TWI766225B - 用於尿液樣本儲存及ｄｎａ提取之組合物及方法 - Google Patents

用於尿液樣本儲存及ｄｎａ提取之組合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI766225B
TWI766225B TW109100210A TW109100210A TWI766225B TW I766225 B TWI766225 B TW I766225B TW 109100210 A TW109100210 A TW 109100210A TW 109100210 A TW109100210 A TW 109100210A TW I766225 B TWI766225 B TW I766225B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
urine sample
certain embodiments
sample
buffer
urine
Prior art date
Application number
TW109100210A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202039839A (zh
Inventor
吳揚
劉剛
寧 呂
一友 陳
Original Assignee
中國大陸商杭州諾輝健康科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國大陸商杭州諾輝健康科技有限公司 filed Critical 中國大陸商杭州諾輝健康科技有限公司
Publication of TW202039839A publication Critical patent/TW202039839A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI766225B publication Critical patent/TWI766225B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

本發明提供用於儲存生物樣本(諸如尿液樣本)之組合物及方法。與本發明之儲存試劑混合之生物樣本中之DNA分子可以在令人意外之長時間內保持穩定。此外，亦提供了自生物樣本(諸如尿液樣本)中提取DNA之組合物及方法。與商業化之產品相比，本發明之組合物及方法對DNA提取更為有效，更適用於大體積尿液樣本之DNA提取，並且易於實現自動化DNA提取。

Description

用於尿液樣本儲存及DNA提取之組合物及方法
本發明係關於用於尿液樣本儲存及自尿液樣本中提取DNA之組合物及方法。
尿液作為一種方便、簡單之生物樣本，在分子診斷及疾病監測治療領域受到越來越多的關注。在目前的臨床實踐中，尿液樣本之儲存大多依賴於低溫環境，其需要額外之設備，亦導致了較高之成本。本發明提供了用於在相對較高之溫度(如室溫)下儲存尿液樣本之組合物及方法，從而有利於尿液樣本之儲存及運輸。
常用之尿液DNA提取試劑及方法可分為兩大類。第一種方法係離心以沈澱尿液中之細胞，並提取細胞顆粒中之DNA。第二種方法係離心後丟棄細胞沈澱物，但在上清液中提取游離DNA。本發明提供了同時提取尿液中游離DNA及細胞DNA之組合物及方法，從而提高了DNA提取效率
傳統之DNA提取方法有酚氯仿法、鹽析法、NaI法及矽膠固相載體法，但存在操作複雜之缺點，不適合自動處理或大體積樣本。另一方面，尿液樣本之組成較為複雜，常用之DNA提取方法自尿液樣本中提取之DNA往往含有抑制因子，影響下游PCR之應用。因此，仍然需要開發改良之DNA提取組合物及方法，使其適合於自尿液樣本中提取DNA。
本發明提供用於儲存自個體獲得之尿液樣本之組合物。在某些實施例中，該等組合物包含、基本上包含或由pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑組成。
在某些實施例中，pH緩衝液配製為將組合物之pH值調整至預選範圍內。在某些實施例中，pH緩衝液包含乙酸及乙酸鹽。在某些實施例中，預先選擇之pH值範圍約為5.0至6.5。在某些實施例中，該組合物之pH值約為6.0。
在某些實施例中，乙酸鹽係乙酸鈉。在某些實施例中，乙酸鈉之濃度約為0.5至1.0 mol/L，例如，約為0.5至0.7 mol/L，或約為0.6至0.7 mol/L。
在某些實施例中，螯合劑係胺基聚羧酸。在某些實施例中，螯合劑係乙二胺四乙酸(EDTA)。在某些實施例中，EDTA之濃度約為10至20 mmol/L，例如，約為15至20 mmol/L，約為16至20 mmol/L，或約為16至18 mmol/L。
在某些實施例中，該界面活性劑為陰離子界面活性劑。在某些實施例中，陰離子界面活性劑係十二烷基硫酸鹽。在某些實施例中，鹽係鈉鹽，陰離子界面活性劑係十二烷基硫酸鈉(SDS)。在某些實施例中，SDS之濃度約為5%至10% (m/v)，例如，約為5%至8%，約為5%至7%，約為6%至8%，或約為6%至7%。
在某些實施例中，該組合物不含防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑。
本發明亦提供了尿液樣本之處理方法。尿液樣本可以立即用於DNA提取，亦可以在儲存後進行提取。在某些實施例中，處理後之尿液樣本包含自個體收集之尿液樣本、pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑。在某些實施例中，pH緩衝液配製為將組合物之pH值調整至預選範圍內。在某些實施例中，pH緩衝液包含乙酸及乙酸鹽。在某些實施例中，乙酸鹽係乙酸鈉。
在某些實施例中，預先選擇之pH值範圍約為5.0至6.5。在某些實施例中，該組合物之pH值約為6.0。在某些實施例中，處理後之尿液樣本中之乙酸鈉濃度約為0.05至0.1 mol/L，例如，約為0.05-0.07 mol/L，或約為0.06-0.07 mol/L。在某些實施例中，螯合劑係胺基聚羧酸。在某些實施例中，螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。在某些實施例中，處理後之尿液樣本中之EDTA之濃度約為1至2.5 mmol/L，例如，約為1.5至2 mmol/L，約為1.6至2 mmol/L，或約為1.6至1.8 mmol/L。在某些實施例中，該界面活性劑為陰離子界面活性劑。在某些實施例中，陰離子界面活性劑係十二烷基硫酸鹽。在某些實施例中，鹽係鈉鹽，陰離子界面活性劑係十二烷基硫酸鈉(SDS)。在某些實施例中，處理後之尿液樣本中之SDS之濃度約為0.5%至1.5% (m/v)，例如，約為0.5%至0.8%，約為0.5%至0.7%，約為0.6%至0.8%，或約為0.6%至0.7%。在某些實施例中，處理後之尿液樣本不含防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑。
本發明亦提供了供儲存之處理尿液樣本之方法。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑混合，或與本發明之組合物(如本發明所述)混合。
本發明亦提供了儲存自個體收集之尿液樣本之方法。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑混合，或與本發明之組合物(如本發明所述)混合，以產生準備儲存之尿液樣本。在某些實施例中，pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑在與自個體收集之尿液樣本混合之前，在混合物中提供，例如本發明中描述之組合物。在某些實施例中，自個體收集之尿液樣本包括個體之細胞及至少一種病毒病原體，且在尿液樣本準備儲存後，細胞及病毒病原體均被裂解。在某些實施例中，病毒病原體係人類乳突病毒(HPV)。在某些實施例中，包含將尿液樣本儲存在預定溫度下，如4℃、-20℃、-80℃或室溫下，以備儲存。在某些實施例中，尿液樣本中之DNA含量在經過15天至30天之儲存時間後係穩定的。在某些實施例中，尿液樣本中之DNA含量在經過1週至2週之儲存時間後係穩定的。
本發明亦提供了偵測自個體收集之尿液樣本中存在或不存在一種或多種分析物之方法。在某些實施例中，該等方法包含使用本文所述之處理後之尿液樣本。在某些實施例中，分析物係病毒或來自該病毒之任何DNA分子。在某些實施例中，病毒係HPV。在某些實施例中，所述分析物之偵測包含偵測病毒之DNA。
本發明亦提供了用於自個體尿液樣本中提取DNA之組合物及套組之集合。在某些實施例中，所述組合物或套組主要包含裂解液、磁性奈米顆粒、蛋白酶、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液、溶離緩衝液、或者以上任何組合。
在某些實施例中，裂解液包含異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris-HCl、EDTA、異丙醇、或者以上任何組合。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為2至6M。在某些實施例中，Triton X 100之濃度約為1至5%。在某些實施例中，Tris-HCl之濃度約為20至50mM，其中裂解液之pH值約為6.5。在某些實施例中，EDTA之濃度約為10至50mM。在某些實施例中，溶液其他組分均混合後再加入異丙醇。在某些實施例中，異丙醇之用量約為50%至200% (v/v)。
在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為2至6 M，Triton X-100之濃度約為1至5%，Tris-HCl之濃度約為20至50mM，裂解液之pH值約為6.5，EDTA之濃度約為10至50mM，或者以上任何組合。在某些實施例中，裂解液包含異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris-HCl及EDTA。在某些實施例中，裂解液進一步包含異丙醇。在某些實施例中，異丙醇之用量約為裂解液之50%至200% (v/v)。
在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為1至2 M，Triton X-100之濃度約為1至2%，Tris-HCl之濃度約為5至10mM，裂解液之pH值約為6-7，EDTA之濃度約為3至5mM，異丙醇之體積約為裂解液之50%至80% (v/v)，或者以上任何組合。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為1.67 M，Triton X-100之濃度約為1.33%，Tris-HCl之濃度約為8.33mM，裂解液之pH值約為6.5，EDTA之濃度約為3.33mM，異丙醇之體積約為裂解液之66.7% (v/v)，或者以上任何組合。
在某些實施例中，磁性奈米顆粒具有內芯層及外殼層。在某些實施例中，內芯層由核殼型磁性奈米顆粒構成，其中，外層由SiO2 構成。在某些實施例中，磁性奈米顆粒之直徑約為100至1000奈米，濃度約為50 mg/ml。在某些實施例中，磁性奈米顆粒之用量約為10至20 µL，例如，約為20 µL。
在某些實施例中，第一洗滌緩衝液包含異硫氰酸胍、Tris-HCl、NaCl及乙醇。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為10mM至100mM。在某些實施例中，Tris-HCl之濃度約為20至50mM，在某些實施例中，第一洗滌緩衝液之pH值約為5.0至6.5。在某些實施例中，NaCl之濃度約為50至200mM。在某些實施例中，乙醇之濃度約為40%至60% (v/v)。
在某些實施例中，第二洗滌緩衝液包含Tris-HCl及乙醇。在某些實施例中，第二洗滌緩衝液中之Tris-HCl濃度約為10至50mM，第二洗滌緩衝液之pH值約為6.0至7.0。在某些實施例中，乙醇之濃度約為70%至80% (v/v)。
在某些實施例中，所述溶離緩衝液為pH值約為8.0之Tris-EDTA緩衝液。
在某些實施例中，蛋白酶為蛋白酶K。在某些實施例中，蛋白酶K之濃度約為10至20 mg/ml。在某些實施例中，蛋白酶K之用量約為2.5至25 µg，例如，約為25 µg。
本發明亦提供了自個體尿液樣本中提取DNA之方法，包含使用本發明所述之用於提取DNA之套組或組合物集合。
在某些實施例中，該方法包含、基本上包含：(1)用磁性奈米顆粒及蛋白酶接觸尿液樣本以產生預處理尿液樣本；(2)將步驟(1)中得到之預處理尿液樣本在裂解液中裂解，產生裂解尿液樣本；(3)用第一洗滌緩衝液洗滌步驟(2)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁性奈米顆粒；(4)用第二洗滌緩衝液洗滌步驟(3)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁性奈米顆粒；(5)用溶離緩衝液將步驟(4)所收集之磁性奈米顆粒中之DNA溶離，以獲得提取之DNA。在某些實施例中，本發明所述之裂解液、磁性奈米顆粒、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液、溶離緩衝液、蛋白酶均如本發明所述。
在某些實施例中，用於DNA提取方法之步驟(1)包含(a)將尿液樣本與磁性奈米顆粒接觸以形成混合物；(b)將混合物離心或利用磁力分離裝置形成沈澱及上清；(c)將沈澱物與蛋白酶接觸形成反應系統；(d)在適當之條件下，在預定之時間內加熱反應系統。
在某些實施例中，用於DNA提取之方法中之步驟(3)、(4)及/或(5)包含使用磁力架或自動核酸提取儀器。
本發明提供了偵測自個體收集之尿液樣本中是否存在分析物之方法。在某些實施例中，方法包含使用本發明所述之套組或組合物集合自尿液樣本中提取之DNA。在某些實施例中，分析物係病毒，如HPV。在某些實施例中，所述分析物之偵測包含偵測病毒之DNA。
在某些實施例中，該等方法包含使用本文所述之處理後之尿液樣本。在某些實施例中，該等方法亦包含自處理後之尿液樣本中提取DNA。在某些實施例中，自樣本中提取DNA之步驟包含：(a)用磁性奈米顆粒及蛋白酶接觸尿液樣本以產生預處理之尿液樣本；(b)將步驟(a)中獲得之預處理尿液樣本在裂解液中裂解，以產生裂解尿液樣本；(c)用第一洗滌緩衝液洗滌步驟(b)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁性奈米顆粒；(d)用第二洗滌緩衝液洗滌步驟(c)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁性奈米顆粒；(e)用溶離緩衝液將步驟(d)中收集到之磁性奈米顆粒中之DNA溶離，以獲得提取之DNA。在某些實施例中，本發明所述之裂解液、磁性奈米顆粒、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液、溶離緩衝液、蛋白酶均為本發明所述。
在某些實施例中，偵測個體尿液樣本中是否存在分析物之方法亦用於根據尿液樣本中是否存在分析物對個體進行治療。
