JP2022516175A - 尿試料保存及びｄｎａ抽出のための組成物ならびに方法 - Google Patents

尿試料保存及びｄｎａ抽出のための組成物ならびに方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、尿試料などの生体試料を保存するための組成物及び方法を提供する。加えて、尿試料などの生体試料からＤＮＡを抽出するための組成物及び方法も提供される。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０７０２７６号の利益を主張し、これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、尿試料保存及び尿試料からのＤＮＡ抽出のための組成物ならびに方法に関する。
便宜的かつ単純な生体試料の一種として、尿試料は、分子診断ならびに疾患モニタリング及び治療の分野でますます注目されている。現在の臨床診療では、尿試料の保存は、主に低温環境に依存し、これには追加の装置が必要であり、また、より高いコストにもつながる。本開示は、尿試料を、室温などの比較的高い温度で保存するための組成物及び方法を提供し、それによって尿試料の保存及び輸送を容易にする。
一般的な尿ＤＮＡ抽出試薬及び方法は、２つのカテゴリに分類することができる。第１は、尿中の細胞を沈殿させるための遠心分離、及び細胞ペレット中のＤＮＡを抽出することを含む。第２は、遠心分離後に細胞沈殿物を廃棄するが、上清中の遊離ＤＮＡを抽出することを含む。本開示は、より高いＤＮＡ抽出効率をもたらす、尿中の遊離ＤＮＡ及び細胞ＤＮＡを同時に抽出するための組成物ならびに方法を提供する。
従来のＤＮＡ抽出方法には、フェノールクロロホルム法、塩析法、ＮａＩ法、及びシリカ固相担体法が含まれるが、これらはいずれも複雑な操作の欠点を有し、自動処理または体積のずれる試料には好適ではない。他方、尿試料の組成は複雑であり、一般的なＤＮＡ抽出方法によって尿試料から抽出されたＤＮＡは、しばしば、下流のＰＣＲの適用に影響を有する阻害物質を含む。したがって、尿試料からＤＮＡを抽出するのに特に好適な改良されたＤＮＡ抽出組成物及び方法を開発する必要性が依然として存在する。
本開示は、対象から得られた尿試料を保存するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤を、含むか、本質的に含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、組成物のｐＨを事前選択された範囲内に調整するように構成される。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、酢酸及び酢酸の塩を含む。いくつかの実施形態において、ｐＨの事前選択された範囲は、約５．０～６．５である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは、約６．０である。
いくつかの実施形態において、酢酸の塩は、酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態において、酢酸ナトリウムは、約０．５～１．０ｍｏｌ／Ｌ、例えば、約０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌ、または約０．６～０．７ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する。
いくつかの実施形態において、キレート剤は、アミノポリカルボン酸である。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、約１０～２０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば、約１５～２０ｍｍｏｌ／Ｌ、約１６～２０ｍｍｏｌ／Ｌ、または約１６～１８ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する。
いくつかの実施形態において、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤である。いくつかの実施形態において、陰イオン界面活性剤は、ドデシル水素スルファートの塩である。いくつかの実施形態において、塩は、ナトリウム塩であり、陰イオン界面活性剤は、ドセシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態において、ＳＤＳは、約５％～１０％（ｍ／ｖ）、例えば、約５％～８％、約５％～７％、約６％～８％、または約６％～７％の濃度を有する。
いくつかの実施形態において、組成物は、防腐剤、細胞固定剤、またはホルムアルデヒド消光剤を含有しない。
本開示はまた、処理された尿試料を提供する。尿試料は、直ちに、または保存された後に、ＤＮＡ抽出に使用することができる。いくつかの実施形態において、処理された尿試料は、対象から収集された尿試料、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、組成物のｐＨを事前選択された範囲内に調整するように構成される。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、酢酸及び酢酸の塩を含む。いくつかの実施形態において、酢酸の塩は、酢酸ナトリウムである。
いくつかの実施形態において、ｐＨの事前選択された範囲は、約５．０～６．５である。いくつかの実施形態において、組成物のｐＨは、約６．０である。いくつかの実施形態において、処理された尿試料中の酢酸ナトリウムは、約０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌ、例えば、約０．０５～０．０７ｍｏｌ／Ｌ、または約０．０６～０．０７ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施形態において、キレート剤は、アミノポリカルボン酸である。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、約１～２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば、約１．５～２ｍｍｏｌ／Ｌ、約１．６～２ｍｍｏｌ／Ｌ、または約１．６～１．８ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤である。いくつかの実施形態において、陰イオン界面活性剤は、ドデシル水素スルファートの塩である。いくつかの実施形態において、塩は、ナトリウム塩であり、陰イオン界面活性剤は、ドセシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態において、ＳＤＳは、約０．５％～１．５％（ｍ／ｖ）、例えば、約０．５％～０．８％、約０．５％～０．７％、約０．６％～０．８％、または約０．６％～０．７％の濃度を有する。いくつかの実施形態において、処理された尿試料は、防腐剤、細胞固定剤、またはホルムアルデヒド消光剤を含有しない。
本開示は、保存のための処理された尿試料を生成するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と、または本明細書に記載されるような本開示の組成物と、混合することを含む。
本開示は、対象から収集された尿試料を保存するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と、または本明細書に記載されるような本開示の組成物と混合して、保存の準備ができた尿試料を生成することを含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤は、それらが対象から収集された尿試料と混合される前に、本明細書に記載されるような本開示の組成物などの混合物で提供される。いくつかの実施形態において、対象から収集された尿試料は、対象の細胞及び少なくとも１つのウイルス病原体を含有し、細胞及びウイルス病原体の両方は、尿試料が保存の準備ができた後に溶解される。いくつかの実施形態において、ウイルス病原体は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。いくつかの実施形態において、保存の準備ができた尿試料を、４℃、－２０℃、－８０℃、または室温などの事前に決定された温度で保存することを含む。いくつかの実施形態において、尿試料中のＤＮＡ含有量は、１５日～３０日の保存時間後に安定している。いくつかの実施形態において、尿試料中のＤＮＡ含有量は、１週間～２週間の保存期間後に安定している。
本開示は、対象から収集された尿試料中の１つ以上の分析物の存在または不在を検出するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載される処理された尿試料を使用することを含む。いくつかの実施形態において、分析物は、ウイルスまたはウイルスに由来する任意のＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＨＰＶである。いくつかの実施形態において、分析物の検出は、ウイルスのＤＮＡを検出することを含む。
