CN114921528A

CN114921528A - 一种核酸内切酶4介导的rna特异扩增方法

Info

Publication number: CN114921528A
Application number: CN202210431057.1A
Authority: CN
Inventors: 曹玉峰; 郑冉; 高青
Original assignee: Shandong Jianwei Biological Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Jianwei Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-08-19

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法。本发明在传统一步法RT‑PCR的特异性逆转录引物的基础上进行修饰引物，选择性扩增RNA而不扩增相应的DNA。本发明所述的方法具有较好的灵敏度和准确性，且操作简单，适用于大规模工业化生产或检测。

Description

一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法。

背景技术

RNA，核糖核酸，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T(胸腺嘧啶)。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。

与DNA相比，RNA种类繁多，分子量较小，含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20-300nt)包括miRNA、SiRNA、piRNA、scRNA、snRNA、snoRNA等，细菌也有小分子RNA(50-500nt)。

然而，由于RNA自身的一些特性如片段长度短、序列相似度高、表达差异跨度大、环境背景复杂，使得其检测特别是单分子水平的定量分析存在重重挑战。例如，专利CN200810219765.9公开了用于RNA体外扩增的试剂及方法，包括连接物、引物、启动子和限制性内切酶等，达到了体外扩增RNA的目的，其所述目标RNA经过与连接物连接，在引物存在下进行RT-PCR后得到扩增，再使用了茎环的结构形成了限制性内切酶的唯一位点，酶切所得产物在启动子启动下经过转录后可以得到除了5’端多一个G和少数3’端多一个A或C外与目标RNA样本完全一样的序列，所得的RNA产物与原样本RNA一样可以直接使用。专利CN202011429693.8则公开了一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；配制Cas13反应体系；将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升级的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；完成孵育反应后读取微反应单元信号，计算待测样品中目标RNA的含量；其所述的方法可实现单分子水平的RNA定量检测，无需内参校正和建立标准曲线，无需反转录及核酸复制步骤，也无需进行标记和功能修饰，恒温反应无需热循环，操作步骤简单且检测精度高。

RNA扩增技术目前主要有TMA及NASBA，当前并不普及，所用酶系(逆转录酶、T7 RNA聚合酶等)及检测体系较为复杂，稳定性欠佳，成本较高，应用较少。与之相反，RT-PCR技术成熟，普及率高，缺点是不能区分模板中的DNA与RNA。在一些对RNA检测有特殊要求的项目如HBV RNA、HPV RNA、CT、NG、UU、MG、MH等的检测中，不能使用，例如专一性检测RNA而不检测其相应DNA，使用RT-PCR方法很难实现，其扩增产物是起始RNA、起始DNA共同的扩增结果。因此，亟需提供一种灵敏度与准确性好，仅扩增RNA，不扩增DNA的RNA特异扩增方法

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法。本发明在传统一步法RT-PCR的特异性逆转录引物的基础上进行修饰引物，选择性扩增RNA而不扩增相应的DNA。本发明所述的方法具有较好的灵敏度和准确性，且操作简单，适用于大规模工业化生产或检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种RNA特异扩增方法，所述的方法为采用核酸复制修复酶及反转录基因特异性引物扩增RNA。

具体地，所述的核酸复制修复酶为不耐热的核酸内切酶4。

具体地，所述的反转录基因特异性引物含有通用标签序列、四氢呋喃(THF)、3’端封闭修饰。

进一步具体地，所述的3’端封闭修饰包括但不限于磷酸封闭、C3 Spacer封闭或双脱氧碱基封闭。

进一步具体地，所述的反转录基因特异性引物含有与检测的RNA互补结合的位点。

具体地，所述的方法采用的RNA特异扩增程序为逆转录37-55℃5-30min，预变性95℃1-10min，95℃1-15秒、60℃5-60秒，热循环35-50次。

在某些实施例中，本发明所述的RNA特异扩增方法使用反转录基因特异引物为逆转录引物，该逆转录引物的特点是，5’端含有通用标签序列，后续序列为待检RNA互补的RT引物，且其中间含有四氢呋喃(THF)修饰位点，相当于一个脱碱基位点(AP位点：可被生物体内修复酶如核酸内切酶4或核酸外切酶3所切割)，最后的1-20个碱基，优选3-15个碱基，与模板上的核酸互补，末端封闭处理，可以是磷酸化，也可以是C3 Spacer等，同时体系中加有不耐热的核酸内切酶4与通用引物。