本發明亦提供了自個體尿液樣本中提取DNA之方法。在某些實施例中，該等方法包含使用一種本發明所述之套組。在某些實施例中，該等方法包含：(1) 用磁性奈米顆粒及蛋白酶與尿液樣本接觸以對尿液樣本進行預處理；(2) 將步驟(1)中得到之預處理尿液樣本在裂解液中裂解，產生裂解後之尿液樣本；(3) 用第一洗滌緩衝液洗滌步驟(2)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁珠；(4) 用第二洗滌緩衝液洗滌步驟(3)中得到之含有尿液樣本DNA之磁珠；(5) 收集步驟(4)中獲得之含有尿液樣本之磁性奈米顆粒；(6)用溶離緩衝液將收集到之磁性奈米顆粒中之DNA溶離，以獲得提取之DNA。
在某些實施例中，裂解液包含異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris-HCl、EDTA及異丙醇。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為1至2 M。在某些實施例中，Triton X 100之濃度約為1至2%。在某些實施例中，Tris-HCl之濃度約為5至10 mM。在某些實施例中，裂解液之pH約為6至7。在某些實施例中，EDTA之濃度約為3至5 mM。在某些實施例中，異丙醇之體積約為裂解液之50%至80% (v/v)。
在某些實施例中，磁性奈米顆粒有一個內核層及外殼層。在某些實施例中，內核層由磁性奈米顆粒構成。在某些實施例中，外殼層由SiO2構成。在某些實施例中，磁性奈米顆粒之直徑大約係100至1000奈米。在某些實施例中，磁性奈米顆粒之濃度約為50 mg/ml。
在某些實施例中，第一洗滌緩衝液包含異硫氰酸胍、Tris-HCl、氯化鈉及乙醇。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為50至100mM。在某些實施例中，Tris-HCl之濃度約為20至50mM。在某些實施例中，第一洗滌緩衝液之pH值約為5.0。在某些實施例中，NaCl之濃度約為50至200mM。在某些實施例中，乙醇濃度約為40%至60% (v/v)。
在某些實施例中，第二洗滌緩衝液包含Tris-HCl及乙醇。在某些實施例中，第二洗滌緩衝液中之Tris-HCl濃度約為10至50mM。在某些實施例中，第二洗滌緩衝液pH值約為6.0。在某些實施例中，乙醇之濃度約為70%至80% (v/v)。
在某些實施例中，溶離緩衝液為pH值約為8.0之Tris-EDTA緩衝液。
在某些實施例中，蛋白酶係蛋白酶K，其中蛋白酶K之濃度約為10至20 mg/ml。
在某些實施例中，本發明所述之自尿液樣本中提取DNA之方法之步驟(1)(「用磁性奈米顆粒及蛋白酶與尿液樣本接觸以對尿液樣本進行預處理」)步驟包含：(a)將尿液樣本與磁性奈米顆粒接觸形成混合物；(b) 將混合物離心或利用磁力分離裝置形成沈澱及上清；(c)將上述沈澱與蛋白酶接觸形成反應系統；並且(d)將上述反應系統在適當之條件下加熱預定之時間。
在某些實施例中，本發明所述之方法中洗滌及/或收集磁性奈米顆粒之步驟包含使用磁力架或自動核酸提取儀。
本發明亦提供了用於偵測自個體收集之尿液樣本中是否存在分析物之方法。在某些實施例中，該等方法包含使用本發明所述之套組自尿液樣本中提取DNA。在某些實施例中，分析物係病毒。在某些實施例中，病毒係人類乳突病毒。在某些實施例中，分析物之偵測包含偵測病毒之DNA。
本發明亦提供了用於偵測自個體收集之尿液樣本中是否存在分析物之方法。在某些實施例中，該等方法包含：(1)使用16至30項如請求項中任何一項中處理後之尿液樣本；並且(2)自處理後之尿液樣本中提取DNA，包含：(a) 用蛋白酶消化含有磁珠之預處理後尿液樣本；(b)將步驟(a)中得到之預處理尿液樣本及磁珠在裂解液中進行裂解及DNA結合；(c)用第一洗滌緩衝液洗滌步驟(b)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁珠；(d)用第二洗滌緩衝液洗滌步驟(c)中獲得之含有尿液樣本DNA之磁珠；(e)收集步驟(d)所得尿液樣本中之磁性奈米顆粒；及(f)用溶離緩衝液溶離步驟(e)中收集之磁性奈米顆粒中之DNA，以獲得提取之DNA。
在某些實施例中，裂解液包含異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris-HCl、EDTA、異丙醇。在某些實施例中，異硫氰酸胍之濃度約為1至2 M。在某些實施例中，Triton X 100之濃度約為1至2%。在某些實施例中，Tris-HCl之濃度約為5至10 mM。在某些實施例中，裂解液之pH約為6至7。在某些實施例中，EDTA之濃度約為3至5 mM。在某些實施例中，異丙醇之體積約為裂解液之50%至80% (v/v)。
交叉引用
本申請主張2019年1月3日提交之PCT申請PCT/CN2019/070276之優先權，該申請之全文以引用方式併入本文。用於樣本儲存之組合物及方法
本發明在某些實施例中提供了用於儲存生物樣本之組合物及方法。非限制性生物樣本包含：血液、汗液、眼淚、尿液、唾液、精液、血清、血漿、腦脊液(CSF)、糞便、陰道液或組織、痰、鼻咽吸液或拭子、淚液、黏液或上皮拭子(頰拭子)、組織、器官、骨骼、牙齒或腫瘤等。
在某些實施例中，生物樣本係自個體收集之尿液樣本。尿液樣本中含有個體之細胞、感染個體之病原體或細胞及病原體之片段及分子，被廣泛應用於分子診斷。然而，如何在保持尿液樣本中潛在重要分子穩定性之同時，以一種具有成本效益之方式儲存收集到之尿液樣本，一直是一種挑戰。例如，若尿液樣本沒有在相對較低之溫度下儲存，來自細胞及病原體之DNA分子可能在收集尿液樣本數小時或數天內迅速降解。即使尿液樣本儲存在低於4℃之冰箱中，若尿液樣本不添加任何東西，在幾週內，尿液樣本中之DNA分子亦不再適合診斷。
本發明提供之組合物及方法能夠保護生物樣本中之DNA不被降解。在某些實施例中，該組合物亦可以破壞樣本中之細胞，以釋放細胞中之DNA及可能存在於樣本中之病原體中之DNA，從而便於隨後之DNA提取及基於DNA之診斷。在某些實施例中，DNA自病原體中釋放。在某些實施例中，DNA係樣本中之無細胞DNA。在某些實施例中，DNA係泌尿循環腫瘤DNA (ctDNA)。
在某些實施例中，本申請中之組合物在與尿液樣本混合及稀釋之前可以處於濃縮狀態，如2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、甚至更多，其取決於稀釋比例。在某些實施例中，稀釋比例亦可以係10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50、1:60、1:80、1:90、1:99，以此類推。在某些實施例中，根據稀釋比例，將組合物與尿液樣本混合並由尿液樣本稀釋，從而達到處理後尿液樣本中之最終工作濃度(1×)。
本發明用於儲存尿液樣本之組合物包含pH緩衝液。在某些實施例中，pH緩衝液係適用於生物系統之緩衝液。在某些實施例中，pH緩衝液包括ACES N-(2-乙醯胺基)-胺基乙磺酸、AMP(2-胺基-2-甲基-1-丙醇)、ADA(N-(2-乙醯胺基)-亞胺基二乙酸)、BES(N,N-雙-(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸)、碳酸氫鹽、二甘胺酸(bicine) (N,N-雙(2-羥乙基)-甘胺酸)、Bis-Tris([雙-(2-羥乙基)-亞胺基]-三-(羥甲基甲烷))、Bis-Tris-丙烷(1,3-雙[三(羥甲基)-甲胺基]丙烷)、硼酸、甲次砷酸鹽(二甲基砷化酸)、CAPSO 3-(環己基胺基)-丙磺酸)、CAPSO 3-((環己基胺基)-2-羥基-1-丙磺酸)、碳酸鹽(碳酸鈉)、CHS (環己基胺基乙烷磺酸)、檸檬酸鹽、DIPSO (3-[N-雙(羥乙基)胺基]-2-羥基丙磺酸)、甲酸鹽、甘胺酸、甘胺醯甘胺酸、HEPES (N-(2-羥乙基)-哌嗪-N'-乙磺酸)、HEPPS、EPPS (N-(2-羥乙基)-哌嗪-N-3-丙磺酸)、HEPPOS (N-(2-羥乙基)-哌嗪-N'-2-羥基丙磺酸)、咪唑、馬來酸、MES (2-(N-嗎啉諾)-乙磺酸)、MPOS (3-(N-嗎啉基)-丙磺酸)、POPSO (哌嗪-N,N'-雙(2-羥基丙磺酸))、磷酸鹽(磷酸鹽)、PIPES (哌嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸))、POPSO(哌嗪-N,N'-雙(2-羥基丙磺酸))、TAPS(3-[三(羥甲基)-甲基]-胺基-丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羥甲基)-甲胺基]-2-羥基丙磺酸)、TEA (三乙醇胺)、TES (2-[參(羥甲基)-甲胺基]-乙磺酸)、三甲基甘胺酸(Tricine) (N-[參(羥甲基)-甲基]-甘胺酸)、參(羥甲基)-胺基甲烷)及乙酸鹽(乙酸鹽)。在某些實施例中，PH緩衝液係乙酸-乙酸鈉系統。
在某些實施例中，pH緩衝液能夠在與尿液樣本混合後將pH保持在預定範圍內。在某些實施例中，預定之pH值約為4.5至6.5，例如約4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5，以及給定範圍內之任何間隔。
在某些實施例中，pH緩衝液係乙酸-乙酸鈉系統。在某些實施例，該組合物中乙酸鈉之濃度可根據預先測定之稀釋比例預先測定，最終工作濃度約為0.05M至0.1M，當該成分與尿液樣本混合時，諸如約0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1 M。例如，10 ×組合物，乙酸鈉之濃度大約係0.5M至1.0M，如0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M，可以用尿液樣本按1:9之比例稀釋。
本發明用於儲存尿液樣本之組成亦包含螯合劑。如本文所用，螯合劑係指其分子可與單個金屬離子形成多個鍵之物質。螯合劑包含但不限於1,1,1-三氟乙醯丙酮、1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮雜環壬烷、2,2'-聯吡啶、乙醯丙酮、茜素、醯胺肟、醯胺肟基、胺基乙基乙醇胺、胺基甲基膦酸、胺基聚羧酸、ATMP、BAPTA、浴銅靈、BDTH2、苯并三唑、雙鉤物、聯吡啶、2,2'-吡啶、雙(二環己基膦)乙烷、1,2-雙(二甲基砷)苯、1,2-雙(二甲基膦)乙烷、1,4-雙(二苯基膦)丁烷、1,2-雙(二苯基膦)乙烷、環芳烴、肉桂醛、盒狀配體、兒茶酚、空穴配體、螯合樹脂、Chelex 100、檸檬酸鹽、檸檬酸、籠狀螯合物、咔咯、穴醚、2.2.2-穴醚、雜環十四烷、大環多胺、環糊精、地拉羅司、去鐵酮、去鐵胺、右丙亞胺、二乙醯單肟、反式-1,2-二胺基環己烷、1,2-二胺基丙烷、1,5-二氮雜-3,7-二磷環辛烷、1,4-二氮雜環庚烷、二苯甲醯甲烷、二乙烯三胺、二甘醇二甲醚、2,3-二羥基苯甲酸、二巰基丙醇、2,3-二巰基-1-丙磺酸、二巰基琥珀酸、1,2-二甲基乙二胺、1,1-二甲基乙二胺、丁二酮肟、DIOP、二苯乙二胺、1,5-二硫環辛烷、軟骨藻酸、DOTA (螯合劑)、DOTA-TATE、DTPMP、EDDHA、EDDS、EDTA、EDTMP、EGTA、1,2-乙二醇、乙二胺、乙二胺二乙酸、乙二胺四乙酸、羥乙二磷酸、Fluo-4, Fura-2、沒食子酸、葡萄糖酸、麩胺酸、乙二醛雙(均三亞胺)、草甘膦、六氟乙醯丙酮、高檸檬酸、亞胺基二乙酸、吲哚-1、異己糖酸、紅藻胺酸、配體、蘋果酸、金屬乙醯基丙酮、金屬二硫雜合物、金屬冠醚、氮基三乙酸、草酸、肟、噴地肽(Pendetide)、三胺五乙酸、戊二酸、Phanephos、菲囉啉、鄰苯二胺、膦酸鹽、酞菁、植物螯合素、吡啶酸、聚天冬胺酸、卟啉、3-吡啶基菸醯胺、4-吡啶基菸醯胺、鄰苯三酚、水楊酸C酸、石棺鹼、檸檬酸鈉、二乙基二硫代胺基甲酸鈉、聚天冬胺酸鈉、三聯吡啶、四甲基乙二胺、四苯基卟啉、三氟乙酮、巰基乙酸、TPEN、1,4,7-三氮雜環壬、磷酸三丁酯、三乙烯四胺、三磷酸鈉、檸檬酸三鈉、1,4,7-三噻環壬酮、TTFA、功能其變體及其任何組合。
如本文所用，術語EDTA係指乙二胺四乙酸或其任何功能性衍生物。在某些實施例中，組合物中之EDTA濃度可以根據預先測定之稀釋比例預先測定，最終工作濃度約為1至2.5 mM，例如約1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM。例如，對於10×組分，EDTA之濃度約為10至25 mM，例如約10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM，然後用尿液樣本以1:9之比例稀釋。
本發明用於儲存尿液樣本之組成亦包含界面活性劑。如本文所用，界面活性劑係指降低兩種液體之間、氣體及液體之間或液體及固體之間之表面張力(或界面張力)之化合物。在某些實施例中，界面活性劑係陽離子界面活性劑。在某些實施例中，所述界面活性劑係一種兩性離子界面活性劑。在某些實施例中，界面活性劑係陰離子界面活性劑。陰離子界面活性劑之非限制性示例包含在其頭部含有陰離子官能團之分子，例如硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽、羧酸鹽等。在某些實施例中，界面活性劑係十二烷基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(十二烷基硫酸鈉、SLS或SDS)、相關之烷基醚硫酸鹽、月桂酸鈉(十二烷基醚硫酸鈉或SLES)、肉豆蔻硫酸鈉、二十二酸鈉、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、全氟丁烷磺酸鹽、烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽、硬脂酸鈉、Triton™X-100、壬氧基醇-9、聚山梨酸酯、SPAN®、泊洛沙單體、tergitol™、antarox®、pentex®99(二辛基磺基琥珀酸鈉(DOSS))、PFOS、CalSoft®(線性烷基苯磺酸鹽)、Texapon®(月桂基醚硫酸鈉)、Darvan®(木質素磺酸鹽)或其任何組合。
在某些實施例中，界面活性劑為SDS。該組合物中之SDS濃度可根據預先測定之稀釋比例預先測定，當該組合物與尿液樣本混合稀釋後，最終工作濃度約為0.4至1.5% (m/v)，如約0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%等。例如，對於一個10X之組分，SDS之濃度大約係4%至15% (m/v)，諸如4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%等，然後用尿液樣本按1:9之比例稀釋。
在某些實施例中，本發明用於儲存尿液樣本之組合物不包括EDTA以外之防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑，因此降低了總成本，並將對下游診斷之潛在抑制降至最低。
在某些實施例中，不將上述各組分預混合形成包括各組分混合物之試劑，只要達到各組分所需之最終工作濃度，即可將上述各組分直接與尿液樣本逐一混合。
因此，本發明亦提供用於儲存及/或下游DNA提取及診斷之處理後之尿液樣本。該等處理後之尿液樣本包含自需要之個體收集之尿液，以及如本文所述之pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑。