本開示は、対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための組成物及びキットのコレクションをさらに提供する。いくつかの実施形態において、組成物またはキットは、溶解溶液、磁性ナノ粒子、プロテアーゼ、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、溶出緩衝剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、本質的に含むか、またはそれらからなる。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、イソプロパノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約２～６Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００は、約１～５％の濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約２０～５０ｍＭの濃度を有し、溶解溶液は、約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、約１０～５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、全ての他の成分が一緒に混合された後に添加される。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、約５０％～２００％（ｖ／ｖ）の用量を有する。
いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約２～６Ｍの濃度を有し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約１～５％の濃度を有し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約２０～５０ｍＭの濃度を有し、溶解溶液は、約６．５のｐＨを有し、ＥＤＴＡは、約１０～５０ｍＭの濃度を有し、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、及びＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、イソプロパノールをさらに含む。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、溶解溶液の約５０％～２００％（ｖ／ｖ）の用量を有する。
いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約１～２Ｍの濃度を有し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約１～２％の濃度を有し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約５～１０ｍＭの濃度を有し、溶解溶液は、約６～７のｐＨを有し、ＥＤＴＡは、約３～５ｍＭの濃度を有し、イソプロパノールは、溶解溶液の約５０％～８０％の体積を有し、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約１．６７Ｍの濃度を有し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００は、約１．３３％の濃度を有し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約８．３３ｍＭの濃度を有し、溶解溶液は、約６．５のｐＨを有し、ＥＤＴＡは、約３．３３ｍＭの濃度を有し、イソプロパノールは、溶解溶液の約６６．７％の体積を有し、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、内側コア層及び外側シェル層を有する。いくつかの実施形態において、内側コア層は、コアシェル型磁性ナノ粒子から構成され、外側シェル層は、ＳｉＯ２から構成される。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、約１００～１０００ｎｍの直径、及び約５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、約１０～２０μＬ、例えば、約２０μＬの体積を有する。
いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約２０～５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、約５．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約５０～２００ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、エタノールは、約４０％～６０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する。
いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤中のＴｒｉｓ－ＨＣｌは、約１０～５０ｍＭの濃度を有し、第２の洗浄緩衝剤は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、エタノールは、約７０％～８０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する。
いくつかの実施形態において、溶出緩衝剤は、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝剤である。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、プロテアーゼＫである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼＫは、約１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼＫは、約２．５～２５μｇ、例えば、約２５μｇの用量を有する。
本開示は、対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法をさらに提供し、本明細書に記載されるようなＤＮＡ抽出のためのキットまたは組成物のコレクションを使用することを含む。
本開示は、対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、（１）尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、（２）ステップ（１）で得られた前処理された尿試料を溶解溶液に溶解させて、溶解した尿試料を生成することと、（３）ステップ（２）で得られた尿試料からのＤＮＡを含む磁性ナノ粒子を、第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（４）ステップ（３）で得られた尿試料からのＤＮＡを含む磁性ナノ粒子を、第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（５）ステップ（４）で収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを溶出緩衝剤で洗い流して、抽出されたＤＮＡを得ることと、を含むか、本質的に含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、溶解溶液、磁性ナノ粒子、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、溶出緩衝剤、プロテアーゼは、本明細書の本開示に記載されるものである。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ抽出のための方法におけるステップ（１）は、（ａ）尿試料を磁性ナノ粒子と接触させて混合物を形成することと、（ｂ）混合物を遠心分離して、または磁性分離デバイスを利用して、沈殿物及び上清を生成することと、（ｃ）沈殿物をプロテアーゼと接触させて、反応系を生成することと、（ｄ）反応系を、好適な条件下で事前に決定された時間加熱することと、を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ抽出のための方法におけるステップ（３）、（４）、及び／または（５）は、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器を使用することを含む。
本開示は、対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるようなキットまたは組成物のコレクションを使用して、尿試料から抽出されたＤＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態において、分析物は、ＨＰＶなどのウイルスである。いくつかの実施形態において、分析物の検出は、ウイルスのＤＮＡを検出することを含む。
