CN103074428A - 一种结核分枝杆菌tb检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mM/L，氯化钾20～300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测TB的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400～4.00E+09copies/ml；应用该试剂盒可以对痰液等未知样本中的TB-DNA进行快速准确的检测，为诊断TB感染提供可靠的实验依据。

Description

一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒

技术领域

本发明提供一种结核分枝杆菌（TB）检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的TB-DNA检测试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌是结核病的病原菌，本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见；目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡；我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多；因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

目前我国对结核病的临床诊断主要通过痰涂片镜检和细菌分离培养。痰涂片镜检法简单、快速，但灵敏度和特异度都达不到要求，而且受实验室条件、实验人员镜检技术水平的影响较大；此外，涂片法的检测精度大约为50%且无法检出耐药菌株。细菌分离培养是结核病诊断的金标准，但耗时长，快速生长菌也至少需7天才有阳性结果，时间长者甚至需要数周，而且由于标本处理过程可能导致细菌死亡，产生假阴性结果。另外，免疫学和血清学技术也因其低灵敏度和特异性而受到限制。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测结核分枝杆菌，主要包括PCR诊断、DNA指纹技术等。而随着FQ-PCR技术的发展，其在结核病早期诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，结核病感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。

运用荧光PCR技术检测TB-DNA主要包括TB核酸的提取和核酸的PCR扩增两方面。

目前国内临床上主要采用直接煮沸法对样本中的TB核酸进行提取，该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。国外临床上主要采用某种DNA提取试剂盒来提取TB核酸，其提取效果较好，但是由于价格昂贵，难以在国内应用。

临床上检测TB-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定量检测。与传统的PCR相比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

目前国内外已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测TB-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒多半以煮沸法提取核酸，且其检测灵敏度不高，约在1-10个TB菌左右。

发明内容

本发明提供一种核酸释放剂在结核分枝杆菌TB检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。

在本发明所述核酸释放剂中，其溶剂可以为本领域常用的，例如为无菌水或TE缓冲液。本发明首次披露在结核分枝杆菌TB检测中使用含强蛋白变性剂的核酸释放剂，在很大程度上简化了该菌检测的步骤，而且检测灵敏度有了很大的提高。

本发明提供一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。

使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测TB的灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400~4.00E+09copies/ml。

具体的，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5'-ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3'，下游引物序列为5'-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3'，探针序列为5'-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3'。需要说明的是，探针中FAM表示该探针羧基端使用FAM荧光基团标记，BHQ1表示羟基端用BHQ1淬灭基团修饰。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。

本发明中，优选所述试剂盒中还包括内标，所述内标的序列为5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。本发明中所述内标为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，它作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性。在所述试剂盒中包含内标的情况下，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’，内标下游引物序列为5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3，内标探针序列为5’-HEX-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’。同样的，探针中HEX表示其羧基端使用HEX荧光基团标记。

优选本发明所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5~2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR产物，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用，从而防止样本检测假阳性。

在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括TB定量参考品、TB阳性对照和TB阴性对照。

本发明还提供一种TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5'-ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3'，下游引物序列为5'-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3。

本发明又提供一种TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5'-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3'。

本发明还具体提供一种TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂、PCR反应液、内标、酶混合液、TB定量参考品、TB阳性对照和TB阴性对照；且所述核酸释放剂中包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%，乙醇0.05～1%和溶剂TE缓冲液；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，用于内标扩增和检测的上游引物、下游引物和探针，10×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸dNTP；所述内标为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体；所述酶混合液中包含DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

本发明提供的TB荧光定量PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽，应用该试剂盒可以对痰液等未知样本中的TB-DNA进行快速准确的检测，为诊断TB感染提供可靠的实验依据。

附图说明

图1中①为实施例中TB-DNA检测结果为阳性的待测样本的扩增曲线，图1中②为实施例中TB-DNA检测结果为阴性的待测样本的扩增曲线。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1

本实施例提供一种具体的结核分枝杆菌检测试剂盒，它包括如下组分：

①核酸释放剂：包含莎梵婷（surfactin）0.1mM/L，氯化钾100mM/L，十二烷基磺酸钠（SDS）0.1%，0.1%的乙醇和溶剂TE缓冲液。

②内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为97碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为2.00E+05copies/ml，其序列为：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。

