sowie
die umgebende Luft 8 ringförmig begrenzt. Die
Oberflächenspannung der Zellsuspension bildet somit gegenüber
der Luft 8 eine der Begrenzungen des Probenkompartiments 7 aus.
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Der
Abstand dEP der Trägerplatten 2a, 2b lässt
sich durch einen Abstandhalter 9 genau einstellen. Eine
Führungsschiene 10 stellt dabei sicher, dass die
entsprechenden auf den Trägerplatten fixierten Flüssigkeitstropfen 3a und 3b beim
Zusammenfügen genau übereinander angeordnet sind.
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3 zeigt
Benetzungsbereiche 5a und 5b zweier gegenüberliegenden
Trägerplatten 2a, 2b. Die Benetzungsbereiche 5a, 5b sind
von Abweisungsbereichen 4a, 4b umgeben. Unterhalb
derjenigen Schichten die die Benetzungsbereiche 5a, 5b bzw.
die Abweisungsbereiche 4a, 4b bilden, sind Schichten
vorgesehen, die die Elektroden 11a und 11b nahe
der Trägeroberfläche der Trägerplatten 2a und 2b erzeugen.
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3a zeigt
eine alternative, bzw. ergänzende Möglichkeit
zur Ausgestaltung der Benetzungsbereichs 5a. So kann der
Benetzungsbereich 5a dadurch gebildet werden, dass er durch
eine erste Teiloberfläche gebildet wird und dass der an
diese Teiloberfläche angrenzende Abweisungsbereich 4 durch eine
Oberfläche gebildet wird, die sich unter Bildung einer
Kante im Winkel zu der dem Benetzungsbereich 5a bildenden
Teiloberfläche erstreckt. In der 3a beträgt
dieser Winkel 90°.
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4 zeigt – nebeneinander
liegend angeordnet – Trägerplatten 2a, 2b.
Die Trägerplatten 2a, 2b werden vorzugsweise
so zusammengeführt, dass die in den Trägerplatten
vorgesehen Elektroden 11a, 11b, die in 4 dargestellte
matrixförmige Anordnung in Form von Spalten und Reihen
ausbilden. Auf diese Weise können die einzelnen Probenkompartimente 7 anhand
dieser Zeilen- und Spaltenelektroden 11a und 11b einzeln
angesteuert werden.
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5 zeigt
eine beispielhafte elektrische Beschaltung der Elektroden 11a und 11b in
Zeilen Z und Spalten S. Elektrode Z2 liegt
auf einem Potential –V, während Elektrode S2 auf einem Potential V liegt. Am Probenkompartiment
Z2, S2 ergibt sich
somit eine Spannungsdifferenz 2 Volt. Stellt man durch die Art der
Beschaltung und hinreichend hohe Isolationswidestände der
Zeilen- und Spaltenelektroden sicher, dass die mit „0” gekennzeichneten
Zeilen und Spalten hochohmig gegen Z2 und
S2 sind, so lässt sich im Pulsbetrieb
erreichen, dass nur die Kapazität des Probenkompartiments
Z2, S2 auf eine
Spannung 2 V geladen wird. Die Kapazitäten der übrigen
Probenkompartimente der Zeilen Z2 und Spalte
S2, sowie auch die der übrigen
Zellen und Spalten sind nach dem Spannungspuls praktisch noch nicht
geladen und besitzen eine Spannung viel kleiner V.
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Die 6 zeigt
die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem nicht
dargestellten Grundkörper. Die Zeilen- und Spaltenelektroden 11a und 11b einer wie
in 2 im Querschnitt schematisch gezeigten Probenmatrix 12 werden
mit Hilfe geeigneter Kontakte 13 und 14 und einer
Treiberschaltung 15 versorgt. Die Treiberschaltung 15 übernimmt
die Spannungsversorgung und Adressierung der Probenkompartimente.
Ein Prozessrechner 16 führt nacheinander die Elektroporation
aller Probenkompartimente der Probenmatrix mit vorgewählten
Parametern wie Stärke des elektrischen Feldes, Dauer eines
elektrischen Impulses, Anzahl der elektrischen Impulse eines Probenkompartiments,
zeitliche Verzögerung zweier elektrischer Impulse eines
Probenkompartiments durch. Zuvor werden für die verwendeten
Probenkompartimente die DNA bzw. RNA Konzentration und das verwendete
Elektroporationsmedium eingestellt.
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Die
erforderliche zeitliche Durchführung der Elektroporation
einer Probenmatrix kann für eine Einzelpulsdauer im Bereich
von Millisekunden bei einigen Sekunden pro 1000 Proben liegen. Eine
Matrix mit beispielsweise 192×128 ist gleich 24.576 Proben, kann
somit in einer Zeit unter einer Minute behandelt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 1257046
A1 [0010]
- - WO 03/070364 A1 [0010]
- - WO 03/071274 A1 [0010]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - P. P. Edwards,
A. Porch, M. O. Jones, D. V. Morgan und R. M. Perks; „Basic
materials physics of transparent conducting oxides”, Dalton
Trans., 2004, 2995–3002 [0014]
- - D. Metzdorf, „Organische passive Matrixdisplays”,
Couviler, 2003 [0025]
- - U. Tietze, C. Schenk: „Halbleiter – Schaltungstechnik”,
12. Auflage, 2002 [0034]
- - H. Wolf et al.; „Control by pulse parameters of electric
field-mediated gene transfer in mammalian cells”, Biophysical
Journal 66, 524 (1994), Seite 526 [0035]
- - H. Wolf et al.; „Control by pulse parameters of electric
field-mediated gene transfer in mammalian cells”, Biophysical
Journal 66, 524 (1994) [0037]