處理後之尿液樣本與自同一個體收集之未處理後之尿液樣本相比，具有更長之貯存期。在某些實施例中，診斷包含偵測尿液樣本中是否存在DNA分子。在某些實施例中，本發明之處理後尿液樣本中之DNA分子足夠穩定，可用於長時間之下游診斷。如本文所用，若與同一個體剛剛收集之尿液樣本中之DNA分子相比沒有明顯降解，則在一定時間內儲存之尿液樣本中之DNA分子係穩定的，因此尿液樣本中之DNA分子品質及數量足以進行基於DNA之診斷，諸如PCR診斷。在某些實施例中，儲存給定時間後之尿液樣本中之DNA分子約為90%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多來自同一個體之尿液樣本中之DNA分子。
在某些實施例中，在用本發明之組合物處理尿液樣本後，當處理後之尿液樣本在約-20℃下儲存時，處理後之尿液樣本中之DNA分子在約10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、200天、300天、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或更長時間後係穩定的。
在某些實施例，在使用本發明之組合物處理尿液樣本後，當處理後之尿液樣本在大約-20 ℃下儲存時，處理後之尿液樣本中之DNA分子在約10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、200天、250天、300天、1年、2年、3年、4年、5年或更長時間後係穩定的。
在某些實施例，在使用本發明之組合物處理尿液樣本後，當處理後之尿液樣本在大約4 ℃儲存時，處理後之尿液樣本中之DNA分子在約10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天或更長時間後係穩定的。
在某些實施例，使用本發明之組合物處理尿液樣本後，當處理後之尿液樣本在室溫儲存時，處理後之尿液樣本中之DNA分子在約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天，或更長時間後係穩定的，如本文所使用之術語「室溫」係指約15℃至25℃ (±2℃)
相應地，本發明亦提供了在相對較低之溫度(如約4℃、約-20℃或約-80℃)下或在相對較高之溫度(如室溫)下生產供儲存之加工尿液樣本之方法。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與pH緩衝液、螯合劑及本發明所述之界面活性劑混合。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與本發明所述之組合物混合。
本發明亦提供了在相對較低之溫度(如約4℃、約-20℃或約-80℃)下或在相對較高之溫度(如室溫)下儲存自個體收集之尿液樣本之方法。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與本發明所述之pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑混合，並將處理後之尿液樣本儲存預定之時間。在某些實施例中，該等方法包含將自個體收集之尿液樣本與本發明所述之組合物在預定之時間內混合。在某些實施例，預定之時間大約係10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300年、一年、兩年、三年，或者更久在相對較低之溫度下(例如，大約4℃、約-20℃、約-80℃)。在某些實施例，時間大約係在室溫下3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天。
因此，在某些實施例中，本發明之加工後尿液樣本可在室溫下儲存至少2週，或在4℃下儲存至少1個月，而不發生任何顯著降解。經過處理之樣本在-20℃或-80℃下可以儲存更長之時間。DNA 提取之組成及方法
本發明亦提供了自收集自個體之生物樣本中提取DNA之組合物及方法。在某些實施例中，生物樣本取自哺乳動物個體，例如人類。在某些實施例中，生物樣本係尿液樣本。非限制性生物樣本包含：血液、汗液、眼淚、尿液、唾液、精液、血清、血漿、腦脊液(CSF)、糞便、陰道液或組織、痰、鼻咽吸液或拭子、黏液或上皮拭子(頰拭子)、組織、器官、骨骼、牙齒或腫瘤等。
本發明之組合物及方法提供了一種自生物樣本(如尿液樣本)中提取DNA之簡單而經濟有效之方法。詳言之，本發明之組合物及方法能夠同時自生物樣本中之脫落細胞及自樣本中之一個或多個病原體中提取DNA。例如，在某些實施例中，本發明之DNA提取組合物及方法可以更有效地提取尿液樣本中之DNA。此外，本發明之組合物及方法使自動提取DNA成為可能，從而降低了勞動強度，提高了處理產出率。
本發明提供之尿液磁珠提取方法能較好地去除PCR抑制劑，易於實現DNA自動提取。本發明之磁珠核酸提取方法產生純度高之核酸，操作簡單，易於實現自動化。在某些實施例中，此等方法在處理大體積尿液樣本時更有用，從而使得基於尿液樣本中DNA分子之診斷具有更高之偵測靈敏度。
在某些實施例中，本發明提供了用於自生物樣本中提取DNA之試劑。在某些實施例中，生物樣本係尿液樣本。在某些實施例中，此等試劑包含磁性顆粒。在某些實施例中，試劑包含蛋白酶。在某些實施例中，此等試劑亦包含裂解溶液。在某些實施例中，此等試劑進一步包含第一洗滌緩衝液。在某些實施例中，此等試劑亦包含第二洗滌緩衝液。在某些實施例中，該等試劑進一步包含所述溶離緩衝液。在某些實施例中，該等試劑可以作為套組提供，亦可以在使用前單獨提供。
在某些實施例中，磁性顆粒及蛋白酶用於對尿液樣本進行預處理並使其為DNA提取做好準備。
在某些實施例中，使用裂解液、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液及溶離緩衝液自預處理尿液樣本中提取DNA。
在某些實施例中，本發明之DNA提取基於磁性顆粒，例如磁性奈米顆粒(例如，奈米磁珠)。
在某些實施例中，磁性顆粒具有磁芯，由塗層保護。該塗層防止了磁性顆粒之不可逆聚集，並允許經由連接配體進行功能化以吸附DNA。在某些實施例中，磁性顆粒在樣本中培育足夠長之時間，以實現最佳吸附。在某些實施例中，磁性顆粒包括氧化鐵，例如Fe3O4或Fe2O3。在某些實施例中，藉由將氧化鐵材料之尺寸減小至幾奈米，將其加工成磁性「顏料」，然後將磁性「顏料」封裝在非磁性基質中，例如二氧化矽、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠及聚苯乙烯，此等基質可以被生物功能化並用於生命科學應用。
在某些實施例中，磁性顆粒具有核-殼結構。在某些實施例中，磁性顆粒具有嵌入結構。
對於核-殼結構，磁性顆粒由具有聚合物或二氧化矽表面塗層之單一超順磁性核組成，諸如經SiO2外殼包圍之磁性核。在其他某些實施例中，磁性顆粒由聚苯乙烯或聚乙烯醇(PVA)核組成，核被超順磁性顆粒包圍，並由表面塗層保護。在某些實施例中，磁性顆粒具有超順磁性顆粒與封裝材料多層交替。
對於嵌入式結構，超順磁珠可以由單分散基體組成，諸如聚苯乙烯、瓊脂糖或瓊脂糖凝膠，此等單分散基體浸漬有多個氧化鐵奈米顆粒(「磁性顏料」)。此等珠子通常直徑數百奈米，用一種防止磁性顏料丟失之材料密封。
用於DNA提取之磁性顆粒之非限制性例子可在美國專利第6514688號、第6673631號、第6027945號、第8710211號、第6033878號、第6368800號、第8324372號、第8729252號、美國專利公開案第20030087286號、第20150141258號、第20160102305號、第20130096292號、第20020086326號、第20050287583號、第20100009351號、第20110171640號、第20110008797號、第20180195035號、第20080132694號、第20040002594號、第20090131650號、第20160369263號、第20140288398號、第20030224366號及第WO/2001/037291A1號、第WO/2001/045522A1號、第WO/1998/031840A1號、第WO/2005/021748A1號、第WO/2017/051939A1號、第WO/2017/137192A1號、第WO/2010/005444A1號、第WO/1992/008805A1號、第WO/2013/164319A1號、第WO/2015/126340A1號、第WO/2017/156336A1號、第WO/2009/102632A3號、第WO/2009/102632A2號、第WO/2009/012185A1號、第WO/2009/012185A9號、第WO/2009/115335A1號、第WO/2015/120445A1號、第WO/2015/123433A2號、第WO/2007/050327A2號、第WO/2007/050327A3及第WO/2013/028548A2號中找到，其中之每一者出於所有目的而以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，磁性顆粒係羥基磁珠，塗有二氧化矽。
在某些實施例，磁性顆粒係平均直徑約50nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1000nm、或者更大之磁珠
亦提供了含有磁性顆粒之溶液。可以根據需要預先測定溶液中磁性顆粒之濃度。在某些實施例中，濃度約為5 mg/ml至100 mg/ml、約100 mg/ml至200 mg/ml、約200 mg/ml至300 mg/ml、約300 mg/ml至400 mg/ml、約400 mg/ml至500 mg/ml或更大。在某些實施例中，濃度約為10 mg/ml、約20 mg/ml、約30 mg/ml、約40 mg/ml、約50 mg/ml、約60 mg/ml、約70 mg/ml、約80 mg/ml、約90 mg/ml、約100 mg/ml、約200 mg/ml、約400 mg/ml、約500 mg/ml或更大。
在某些實施例中，包括磁性顆粒之溶液與包括DNA之樣本混合。在某些實施例中，根據樣本中DNA之潛在或實際數量，預先測定了與樣本混合後磁性顆粒之最終濃度。在某些實施例中，與含有DNA之樣本混合後，磁性顆粒之最終工作濃度約為0.01至0.5 mg/ml。在某些實施例中，最終工作濃度約為0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.03 mg/ml、0.04 mg/ml、0.05 mg/ml、0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.25 mg/ml、0.3 mg/ml、0.35 mg/ml、0.4 mg/ml、0.45 mg/ml、0.5 mg/ml或更大。
在某些實施例中，在將磁性顆粒與含有DNA之樣本混合後，對混合物進行預定時間之振動。在某些實施例中，可選擇性地將混合物在混合後之一段時間內保持靜止。然後以預定之速度離心混合物以沈澱磁性顆粒。在某些實施例中，除去上清液並進一步處理沈澱之磁性顆粒以提取DNA。
在某些實施例中，沈澱之磁性顆粒由蛋白酶處理。在某些實施例中，蛋白酶係一種廣譜蛋白酶。在某些實施例中，蛋白酶係絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬醯胺肽裂解酶。
在某些實施例中，絲胺酸蛋白酶係蛋白酶K (EC 3.4.21.64、蛋白酶K、內肽酶K、腐生真菌鹼性蛋白酶、白色念球菌絲胺酸蛋白酶、白色念球菌蛋白酶K)。在某些實施例中，術語蛋白酶K亦包含天然蛋白酶K之任何功能變體。
亦提供了一種含有蛋白酶之溶液，諸如蛋白酶k。可以根據需要預先測定溶液中蛋白酶之濃度。在某些實施例中，濃度約為1 mg/ml至100 mg/ml。在某些實施例，濃度係1 mg/ml、大約2 mg/ml、大約3 g/ml、大約4 mg/ml、大約5 mg/ml、大約6 mg/ml、大約7 mg/ml、約8 mg/ml、大約9 mg/ml、大約10 mg/ml、大約11 mg/ml、大約12 mg/ml、約13 mg/ml、大約14 mg/ml、大約15 mg/ml、約16 mg/ml、大約17 mg/ml、大約18 mg/ml、大約19 mg/ml、20 mg/ml、大約30 mg/ml、約40 mg/ml、大約50 mg/ml、大約60 mg/ml、約70 mg/ml、約80 mg/ml、約90 mg/ml、約100 mg/ml，或者更大。
在某些實施例中，沈澱之磁性顆粒與包括蛋白酶之溶液混合，諸如蛋白酶k。在某些實施例中，混合後蛋白酶之最終濃度係預先確定的。在某些實施例中，蛋白酶與沈澱磁顆粒混合後之最終工作濃度約為5至500 µg/ml。在某些實施例中，最終工作濃度約為5 µg/ml、6 µg/ml、7 µg/ml、8 µg/ml、9 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、150 µg/ml、200 µg/ml、250 µg/ml、300µg/ml、350 µg/ml、400 µg/ml、450µg/ml、500 µg/ml或更大。
在某些實施例中，沈澱磁顆粒及蛋白酶之混合物可以在預定之時間內保持在所需之溫度下。在某些實施例中，所需溫度係蛋白酶之較佳酶反應溫度。在某些實施例中，蛋白酶為蛋白酶K，溫度約為20℃至60℃。在某些實施例中，溫度約為50℃至60℃。在某些實施例中，溫度約為55℃ (±2℃)。
在某些實施例中，沈澱磁性顆粒及蛋白酶之混合物可以在預定之時間內保持靜止。在某些實施例中，時間大約係5分鐘、大約10分鐘、大約15分鐘、大約20分鐘、大約25分鐘、大約30分鐘、大約35分鐘、大約40分鐘、大約45分鐘、大約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘、約1.5小時、約2小時、3小時、大約4小時、大約5小時，或者更多。
在某些實施例中，尿液樣本經過磁性顆粒及蛋白酶之預處理後，被帶到下一個階段進行DNA提取。在某些實施例中，依次使用裂解液、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液及溶離緩衝液。
在某些實施例中，裂解溶液包含具有式(I)之化合物：
Figure 02_image001
式(I)，其中R1、R2、R3、R4、R5獨立地為氫、鹵素、醯基、經取代醯基、烷氧羰基、經取代烷氧羰基、芳基、經取代芳基、烴基、經取代烴基、芳基、經取代芳基、經取代芳基、異芳基、經取代異芳基、雜芳基、經取代雜芳基、芳烷基、經取代芳烷基、雜烷基。
在某些實施例中，該化合物包含胍。在某些實施例中，該化合物包含異硫氰酸胍或其功能衍生物。
在某些實施例中，裂解液亦包含界面活性劑、pH緩衝液、螯合劑及醇(例如，羥基官能團(OH)與碳結合之有機化合物)。在某些實施例中，界面活性劑為Triton X 100。在某些實施例中，pH緩衝液為Tris-HCl。在某些實施例中，螯合劑為EDTA。在某些實施例中，醇係異丙醇。
在某些實施例中，裂解液之pH值約為6.2至6.8，如約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7或約6.8。