另一方面，本发明提供了一种HCV RNA检测引物组合物，所述的引物组合物包括：

UTS(SEQ ID NO.1):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HCV-MUTS(SEQ ID NO.2):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTctcatgdtgcacggtctacgTHF-gac-C3Space；

HCVF(SEQ ID NO.3):GYGTTGGGTYGCGAAAGG；

HCVP(SEQ ID NO.4):CY5-TGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT-BHQ2。

又一方面，本发明提供了上述引物组合物在制备检测HCV RNA产品中的应用。

具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

又一方面，本发明提供了一种检测HCV RNA的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品还包括PCR反应液。

又一方面，本发明提供了一种HPV16和HPV18 RNA检测引物组合物，所述的引物组合物包括：

UTS(SEQ ID NO.1):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HPV16-MUTS(SEQ ID NO.5):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTcgaatgtctacgtgtgtgctttTHF-tac-C3Space；

HPV16F(SEQ ID NO.6):gaggaggaggatgaaatagatggt；

HPV16P(SEQ ID NO.7):VIC-cacaaccgaagcgtagagtcacacttgc–BHQ1；

HPV18F(SEQ ID NO.8):aaacgacgattycacaacatagc；

HPV18-MUTS(SEQ ID NO.9):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTgtcgttggagtckttcctgtcTHF-tg-C3Space；

HPV18P(SEQ ID NO.10):ROX-tcggttgcagcacgaatggca-BHQ2。

又一方面，本发明提供了上述引物组合物在制备检测HPV16和HPV18 RNA产品中的应用。

又一方面，本发明提供了一种检测HPV16和HPV18 RNA的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

具体地，所述的产品还包括PCR反应液。

与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

本发明在传统一步法RT-PCR的特异性逆转录引物的基础上进行修饰引物，选择性扩增RNA而不扩增相应的DNA。本发明所述的方法具有较好的灵敏度和准确性，且操作简单，适用于大规模工业化生产或检测。

附图说明

图1为RNA特异扩增方法示意图。

图2为HCV RNA检测结果曲线图。

图3为HPV16 RNA检测结果曲线图。

图4为HPV18 RNA检测结果曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1.RNA特异扩增方法

本发明所述的RNA特异扩增方法具体如图1所示。

1)采用通用标签序列(UDI)即a、常规引物，b、含有UDI的特异逆转录引物(GSP)c进行RNA特异性“One step RT PCR”，寡核苷酸c还含有四氢呋喃，3’端封闭(可选用双脱氧核苷酸、磷酸、C3 Spacer等修饰)。其中特异性逆转录引物c的加入量很少，仅用于逆转录。2)寡核酸a与b用于PCR扩增，当体系中不含有与c互补的RNA时，不能获得含有a的cDNA，引物对a、b不能扩增。当体系中存在与c互补的RNA时，THF被核酸内切酶4所切割，并在逆转录酶作用下，获得cDNA，可被引物对a、b有效扩增。3)当体系中含有与c互补的DNA时，由于在逆转录的温度(37-60℃)下，DNA双链在RT-PCR缓冲液中未能变性，c无法结合DNA中与其互补的那条链，而核酸内切酶4在随后的预变性步骤中被灭活，c的3端始终封闭，引物对a、b因a非模板上存在序列而无法扩增其DNA。

具体为：

当体系在37-55℃，逆转录酶较佳的活性条件下，修饰逆转录引物与模板RNA结合，在核酸内切酶4(大肠杆菌Nfo酶在60℃以下均具活性，85℃20min热失活)的作用下，THF被切割并产生自由羟基，逆转录反应得以启动，得到含有通用标签序列的cDNA，高温如95℃预变性，同时灭核酸内切酶4，以通用标签序列引物与另一条常规引物进行PCR扩增，得到扩增产物。当模板RNA不存在，通用标签序列引物与另一条常规引物无法扩增，即便相应的DNA存在下，在37-55℃条件下，DNA没有变性成为单链，修饰逆转录引物无法与其退火结合，THF不能被切割，cDNA无法形成，且不耐热的核酸内切酶4被高温预变性所灭活，以通用标签引物和另一条引物不能有效进行后续的PCR扩增。

