CN107603974B - 一种人类尿液dna的提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒，包括1）前处理剂；2）DNA提取液Ⅱ；3）DNA提取液D；4）DNA溶解液；5）无水乙醇和75%乙醇。本发明还提供了一种人类尿液DNA的提取试剂盒。本发明具有如下技术效果：本发明有较高的重复稳定性，不需要重复试验，在50例志愿者尿液DNA提取中，仅一次提取即得高质量的模板DNA，在对全外显子的扩增中，所有提取的尿液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明的可靠性。

Description

一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种人类尿液DNA的提取试剂盒及提取方法。

背景技术

膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，约95％来源于膀胱上皮。其中膀胱尿路上皮癌是泌尿道的恶性肿瘤。癌发病率水平在全国32个肿瘤登记处的合计为6.69/10万，占全部恶性肿瘤新发病例的2.52％。按性别统计，膀胱癌男、女发病率分别为10.10/10万和3.20/10万，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全国32个肿瘤登记中为2.53/10万，占全部恶性肿瘤死亡总数的1.47％。膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)，而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscle invasive bladdercancer,MIBC)。目前用于膀胱癌预防复发的药物疗效并不理想。高达40％-80％的患者会发生一次或多次复发，10％-15％的患者会发展为更高级别的肿瘤或发生转移。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。

传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会收操作者主观判断而带来一定的误差。而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏度特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。

近年来，基因诊断在人类多种肿瘤、疾病的早期诊断、治疗以及预后评估中受到广泛重视。进行基因诊断的首要工作室样品的采集和DNA样本的提取。过去采样的方法主要有两种：一是伤害性取样，即获取病人的病理组织和血液等组织样本，这种方法会对病人造成疼痛；二是非伤害性取样，即通过获取病人的毛发、指甲等分析样品，虽然该方法不会对病人造成疼痛，但是从这些样品中抽取的DNA含量太少，很难用来进行分子诊断。

非损伤性取样时在不触及或者不伤害人体本身的情况下，通过收集人的毛发、粪便、尿液、食物残渣等不同形式的分析样品而进行DNA的提取和分析。在非损伤性取样材料中，尿液是一种理想的分析样品，原因包括：(1)人类排尿具有节律性，相对于其他非损伤性取样材料来说，样品充足，易于采集；(2)尿液样品可以在不接触样品来源人的情况下直接获取，对人的干扰小；(3)采集尿液样本可以显著降低采样花费成本。因此，该方法排除了传统对病人取样方法的种种不利因素，近年来已经被广泛关注。

发明内容

为了实现膀胱癌的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的操作简便、成本低廉的提取尿液中细胞DNA的提取试剂盒及提取方法。

本发明的人类尿液DNA的提取试剂盒，包括：1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；

所述的前处理剂为PEG 6000；

所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L，EDTA 20mmol/L，二硫苏糖醇32.5mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L，TritonX-100 4％v/v；

所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L；

所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL 10mM。

使用所述的试剂盒用于人类尿液DNA的提取方法，包括前处理和DNA提取，具体步骤如下：

A、前处理：

1)取尿液分装至离心管中，加入PEG 6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解；

2)离心，去上清，剩2ml液体；

3)充分重悬剩余液体并将其转移至离心管中，往其中加入PBS缓冲液，离心；

4)离心结束后，弃去上清留1ml液体，往其中加入PBS缓冲液混匀，再转移至离心管中，离心；

5)弃去上清，留200μL保留在离心管中，-20℃保存；

B、DNA提取：

1)根据尿液前处理后的体积，在样本中加入等体积的DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解；

2)孵育后加入DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液；

3)向细胞裂解液加入无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置后，离心，倒弃滤液；

4)往离心柱中加入75％乙醇，离心；

5)重复第4步一次；

6)将离心柱再离心以去除残留液体；

7)取出离心柱放至另一洁净的离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min挥发残留乙醇后，在柱中央加入56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min；

8)将离心管和收集管一起放进离心机离心，离心，收集DNA溶液于上述离心管中，丢弃离心柱；DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。

本发明与现有技术相比，有如下创新点：

1)增加了前处理，前处理中我们加入了PEG6000，可以增加溶液的溶解度，提高溶液对其他杂质分子的溶解能力，从而在离心的时候更有利于沉淀尿液中的脱落细胞，尽可能避免引入其他杂质，为后续的DNA提取做准备。

2)省略了蛋白酶K，在DNA的提取过程中，我们采用了含有盐酸胍成分的试剂来代替蛋白酶K，用于溶解蛋白质，破坏细胞结构，从而减少了DNA提取时间，同时也降低了成本费用。