本開示は、対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるような処理された尿試料を使用することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、処理された尿試料からＤＮＡを抽出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、試料からＤＮＡを抽出するステップは、（ａ）尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前処理された尿試料を、溶解溶液に溶解して、溶解した尿試料を生成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた尿試料からのＤＮＡを含む磁性ナノ粒子を、第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた尿試料からのＤＮＡを含む磁性ナノ粒子を第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（ｅ）ステップ（ｄ）で収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを溶出緩衝剤で洗浄して、抽出されたＤＮＡを得ることと、を含む。いくつかの実施形態において、溶解溶液、磁性ナノ粒子、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、溶出緩衝剤、プロテアーゼは、本明細書の本開示に記載されるものである。
いくつかの実施形態において、対象の尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法は、尿試料中の分析物の存在または不在に基づいて対象を治療することをさらに含む。
本開示は、対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるようなキットを使用することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（１）尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、（２）ステップ（１）で得られた前処理された尿試料を溶解溶液に溶解させて、溶解された尿試料を生成することと、（３）ステップ（２）で得られた磁性ナノ粒子を第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（４）ステップ（３）で得られた磁性ナノ粒子を第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（５）ステップ（４）で得られた尿試料中の磁性ナノ粒子を収集することと、（６）ステップ（５）で得られた収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを洗い流して、抽出されたＤＮＡを得ることと、を含む。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、及びイソプロパノールを含む。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約１～２Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００は、約１～２％の濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約５～１０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、約６～７のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、約３～５ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、溶解溶液の約５０％～８０％（ｖ／ｖ）の体積を有する。
いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は内側コア層及び外側シェル層を有し、内側コア層は、コアシェル型磁性ナノ粒子から構成され、外側シェル層はＳｉＯ２から構成され、磁性ナノ粒子は、約１００～１０００ｎｍの直径、及び約５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約５０～１００ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約２０～５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、約５．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、約５０～２００ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、エタノールは、約４０％～６０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する。
いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤中のＴｒｉｓ－ＨＣｌは、約１０～５０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、エタノールは、約７０％～８０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する。
いくつかの実施形態において、溶出緩衝剤は、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝剤である。いくつかの実施形態において、
いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、プロテアーゼＫであり、プロテアーゼＫは、約１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
いくつかの実施形態において、尿試料からＤＮＡを抽出する（「尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成する」）ための方法のステップ（１）は、（ａ）尿試料を磁性ナノ粒子と接触させて混合物を形成することと、（ｂ）混合物を遠心分離して、または磁性分離デバイスを利用して、沈殿物及び上清を生成することと、（ｃ）沈殿物をプロテアーゼと接触させて反応系を生成することと、（ｄ）反応系を、好適な条件下で事前に決定された時間加熱することと、を含む。
いくつかの実施形態において、対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法において磁性ナノ粒子を洗浄及び／または収集するステップは、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器を使用することを含む。
本開示は、対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるようなキットを使用して、尿試料から抽出されたＤＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態において、分析物は、ウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＨＰＶである。いくつかの実施形態において、分析物の検出は、ウイルスのＤＮＡを検出することを含む。
本開示は、対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、（１）請求項１６～３０のいずれか一項に記載の処理された尿試料を使用すること、及び（２）処理された尿試料からＤＮＡを抽出することであって、（ａ）尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前処理された尿試料を溶解溶液に溶解させて、溶解した尿試料を生成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた磁性ナノ粒子を第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた磁性ナノ粒子を第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、（ｅ）ステップ（ｄ）で得られた尿試料中の磁性ナノ粒子を収集することと、（ｆ）ステップ（ｅ）で得られた収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを溶出緩衝剤で洗い流して、抽出ＤＮＡを得ることと、を含む、ＤＮＡを抽出することを含む。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、及びイソプロパノールを含む。いくつかの実施形態において、グアニジウムイソチオシアネートは、約１～２Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００は、約１～２％の濃度を有する。いくつかの実施形態において、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、約５～１０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、約６～７のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＥＤＴＡは、約３～５ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、溶解溶液の約５０％～８０％（ｖ／ｖ）の体積を有する。
