DE102008012760A1

DE102008012760A1 - Vorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen

Info

Publication number: DE102008012760A1
Application number: DE200810012760
Authority: DE
Inventors: Jonathan Dipl.-Ing. Derix; Gerald Prof. Dr.-Ing. Habil. Gerlach; Richard Prof. Dr. Med. Funk; Susanne Wetzel
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2009-09-10
Anticipated expiration: 2028-02-28
Also published as: DE102008012760B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur direkten elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen (8) und Zellverbünde, aufweisend eine Auflagefläche für die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde sowie einen oder mehrere elektrische Anschlüsse (7) zu deren Kontaktierung. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass gegenüber der Auflagefläche eine Kanalplatte (4) mit voneinander getrennten Kanälen (10) zur Aufnahme eines Elektrolyten (11) vorgesehen ist, und der Elektrolyt (11) mit den elektrischen Anschlüssen (7) niederohmig verbunden ist, die Kanäle (10) in der Kanalplatte (4) mit einer isolierenden Membran (2) abgedeckt sind, wobei die Membran mehrere Öffnungen (3) zu den Kanälen (10) aufweist, die isolierende Membran (2) mit einer porösen Membran (1) mit einer Vielzahl kleinerer Öffnungen bedeckt ist, die die Auflagefläche für die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde bildet, so dass die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde auf der Auflagefläche durch die sich überdeckenden Öffnungen in der porösen Membran (1) und der Membran (2) mit Elektrolyten (11) in den Kanälen (10) niederohmig verbunden und somit mit den elektrischen Anschlüssen (7) kontaktiert sind.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur direkten elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen und Zellverbünde nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Vorrichtung erlaubt die ortsaufgelöste Stimulation biologischer Zellen durch ein stationäres elektrisches Feld sowie die Messung extrazellulärer Potentiale.
Stationäre elektrische Felder spielen eine große Rolle in der Regeneration von biologischem Gewebe und der Entwicklung von Embryonen. Bei der Erzeugung dieser Felder mit Hilfe von Anordnungen, die Metallelektroden enthalten, wie zum Beispiel in EP 1 344 551 A2 , entstehen an der Elektrodenoberfläche potentiell giftige Substanzen als Folge der bei konstantem Stromfluss unvermeidlichen faradayschen Reaktionen. Diese zum Teil irreversiblen Reaktionen limitieren auch bei der Stimulation von Nervengewebe durch metallische Elektroden die pro Puls ohne Gewebeschädigung injizierbare Ladungsmenge.
Verschiedene Oberflächenmaterialien der Elektroden werden verwendet, um die Landungsträgerinjektion zu verbessern, zum Beispiel in E. Slavcheva, R. Vitushinsky, W. Mokwa, and U. Schnakenberg: Sputtered Iridium Oxide Films as Charge Injection Material for Functional Electrostimulation, J. Electrochem. Soc. (2004), 151(7), pp. E226–E237.
Anwendungen zur Stimulation mit stationären Feldern sind dadurch aber prinzipiell nicht möglich.
Für die Erzeugung stationärer elektrischer Felder ist zum Beispiel aus L. Hinkle, C. D. McCaig und K. R. Robinson: The Direction of Growth of Differentiating Neurons and Myoblasts from Frog Embryos in an Applied Electric Field, J. Physiol. (1981), 314, pp. 121–135 eine Apparatur bekannt, die das Untersuchungsgebiet durch Elektrolytbrücken von den Elektroden trennt. Elektroden, die zur Erzeugung stationärer Felder prinzipiell geeignet sind, werden auch zum planaren Patch-Clamp wie zum Beispiel in US020020064841A1 verwendet. Nachteilig an diesen Apparaturen ist aber, dass sie keine bzw. eine zu geringe örtliche Auflösung bieten und dass die Elektroden die Zellen schon durch ihre sich von der übrigen Oberfläche unterscheidenden Topographie beeinflussen.
Oft erfordert die Untersuchung von biologischem Gewebe jedoch eine hohe örtliche Auflösung bei der Messung und Erzeugung der elektrischen Potentiale. Außerdem soll keine Beeinflussung der Untersuchungsobjekte durch einen chemischen Konzentrationsgradienten oder durch eine uneinheitliche Topographie der Testeinrichtung im Untersuchungsgebiet erfolgen.
Aufgabe der Erfindung ist deshalb, eine Vorrichtung mit einer Auflagefläche anzugeben, in der sich eine Anordnung mehrerer Elektroden mit der Größe und dem Abstand zueinander von nicht mehr als 10 Mikrometer befinden. Die Auflagefläche soll für die Besiedelung mit biologischen Zellen in einem Nährmedium geeignet sein. Die Elektrodenflächen sollen sich in ihren optischen, chemischen und topografischen Eigenschaften nicht von denen der übrigen Oberfläche unterscheiden. Die Elektroden sollen dazu in der Lage sein, im Nährmedium stationäre elektrische Felder mit einer Feldstärke bis zu 500 V/m zu erzeugen, jedoch ohne dass an der Oberfläche der Versuchseinrichtung die chemische Zusammensetzung des Nährmediums verändert wird.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen.