③PCR反应液：包括10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物均为0.3μmol/L，用于靶多核苷酸检测的探针为0.3μmol/L，用于内标片段扩增的上下游引物均为0.3μmol/L，用于检测内标的探针为0.1μmol/L。其中，所述10×PCR反应缓冲液为包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP和dGTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针是源于结核分枝杆菌的保守区域的引物和探针，其碱基序列分别为，上游引物：5'-ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3'，下游引物：5'-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3'，探针：5'-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3'；所述的用于检测内标的引物探针序列分别为，上游引物：5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’，下游引物：5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3，探针：5’-HEX-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’。

④酶混合液：包含5U/μl的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。

⑤TB定量参考品：来源于使用TB企业定量线性参考品L1~L5定值后的TB强阳性质粒，该TB定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为4.00E+07copies/ml（A）、4.00E+06copies/ml（B）、4.00E+05copies/ml（C）、4.00E+04copies/ml（D）。

⑥TB阳性对照：为临床医院收集的已灭活的TB强阳性痰液液化样本，经合格的TB试剂盒检测并定值后，用灭菌生理盐水稀释至浓度为4.00E+05copies/ml。

⑦TB阴性对照：以灭菌生理盐水为待测样本，经合格的TB试剂盒检测为阴性。

实施例2

本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测痰液等未知样本中TB-DNA的操作步骤：

一、试剂准备

根据待测样本、TB阴性对照、TB阳性对照以及TB定量参考品A~D的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）及内标1.0μl/人份，充分混匀成PCR-mix，例如待测样本为3人份时，一共需配制9人份（上述四者的人份数分别为3、1、1和4）的PCR-mix；瞬时离心后备用。

二、核酸提取

在样本中加入2~3倍体积的4%NaOH溶液，震荡混匀后，静置液化30min。取液化后的样本500μl于1.5ml离心管（避免吸出明显的固体杂质），12000r/min离心3min，吸除上清；加入1ml无菌生理盐水重悬沉淀，12000r/min离心3min，吸除上清；加入50μl核酸释放剂，100℃处理10min，12000r/min离心3min，上清作为待测样本备用。

三、向PCR反应管中加样

每个PCR反应管中加入上述第二步骤中处理后的待测样本、TB阴性对照、TB阳性对照以及TB定量参考品A~D各5μl；每管加入步骤一中的PCR-mix40μl，去除气泡后盖上管盖，2000rpm离心30秒。

四、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测TB；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标；参比荧光（Passive Reference）设置为none。

3）荧光定量PCR反应条件见表1：

表1

4）结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定量检测结果。对于测定Ct值≤39（Ct值＞0）的样本，报告为TB-DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型（见图1中①）；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为TB-DNA阴性，此时待测样本扩增曲线平直（见图1中②）；对于测定Ct值>39的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤39），报告为低于检测下限。若内标Ct值>39或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

使用本发明中试剂盒的特异性试验表明，其与鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏菌、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌、MP、EBV、呼吸道合胞病毒等样本无交叉反应，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。

使用本发明中试剂盒检测企业工作参考品，其阴阳性符合率为100%，灵敏度检测结果符合质量标准；精密度试验表明批内和批间重复性好，其Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。使用本发明中试剂盒对临床样本的检测试验表明，该试剂盒的定量线性范围为400～4.00E+09copies/ml，检测下限即灵敏度为400copies/ml。

Claims (10)

1.一种核酸释放剂在结核分枝杆菌TB检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%。

2.一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷（surfactin）0.01~0.5mM/L，氯化钾20~300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01~2%和乙醇0.05~1%；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的上游引物序列为5'-ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3'，用于靶多核苷酸的下游引物序列为5'-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3'。

4.根据权利要求2或3所述的检测试剂盒，其特征在于，用于靶多核苷酸的探针序列为5'-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3'。

5.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标序列为5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGTCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTCGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3’。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包括用于内标检测的上游引物、下游引物和探针；内标上游引物序列为5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’，内标下游引物序列为5’-ACAAACGGGCAACATACCTTG-3，内标探针序列为5’-HEX-TCATCCAGTGCAAGTCTTGATCCTGTC-3’。

7.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐热DNA聚合酶（Taq酶）和0.5~2U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶），同时在所述PCR反应液中还包含dUTP。

8.根据权利要求2~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括TB定量参考品、TB阳性对照和TB阴性对照。

9.一种TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的上游引物序列为5'-ACGGATAGGGGATCTCAGTACAC-3'，下游引物序列为5'-CGTCTCGGCTAGTGCATTGTC-3。

10.一种TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针，且用于靶多核苷酸的探针序列为5'-FAM-TTCCGACCGCTCCGACCGAC-BHQ1-3'。

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