本開示の保存試薬によって処理されているか、または処理されていない、尿試料中のβ－アクチン遺伝子の蛍光定量ＰＣＲ増幅曲線を示す。 尿試料を尿保存試薬と混合した後の０～４週間４℃における、尿保存試薬によって処理された尿試料中のβ－アクチン内部標準の変化を示す。 尿試料を尿保存試薬と混合した後の０～４週間室温における、尿保存試薬によって処理された尿試料中のβ－アクチン内部標準の変化を示す。 尿試料を尿保存試薬と混合した後の０～４週間４℃における、尿保存試薬によって処理された尿試料中のＨＰＶの変化を示す。 尿試料を尿保存試薬と混合した後の０～４週間室温における、尿保存試薬によって処理された尿試料中のＨＰＶの変化を示す。 異なる方法／キットを使用して尿試料から抽出されたＤＮＡにおけるβ－アクチン遺伝子またはＨＰＶ遺伝子の増幅曲線を示す。本開示の試薬及び方法を、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ尿キット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ３０６１）と比較する。 異なる方法／キットを使用して尿試料から抽出されたＤＮＡにおけるβ－アクチン遺伝子またはＨＰＶ遺伝子の増幅曲線を示す。本開示の試薬及び方法を、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ尿キット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ３０６１）と比較する。 異なる方法／キットを使用して尿試料から抽出されたＤＮＡにおけるβ－アクチン遺伝子またはＨＰＶ遺伝子の増幅曲線を示す。本開示の試薬及び方法を、磁性ビーズ尿ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＤＥ－５００５）、及び血漿遊離ＤＮＡ用ＦｉｎｅＭａｇ大容量磁性ビーズ－ＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｅｆｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＦＭ１０７）と比較する。 異なる方法／キットを使用して尿試料から抽出されたＤＮＡにおけるβ－アクチン遺伝子またはＨＰＶ遺伝子の増幅曲線を示す。本開示の試薬及び方法を、磁性ビーズ尿ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＤＥ－５００５）、及び血漿遊離ＤＮＡ用ＦｉｎｅＭａｇ大容量磁性ビーズ－ＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｅｆｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＦＭ１０７）と比較する。
試料保存のための組成物及び方法
本開示は、いくつかの実施形態において、生体試料を保存するための組成物及び方法を提供する。生体試料の非限定的な例には、とりわけ、血液、汗、涙、尿、唾液、精液、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、排泄物、膣液もしくは組織、痰、鼻咽頭吸引液もしくは拭き取り、涙液、粘膜、または上皮拭き取り（口腔拭き取り）、組織、臓器、骨、歯、または腫瘍が含まれる。
いくつかの実施形態において、生体試料は、対象から収集される尿試料である。尿試料は、分子診断に広く使用されており、それは、対象の細胞、対象に感染している病原体、または細胞ならびに病原体の断片及び分子を含有する。しかしながら、収集された尿試料を、試料中の潜在的に重要な分子の安定性を維持しながら、費用対効果の高い方法で保存することは難しいものである。例えば、細胞及び病原体に由来するＤＮＡ分子は、尿試料が収集された後、試料が比較的低い温度下で保存されない場合、数時間または数日以内に迅速に分解し得る。尿試料が４℃下で冷蔵庫に保存される場合でさえ、尿試料中のＤＮＡ分子は、尿試料がいかなる添加もなくそのままにされる場合、数週間以内でもはや診断に適さなくなる。
本出願で提供される組成物及び方法は、生体試料中のＤＮＡを分解から保護することができる。いくつかの実施形態において、組成物はまた、試料中の細胞を破壊して、細胞中のＤＮＡ及び試料中に存在し得る病原体中のＤＮＡを放出することができ、それによって、その後のＤＮＡ抽出及びＤＮＡに基づく診断を容易にする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、病原体から放出される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、試料中の無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、尿循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、それが尿試料と混合されて、尿試料の希釈スケールに応じて、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、２５×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、１００×以上などに希釈される前に、濃縮状態にあり得る。いくつかの実施形態において、希釈スケールはまた、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：９９などであることができる。いくつかの実施形態において、希釈スケールに基づいて、組成物は尿試料と混合され、尿試料によって希釈され、それによって、処理された尿試料中の最終作業濃度（１倍）が達成される。
尿試料を保存するための本開示の組成物は、ｐＨ緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、生物学的系に好適な緩衝剤である。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、ＡＣＥＳ Ｎ－（２－アセトアミド）－アミノエタンスルホン酸、ＡＭＰ（２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール）、ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）－イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス－（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、重炭酸塩、ビシン（Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－グリシン）、Ｂｒｉｓ－Ｔｒｉｓ（［ビス－（２－ヒドロキシエチル）－イミノ］－トリス－（ヒドロキシメチルメタン））、ビス－トリス－プロパン（１，３－ビス［トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］プロパン）、ホウ酸、カコジル酸（ジメチルアルシン酸）、ＣＡＰＳ（３－（シクロヘキシルアミノ）－プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ ３－（（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）、炭酸塩（炭酸ナトリウム）、ＣＨＥＳ（シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸）、クエン酸の塩、ＤＩＰＳＯ（３－［Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ギ酸の塩、グリシン、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－３－プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、イミダゾール、マレイン酸、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸）、ＭＰＯＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）－プロパンスルホン酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））、リン酸の塩（リン酸塩）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＴＡＰＳ（３－｛［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］－アミノ｝－プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＴＥＳ（２－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］－エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］－グリシン）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン）、及び酢酸塩（酢酸の塩）を含む。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウム系である。
いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、尿試料と混合された後、ｐＨを事前に決定された範囲内に維持することができる。いくつかの実施形態において、事前に決定されたｐＨは、約４．５～６．５であり、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、及び所与の範囲の任意の間隔などである。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウム系である。いくつかの実施形態において、組成物中の酢酸ナトリウムの濃度は、事前に決定された希釈スケールに基づいて事前に決定され得、組成物が尿試料と混合されると、約０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１Ｍなどの約０．０５Ｍ～約０．１Ｍの最終作業濃度をもたらす。例えば、１０×組成物では、酢酸ナトリウムの濃度は、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、または１．０Ｍなどの約０．５Ｍ～約１．０Ｍであり、尿試料によって１：９の比で希釈することができる。
尿試料を保存するための本開示の組成物は、キレート剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、キレート剤は、分子が単一の金属イオンとのいくつかの結合を形成し得る物質を指す。キレート剤には、１，１，１－トリフルオロアセチルアセトン、１，４，７－トリメチル－１，４，７－トリアザシクロノナン、２，２’－ビピリミジン、アセチルアセトン、アリザリン、アミドキシム、ミドキシム基、アミノエチルエタノールアミン、アミノメチルホスホン酸、アミノポリカルボン酸、ＡＴＭＰ、ＢＡＰＴＡ、バソクプロイン、ＢＤＴＨ２、ベンゾトリアゾール、二配座、ビピリジン、２，２’－ビピリジン、ビス（ジシクロヘキシルホスフィノ）エタン、１，２－ビス（ジメチルアルシノ）ベンゼン、１，２－ビス（ジメチルホスフィノ）エタン、１，４－ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、１，２－ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、カリックスアレーン、カルセランド、カテコール、キャビタンド、キレート樹脂、Ｃｈｅｌｅｘ１００、クエン酸塩、クエン酸、クラスロキレート、コロール、クリプタンド、２．２．２－クリプタンド、サイクラム、サイクレン、シクロデキストリン、デフェラシロックス、デフェリプロン、デフェロキサミン、デンティシティ、デクスラゾキサン、ジアセチルモノキシム、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン、１，２－ジアミノプロパン、１，５－ジアザ－３，７－ジホスファシクロオクタン、１，４－ジアザシクロヘプタン、ジベンゾイルメタン、ジエチレントリアミン、ジグライム、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、ジメルカプロール、２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホン酸、ジメルカプトコハク酸、１，２－ジメチルエチレンジアミン、１，１－ジメチルエチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、ＤＩＯＰ、ジフェニルエチレンジアミン、１，５－ジチアシクロオクタン、ドウモイ酸、ＤＯＴＡ（キレーター）、ＤＯＴＡ－ＴＡＴＥ、ＤＴＰＭＰ、ＥＤＤＨＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＥＧＴＡ（化学）、１，２－エタンジチオール、エチレンジアミン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチドロン酸、Ｆｌｕｏ－４、Ｆｕｒａ－２、没食子酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリオキサールビス（メシリミン）、グリホサート、ヘキサフルオロアセチルアセトン、ホモクエン酸、イミノ二酢酸、Ｉｎｄｏ－１、イソサッカリン酸、カイニン酸、配位子、リンゴ酸、金属アセチルアセトナート、金属ジチオレン錯体、メタラクロン、ニトリロ三酢酸、シュウ酸、オキシム、ペンデチド、ペニシラミン、ペンテト酸、フェネホス、フェナントロリン、Ｏ－フェニレンジアミン、ホスホネート、フタロシアニン、フィトケラチン、ピコリン酸、ポリアスパラギン酸、ポルフィリン、ポルフィリン、３－ピリジルニコチンアミド、４－ピリジルニコチンアミド、ピロガロール、サリチル酸、サルコファジン、クエン酸ナトリウム、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、ポリアスパラギン酸ナトリウム、ターピリジン、テトラメチルエチレンジアミン、テトラフェニルポルフィリン、テノイルトリフルオロアセトン、チオグリコール酸、ＴＰＥＮ、１，４，７－トリアザシクロノナン、トリブチルホスフェート、三配座、トリエチレンテトラミン、トリホス、クエン酸三ナトリウム、１，４，７－トリチアシクロノナン、ＴＴＦＡ、それらの機能的変異体、及びこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのアミノポリカルボン酸である。本明細書で使用される場合、ＥＤＴＡという用語は、エチレンジアミン四酢酸またはその任意の官能誘導体を指す。いくつかの実施形態において、組成物中のＥＤＴＡ濃度は、事前に決定された希釈スケールに基づいて事前に決定することができ、組成物が尿試料と混合されて、尿試料によって希釈されると、約１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、または２．５ｍＭなどの約１～約２．５ｍＭの最終作業濃度をもたらす。例えば、１０×組成物において、ＥＤＴＡの濃度は、約１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭなどの約１０～２５ｍＭであり、次いで、尿試料によって１：９の比で希釈される。
尿試料を保存するための本開示の組成物は、界面活性剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、界面活性剤は、２つの液体の間、ガスと液体の間、または液体と固体の間の表面張力（または界面張力）を低下させる化合物を指す。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、陽イオン界面活性剤である。いくつかの実施形態において、双イオン界面活性剤である。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、陰イオン界面活性剤である。アニオン性界面活性剤の非限定的な例には、硫酸、スルホン酸、リン酸、カルボン酸などのアニオン官能基をそれらの頭部に含む分子が含まれる。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＬＳ、またはＳＤＳ）、関連するアルキルエーテル硫酸塩であるラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウムまたはＳＬＥＳ）、マイレス硫酸ナトリウム、ドクサート、ペルフルオロオクタンスルホン酸ナトリウム（ＰＦＯＳ）、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、アルキルアリールエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、ステアリン酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、ノノキシノール－９、ポリソルベート、Ｓｐａｎ（登録商標）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）、Ａｎｔａｒｏｘ（登録商標）、ＰＥＮＴＥＸ（登録商標）９９（スルホコハク酸ジオクチルナトリウム（ＤＯＳＳ））、ＰＦＯＳ、Ｃａｌｓｏｆｔ（登録商標）（リニアアルキルベンゼンスルホン酸塩）、Ｔｅｘａｐｏｎ（登録商標）（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム）、Ｄａｒｖａｎ（リグノスルホン酸塩）、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ＳＤＳである。組成物中のＳＤＳ濃度は、事前に決定された希釈スケールに基づいて事前に決定することができ、組成物が尿試料と混合されて、尿試料によって希釈されると、約０．４％、０．５％０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％などの約０．４～１．５％（ｍ／ｖ）の最終作業濃度をもたらす。例えば、１０×組成物について、ＳＤＳの濃度は、約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％などの約４％～１５％（ｍ／ｖ）であり、次いで尿試料によって１：９の比で希釈される。