Die Vorrichtung weist gegenüber der Auflagefläche für die Zellen eine Kanalplatte mit voneinander getrennten Kanälen zur Aufnahme eines Elektrolyten auf, wobei der Elektrolyt mit den erforderlichen elektrischen Anschlüssen niederohmig verbunden ist. Die Kanäle in der Kanalplatte sind mit einer isolierenden Membran abgedeckt, wobei die Membran mehrere Öffnungen zu den einzelnen Kanälen aufweist. Die isolierende Membran ist mit einer porösen Membran mit einer Vielzahl kleinerer Öffnungen bedeckt, die die Auflagefläche für die biologischen Zellen oder Zellverbünde bildet. Durch die sich überdeckenden Öffnungen in der porösen Membran und der isolierenden Membran stehen die biologischen Zellen oder Zellverbünde auf der Auflagefläche mit dem Elektrolyten in den Kanälen in Kontakt und sind mit den elektrischen Anschlüssen niederohmig verbunden.
Die Oberfläche der porösen Membran bildet bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung durch die mit Elektrolyt gefüllten Poren eine Art Mikroelektrodenarray. Zu jeder dieser Mikroelektroden führt ein Mikrofluidkanal, der mit dem genannten Elektrolyt gefüllt ist und etwa in der Mitte der Anordnung an die Oberfläche tritt. Am anderen Ende des Kanals befindet sich ein elektrischer Anschluss, z. B. eine metallische Elektrode.
Zur Vermeidung eines Leckstromes zwischen einzelnen Elektroden werden in der porösen Membran nur Strömungen senkrecht zur Oberfläche zugelassen. Dazu eignen sich Polyethylenterephthalat(PET)- oder Polyimid(PI)-Membranen mit Poren, die durch Ionenbeschuss hergestellt worden sind oder poröse Aluminiumoxidschichten, deren Poren nicht untereinander verbunden sind.
Bei der Beschichtung der Unterseite der porösen Membran ist zu beachten, dass während des Beschichtungsprozesses kein Material durch die Poren dringt. Dies kann vermieden werden, indem die Beschichtung zunächst auf einer Hilfsoberfläche vorgenommen und danach in verfestigtem Zustand auf die isolierende Membran übertragen wird.
Die Kanalplatte enthält in ihrer Oberfläche voneinander getrennte Kanäle, die von der Position der Elektrodenöffnungen in der Mitte des Mikroelektrodenarrays aus betrachtet sternförmig nach außen verlaufen und dabei sowohl breiter als auch tiefer werden.
Die elektrische Kontaktierung des Mikroelektrodenarrays geschieht je nach Anforderung an Versuchsdauer, Feldstärke und Messgenauigkeit durch Elektroden erster oder zweiter Art. Die Elektroden können sich direkt auf der Kanalplatte befinden. Für Anwendungen mit längerer Messdauer werden die Kanäle mit Elektrolytbrücken verbunden, die in Kontakt mit metallischen Elektroden stehen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
1 eine Explosionsdarstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
2 eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung
3 eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf einer Basisplatte mit angeschlossenen Elektrolytbrücken und einem Reservoir mit in Nährmedium suspendierten biologischen Zellen.
1 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit vier elektrischen Anschlüssen 7 oder Elektroden.
Die Oberseite der porösen Membran 1 ist als Auflagefläche für die Zellen oder Zellverbünde vorgesehen. Die Membran 1 ist mit einer Vielzahl von Poren versehen. Auf der zellabgewandten Seite ist die poröse Membran 1 mit einer elektrisch isolierenden Membran 2 bedeckt. In der elektrisch isolierenden Membran 2 sind Öffnungen 3 vorgesehen, die über den Enden der Kanälen 10 etwa in der Mitte der Anordnung liegen. Die elektrisch isolierenden Membran dient zum Abschluss der Kanäle 10 in der sich anschließenden Kanalplatte 4, in der die Kanäle 10 voneinander getrennt eingearbeitet sind.
Die Membran 1 weist durch Ionenbeschuss Poren 9 mit einem Durchmesser von ca. 300 μm und einer Dichte von 20·10⁶ cm^–2 auf. Die isolierende Membran 2 besteht aus Polydimethylsiloxan(PDMS), in das durch Stempeln vier Öffnungen 3 eingebracht wurden. Die Kanalplatte 4 besteht aus PDMS. Die Kanalenden befinden sich unter den Öffnungen 3, so dass durch die Öffnungen 3 und die Poren 9 in der Membran 1 eine Verbindung zur Auflagefläche der Vorrichtung entsteht. An den äußeren Enden der Kanäle befinden sich Durchgänge zur Unterseite der Kanalplatte 4, so dass hier der Aufbau einer Elektrolytbrücke möglich ist.
In der 2 ist eine Seitenansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung entsprechend der 1 dargestellt. An der porösen Membran 1 ist die zellabgewandte Seite mit 1a bezeichnet. In der Kanalplatte 4 ist ein Durchgang zum Aufbau einer Elektrolytbrücke zwischen Kanal 10 und hier nicht gezeigten elektrischen Anschlüssen dargestellt.
3 zeigt einen vollständigen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Der in 1 gezeigte Aufbau wird auf einer Basisplatte 5 aus Polycarbonat(PC) befestigt. Durch die Basisplatte 5 lässt sich die erfindungsgemäße Vorrichtung in den Objektträger von Mikroskopen einsetzen. Die Basisplatte 5 besitzt außerdem Anschlusselemente für die Ausbildung von Elektrolytbrücken 6.
Als Anschlusselemente dienen Kunststoffschläuche, die mit einer Elektrolytlösung gefüllt sind und in welche die elektrischen Anschlüsse 7 in Form von Elektroden eingeführt sind. Die Elektrolytlösung wird durch Zugabe von Agar-Agar verdickt.
Auf der Oberseite der porösen Membran 1 ist ein biologischer Zellverbund 8 dargestellt: Der Zellverbund 8 ist in einem Nährmedium suspendierten, welches in einem Reservoir eingeschlossen ist. Das Nährmedium ist mit der Elektrolytlösung 11 identisch.