3)本发明得到的DNA片段，260/280比值介于1.7-1.9之间，可直接用于PCR和其他分子生物学用途。

本发明具有如下技术效果：本发明有较高的重复稳定性，不需要重复试验，在50例志愿者尿液DNA提取中，仅一次提取即得高质量的模板DNA，在对全外显子的扩增中，所有提取的尿液DNA模板均能成功进行扩增，得到与预计片段大小相同的产物，测序结果也证实了本发明的可靠性。

附图说明

图1A为使用没有经过预处理的志愿者A1的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

图1B为使用没有经过预处理的志愿者A2的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

图2A为使用本发明提取方法提取志愿者B1的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

图2B为使用本发明提取方法提取志愿者B2的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

图3A为使用现有的尿液DNA提取试剂盒提取志愿者C1的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

图3B为使用现有的尿液DNA提取试剂盒提取志愿者C2的人类尿液DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA作浓度检测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

现以正常人尿液为例，非限定实施例叙述如下：

实施例1

1、尿液样品采集：

采集人体排出的暴露不超过24小时的晨尿样品，将尿液置于60mL采集尿液杯中。

2、样品保存：

采集后的尿液样品，4小时内置于室温存放，4小时以上置于4℃存放。

3、样品前处理：

处理步骤：

将收集到的来自两位志愿者(A1、A2)的尿液样本，分别转移40ml尿液至50ml离心管中，直接4400rpm离心15分钟，弃去上清，将所得沉淀用于下一步实验。

4、DNA提取

提取步骤：

(1)根据尿液前处理后的体积，加入等体积(200μL)DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解。

(2)孵育后加入100μL DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液。

(3)向细胞裂解液加入400μL无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置2min后，10000rpm离心1min，倒弃滤液。

(4)往离心柱中加入600μL 75％乙醇，10000rpm离心1min，倒弃滤液。

(5)重复第4步一次。

(6)将离心柱(带空的收集管)10000rpm再离心2min以去除残留液体。

(7)取出离心柱放至另一洁净的1.5mL离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min，挥发残留乙醇。

(8)在柱中央加入60μL 56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min。

(9)将离心管和收集管一起放进离心机，10000rpm离心1min。

(10)收集DNA溶液于上述1.5mL管中，丢弃离心柱。DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。

实施例2

采用人类尿液DNA的提取试剂盒，包括1)前处理剂；2)DNA提取液Ⅱ；3)DNA提取液D；4)DNA溶解液；5)无水乙醇和75％乙醇；

所述的前处理剂为PEG 6000；

所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍2mol/L、EDTA 20mmol/L、二硫苏糖醇32.5mmol/L、Tris-Cl 10mmol/L，TritonX-100 4％v/v；

所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍4mol/L。

所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL 10mM。

提取方法如下：

1、尿液样品采集：

采集人体排出的暴露不超过24小时的晨尿样品，将尿液置于60mL采集尿液杯中。

2、样品保存：

采集后的尿液样品，4小时内置于室温存放，4小时以上置于4℃存放。

3、样品前处理：

处理步骤：

(1)将收集到的来自两位志愿者(B1、B2)的尿液样本，分别转移40ml尿液至50ml离心管中，再分别将40ml尿液分装至10mL离心管中。

(2)分别称取1.5g PEG6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解。

(3)2000rpm离心15min。

(4)吸去上清，剩2mL液体，充分重悬剩余液体并将其转移至5mL离心管中。

(5)往其中加入PBS缓冲液至4mL，2000rpm离心15min。

(6)离心结束后，弃去上清留1mL液体，往其中加入500μL PBS缓冲液混匀，再转移至2ml离心管中。

(7)4400rpm离心5min。

(8)离心结束后弃去上清，留200μL保留在1.5mL离心管中，-20℃保存。

4、DNA提取

提取步骤：

(1)根据尿液前处理后的体积，加入等体积(200μL)DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解。

(2)孵育后加入400μL DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液。

(3)向细胞裂解液加入400μL无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置2min后，10000rpm离心1min，倒弃滤液。

(4)往离心柱中加入600μL 75％乙醇，10000rpm离心1min，倒弃滤液。

(5)重复第4步一次。

(6)将离心柱(带空的收集管)10000rpm再离心2min以去除残留液体。

(7)取出离心柱放至另一洁净的1.5mL离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min，挥发残留乙醇。

(8)在柱中央加入60μL 56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min。

(9)将离心管和收集管一起放进离心机，10000rpm离心1min。

(10)收集DNA溶液于上述1.5mL管中，丢弃离心柱。DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。

实施例3

1、尿液样品采集：

采集人体排出的暴露不超过24小时的晨尿样品，将尿液置于60mL采集尿液杯中。

2、样品保存：

采集后的尿液样品，4小时内置于室温存放，4小时以上置于4℃存放。

3、样品前处理：采用ab156899尿液DNA提取试剂盒(abcam)