いくつかの実施形態において、尿試料を保存するための本開示の組成物は、ＥＤＴＡ、細胞固定剤、またはホルムアルデヒ消光剤以外の保存剤を含有せず、したがって、総費用を低減し、下流にある診断の潜在的阻害を最小限にする。
いくつかの実施形態において、上記の各成分を事前に混合して、各成分の混合物を含む試薬を生成する代わりに、上記の成分は、各成分について所望の最終作業濃度が達成される限り、尿試料と１つずつ直接混合することができる。
したがって、本開示はまた、保存、ならびに／または下流のＤＮＡ抽出及び診断のための処理された尿試料を提供する。該処理された尿試料は、本明細書に記載されるように、それを必要とする対象から収集された尿、ならびにｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤を含む。
処理された尿試料は、同じ対象から収集された未処理の尿試料と比較してより長い保存期間を有する。いくつかの実施形態において、診断は、尿試料中のＤＮＡ分子の存在または不在を検出することを含む。いくつかの実施形態において、本開示の処理された尿試料中のＤＮＡ分子は、長期間にわたる下流の診断のために十分安定している。本明細書で使用される場合、所与の期間保存されている尿試料中のＤＮＡ分子は、同じ対象のために収集されたばかりの尿試料中のＤＮＡ分子と比較して有意な分解がないと、それによって、尿試料中のＤＮＡ分子は、ＰＣＲ診断などのＤＮＡに基づく診断のために十分であるような優れた品質及び優れた量にある。いくつかの実施形態において、所与の期間保存されている尿試料中のＤＮＡ分子は、同一の対象から収集されたばかりの尿試料中のＤＮＡ分子の、約９０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上である。
いくつかの実施形態において、処理された尿試料が約－２０℃で保存される場合、処理された尿試料中のＤＮＡ分子は、尿試料が本出願の組成物で処理された後、約１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、２００日、３００日、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年以上後に安定している。
いくつかの実施形態において、処理された尿試料が約－２０℃で保存される場合、処理された尿試料中のＤＮＡ分子は、尿試料が本出願の組成物で処理された後、約１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、１１０日、１２０日、１３０日、１４０日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、１年、２年、３年、４年、５年以上後に安定している。
いくつかの実施形態において、処理された尿試料が約４℃で保存される場合、処理された尿試料中のＤＮＡ分子は、尿試料が本出願の組成物で処理された後、約１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日以上後に安定している。
いくつかの実施形態において、処理された尿試料が室温で保存される場合、処理された尿試料中のＤＮＡ分子は、尿試料が本出願の組成物で処理された後、約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日以上後に安定している。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、約１５℃～２５℃（±２℃）を指す。
したがって、本開示はまた、比較的低い温度下（例えば、約４℃、約－２０℃、または約－８０℃）、または室温などの比較的高い温度下での保存のために処理された尿試料を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、本明細書に記載されるようなｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と混合することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、本明細書に記載されるような本開示の組成物と混合することを含む。
本開示はまた、対象から収集された尿試料を比較的低い温度（例えば、約４℃、約２０℃、または約－８０℃）、または室温などの比較的高い温度下で保存するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、本明細書に記載されるようなｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と混合することと、処置された尿試料を事前に決定された期間の間保存することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、対象から収集された尿試料を、本明細書に記載されるような本開示の組成物と、事前に決定された期間混合することを含む。いくつかの実施形態において、事前に決定された期間は、比較的低い温度下（例えば、約４℃、約－２０℃、または約－８０℃）で、約１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、１年、２年、３年以上である。いくつかの実施形態において、期間は、室温下で、約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日である。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の処理された尿試料は、任意の有意な分解を伴わずに、室温で少なくとも２週間保存され得るか、または４℃で少なくとも１ヶ月間保存され得る。処理された試料は、－２０℃または－８０℃でさらに長期間保存することができる。
ＤＮＡ抽出のための組成物及び方法
本開示はまた、対象から収集された生体試料からＤＮＡを抽出するための組成物及び方法を提供する。いくつかの実施形態において、生体試料は、ヒトなどの哺乳類対象から収集される。いくつかの実施形態において、生体試料は、尿試料である。生体試料の非限定的な例には、とりわけ、血液、汗、涙、尿、唾液、精液、血清、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便、膣の液体もしくは組織、痰、鼻咽頭吸引液もしくは拭き取り、涙液、粘膜、もしくは上皮拭き取り（口腔拭き取り）、組織、臓器、骨、歯、または腫瘍が含まれる。
本開示の組成物及び方法は、尿試料などの生体試料からＤＮＡを抽出するための単純かつ費用対効果の高い方法を与える。特に、本開示の組成物及び方法は、生体試料中の剥離細胞からＤＮＡを抽出すること、及び試料中の１つ以上の病原体からＤＮＡを抽出することを同時に可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のＤＮＡ抽出組成物及び方法は、尿試料中のＤＮＡをより効果的に抽出し得る。加えて、本開示の組成物及び方法は、自動ＤＮＡ抽出を行うことを可能にし、したがって、全体のスループットを増加させながら労働強度を低減する。
本開示によって提供される尿磁性ビーズ抽出法は、ＰＣＲ阻害剤を十分除去することができ、自動ＤＮＡ抽出を実現するのが容易である。高純度の核酸を生成する本開示の磁性ビーズ核酸抽出法は、操作するのが簡単であり、自動化を達成するのが容易である。いくつかの実施形態において、本方法は、尿試料を大容量で処理する際により有用であり、次いで、尿試料中のＤＮＡ分子に基づく診断において、より高い検出感度をもたらす。
いくつかの実施形態において、本開示は、生体試料からのＤＮＡ抽出のための試薬を提供する。いくつかの実施形態において、生体試料は、尿試料である。いくつかの実施形態において、試薬は、磁性粒子を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、プロテアーゼを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、溶解溶液をさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、第１の洗浄緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、第２の洗浄緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、試薬は、溶出緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、該試薬は、キットとして提供されるか、または使用前に別個に提供されるかのいずれかであり得る。
いくつかの実施形態において、磁性粒子及びプロテアーゼは、尿試料を前処理し、ＤＮＡ抽出の準備をするために使用される。
いくつかの実施形態において、溶解溶液、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、及び溶出緩衝剤は、前処理された尿試料からＤＮＡを抽出するために使用される。
いくつかの実施形態において、本開示のＤＮＡ抽出は、磁性ナノ粒子（例えば、磁性ナノビーズ）などの磁性粒子に基づく。