在某些實施例，本發明之裂解液在添加至含有DNA之樣本(諸如液體樣本)之前可以係濃縮狀態，諸如2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100× 等等，其取決於稀釋比例。在某些實施例中，稀釋比例可以係10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:40、1:50、1:60、1:80、1:90、1:99，等等。根據稀釋比例，將裂解液與含有DNA之樣本混合，最終工作濃度為1X。
在某些實施例中，稀釋比例為3:1 (例如，將3體之積裂解液添加至1體積之含有DNA之樣本)。在此類情況下，裂解液之製備方法為，先製備包含約2至6M異硫氰酸胍，約1%至約5%Triton X 100、約20mM至50mMTris-HCl、大約10至50mM EDTA之溶液，再向該溶液中加入約50%至約200% (v / v)用量之異丙醇。
在某些實施例中，裂解液與含有DNA之樣本混合後，各組分之工作濃度(1X)為： (a)異硫氰酸胍約1.0 M至5.0M，諸如約1.0 M、約1.5 M、約2.0 M、約2.5 M、約3.0 M、約3.5 M、約4.0 M、約4.5M、約5.0M或更大； (b) Triton X-100約0.5%至4%，諸如約0.5%，約0.75%，約1.0%，約1.25%，約1.75%，約2.25%，約2.55，約2.75%，約3.255，約3.5%，約3.75%，約3.75%，約4%，或更大； (c) Tris-HCl約5 mM 至大約30 mM，諸如約 5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或更大； (d) EDTA約 2 mM 至大約20 mM，諸如約2 mM、約 5 mM、約 8 mM、約 11 mM、約 14 mM、約 17 mM、約 20 mM或更大； (e)約30%至大約150%用量(v/v)之異丙醇，諸如約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、約150%或更大。
在某些實施例中，將含有磁性顆粒之樣本與裂解液混合後，將容納該混合物之容器搖動預定時間。在某些實施例中，將容器搖晃約10至20分鐘，如約10分鐘、約11分鐘、約12分鐘、約13分鐘、約14分鐘、約15分鐘、約16分鐘、約17分鐘、約18分鐘、約19分鐘、約20分鐘或更長時間。
在某些實施例中，在本發明之裂解液裂解含有磁性顆粒之樣本後，藉由使用磁性物體(如磁性框架或自動核酸提取儀)收集樣本中之磁性顆粒。
在某些實施例，收集到之磁性顆粒在第一洗滌緩衝液中洗滌(洗滌緩衝液I)。
在某些實施例中，第一洗滌緩衝液包含具有式(I)結構之化合物
Figure 02_image001
式 (I)，其中R1、R2、R3、R4、R5分別為氫、鹵素、醯基、經取代醯基、烷氧羰基、經取代烷氧羰基、芳基、經取代芳基、烴基、取代烴基、芳基、經取代芳基、經取代芳基、異芳基、經取代異芳基、雜芳基、經取代雜芳基、芳烷基、經取代芳烷基、雜烷基。
在某些實施例中，第一洗滌緩衝液亦包含pH緩衝液、鹽及醇(例如，羥基官能團(-OH)與碳結合之有機化合物)。
在某些實施例中，pH緩衝液為Tris-HCl。在某些實施例中，鹽係鈉鹽，例如NaCl。在某些實施例中，醇係乙醇。
在某些實施例中，第一洗滌緩衝液之pH值約為4.5至5.5，如約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5。
在某些實施例，本發明之第一洗滌緩衝液在其用於洗滌磁性顆粒之前可以係濃縮狀態，諸如2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×，或更多，其取決於稀釋比例。在某些實施例中，稀釋比例可以係10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:40、1:50、1:60、1:80、1:90、1:99，以此類推。根據稀釋比例，用合適之溶劑稀釋洗滌緩衝液，達到最終之工作濃度。
在某些實施例中，各組分之工作濃度為： (a)異硫氰酸胍約50至100mM，諸如約50mM、約55mM、約60mM、約65mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM、約100mM或更大； (b) Tris-HCl約20mM至約50mM，諸如約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM或更大； (c) NaCL約50mM至200mM，諸如約50mM、約55mM、約60mM、約65mM、約70mM、約75mM、約80mM、約85mM、約90mM、約95mM、約100mM、約105mM、約110mM、約115mM、約120mM、約125mM、約130mM、約135mM、約140mM、約145mM、約150mM、約155mM、約160mM、約165mM、約170mM、約175mM、約180mM、約185mM、約190mM、約195mM、約200mM或更大； (d)約40%至約60% (v/v)乙醇，諸如約40%、約45%、約50%、約55%、約60%或更大。
在某些實施例，每0.1mg至1mg磁性顆粒使用大約500至1000µl第一洗滌緩衝液。
在某些實施例中，樣本中之磁性顆粒被清洗一段預定之時間。在某些實施例中，將磁顆粒清洗約1至10分鐘，如約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘或更長時間。
在第一洗滌緩衝液中洗滌後，藉由用磁性物體(諸如磁力架或自動核酸提取儀)再次收集磁性顆粒
在某些實施例，收集到之磁性顆粒在第二洗滌緩衝液(洗滌緩衝液II)中洗滌。
在某些實施例中，第二洗滌緩衝液亦包含pH緩衝液及醇(例如，羥基官能團(-OH)與碳結合之有機化合物)。
在某些實施例中，pH緩衝液為Tris-HCl。在某些實施例中，醇係乙醇。
在某些實施例中，第二洗滌緩衝液之pH值約為5.5至6.5，如約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5。
在某些實施例，本發明之第二洗滌緩衝液在用於洗滌磁性顆粒之前可以係濃縮狀態，諸如2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×、20×、25×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、甚至更多，其取決於稀釋比例。在某些實施例中，稀釋比例可以係10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:40、1:50、1:60、1:80、1:90、1:99，等等。根據稀釋比例，用合適之溶劑稀釋洗滌緩衝液，達到最終之工作濃度。
在某些實施例中，各組分之工作濃度為： (a) Tris-HCl約10mM至約50mM，諸如約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM或更大； (b)乙醇約70%至80%，諸如約71%、約72%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%。
在某些實施例，每0.1mg至1mg磁性顆粒使用大約500至1000µl第二洗滌緩衝液。
在某些實施例中，樣本中之磁顆粒在第二洗滌緩衝液中洗滌預定之時間。在某些實施例中，將磁顆粒清洗約1至10分鐘，如約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘或更多。
在某些實施例中，用第二洗滌緩衝液洗滌後，藉由使用磁性物體(如磁力架或自動核酸提取儀)再次收集磁性顆粒。
在某些實施例中，收集到之磁性顆粒在溶離緩衝液中處理，以釋放分離之DNA分子。
在某些實施例中，溶離緩衝液係TE緩衝液。在某些實施例中，TE緩衝液係1X TE緩衝液，其包含約10mM Tris及約1mM EDTA。在某些實施例中，使用鹽酸將TE緩衝液之pH值提高至8.0左右。
在某些實施例中，在磁顆粒被溶離緩衝液處理之前，其需要在預定之溫度下靜置預定時間。
在某些實施例中，預定時間約為1至10分鐘，如約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘或更長時間。
在某些實施例中，預選溫度可以係室溫、較高或較低之溫度，諸如約-80℃至約37℃。
在某些實施例，溶離步驟包含在相對較高之溫度下加熱包括磁性顆粒之溶離緩衝液，諸如約50℃至75℃，如約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、或者更高。 尿液樣本儲存及/或DNA提取之套組
本發明亦提供了用於尿液樣本儲存及/或用於自尿液樣本中提取DNA之套組。
在某些實施例中，此等套組可以包含、包括或基本上包括本文描述之一個或多個成分，此等成分可用於儲存生物樣本，例如尿液樣本。在某些實施例中，該套組包括pH緩衝液、螯合劑及/或界面活性劑。在某些實施例中，pH緩衝液為乙酸-乙酸鈉；螯合劑為EDTA；界面活性劑係SDS。上文描述了用於儲存尿液樣本之套組中各組分之濃度。在某些實施例中，套組之一個或多個或所有成分以液體形式呈現。在某些實施例中，套組之一個或多個或所有組分以固體形式呈現。在某些實施例中，一個或多個成分處於濃縮狀態，在使用前必須稀釋。在某些實施例中，一個或多個成分處於工作濃度，可以直接使用。在某些實施例中，該套組包括用於製造溶液之溶劑。在某些實施例中，此等套組包含用於收集尿液樣本之容器。在某些實施例中，套組包含一個或多個量測容器。在某些實施例中，量測容器用於量測尿液樣本之體積。在某些實施例中，該套組包含用於在尿液樣本與套組中之組分混合後儲存該尿液樣本之容器。
在某些實施例中，該套組可包含、包括或基本上包括本發明中描述之用於DNA提取之一個或多個組分，諸如裂解液、磁性奈米顆粒、蛋白酶、第一洗滌緩衝液、第二洗滌緩衝液及/或溶離緩衝液。在某些實施例中，裂解液包含異硫氰酸胍、Triton X 100、Tris-HCl、EDTA及異丙醇。在某些實施例中，磁性奈米顆粒具有內芯層及外殼層，其中內芯層由核殼型磁性奈米顆粒組成，其中外殼層由SiO2組成。在某些實施例中，第一洗滌緩衝液包含異硫氰酸胍、Tris-HCl、NaCl及乙醇。在某些實施例中，第二洗滌緩衝器包含Tris-HCl及乙醇。在某些實施例中，蛋白酶為蛋白酶k。在某些實施例中，溶離緩衝液為1× TE緩衝液，pH值約為8.0。在某些實施例中，上述描述了套組中之組分濃度。在某些實施例中，套組之一個或多個或所有組分以液體形式呈現。在某些實施例中，套組之一個或多個或所有組分以固體形式呈現。在某些實施例中，一個或多個組分處於濃縮狀態，在使用前必須稀釋。在某些實施例中，一個或多個組分處於工作濃度，可以直接使用。在某些實施例中，該組分包括用於製造溶液之溶劑。在某些實施例中，此等套組包含用於DNA提取之一個或多個容器。在某些實施例中，該容器適用於自動核酸提取系統。在某些實施例中，容器係多孔裝置，例如48孔裝置、96孔板或384孔板。在某些實施例中，此等套組包含用於儲存自樣本中提取之DNA之容器。
在某些實施例中，該套組可包含、包括或基本上包括本發明所述之一個或多個組分，用於儲存生物樣本(例如尿液樣本)及自該等生物樣本中提取DNA。
此外，本發明之套組可包含指導(例如，技術操作規程)本發明所述方法之實踐之教學材料。 疾病診斷
本發明亦提供了偵測生物樣本(諸如自個體收集之尿液樣本)中存在或不存在或一種或多種分析物之含量之方法。在某些實施例中，該等方法包含使用本發明所述之組合物及方法自樣本中提取DNA，並偵測生物樣本中存在或不存在一種或多種分析物。在某些實施例中，該等生物樣本已由本發明之組合物處理，其儲存時間更長。在某些實施例中，處理後之尿液樣本在進行分析之前已經儲存了一段時間。在某些實施例中，至少有一個分析物係樣本中之DNA分子。在某些實施例中，DNA分子係疾病之生物標記物
本發明之組合物及方法適用於許多疾病之診斷及/或治療。在某些實施例中，疾病與泌尿生殖系統之一個或多個器官或組織相關聯。在某些實施例中，疾病與病原體感染及/或癌症相關。本發明之組合物及方法提供了一種方便、無侵入性及廉價之方法來儲存尿液樣本及自尿液樣本中提取DNA。該組合物及方法亦使自同一個體之多個樣本或多個個體之樣本中提取DNA在技術及經濟上成為可能。此外，本發明揭示之組合物及方法適用於大規模自動尿液樣本處理及DNA提取。尤其係成分及方法適用於分析收集自同一個體在很長一段時間(例如，幾個星期至幾個月)不使用低溫儲存設備之有相對較大之體積(例如，約1至10毫升)之尿液樣本，其使得其可以重複之以較低之成本進行分析，並監測個體之疾病。由於所分析尿液樣本之體積相對較大(與以往通常處理體積小於1 ml尿液樣本之方法相比)，本發明之組合物及方法以較低之成本提供了更穩定可靠之診斷結果。
因此，本發明中處理後之樣本可用於診斷、監測及/或治療目的。在某些實施例中，診斷、監測及/或治療涉及個體中之一種或多種疾病。在某些實施例中，疾病包含但不限於疼痛障礙；體溫之改變(例如發燒)；神經系統功能障礙(如暈厥、肌痛、運動障礙、麻木、感覺喪失、譫妄、癡呆、記憶力喪失或睡眠障礙)；與眼睛、耳朵、鼻子及喉嚨有關之疾病；與循環及/或呼吸功能有關之情況(例如，脊柱疾患、肺水腫、咳嗽、咯血、高血壓、心肌梗塞、缺氧、發紺、心血管衰竭、充血性心力衰竭、水腫或休克)；與胃腸功能有關之情況(如吞咽困難、腹瀉、便秘、胃腸道出血、黃疸、腹水、消化不良、鼻塞、嘔吐)；與腎臟及尿路功能相關之疾病(如酸中毒、鹼中毒、液體及電解質失衡、無氮血症或尿路異常)；與性功能及生殖有關之情況(如勃起功能障礙、月經紊亂、多毛、陽剛之氣增多、不育、妊娠相關障礙及標準量測)；與皮膚有關之情況(如濕疹、牛皮癬、痤瘡、酒渣鼻、皮膚感染、免疫性皮膚病或光敏性皮膚病)；與血液有關之情況(例如血液學)；基因(例如，遺傳疾病)；與藥物反應有關之情況(例如藥物不良反應)；以及營養(如肥胖、飲食失調或營養評估)。本發明實施例具有實用價值之其他醫學領域包含腫瘤學(例如，腫瘤、惡性腫瘤、血管生成、副腫瘤綜合症或腫瘤急診)；血液學(如貧血、血光病、巨細胞性貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血、骨髓增生異常、骨髓衰竭、真性紅細胞增多症、增生性肌增生性疾病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、淋巴惡性腫瘤、漿細胞疾病、輸血生物學或移植)；止血(如凝血及血栓形成障礙，或血小板及血管壁障礙)；感染性疾病(如敗血症、感染性休克、不明原因發熱、心內膜炎、咬傷、燒傷、骨髓炎、膿腫、食物中毒、盆腔炎、細菌(如革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、雜菌(革蘭氏陽性、肌動蛋白陽性、混合)、支原體、螺旋體、立克次體或支原體)；衣原體；病毒(DNA、RNA)、真菌及藻類感染；原生動物及蠕蟲感染；內分泌疾病；營養疾病；及代謝疾病。
在某些實施例中，疾病與泌尿生殖系統相關。在某些實施例中，疾病與男性或女性泌尿生殖系統相關聯。在某些實施例中，醫療條件與組織、器官或男性泌尿生殖系統之一部分有關，諸如脊柱、直腸、精囊、射精管、肛門、附睾、睾丸、陰囊、輸尿管、膀胱、輸精管、勃起組織、陰莖、尿道、陰莖、腎臟等。在某些實施例中，疾病與組織、器官或女性泌尿生殖系統之一部分有關，諸如腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、子宮、輸卵管、卵巢及陰道。