1: poröse Membran
2: isolierende Membran
3: Öffnung
4: Kanalplatte
5: Basisplatte
6: Elektrolytbrücke
7: elektrischer Anschluss
8: Zelle/Zellverbund
9: Pore
10: Kanal
11: Elektrolyt

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- EP 1344551 A2 [0002]
- US 020020064841 A1 [0005]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- E. Slavcheva, R. Vitushinsky, W. Mokwa, and U. Schnakenberg: Sputtered Iridium Oxide Films as Charge Injection Material for Functional Electrostimulation, J. Electrochem. Soc. (2004), 151(7), pp. E226–E237 [0003]
- L. Hinkle, C. D. McCaig und K. R. Robinson: The Direction of Growth of Differentiating Neurons and Myoblasts from Frog Embryos in an Applied Electric Field, J. Physiol. (1981), 314, pp. 121–135 [0005]

Claims

Vorrichtung zur direkten elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen (8) und Zellverbünde, aufweisend eine Auflagefläche für die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde sowie einen oder mehrere elektrische Anschlüsse (7) zu deren Kontaktierung, dadurch gekennzeichnet, dass – gegenüber der Auflagefläche eine Kanalplatte (4) mit voneinander getrennten Kanälen (10) zur Aufnahme eines Elektrolyten (11) vorgesehen ist, und der Elektrolyt (11) mit den elektrischen Anschlüssen (7) niederohmig verbunden ist, – die Kanäle (10) in der Kanalplatte (4) mit einer isolierenden Membran (2) abgedeckt sind, wobei die Membran mehrere Öffnungen (3) zu den Kanälen (10) aufweist, – die isolierende Membran (2) mit einer porösen Membran (1) mit einer Vielzahl kleinerer Öffnungen bedeckt ist, die die Auflagefläche für die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde bildet, so dass – die biologischen Zellen (8) oder Zellverbünde auf der Auflagefläche durch die sich überdeckenden Öffnungen in der porösen Membran (1) und der isolierenden Membran (2) mit dem Elektrolyten (11) in den Kanälen (10) niederohmig verbunden und somit mit den elektrischen Anschlüssen (7) kontaktierbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die voneinander getrennten Kanäle (10) in der Kanalplatte (4) sternförmig verlaufen, und die mehreren Öffnungen (3) in der Membran (2) zu den Kanälen (10) an den im Zentrum des Sternes liegenden Enden der Kanäle (10) vorgesehen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Anschlüsse (7) auf der den Kanälen (10) gegenüberliegenden Seite der Kanalplatte (4) vorgesehen sind und mittels einer Elektrolytbrücke (6) mit dem Elektrolyt (11) in den Kanälen (10) niederohmig verbunden sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Membran (1) eine Poren (9) aufweisende Schicht aus einem Polymer ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyethylenterephtalat(PET) oder ein Polyimid(PI) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren (9) durch Ionenbeschuss der Membran (1) erzeugt worden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren (9) durch anodische Oxidation der Membran (1) erzeugt worden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (1) aus einem Glas besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (1) aus einer Keramik besteht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektrolyt (11) verdickt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektrolyt (11) durch Zugabe von Agar-Agar verdickt ist.