本发明与经典one step RT PCR体系存在两点不同，一是PCR系统中加有不耐热的核酸内切酶4(大肠杆菌核酸内切酶4)，二是引物对为3条，1条是通用标签引物，不同项目可公用，另1条为常规引物，第3条为修饰引物，5’端含有通用标签序列，后续为与RNA互补的引物序列，该序列含有THF及后续N个碱基，3’封闭修饰。其中常规引物使用常规浓度而修饰引物的浓度较低，是常规引物浓度的1/5-1/100，仅供逆转录步骤使用而不参与PCR扩增。本发明不改变原有一步法RT-PCR体系及程序，可有效使用本发明内容。从操作方便性等因素考虑，并没有增加操作时间或增加操作步骤，十分适合临床及科研工作的常规开展专有RNA的扩增检测。且本发明采用大肠杆菌核酸内切酶4即Nfo酶识别RNA/DNA杂交体中单链DNA上的THF位点并将其切割，通常仅认为Nfo酶识别DNA上的THF位点可将其切割。

实验例1.以Nfo one step RT-PCR TaqMan法检测HCV RNA与含有HCV靶基因的DNA

HCV为正链RNA病毒，其靶标(UTR)如下(SEQ ID NO.11)：

Gacgaccgggtcctttcttggatcaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgagtgccccgggaggtctcgtagaccgtgcaccatgagcacgaatcctaaac。

设计修饰的逆转录引物，合成如下引物及探针：

UTS(SEQ ID NO.1):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HCVF(SEQ ID NO.3):GYGTTGGGTYGCGAAAGG；

HCVP(SEQ ID NO.4):CY5-TGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT-BHQ2。

采用山东见微生物的One step RT PCR Mix，含0.4μM UTS、0.4μM HCVF、0.1μMHCVP、50nM HCV-MUTS，8U/mLNfo(Themo scientific，货号EN0191，200U/μL)；RT-PCR程序为：55℃10min、95℃2min，95℃5s、60℃30s，循环45次，60℃末读荧光。体积选择50μL。分别扩增HCV RNA(HCV阳性临床标本提取产物，浓度经有证试剂测定为2E5 IU/mL，命名为S1，用纯水梯度稀释成2E4、2E3、2E2、2E1、2E0浓度)及含有上述基因的质粒DNA(浓度约为1E7拷贝/mL，命名为S2，用纯水梯度稀释成1E6、1E5、1E4、1E3、1E2、1E1、1E0浓度)。结果如图2所示。

由图2可知，本发明对含有靶基因的DNA不能扩增，而相应的单链RNA可以有效扩增。

实验例2.以Nfo one step RT-PCR TaqMan法检测HPV16/18mRNA与HPV16/18DNA

HPV16 E7靶标(NC_001526.4)如下(SEQ ID NO.12)：

Gcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataatctacc；

HPV18 E6靶标(MF288726.1)如下(SEQ ID NO.13)：

Tgcggtgccagaaaccgttgaatccagcagaaaaacttagacaccttaatgaaaaacgacgattccacaacatagctgggcactatagaggccagtgccattcgtgctgcaaccgagcacgacaggaaagactccaacgacgcagagaaacacaagtataatattaagtatgcatggacc。

设计修饰的逆转录引物，合成如下引物及探针：

UTS(SEQ ID NO.1):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HPV16-MUTS(SEQ IDNO.5):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTcgaatgtctacgtgtgtgctttTHF-tac-C3Space；

HPV16F(SEQ ID NO.6):gaggaggaggatgaaatagatggt；

HPV16P(SEQ ID NO.7):VIC-cacaaccgaagcgtagagtcacacttgc–BHQ1；

HPV18F(SEQ ID NO.8):aaacgacgattycacaacatagc；

HPV18-MUTS(SEQ IDNO.9):ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTgtcgttggagtckttcctgtcTHF-tg-C3Space；