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、磁性コアを有し、コーティングによって保護される。コーティングは、磁性粒子の不可逆的な凝集を防止し、ＤＮＡの吸着のためのリガンドの付着による官能化を可能にする。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、最適な吸着を達成するために必要な期間の長さにおいて試料中でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、Ｆｅ３Ｏ４またはＦｅ２Ｏ３などの酸化鉄を含有する。いくつかの実施形態において、酸化鉄材料は、そのサイズを数ナノメートルに低減させることによって磁性「顔料」に処理され、次いで磁性「顔料」は、生体官能化され、ライフサイエンス用途に使用され得るシリカ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、デキストラン、アガロース、セファロース、及びポリスチレンなどの非磁性マトリックスに封入され得る。
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、コアシェル構造を有する。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、埋め込み構造を有する。
コアシェル構造の場合、磁性粒子は、ＳｉＯ２シェルで囲まれた磁性コアなどのポリマーまたはシリカ表面コーティングを有する単一の超常磁性コアから構成される。いくつかの他の実施形態において、磁性粒子は、超常磁性粒子に囲まれ、表面コーティングによって保護されるポリスチレンまたはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）コアから構成される。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、封入化材料と交互に複数層の超常磁性粒子を有する。
埋め込み構造に関して、超常磁性ビーズは、複数の酸化鉄ナノ粒子（「磁性顔料」）で含浸されたポリスチレン、アガロース、またはセファロースなどの単分散マトリックスから構成され得る。これらのビーズは、典型的には、直径数百ナノメートルであり、磁性顔料の損失を防止する材料で密封される。
ＤＮＡ抽出のための磁性粒子の非限定的な例は、米国特許第６５１４６８８号、第６６７３６３１号、第６０２７９４５号、第８７１０２１１号、第６０３３８７８号、第６３６８８００号、第８３２４３７２号、第８７２９２５２号、米国出願公開第２００３／００８７２８６号、第２０１５／０１４１２５８号、第２０１６／０１０２３０５号、第２０１３／００９６２９２号、第２００２／００８６３２６号、第２００５／０２８７５８３号、第２０１０／０００９３５１号、第２０１１／０１７１６４０号、第２０１１／０００８７９７号、第２０１８／０１９５０３５号、第２００８／０１３２６９４号、第２００４／０００２５９４号、第２００９／０１３１６５０号、第２０１６／０３６９２６３号、第２０１４／０２８８３９８号、第２００３／０２２４３６６号、ならびにＷＯ／２００１／０３７２９１Ａ１、ＷＯ／２００１／０４５５２２Ａ１、ＷＯ／１９９８／０３１８４０Ａ１、ＷＯ／２００５／０２１７４８Ａ１、ＷＯ／２０１７／０５１９３９Ａ１、ＷＯ／２０１７／１３７１９２Ａ１、ＷＯ／２０１０／００５４４４Ａ１、ＷＯ／１９９２／００８８０５Ａ１、ＷＯ／２０１３／１６４３１９Ａ１、ＷＯ／２０１５／１２６３４０Ａ１、ＷＯ／２０１７／１５６３３６Ａ１、ＷＯ／２００９／１０２６３２Ａ３、ＷＯ／２００９／１０２６３２Ａ２、ＷＯ／２００９／０１２１８５Ａ１、ＷＯ／２００９／０１２１８５Ａ９、ＷＯ／２００９／１１５３３５Ａ１、ＷＯ／２０１５／１２０４４５Ａ１、ＷＯ／２０１５／１２３４３３Ａ２、ＷＯ／２００７／０５０３２７Ａ２、ＷＯ／２００７／０５０３２７Ａ３、及びＷＯ／２０１３／０２８５４８Ａ２で見つけることができ、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、シリカによってコーティングされたヒドロキシル磁性ビーズである。
いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１０００ｎｍ以上の平均直径を有する磁性ビーズである。
また、磁性粒子を含有する溶液も提供される。溶液中の磁性粒子の濃度は、必要に応じて事前に決定され得る。いくつかの実施形態において、濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ～４００ｍｇ／ｍｌ、約４００ｍｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態において、濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約３００ｍｇ／ｍｌ、約４００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態において、磁性粒子を含有する溶液は、ＤＮＡを含有する試料と混合される。いくつかの実施形態において、試料と混合した後の磁性粒子の最終的な濃度は、試料中のＤＮＡの潜在的または実際の量に基づいて、事前に決定される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡを含有する試料と混合された後の磁性粒子の最終作業濃度は、約０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、最終作業濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０２ｍｇ／ｍｌ、０．０３ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．３５ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態において、混合されたＤＮＡを含有する試料と磁性粒子が混合された後、混合物は、事前に決定された時間振盪される。いくつかの実施形態において、任意選択で、混合物は、混合された後、ある一定時間の間静置される。次いで、混合物は、事前に決定された速度で遠心分離されて、磁性粒子を沈殿させる。いくつかの実施形態において、上清は除去され、沈殿した磁性粒子はＤＮＡ抽出のためにさらに処理される。
いくつかの実施形態において、沈殿した磁性粒子は、プロテアーゼによって処理される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、広範囲プロテアーゼである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼである。
いくつかの実施形態において、セリンプロテアーゼは、プロテアーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４、プロテイナーゼＫ、エンドペプチダーゼＫ、トリチラキウムアルカリプロテイナーゼ、トリチラキウムアルブムセリンプロテイナーゼ、トリチラキウムアルブムプロテイナーゼＫ）である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼＫという用語は、天然プロテアーゼＫの任意の機能的変異体も含む。
また、プロテアーゼＫなどのプロテアーゼを含有する溶液も提供される。溶液中のプロテアーゼの濃度は、必要に応じて事前に決定することができる。いくつかの実施形態において、濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態において、沈殿した磁性粒子は、プロテアーゼＫなどのプロテアーゼを含む溶液と混合される。いくつかの実施形態において、混合された後のプロテアーゼの最終濃度は、事前に決定される。いくつかの実施形態において、沈殿した磁性粒子と混合された後のプロテアーゼの最終作業濃度は、約５～５００μｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、最終作業濃度は、約５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態において、沈殿した磁性粒子とプロテアーゼとの混合物は、所望の温度で事前に決定された時間静置され得る。いくつかの実施形態において、所望の温度は、プロテアーゼの好ましい酵素反応温度である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、プロテアーゼＫであり、温度は、約２０℃～約６０℃である。いくつかの実施形態において、温度は、約５０℃～約６０℃である。いくつかの実施形態において、温度は、約５５℃（±２℃）である。
いくつかの実施形態において、沈殿した磁性粒子とプロテアーゼとの混合物は、事前に決定された時間の間静置され得る。いくつかの実施形態において、時間は、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間以上である。
いくつかの実施形態において、尿試料を磁性粒子及びプロテアーゼで前処理した後、それをＤＮＡ抽出のために次の段階に供する。いくつかの実施形態において、溶解溶液、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、及び溶出緩衝剤が順次使用される。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、式（Ｉ）の構造を有する化合物を含み、
Figure 2022516175000001