处理步骤：若尿液无法在24小时内处理，需加入蛋白分解抑制剂(proteaseinhibitors)。

4、DNA提取

提取步骤：采用ab156899尿液DNA提取试剂盒(abcam)

(1)将收集到的两位志愿者(C1、C2)的尿液样本转移40ml尿液至50ml离心管中，2000rpm离心10min。

(2)弃去上清后加入200μl悬浮液DNU1将沉淀重悬。

(3)往重悬液中加入4μl DUN2/DUN3混合液，震荡混匀后瞬离，65℃孵育15min。

(4)孵育后加入400μl DUN4，震荡混匀后转移至离心，中，12000rpm离心45s，倒弃滤液。

(5)往离心柱中加入300μl 70％乙醇，12000rpm离心30s，倒弃滤液。

(6)往离心柱中加入200μl 90％乙醇，12000rpm离心30s，倒弃滤液。

(7)往离心柱中加入200μl 90％乙醇，12000rpm离心40s，倒弃滤液。

(8)取出离心柱放至另一洁净的1.5mL离心管中，加入18μl DNU5，12000rpm离心20s，得到DNA溶液。DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。

实施例4实施例1-3实施例所得到的DNA溶液进行浓度测定

将以上3个实施例所得到的DNA溶液进行浓度测定，结果如下表：

Nanodrop(ng/μl)表示用Nanodrop分光光度计测得的核酸浓度。

A260/A280表示在260nm和280nm处的紫外光吸收比值，用于检测提取DNA的纯度(纯的DNA在1.8左右)。

Qubit(ng/μl)表示用荧光定量计测得的核酸浓度。

检测结果：

1)没有经过预处理的志愿者A1、A2的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA的检测结果如图1A，图1B和上表所示。

2)经过预处理的志愿者B1、B2的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA的检测结果如图2A，图2B和上表所示。

3)经过预处理的志愿者C1、C2的人类尿液提取DNA后，利用Nanodrop分光光度计对提取DNA的检测结果如图3A，图3B和上表所示。

结论分析

从DNA浓度及纯度检测的结果可以明显看出本发明前处理部分以及提取过程产生的效果。

1、比较实施例1、2，可得出本发明前处理部分中所加入的试剂以及其离心步骤可以得到纯度更好的DNA。

2、比较实施例2、3，可以看出本发明提取过程中所用到试剂以及独特的配方相对于市面上的提取试剂盒更有优势，可以得到浓度及纯度都相对较好的DNA。

Claims (2)

1.人类尿液DNA的提取试剂盒，其特征在于，由以下成分组成：1）前处理剂；2）DNA提取液Ⅱ；3）DNA提取液D；4）DNA溶解液；5）无水乙醇和75%乙醇；

所述的前处理剂为PEG 6000；

所述的DNA提取液Ⅱ的组分及各组分在DNA提取液Ⅱ中的含量如下：异硫氰酸胍 2mol/L，EDTA 20mmol/L，二硫苏糖醇 32.5mmol/L，Tris-HCl 10mmol/L，TritonX-100 4%v/v；

所述的DNA提取液D的组分及浓度如下：盐酸胍 4mol/L；

所述的DNA溶解液的组分及浓度如下：Tris-HCL 10mM。

2.使用如权利要求1所述的试剂盒用于人类尿液DNA的提取方法，其特征在于，包括前处理和DNA提取，具体步骤如下：

A、前处理：

1)取尿液分装至离心管中，加入PEG 6000至每个离心管中，涡旋震荡直至其完全溶解；

2)离心，去上清，剩2ml液体；

3)充分重悬剩余液体并将其转移至离心管中，往其中加入PBS缓冲液，离心；

4)离心结束后，弃去上清留1ml液体，往其中加入PBS缓冲液混匀，再转移至离心管中，离心；

5)弃去上清，留200μL保留在离心管中，-20℃保存；

B、DNA提取：

1)根据尿液前处理后的体积，在样本中加入等体积的DNA提取液Ⅱ，吹打混匀，置于常温孵育10-15min充分裂解；

2)孵育后加入DNA提取液D，颠倒混匀至液体呈均匀混浊状，得到细胞裂解液；

3)向细胞裂解液加入无水乙醇，颠倒混匀至呈清亮透明后，转移全部液体至离心柱中，室温静置后，离心，倒弃滤液；

4)往离心柱中加入75%乙醇，离心；

5)重复第4步一次；

6)将离心柱再离心以去除残留液体；

7)取出离心柱放至另一洁净的离心管中，打开离心柱盖，室温放置3-5min挥发残留乙醇后，在柱中央加入56℃预热的DNA溶解液，室温放置3-5min；

8)将离心管和收集管一起放进离心机，离心，收集DNA溶液于上述离心管中，丢弃离心柱；DNA溶液用于检测或-20℃保存备用。

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