HPV18P(SEQ ID NO.10):ROX-tcggttgcagcacgaatggca-BHQ2。

采用山东见微生物的One step RT PCR Mix，含0.4μM UTS、0.2μM HPV16F、0.2μMHPV18F、0.1μM HPV16P、0.1μM HPV18P、50nM HPV16-MUTS、50nM HPV18-MUTS，8U/mLNfo(Themo scientific，货号EN0191，200U/μL)；RT-PCR程序为：50℃10min、95℃2min，95℃5s、60℃30s，循环45次，60℃末读荧光。体积选择50μL。分别扩增HPV16 RNA(HPV16 DNA阳性，临床宫颈癌标本提取产物，其DNA约为1E6拷贝/mL，HPV16 RNA含量未知，命名为S3)、含有HPV16全基因的质粒DNA(浓度约为1E7拷贝/mL，命名为S4)及S3核酸提取物经RNA酶消化后的纯化产物(称之为S5)，同样的，HPV18 RNA(HPV18DNA阳性，临床宫颈癌标本提取产物，其DNA约为1E6拷贝/mL，命名为S6)、含有HPV18全基因的质粒DNA(浓度约为1E7拷贝/mL，命名为S7)及S6核酸提取物经RNA酶消化后的纯化产物(称之为S8)。结果如图3，图4所示。

由图3及图4可知，本发明对HPV16/18DNA不能扩增，而对HPV16/18RNA可以有效扩增。

以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东见微生物科技有限公司

<120> 一种核酸内切酶4介导的RNA特异扩增方法

<130> 20220410

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atcagcctcc tcagtctcgt ct 22

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

atcagcctcc tcagtctcgt ctctcatgdt gcacggtcta cggac 45

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gygttgggty gcgaaagg 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

tgtggtactg cctgataggg tgctt 25

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

atcagcctcc tcagtctcgt ctcgaatgtc tacgtgtgtg cttttac 47

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gaggaggagg atgaaataga tggt 24

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

cacaaccgaa gcgtagagtc acacttgc 28

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

aaacgacgat tycacaacat agc 23

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

atcagcctcc tcagtctcgt ctgtcgttgg agtckttcct gtctg 45

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

tcggttgcag cacgaatggc a 21

<210> 11

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc 60

gcaagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg 120

gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac 180

<210> 12

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

gcaattaaat gacagctcag aggaggagga tgaaatagat ggtccagctg gacaagcaga 60

accggacaga gcccattaca atattgtaac cttttgttgc aagtgtgact ctacgcttcg 120

gttgtgcgta caaagcacac acgtagacat tcgtactttg gaagacctgt taatgggcac 180

actaggaatt gtgtgcccca tctgttctca gaaaccataa tctacc 226

<210> 13

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

tgcggtgcca gaaaccgttg aatccagcag aaaaacttag acaccttaat gaaaaacgac 60

gattccacaa catagctggg cactatagag gccagtgcca ttcgtgctgc aaccgagcac 120

gacaggaaag actccaacga cgcagagaaa cacaagtata atattaagta tgcatggacc 180

Claims

1.一种RNA特异扩增方法，其特征在于：所述的方法为采用核酸复制修复酶及反转录基因特异性引物扩增RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的核酸复制修复酶为不耐热的核酸内切酶4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反转录基因特异性引物含有通用标签序列、四氢呋喃THF、3’端封闭修饰。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的3’端封闭修饰为磷酸封闭、C3Spacer封闭或双脱氧碱基封闭。

5.一种HCV RNA检测引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括：

UTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HCV-MUTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTctcatgdtgcacggtctacgTHF-gac-C3Space；

HCVF:GYGTTGGGTYGCGAAAGG；

HCVP:CY5-TGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTT-BHQ2。

6.权利要求5所述的引物组合物在制备检测HCV RNA产品中的应用。

7.一种检测HCV RNA的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求5所述的引物探针组合物。

8.一种HPV16和HPV18 RNA检测引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物包括：

UTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCT；

HPV16-MUTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTcgaatgtctacgtgtgtgctttTHF-tac-C3Space；

HPV16F:gaggaggaggatgaaatagatggt；

HPV16P:VIC-cacaaccgaagcgtagagtcacacttgc–BHQ1；

HPV18F:aaacgacgattycacaacatagc；

HPV18-MUTS:ATCAGCCTCCTCAGTCTCGTCTgtcgttggagtckttcctgtcTHF-tg-C3Space；

HPV18P:ROX-tcggttgcagcacgaatggca-BHQ2。

9.权利要求8所述的引物组合物在制备检测HPV16和HPV18 RNA产品中的应用。

10.一种检测HPV16和HPV18 RNA的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求8所述的引物探针组合物。