在某些實施例，疾病包含但不限於急性腎小球腎炎、腎病綜合症、慢性腎炎、腎炎、腎病、急性腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、腎感染、腎盂腎炎、腎盂積水、腎結石及輸尿管結石、下尿路感染、膀胱炎、尿道炎、尿道炎、尿道狹窄、前列腺增生、前列腺之炎症性疾病、積水、睾丸炎、附睾炎、包皮過長、包莖過多、不孕、陰莖功能障礙、乳腺良性病變、卵巢、輸卵管、盆腔細胞組織炎性疾病、腹膜炎性疾病、子宮炎性疾病(宮頸除外)、宮頸、陰道、外陰炎性疾病、子宮內膜異位症、生殖器脫垂、子宮功能障礙、性傳播疾病等。
在某些實施例中，疾病與一個或多個病原體相關聯。
在某些實施例中，病原體係病毒。在某些實施例，病毒包含但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類乳突病毒(HPV)、單純疱疹病毒(HSV)、人類巨細胞病毒(HCMV)、人類疱疹病毒(HHV)、人類內源性逆轉錄病毒(HERV) Zika病毒、登革熱病毒、基孔肯雅病毒、埃博拉病毒、人類T淋巴細胞病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LMCV)、EB病毒、水痘一帶狀疱疹病毒、JC病毒、細小病毒、流感、輪狀病毒、人腺病毒、風疹病毒、人腸病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、埃可病毒、柯薩奇病毒、天花病毒、牛痘病毒、風疹病毒、漢坦病毒或任何其他經腎病毒。在某些實施例中，病毒係HPV。
在某些實施例中，HPV係一種高危型HPV，如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53及66。在某些實施例中，HPV係一種低危型HPV，例如HPV  6、11、42、43及44。
在某些實施例中，qPCR用於測定給定HPV亞型之存在或不存在。在某些實施例中，藉由螢光信號之累積偵測到陽性反應。循環臨限值(Ct)定義為螢光信號與臨限值相交(如超過背景含量)所需之循環次數。在某些實施例中，臨限值由qPCR儀器之軟體或其他合適之方法自動測定。在某些實施例中，臨限值僅設置在超過陰性對照樣本中終點螢光值(例如，約0.01%、0.1%、1%、5%或10%更高)。在某些實施例中，當與HPV亞型擴增關聯之Ct值在測試樣本不超過(≤)大約35、34、33、32、31、30、或者更少，則該樣本被測定包括HPV亞型(陽性結果)，否則樣本被測定不包括HPV亞型(陰性結果)。對於內參基因之擴增，當與內參基因擴增關聯之Ct值不超過(≤)大約35、34、33、32、31、30、29、或者更少，則內參基因被測定為陽性的，否則內參基因擴增被測定為陰性的。當內參基因擴增結果為陰性時，且HPV基因擴增結果亦為陰性時，測試結果無效。
在某些實施例中，病原體係細菌。在某些實施例中，細菌係大腸桿菌、淋病奈瑟菌、鉤端螺旋體病或結核分枝桿菌。
在某些實施例中，病原體係沙眼衣原體、生殖支原體、陰道毛滴蟲或解脲支原體。
在某些實施例中，疾病係癌症。在某些實施例中，癌症包含但不限於膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、泌尿系癌、腎癌、睾丸癌、尿路上皮癌、結直腸癌、胰腺癌及胃癌。
在某些實施例中，本發明中處理後之樣本，例如本發明中處理後之尿液樣本，可用於診斷本個體之一種或多種疾病。在某些實施例中，測定樣本中與一種或多種疾病相關之一個或多個生物標記物之存在或不存在，或其含量。
膀胱癌生物標誌物包含但不限於CA9、CCL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH、及MXRA FIXA1、載脂蛋白A1 (APOA1)、載脂蛋白A2 (APOA2)、酶類2 (PRDX2)、肝素輔因子2前體(HCII)、血清澱粉樣蛋白4 (SAA4)、半胱胺酸蛋白酶抑制物B、選自啟動子區域集合GDF15啟動子區域、HSPA2啟動子區域及TMEFF2啟動子區域、ABCC13、ABCC6、ABCC8、ALX4、APC、BCAR3、BCL2、BMP3B、BNIP3、BRCA1及BRCA2、CBR1、CBR3 CCNA1、CDH1、CDH13、CDKN1C、CFTR、COX2、DAPK1、DRG1、DRM、EDNRB、FADD、GALC、GSTP1、HNF3B、HPP1、HTERT、ICAM1、ITGA4、LAMA3、LITAF、MAGEA1、MDR1、MGMT、MINT1、MINT2、MT1GMT、MINT1、MINT2、MT1A、MTSS1、MYOD1、OCLN、p14ARF、p16INK4a、RASSF1A、RPRM、RUNX3、SALL3、SERPINB5、SLC29A1、STAT1、TMS1、TNFRSF10A、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF21、WWOX之啟動子區域甲基化CpG島，此等描述在美國發明專利案第20140303001號及第20140303001號，其中之每一者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
前列腺癌之生物標誌物包含但不限於前列腺特異抗原(PSA)、前列腺癌抗原3 (PCA3)、α-甲基醯基-CoA消旋酶、膜聯蛋白A3、TMPRSS2:ERG、個人炎性細胞因子(例如Il-6、IL-8、TGF-β1)、c反應蛋白(CRP)、鐸樣受體(TLRs)、嗜中性白血球與淋巴細胞比率、PD-1/PD-L1 (B7-H1)、CD276(B7-H3) CD73、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、細胞毒性CD8腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、Treg腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)以及描述於以下中之彼等者：美國專利案第8518650號、第8784795號、第10048265號及美國申請公開案第20100292331號、第20170058352號、第20140094380號、第20140106369號、第20130217647號、第20130116142號、第20150116133號、第2017001161303號、第201301161303號、第20100216131313號、第201401154169號、第20130184169號、第201401824961號、第20140041173號、第201404117773號、第20160218655號、第20160218682號、第20160176443號、第20160206443號、第2016025255887號、第2016025258958號、第2016025898500號、第20150276746號、第20130331279號、第201402747894號、第20140184169號、第20150024961，20080254481號、第20070009970號、第20110045053及第20140051082號，其中之每一者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
卵巢癌生物標記物包含但不限於Cyr61、ApoA1、beta 2微球蛋白、CA125及描述於以下中之彼等者：美國專利案第5769074號、第7666583號、第8053198號、第8288110號、第8206934號、第9816995號、第美國實用型專利號US20090068690號、第20090075307號、第20090081685號、第20140274787號、第20130267439號、第20070212721號、第20150080229號、第20180196054號、第20080286814號、第20110256560號、第20100197561號、第20150168414號、第20070054329號、第20100221752號、第20100086948號、第20060029956號、第20180074063號、第20100105067號、第20160047815號、第20090087849號、第20100055690號、第20150147823號、第20130096022號、第20120027276680號、第20150362497號、第20050214760號、第2011027172902號、第20110272172902號、第201302171559號、第201300229958號、第20150126384號、第20120171694號、第20100227335號、第20150198600號、第20080254048號、第20140121127號、第20100227343號、第20140221240號、第20090004687，其中之每一者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
結直腸癌生物標誌物包含但不限於，BMP3、TFPI1、NDRG4、Septin9、TFPI2、OPLAH、FLI1、PDGFD、SFMBT2、CHST2、VAV3、DTX1及描述於以下之彼等者：美國專利案第9095549號、第9835626號、第8426150號、第10042983號，及美國專利公開案第20090142332號、第20180282815號、第20050014165號、第20170205414號、第20130345322號、第20130323253號、第20120040383號、第20080020940號、第20100304410號、第20150072341號、第20120264131號、第20170176441號、第20120207856號、第20150212088號、第20080286801號、第20160160296號、第20180094322號、第20180164320號、第20140045180號、第20140113882號、第201401121215號、第201401121215號、第20170108501號、第20170234874，其中之每一者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
腎癌生物標誌物包含但不限於山梨糖醇、果糖、6磷酸山梨醇、豆蔻酸、棕櫚酸及硬脂酸、水孔蛋白-1 (AQP1)、親脂素(ADFP)以及描述於以下中之彼等者：美國發明專利第8426150號、第8335550號、第8211653號、美國申請公開案第20160245814號、第20140343865號、第20100261224號、第20150198600號、第20060084126號、第20110237450號、第20170108501號、第20070054282號、第20170240971號、第20110151460號、第20170234884號、第20140213475號、第20180068083號、第20160305947號、第20150017638號、第20160215349號、第20120207856號、第20080139402號、第20030190602號、第20030199685號、第20100233080號、第20110020836號、第20170166685號、第20160166685號、第20180171022號、第20070026415號、第20150124329號、第201000226344號、第2016002263838號、第20090299154，其中之每一者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
移行細胞癌生物標誌物包含但不限於SLC2A1、S100A13、GAPDH、KRT17、GPRC5A、P4HA1、HSD17B2、泛素2、EGF、IL1β、sTNFR、VEGF、CK18、vWF、FAS。定義
引用「一個實施例」、「一實施例」、「一個實例」及「一實例」表明，如此描述之實施例或實例可包括特定特徵、結構、特性、屬性、要素、或限制，但每個實施例或實例並不一定包括特定特徵、結構、特性、屬性、要素或限制。此外，習語「在一個實施例中」之重複使用不一定指同一實施例，儘管其可以。
如本文所使用之術語「約」係指所參考數字之正負10%或5%。
如本文中所使用，「核酸」或「寡核苷酸」或「聚核苷酸」意謂共價連接在一起之至少兩種核苷酸。單股之描述亦定義了互補股之序列。因此，核酸亦涵蓋所描繪單股之互補股。核酸之許多變體可與給定核酸用於相同目的。因此，核酸進一步涵蓋實質上一致之核酸及其補體。單股提供一種探針，其可在嚴格雜交條件下與目標序列雜交。因此，核酸進一步涵蓋在嚴格雜交條件下雜交之探針。核酸可為單股或雙股，或可含有雙股及單股序列之部分。核酸可為DNA、基因組及cDNA、RNA，或雜交物，其中核酸可含有脫氧核糖及核糖核苷酸，及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶及異鳥嘌呤鹼基之組合。核酸可藉由化學合成或重組方法獲取。
如本文中所使用的指代核酸之「變體」係指(i)參考核苷酸序列之一部分；(ii)參考核苷酸序列或其部分之補體；(iii)與參考核酸或其補體實質上一致之核酸；或(iv)在嚴格條件下與參考核酸、其補體或與其實質上一致之序列雜交之核酸。
如本文所使用之術語「診斷」係指對病理或症狀進行分類，測定病理之嚴重程度(例如，分級或分期)，監測病理進展，預測病理結果及/或康復前景。
習語「基本上由…組成」意謂組合物或方法可能包括額外成分及/或步驟，但僅當額外成分及/或步驟不會實質性改變所主張之組合物或方法之基本及新穎特徵時如此。
如本文所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數參考物，除非上下文另有明確規定。例如，術語「化合物」或「至少一個化合物」可以包括多個化合物，包括其混合物。
詞語「視情況」在本文中用於表示「在一些實施例中提供，而不在其他實施例中提供」。本發明之任何特定實施例可包括多個「可選」特徵，除非此等特徵相衝突。
如本文中所使用，「異丙醇之用量(V/V)」意謂在製備最終溶液期間異丙醇之體積與包含該溶液中所有其他組份之溶液之體積的比率。例如，「異丙醇之用量為約50%至200% (v/v)」意謂在製備最終溶液時所添加的異丙醇之體積為包含該最終溶液中所有其他組份之溶液之體積的50%至200%。
在本文中「Ct值」表示循環臨限值，係指螢光信號與臨限值相交(諸如超過背景含量)所需之循環次數。Ct值與樣本中之目標核苷酸含量成反比。
本發明之某些實施例將在以下實例中進一步描述。應理解，此等實例僅以說明之方式給出。根據以上論述及此等實例，熟習此項技術者可以確定基本特徵，並且在不偏離其精神及範圍之情況下，可以對本發明之實施例進行各種更改及修改，使其適應各種用途及條件。因此，除了本文所展示及描述之修改外，本發明實施例之各種修改將對於熟習此項技術者根據前述描述而顯而易見。此等修改亦意欲落入所附申請專利範圍之範疇。實例 實例1：尿液樣本儲存液之製備
乙酸-乙酸鈉緩衝液 (2 mol/L，pH=6.0)、SDS 溶液 (10% (M/V))及EDTA 溶液 (0.5 mol/L，pH 8.4) 以10:20:1之比例按體積混合，以製備尿液樣本儲存液。例如，若需 310 mL 溶液，取100 ml乙酸-乙酸鈉緩衝液，200 ml SDS溶液，及10 ml EDTA溶液進行混合。 實例2：尿液樣本DNA提取試劑之製備
為自尿液樣本中提取DNA，需要提供以下試劑： 磁珠：商品化矽羥基磁珠，粒徑為300奈米，濃度為50 mg/ml 蛋白酶K：商品化20mg/ml蛋白酶K，用去離子水稀釋至10mg/ml 裂解液：先製備包含 5 M 異硫氰酸胍、4% Triton X 100、25 mM Tris-HCl (pH 6.5)、10 mM EDTA之溶液，再向該溶液中加入200% (V/V)用量之異丙醇並且調整其pH至6.5。最終之裂解液中包含 1.67 M異硫氰酸胍、1.33% Triton X 100、8.33 mM Tris-HCl、3.33 mM EDTA，以及占裂解液體積66.7%之異丙醇(v/v)。 洗滌緩衝液 I：50 mM 異硫氰酸胍、50 mM Tris-HCl (pH 5.0)、100 mM NaCl、60% 乙醇並且調整其 pH 至 5.0。 洗滌緩衝液 II：10 mM Tris-HCl (pH 6.0) 及70%乙醇並且調整其 pH 至6.0。 溶離緩衝液：1× TE (pH 8.0)。 實例3：驗證尿液樣本儲存試劑之有效性
人類尿液樣本收集自多個人類個體。每個尿液樣本被分成兩部分。第一部分以10:1之比例(尿液:儲存液)加入實施例1中製備之儲存液中，第二部分加入等量之無菌去離子水作為對照組。所有之樣本均放置在37攝氏度之溫度下進行熱加速實驗。
分別於第0天、第4天及第7天取樣。使用實例2中製備之尿液DNA提取試劑提取收集樣本中之DNA。提取之DNA中之 β-肌動蛋白基因進行定量PCR擴增。偵測β-肌動蛋白基因之引子及探針序列: CGTGCTCAGGGCTTCTTGTC (上游引子，SEQ ID NO: 1)、CTCGTCGCCCACATAGGAATC (下游引子，SEQ ID NO: 2)及5'-FAM-TGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3'BHQ1 (探針，SEQ ID NO: 3)。採用螢光定量PCR結果測定經過熱加速後樣本之DNA品質。結果如下面之表1及圖1所示。 表1：尿液樣本儲存試劑之驗證
   0天 4天 7天
β-肌動蛋白Ct值 β-肌動蛋白Ct值 β-肌動蛋白Ct值
對照組 (無儲存試劑) 29.67 29.83 29.8 29.68 29.58 36.9 36.58 38.04 37.29 36.79 37.41 41.04 36.34 37.04 38.07
測試組 (有儲存試劑) 29.18 29.5 29.2 29.08 29.29 30.63 30.26 30.89 30.58 30.7 29.34 28.94 29.3 28.97 28.85
結果表明，將混合尿液儲存試劑之尿液樣本與第0天收集之尿液樣本進行比較時，β-肌動蛋白基因數量及品質沒有顯著差異，即使在尿液樣本儲存在37℃下7天，藉由qPCR Ct值進行驗證。在第0天收集之尿液樣本與在沒有儲存試劑之情況下僅在37℃儲存4天之尿液樣本有顯著差異。結果表明，該尿液儲存試劑即使在高溫條件下亦能有效地儲存尿液樣本中之DNA。 實例4：尿液樣本貯存試劑穩定性驗證
本實驗採用實例1所示之尿液樣本儲存試劑對尿液樣本進行處理後，偵測尿液樣本之DNA穩定性。
選取12例高危hpv陽性尿液樣本作為研究對象。將每個尿液樣本與例1中生成之尿液儲存試劑按10:1之比例混合。每種混合物之等分分別在4℃及室溫下儲存。
在混合物製成後之0、1、2、3及4週，使用實例2中生產之DNA提取試劑自此等試樣中提取DNA。採用高危人類乳突病毒偵測套組(hybribio Bio)偵測HPV DNA，以測定尿液樣本中DNA之穩定性。
表2及圖2證明β-肌動蛋白基因之DNA之穩定性，在4 ℃儲存0、1、2、3、4週後，如螢光定量PCR中β-肌動蛋白基因Ct值所示。
表3及圖3證明β-肌動蛋白基因之DNA之穩定性，在室溫儲存0、1、2、3、4週後，如螢光定量PCR中β-肌動蛋白基因Ct值所示。 表2：在4℃條件下含有尿液樣本儲存試劑之尿液樣本中β-肌動蛋白穩定性。 (0至4週，如qPCR Ct值所示)
   0週 (ct 值) 1週 (ct 值) 2週 (ct 值) 3週 (ct 值) 4週 (ct 值)
樣本 1 19.92 19.88 20.21 19.56 19.54
樣本 2 17.57 21.01 19.30 19.08 19.09
樣本 3 19.70 19.63 19.85 19.41 19.06
樣本 4 17.57 17.83 17.55 17.71 17.36
樣本 5 18.41 18.66 18.28 18.28 18.14
樣本 6 17.75 18.58 18.62 18.21 18.30
樣本 7 20.17 20.12 19.91 20.04 19.78
樣本 8 21.76 22.13 22.01 21.85 21.85
樣本 9 20.99 21.23 21.19 21.16 20.82
樣本 10 17.74 18.68 18.05 18.22 17.61
樣本 11 23.05 21.05 21.10 21.26 21.09
樣本 12 20.66 20.71 20.72 20.64 20.27
表3：在室溫條件下含有尿液樣本儲存試劑之尿液樣本中β-肌動蛋白穩定性。 (0至4週，如qPCR Ct值所示)
   0週 (ct 值) 1週 (ct 值) 2週 (ct 值) 3週 (ct 值) 4週 (ct 值)
樣本 1 19.92 20.04 19.56 19.82 20.58
樣本 2 17.57 17.82 17.87 17.88 17.95
樣本 3 19.70 19.43 19.67 19.25 19.04
樣本 4 17.57 18.57 18.13 18.36 17.19
樣本 5 18.41 19.61 19.49 20.05 18.83
樣本 6 17.75 19.44 18.98 20.46 18.30
樣本 7 20.17 20.86 20.56 40.00 40.00
樣本 8 21.76 21.95 22.13 22.07 23.43
樣本 9 20.99 21.35 22.00 22.20 40.00
樣本 10 17.74 18.31 18.29 18.60 18.64
樣本 11 23.05 21.56 20.87 21.60 21.92
樣本 12 20.66 21.26 19.84 21.01 20.76
表4及圖4證明在4℃條件下，在0、1、2、3、4週後HPV標記基因之DNA穩定性，如螢光定量PCR中β-肌動蛋白基因Ct值所示。
表5及圖5證明在室溫條件下，在0、1、2、3、4週後HPV標記基因之DNA穩定性，如螢光定量PCR中β-肌動蛋白基因Ct值所示。 表4：在4℃條件下含有尿液樣本儲存試劑之尿液樣本中HPV基因穩定性。 (0至4週，如qPCR Ct值所示)
   0週 (ct 值) 1週 (ct 值) 2週 (ct 值) 3週 (ct 值) 4週 (ct 值)
樣本 1 27.95 28.14 27.32 25.97 28.28
樣本 2 18.62 19.19 18.54 18.96 18.99
樣本 3 20.30 20.18 20.49 20.20 20.03
樣本 4 18.33 18.61 18.22 18.47 18.11
樣本 5 25.11 25.27 25.11 25.29 25.16
樣本 6 26.07 26.08 25.89 26.26 25.84
樣本 7 22.83 22.59 22.48 21.77 22.69
樣本 8 27.33 27.46 27.98 27.57 26.98
樣本 9 27.30 27.30 27.15 27.52 26.39
樣本 10 22.85 23.38 23.23 23.49 22.88
樣本 11 24.46 23.75 24.14 24.31 24.16
樣本 12 24.58 23.83 24.58 24.52 24.10
表5：在室溫條件下含有尿液樣本儲存試劑之尿液樣本中HPV基因穩定性。 (0至4週，如qPCR Ct值所示)
   0週 (ct 值) 1週 (ct 值) 2週 (ct 值) 3週 (ct 值) 4週 (ct 值)
樣本 1 27.95 27.15 27.03 40.00 40.00
樣本 2 18.62 18.48 18.67 18.76 18.86
樣本 3 20.30 20.08 20.11 20.16 20.03
樣本 4 18.33 19.26 18.72 18.94 17.25
樣本 5 25.11 25.71 25.65 25.96 25.19
樣本 6 26.07 26.55 26.48 25.38 40.00
樣本 7 22.83 22.76 23.19 23.45 22.73
樣本 8 27.33 27.12 27.22 27.01 27.02
樣本 9 27.30 27.05 27.23 27.80 27.37
樣本 10 22.85 23.30 22.66 23.60 23.84
樣本 11 24.46 24.06 23.68 24.13 24.39
樣本 12 24.58 24.95 21.09 25.16 23.89
上述實驗結果表明，將尿液樣本與本發明之尿液儲存試劑混合後，人類β-肌動蛋白基因之DNA分子及尿液中之高危HPV DNA樣本儲存在4℃，持續1週、2週、3週、4週，將其與在0週收集之尿液樣本中之DNA進行比較，係因為如藉由PCR量測之DNA品質及數量沒有顯著改變。將常溫儲存之尿液樣本與本發明之尿液儲存試劑混合後，與第0週收集之尿液樣本相比，1至2週後無明顯變化，但3至4週後開始變得不穩定。結果表明，本發明之尿液儲存試劑在處理後之樣本在4℃下儲存至少4週，或在室溫下儲存至少2週時，尿液樣本中之DNA保持穩定。 實例5：驗證尿液樣本DNA提取試劑之有效性
使用不同方法或套組提取含有高危型HPV之尿液樣本中之DNA。該等方法或套組包含Quick-DNA尿液套組(ZYMO RESEARCH, D3061)、磁珠法尿液基因組DNA提取套組(Enriching biotechnology, UDE-5005)、FineMag磁珠法大體積血漿游離DNA提取試劑(Genefine Biotech, FM107)以及本發明之尿液DNA提取試劑。在DNA提取之後，使用凱普高危型人類乳突病毒偵測試劑進行實時螢光定量PCR偵測HPV。按照每一種試劑之說明書進行操作。
使用本發明之DNA提取試劑自尿液樣本中提取DNA，採取了以下步驟： 1. 尿液樣本預處理：將10ml尿液樣本加入50ml離心管中。加入20μl羥基磁珠至樣本中並渦旋混勻。試管以10000rpm離心5min。之後小心棄去上清，將500μl沈澱加入新的1.5ml 離心管 加入2.5 μl 蛋白酶K至上述沈澱中。將離心管在 56℃金屬浴培育30 min。 2. 分裝提取試劑：裂解液、洗滌緩衝液I、洗滌緩衝液II及溶離緩衝液分別以 750 μl、600 μl、600 μl及50 μl加入96孔深孔提取板中。
表6展示了一個可能之樣本加載計劃。其中自A至H之8列中，每一列可以對2個樣本進行DNA提取。對於一個96孔板，可以自16個樣本中提取DNA。 表6.在96孔板上提取DNA之樣本裝載計劃
   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
B 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
C 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
D 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
E 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
F 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
G 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
H 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液 裂解液 裂解液 洗滌緩衝液I 洗滌緩衝液II    溶離緩衝液
在第1、2、7及8行之每一孔中，將750 μl裂解液及250μl上述處理後之尿液樣本進行混合。600 μl洗滌緩衝液I加入至第3及9行之每一孔。600 μl洗滌緩衝液II 加入至第4及10行之每一孔。50 μl 溶離緩衝液加入至第6及12行之每一孔。
3.使用自動DNA提取設備提取DNA：上述含有樣本之96孔板被放入自動DNA提取設備(西安天隆, NP968-S)中。按照操作說明書，使用如下程式： 表7：自動DNA提取設備程式
步驟 混勻時間 磁吸時間 體積 混勻速度 溫度 孔位 描述 等待時間
1 10 min 60s 1000 μl Level 7    1 裂解結合   
2 5 min 60s 1000 μl Level 7    2 裂解結合   
3 3 min 60s 600 μl Level 7    3 洗滌   
4 2 min 60s 600 μl Level 7    4 洗滌   
5 5 min 60s 50 μl Level 7 65℃ 6 溶離 5分鐘
6 2 min    50 μl Level 6    4 棄磁珠   
使用不同方法/套組自尿液樣本中提取DNA分子後，使用螢光定量PCR方法偵測HPV基因，以測定此等方法/套組之DNA提取效率。每一種DNA提取方法或套組使用等量之尿液，並且每一種提取方法或套組使用相同體積之DNA進行 PCR 以便做出有意義之比較。結果如圖6A至圖6D中所示。
結果表明，與現有之商業產品相比，本發明之試劑及方法提供了一種自尿液樣本中提取DNA更有效之方法。 實例6.尿液DNA提取試劑之各組分之配方最佳化
為了提高尿液中DNA提取純化之提取純化效率，對本提取試劑之裂解液成分、洗滌緩衝液I成分、洗滌緩衝液Ⅱ成分、磁珠用量、蛋白酶k 用量進行了最佳化。
裂解液配方最佳化：在5M異硫氰酸胍濃度不變及異丙醇用量為200%(V/V)之情況下，分別對4%TritonX-100搭配5mM、10mM、25mM、50mM、100mM 共5個不同濃度之EDTA之裂解液配方，以及10mM EDTA搭配1%、2%、4%、6%、8%共5個不同濃度之TritonX-100之裂解液配方進行了最佳化；使用上述不同配方之裂解液(見表8)對同一份尿液樣本進行DNA提取。在本文描述中，「濃度」係指溶液中各組分在加入異丙醇之前之濃度。洗滌緩衝液採用75%乙醇，溶離緩衝液採用1*TE，磁珠採用300nm羥基磁珠，蛋白酶K濃度為10mg/ml，尿液DNA提取方法使用本發明中實例3中之方法。對經不同配方裂解液提取之尿液DNA中之 β-肌動蛋白基因進行定量PCR擴增偵測，藉由β-肌動蛋白基因之含量(與測得之Ct值呈反比)來判斷不同配方裂解液之提取效率。偵測β-肌動蛋白基因之引子及探針序列: CGTGCTCAGGGCTTCTTGTC (上游引子，SEQ ID NO: 1)、CTCGTCGCCCACATAGGAATC (下游引子，SEQ ID NO: 2)及5'-FAM-TGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3'BHQ1 (探針，SEQ ID NO: 3)。結果如下表9所示。 表8:裂解液配方
   異硫氰酸胍 Triton X-100 Tris-HCl EDTA 異丙醇(V/V) pH
配方1 5M 4% 25mM 5mM 200% 6.5
配方2 5M 4% 25mM 10mM 200% 6.5
配方3 5M 4% 25mM 25mM 200% 6.5
配方4 5M 4% 25mM 50mM 200% 6.5
配方5 5M 4% 25mM 100mM 200% 6.5
配方6 5M 1% 25mM 10mM 200% 6.5
配方7 5M 2% 25mM 10mM 200% 6.5
配方8 5M 4% 25mM 10mM 200% 6.5
配方9 5M 6% 25mM 10mM 200% 6.5
配方10 5M 8% 25mM 10mM 200% 6.5
表9：不同配方裂解液提取尿液樣本後之β-肌動蛋白基因的測試結果
配方 測試次數 β-肌動蛋白Cт Cт  平均值 配方 測試次數 β-肌動蛋白Cт Cт  平均值
配方1 第1次 32.09 31.74 配方6 第1次 31.96 31.84
配方1 第2次 31.86 配方6 第2次 31.65
配方1 第3次 31.88 配方6 第3次 32.00
配方1 第4次 31.49 配方6 第4次 31.86
配方1 第5次 31.40 配方6 第5次 31.72
配方2 第1次 32.57 31.21 配方7 第1次 32.96 32.13
配方2 第2次 25.56 配方7 第2次 31.75
配方2 第3次 33.15 配方7 第3次 32.06
配方2 第4次 32.21 配方7 第4次 32.13
配方2 第5次 32.57 配方7 第5次 31.74
配方3 第1次 31.79 31.83 配方8 第1次 32.18 32.22
配方3 第2次 32.06 配方8 第2次 32.13
配方3 第3次 31.91 配方8 第3次 32.00
配方3 第4次 31.93 配方8 第4次 32.54
配方3 第5次 31.48 配方8 第5次 32.26
配方4 第1次 31.60 31.94 配方9 第1次 31.98 32.04
配方4 第2次 32.23 配方9 第2次 31.96
配方4 第3次 31.67 配方9 第3次 32.49
配方4 第4次 31.98 配方9 第4次 32.11
配方4 第5次 32.22 配方9 第5次 31.63
配方5 第1次 32.29 31.81 配方10 第1次 31.88 31.80
配方5 第2次 32.44 配方10 第2次 31.98
配方5 第3次 31.62 配方10 第3次 31.73
配方5 第4次 未測定 配方10 第4次 31.62
配方5 第5次 30.91 配方10 第5次 31.77
由上述結果可知配方2裂解液提取得到之DNA中β-肌動蛋白基因含量最高(Ct值最小)，故裂解液中之Triton X-100及EDTA濃度應優選4%及10mM。
採用類似之方法對於裂解液中異硫氰酸胍濃度設置2M、3M、4M、5M濃度梯度，對Tris-HCL設置10mM、25mM、50mM、100mM濃度梯度，對異丙醇用量(V/V)設置50%、100%、150%、200%用量梯度、對裂解液PH值設置5.5、6.0、6.5、7.0PH梯度，分別進行最佳化，最終得到本發明中裂解液各組分之最佳配方為：5M 異硫氰酸胍、4% TritonX-100、25mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH=6.5。在本實施例之描述中，「濃度」係指溶液中各組分在加入異丙醇之前之濃度。
洗滌緩衝液I配方最佳化：配製8種不同配方之洗滌緩衝液I，洗滌緩衝液I具體配方見表10。洗滌緩衝液I搭配尿液DNA提取試劑其他組分，提取同一份尿液樣本，用qPCR偵測其中β-肌動蛋白基因(方法同「裂解液最佳化」)。測試結果見表11。 表10：8種不同洗滌緩衝液I配方
   異硫氰酸胍(M) 50mM Tris-HCl PH NaCl(M) CTAB(%) PVP40(%) 乙醇(%)
配方1 0.5 6.0 0.10 0.01    40
配方2 0.5 6.0 0.10 / 0.1 40
配方3 0.05 6.0 0.10 / 0.1 40
配方4 0.05 6.0 0.10 / 0.1 50
配方5 0.05 5.0 0.10 / 0.1 60
配方6 / 5.0 0.10 /    40
配方7 / 5.0 0.10 /    60
配方8 0.5 6.0 0.15 / 0.2 40
表11：不同洗滌緩衝液I提取效果
洗滌緩衝液I配方 測試次數 β-肌動蛋白Cт
配方1 第1次 21.66
第2次 21.6
第3次 21.56
配方2 第1次 21.84
第2次 21.95
第3次 21.89
配方3 第1次 22.64
第2次 22.65
第3次 22.44
配方4 第1次 21.63
第2次 21.53
第3次 21.57
配方5 第1次 21.52
第2次 21.57
第3次 21.56
配方6 第1次 22.6
第2次 22.63
第3次 22.6
配方7 第1次 21.59
第2次 21.62
第3次 21.6
配方8 第1次 21.72
第2次 21.73
第3次 21.79
自上表資料分析可得：配方5洗滌緩衝液I提取效果最好，且提取過程中磁珠不出現聚團現象，洗滌效果更佳。最終測定洗滌緩衝液I配方為0.05M異硫氰酸胍，0.1% PVP40，50mM Tris-HCl，60%乙醇，100mM NaCl，pH=5.0。
洗滌緩衝液II配方最佳化：配製含10mM Tris-HCl之75%乙醇(PH6.0)(新配方)，搭配尿液DNA提取試劑裂解液、磁珠等其餘組分與原75%乙醇洗滌緩衝液(原配方)對比，分別提取尿液樣本3份。
用qPCR偵測其中β-肌動蛋白基因(方法同「裂解液最佳化」)，看是否能減少洗滌時DNA丟失，結果如下表12。 表12. 不同洗滌緩衝液II之測試結果之比較
配方 測試次數 β-肌動蛋白Cт
原配方洗滌緩衝液II    第1次 23.50
第2次 24.25
第3次 24.52
新配方洗滌緩衝液II    第1次 23.63
第2次 23.72
第3次 23.63
自上表資料分析可得：將75%乙醇之PH值調整至PH6.0的確可減輕洗滌時之DNA損失，所以測定洗滌緩衝液Ⅱ配方為75%乙醇，10mM Tris-HCl，PH=6.0。
磁珠用量最佳化：磁珠用量設置10ul、15ul、20ul三個梯度，搭配尿液DNA提取試劑其餘組分，提取尿液樣本各2份並進行β-肌動蛋白基因qPCR偵測(方法同「裂解液最佳化」)。結果如下表13： 表13. 不同磁珠用量之偵測結果之比較
磁珠用量 測試次數 β-肌動蛋白Cт
15ul 第1次 22.54
15ul 第2次 22.49
10ul 第1次 22.66
10ul 第2次 22.64
20ul 第1次 21.98
20ul 第2次 22.14
自上表資料分析可得：增加磁珠用量至20ul，提取效率略有提高，且提取過程中可消除磁珠聚團現象。因此磁珠用量最終測定為20μL。
蛋白酶K用量最佳化：蛋白酶K用量設置0μg、2.5μg、25μg三個梯度，搭配尿液DNA提取試劑其餘組分提取尿液樣本各3份並進行β-肌動蛋白基因qPCR偵測(方法同「裂解液最佳化」)。結果如下表14： 表14. 不同蛋白酶K用量之測試結果之比較
蛋白酶K用量 測試次數 β-肌動蛋白Cт
0μg 第1次 23.48
第2次 23.24
第3次 23.61
2.5μg 第1次 21.33
第2次 21.53
第3次 21.54
25μg 第1次 21.49
第2次 20.9
第3次 21.16
自上表資料分析可得：增加蛋白酶K用量至25μg，提取效率有提高。因此蛋白酶K用量最終測定為25μg。
樣本用量最佳化及測定：選3份臨床尿液樣本，樣本用量設置400μl、1000μl、8000μl三種不同體積，使用本發明所述尿液DNA提取試劑及方法進行DNA提取及β-肌動蛋白基因qPCR偵測(方法同「裂解液最佳化」)，以測定最佳樣本用量。偵測結果見表15。 表15：不同樣本量之測試結果之比較
樣本用量 樣本 β-肌動蛋白CT
400μl 臨床樣本1 -
1000μl 臨床樣本1 -
8000μl 臨床樣本1 37.23
400μl 臨床樣本2 39.23
1000μl 臨床樣本2 36.97
8000μl 臨床樣本2 33.8
400μl 臨床樣本3 33.28
1000μl 臨床樣本3 33
8000μl 臨床樣本3 29.5
自上表資料分析可得，樣本量增加能顯著提高偵測效果，且8ml樣本量最佳。為了便於操作，樣本使用量最終取整數10mL。
本文引用之所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利出版物及專利申請全部以引用之方式合併。然而，提及所引用之任何參考、文章、出版物、專利、專利公開案、專利申請在此並不且亦不應被視為對以下之承認或任何形式之建議，其構成有效之現有技術或形成世界上任何國家之一般常識之一部分。
除另有定義外，本發明中之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬之技術領域中一般熟習此項技術者所理解之相同之含義。儘管與本文描述之方法及材料相似或等效之任何方法及材料均可以用於本發明之實踐或測試，但本文描述了較佳之方法及材料。所有引用之出版物、專利及專利出版物出於所有目的在本文中被完整地引用。
本文所討論之出版物的揭示內容僅供在本申請提交日期之前提供。此處之任何內容均不應被解釋為承認本發明不應因先前之發明而提前發表。
雖然本發明已就其具體實施例進行了描述，但應理解，本發明可進行進一步修改，本申請旨在涵蓋本發明之任何變體、使用或調適，一般而言，本發明之原理，包含在本發明所屬之技術範圍內之已知之或習慣之做法，以及可能適用於上述所述之及所附如申請專利範圍內之基本特徵之偏離本發明之原理。序列表 SEQ ID NO: 1, β-肌動蛋白上游引子 CGTGCTCAGGGCTTCTTGTC, SEQ ID NO: 2, β-肌動蛋白下游引子 CTCGTCGCCCACATAGGAATC, SEQ ID NO: 3, β-肌動蛋白qPCR探針 5'-FAM-TGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3'BHQ1
圖 1 描述了使用或未使用本發明中儲存液處理之尿液樣本中β-肌動蛋白基因之螢光定量PCR擴增曲線
圖 2 描述了在尿液樣本與尿液儲存試劑混合後0至4週內在4℃下藉由尿液儲存試劑處理之尿液樣本中β-肌動蛋白內標之變化。
圖 3 描述了在尿液樣本與尿液儲存試劑混合後0至4週內在室溫下藉由尿液儲存試劑處理之尿液樣本中β-肌動蛋白內標之變化。
圖 4 描述了在尿液樣本與尿液儲存試劑混合後0至4週內在4℃下藉由尿液儲存試劑處理之尿液樣本中HPV基因之變化。
圖 5 描述了在尿液樣本與尿液儲存試劑混合後0至4週內在室溫下藉由尿液儲存試劑處理之尿液樣本中HPV基因之變化。
圖 6A 至圖 6D 描述使用不同方法/套組自尿液樣本中提取之DNA中β-肌動蛋白或HPV基因之擴增曲線。圖6A及圖6B比較了本發明之試劑及方法與Quick-DNA尿液套組(ZYMO RESEARCH, D3061)。圖6C及圖6D 比較了本發明之試劑及方法與磁珠法尿液基因組DNA提取套組(Enriching biotechnology, UDE-5005)及FineMag大體積磁珠法血漿游離DNA提取試劑(Genefin Biotech, FM107)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (33)

  1. 一種用於儲存自個體獲得之尿液樣本之組合物，其中該組合物包含pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑，其中該pH緩衝液經配置成將該組合物之pH調整至5.0至6.5之範圍內，其中該螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)且具有10至25mmol/L之濃度，其中該界面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)且具有5%至10%(m/v)之濃度。
  2. 如請求項1之組合物，其中該pH緩衝液包含乙酸及乙酸鹽。
  3. 如請求項2之組合物，其中該乙酸鹽為乙酸鈉。
  4. 如請求項1之組合物，其中該組合物之pH為5.7至6.3。
  5. 如請求項3之組合物，其中該乙酸鈉具有0.5至1.0mol/L之濃度。
  6. 如請求項1之組合物，其中該組合物不含防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑(quencher)。
  7. 一種供儲存之經處理尿液樣本，其中該經處理尿液樣本包含自個體收集之尿液樣本、pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑，其中該pH緩衝液經配置成將該經處理尿液樣本之pH調整至5.0至6.5之範圍內，其中該螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)且具有1至2.5mmol/L之濃度，其中該界面活性劑 為十二烷基硫酸鈉(SDS)且具有0.5%至1.5%(m/v)之濃度。
  8. 如請求項7之供儲存之經處理尿液樣本，其中該pH緩衝液包含乙酸及乙酸鹽。
  9. 如請求項8中供儲存之經處理尿液樣本，其中該乙酸鹽為乙酸鈉。
  10. 如請求項7之供儲存之經處理尿液樣本，其中該組合物之pH為5.7至6.3。
  11. 如請求項9之供儲存之經處理尿液樣本，其中該經處理尿液樣本中乙酸鈉之濃度為0.05至0.1mol/L。
  12. 如請求項7之供儲存之經處理尿液樣本，其中該經處理尿液樣本不含防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑。
  13. 一種生產經處理尿液樣本以供儲存之方法，其包含將自個體收集之尿液樣本與pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑混合，或與如請求項1至6中任一項之組合物混合，其中該pH緩衝液經配置成將該經處理尿液樣本之pH調整至5.0至6.5之範圍內，其中該螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)且在該經處理尿液樣本中具有1至2.5mmol/L之濃度，其中該界面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)且在該經處理尿液樣本中具有0.5%至1.5%(m/v)之濃度。
  14. 如請求項13之方法，其中該pH緩衝液包含乙酸及乙酸鈉。
  15. 如請求項14之方法，其中該經處理尿液樣本中之乙酸鈉具有0.05至0.1mol/L之濃度。
  16. 一種儲存自個體收集之尿液樣本之方法，其包含將自該個體收集之尿液樣本與pH緩衝液、螯合劑及界面活性劑混合，以產生準備儲存之尿液樣本，其中該pH緩衝液經配置成將該準備儲存之尿液樣本之pH調整至5.0至6.5之範圍內，其中該螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)，其中該界面活性劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)，且其中自該個體收集之尿液樣本含有該個體之細胞及至少一個病毒病原體，且在該尿液樣本準備儲存後，該等細胞及病毒病原體均被裂解。
  17. 如請求項16之方法，其中該pH緩衝液、該螯合劑及該界面活性劑以混合物形式提供，然後與自該個體收集之尿液樣本混合。
  18. 如請求項16之方法，其中該pH緩衝液包含乙酸及乙酸鹽。
  19. 如請求項18之方法，其中該乙酸鹽為乙酸鈉。
  20. 如請求項16之方法，其中該準備儲存之尿液樣本之pH為5.7至6.3。
  21. 如請求項19之方法，其中該準備儲存之尿液樣本中之乙酸鈉具有0.05至0.1mol/L之濃度。
  22. 如請求項16之方法，其中該準備儲存之尿液樣本中之EDTA具有1至2.5mmol/L之濃度。
  23. 如請求項16之方法，其中該準備儲存之尿液樣本中之SDS具有0.5%至1.5%(m/v)之濃度。
  24. 如請求項16之方法，其中該準備儲存之尿液樣本不含防腐劑、細胞固定劑或甲醛淬滅劑。
  25. 如請求項16之方法，其中該病毒病原體係人類乳突病毒(HPV)。
  26. 如請求項16之方法，其包括在4℃儲存該尿液樣本以備儲存。
  27. 如請求項16之方法，其包括在室溫下儲存該尿液樣本以備儲存。
  28. 如請求項26之方法，其中該尿液樣本中之DNA含量在15天至30天之儲存時間後係穩定的。
  29. 如請求項27之方法，其中該尿液樣本中之DNA含量在1週至2週之儲存時間後係穩定的。
  30. 一種用於偵測自個體收集之尿液樣本中存在或不存在一個或多個分析物之方法，其中該方法包含使用如請求項7至12中任一項之經處理尿液樣本。
  31. 如請求項30之方法，其中該分析物係病毒。
  32. 如請求項31之方法，其中該病毒係HPV。
  33. 如請求項31之方法，其中該偵測分析物包含偵測病毒之DNA。
TW109100210A 2019-01-03 2020-01-03 用於尿液樣本儲存及ｄｎａ提取之組合物及方法 TWI766225B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019070276 2019-01-03
WOPCT/CN2019/070276 2019-01-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202039839A TW202039839A (zh) 2020-11-01
TWI766225B true TWI766225B (zh) 2022-06-01

Family

ID=71407294

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111118874A TW202233846A (zh) 2019-01-03 2020-01-03 用於尿液樣本儲存及dna提取之組合物及方法
TW109100210A TWI766225B (zh) 2019-01-03 2020-01-03 用於尿液樣本儲存及ｄｎａ提取之組合物及方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111118874A TW202233846A (zh) 2019-01-03 2020-01-03 用於尿液樣本儲存及dna提取之組合物及方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220081705A1 (zh)
EP (1) EP3906319A4 (zh)
JP (1) JP2022516175A (zh)
KR (1) KR20210111250A (zh)
CN (1) CN111902545B (zh)
AU (1) AU2020205015A1 (zh)
BR (1) BR112021012224A2 (zh)
CA (1) CA3119928A1 (zh)
SG (1) SG11202106788UA (zh)
TW (2) TW202233846A (zh)
WO (1) WO2020140975A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3177571A1 (en) * 2020-05-04 2021-11-11 David C. BULIR Molecular transport for viral agents
EP4204577A4 (en) * 2020-08-25 2024-10-09 Microgen Laboratories METHODS AND REAGENTS FOR RAPID DETECTION OF PATHOGENS IN BIOLOGICAL SAMPLES
CN114574486B (zh) * 2020-12-01 2024-04-16 中国科学院大连化学物理研究所 作用于OPLAH的siRNA、DNA及构建物和应用
CN112592961A (zh) * 2021-01-07 2021-04-02 山东科硕生物技术有限公司 一种核酸样本保存液及其制备方法和应用
US20220315992A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-06 ID Match, LLC Method for identification of urine drug testing sample
CN115521996A (zh) * 2021-10-25 2022-12-27 杭州诺辉健康科技有限公司 用于鼻咽癌诊断的试剂和方法
CN114959111B (zh) * 2022-05-07 2024-10-18 英科新创（苏州）生物科技有限公司 用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法
CN114875022B (zh) * 2022-05-31 2024-01-19 圣湘生物科技股份有限公司 尿液保存液、保存方法和尿液保存管
KR102690427B1 (ko) * 2022-06-29 2024-07-31 주식회사 어큐진 Dna, rna 동시추출 키트 및 이를 이용한 dna, rna 동시추출 방법
CN115363637A (zh) * 2022-08-23 2022-11-22 宁波海尔施基因科技股份有限公司 一种唾液样本采集卡及利用该采集卡采集唾液样本的方法
CN115901401B (zh) * 2023-01-09 2023-05-26 深圳市森盈生物科技有限公司 一种p16免疫细胞化学染色试剂盒及染色方法
CN116891849B (zh) * 2023-09-11 2023-11-17 成都斯马特科技有限公司 一种快速从鼻咽拭子中提取核酸的试剂盒及提取方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2168975A2 (en) * 2004-05-24 2010-03-31 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
CN105368820A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 南京先进激光技术研究院 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用
CN106754880A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 广州和实生物技术有限公司 尿液核酸快速提取试剂盒
CN106967712A (zh) * 2017-05-12 2017-07-21 广州和实生物技术有限公司 粪便dna快速提取试剂盒
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1510577A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-02 Qiagen GmbH Method for magnetic bead isolation of nucleic acids
CN101861164B (zh) * 2007-08-09 2014-12-10 西尔万医药有限公司 朊病毒蛋白相关疾病的治疗
WO2009041577A1 (ja) * 2007-09-27 2009-04-02 Niigata University 尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法。
US9480966B2 (en) * 2012-04-30 2016-11-01 General Electric Company Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules
CN105506129B (zh) * 2016-01-01 2019-03-15 广州邦德盛生物科技有限公司 一种rna类样本保存稀释液及其制备
CN107058296B (zh) * 2017-05-27 2018-09-25 山东森芃生物科技有限公司 土壤尿液dna提取试剂盒及方法
CN107267500A (zh) * 2017-07-17 2017-10-20 北京安必奇生物科技有限公司 一种游离dna保存液及其制备方法和应用
CN110283818A (zh) * 2019-07-31 2019-09-27 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 一种磁珠法提取血浆游离dna的试剂盒和方法
CN110699429B (zh) * 2019-11-25 2023-04-07 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 一种尿液dna提取保存液、尿液保存管、提取试剂盒和提取方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2168975A2 (en) * 2004-05-24 2010-03-31 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
CN105368820A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 南京先进激光技术研究院 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用
CN106754880A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 广州和实生物技术有限公司 尿液核酸快速提取试剂盒
CN106967712A (zh) * 2017-05-12 2017-07-21 广州和实生物技术有限公司 粪便dna快速提取试剂盒
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021012224A2 (pt) 2021-09-28
EP3906319A4 (en) 2022-11-16
US20220081705A1 (en) 2022-03-17
AU2020205015A1 (en) 2021-06-03
JP2022516175A (ja) 2022-02-24
SG11202106788UA (en) 2021-07-29
KR20210111250A (ko) 2021-09-10
CA3119928A1 (en) 2020-07-09
TW202233846A (zh) 2022-09-01
WO2020140975A1 (en) 2020-07-09
CN111902545A (zh) 2020-11-06
CN111902545B (zh) 2024-09-06
EP3906319A1 (en) 2021-11-10
TW202039839A (zh) 2020-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI766225B (zh) 用於尿液樣本儲存及ｄｎａ提取之組合物及方法
Tang et al. Application of magnetic nanoparticles in nucleic acid detection
US20200157526A1 (en) Enrichment of small nucleic acids
ES2937410T3 (es) Método rápido para aislar ácidos nucleicos extracelulares
JP4887530B2 (ja) 磁性微粒子、およびその製造方法
CN107690481B (zh) 利用阴离子交换粒子分离细胞外核酸的方法
JP6433075B2 (ja) 診断アッセイのための制御
US20200124592A1 (en) Magnetic nanoparticle
CA2993447A1 (en) Compositions and methods for dna and rna extraction from tissue samples
JP2006517225A (ja) 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット
Arkhis et al. Capture of enveloped viruses using polymer tentacles containing magnetic latex particles
CN111690719A (zh) 确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法
JP2021104046A (ja) ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法
JP7068183B2 (ja) 単一洗浄溶出バッファー溶液を使用する核酸精製システム
US10545152B2 (en) Method and composition using a quaternary ammonium compound
Chi et al. Colorimetric detection of African swine fever (ASF)-associated microRNA based on rolling circle amplification and salt-induced gold nanoparticle aggregation
Seyyedi et al. A high yield gold nanoparticle-based DNA isolation method for human papillomaviruses genotypes from cervical cancer tissue samples