 式（Ｉ）であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が独立して、水素、ハロゲン、アシル、置換アシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキルである。
いくつかの実施形態において、化合物は、グアニジウムを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、グアニジウムイソチオシアネート、またはその官能誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及びアルコール（例えば、ヒドロキシル官能基（－ＯＨ）が炭素に結合する有機化合物）をさらに含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００である。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌである。いくつかの実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡである。いくつかの実施形態において、アルコールは、イソプロパノールである。
いくつかの実施形態において、溶解溶液は、約６．２～６．８、例えば、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、または約６．８のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、本開示の溶解溶液は、希釈スケールに応じて、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、２５Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘ、６０Ｘ、７０Ｘ、８０Ｘ、９０Ｘ、１００Ｘ以上などの、ＤＮＡを含有する試料（例えば、液体試料）に添加される前に濃縮状態にあり得る。いくつかの実施形態において、希釈スケールは、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：９９などであり得る。希釈スケールに基づいて、溶解溶液はＤＮＡを含有する試料と混合されるため、１倍の最終作業濃度が達成される。
いくつかの実施形態において、希釈スケールは、３：１である（例えば、３体積の溶解溶液が１体積のＤＮＡを含有する試料に添加される）。この場合、溶解溶液の調製は、ａ）約２～６Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、約１％～約５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、約２０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、約１０～約５０ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液を調製することと、ｂ）約５０％～約２００％（ｖ／ｖ）の用量のイソプロパノールを溶液に添加することと、を含む。
いくつかの実施形態において、溶解溶液がＤＮＡを含有する試料と混合された後、各成分の作業濃度（１Ｘ）は、
（ａ）約１．０Ｍ～５．０Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、例えば、約１．０Ｍ、約１．５Ｍ、約２．０Ｍ、約２．５Ｍ、約３．０Ｍ、約３．５Ｍ、約４．０Ｍ、約４．５Ｍ、約５．０Ｍ以上；
（ｂ）約０．５％～約４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、例えば、約０．５％、約０．７５％、約１．０％、約１．２５％、約１．５％、約１．７５％、約２．０％、約２．２５％、約２．５５、約２．７５％、約３．０％、約３．２５５、約３．５％、約３．７５％、約４％以上；
（ｃ）約５ｍＭ～約３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、例えば、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ以上；
（ｄ）約２ｍＭ～約２０ｍＭのＥＤＴＡ、例えば、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約８ｍＭ、約１１ｍＭ、約１４ｍＭ、約１７ｍＭ、約２０ｍＭ以上；
（ｅ）約３０％～約１５０％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール、例えば、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％以上、である。
いくつかの実施形態において、磁性粒子を含有する試料が溶解溶液と混合された後、混合物を保持する容器は、事前に決定された時間振盪される。いくつかの実施形態において、容器は、約１０～２０分間、例えば、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分以上振盪される。
いくつかの実施形態において、磁性粒子を含有する試料が本開示の溶解溶液によって溶解された後、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器などの磁性物体を使用することによって、試料中の磁性粒子が収集される。
いくつかの実施形態において、収集された磁性粒子は、第１の洗浄緩衝剤（洗浄緩衝剤Ｉ）中で洗浄される。
いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、式（Ｉ）の構造を有する化合物を含み、
Figure 2022516175000002
 式（Ｉ）であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が独立して、水素、ハロゲン、アシル、置換アシル、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、置換アリールオキシカルボニル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態において、化合物は、グアニジウムを含む。いくつかの実施形態において、化合物は、グアニジウムイソチオシアネート、またはその官能誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、ｐＨ緩衝剤、塩、及びアルコール（例えば、ヒドロキシル官能基（－ＯＨ）が炭素に結合する有機化合物）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌである。いくつかの実施形態において、塩は、ＮａＣｌなどのナトリウム塩である。いくつかの実施形態において、アルコールは、エタノールである。
いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、約４．５～５．５、例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、本開示の第１の洗浄緩衝剤は、希釈スケールに応じて、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、２５Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘ、６０Ｘ、７０Ｘ、８０Ｘ、９０Ｘ、１００Ｘ以上などの、磁性粒子を洗浄するために使用される前に濃縮状態であり得る。いくつかの実施形態において、希釈スケールは、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：９９などであり得る。希釈スケールに基づいて、洗浄緩衝剤は好適な溶媒によって希釈されるため、最終作業濃度が達成される。
各成分の作業濃度は、
（ａ）約５０～約１００ｍＭのグアニジウムイソチオシアネート、例えば、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ以上；
（ｂ）約２０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、例えば、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ以上；
（ｃ）約５０ｍＭ～約２００ｍＭのＮａＣｌ、例えば、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１０５ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１１５ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１３５ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１４５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１５５ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約１９５ｍＭ、約２００ｍＭ以上；及び
（ｄ）約４０％～約６０％（ｖ／ｖ）のエタノール、例えば、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％以上である。
いくつかの実施形態において、０．１ｍｇ～１ｍｇの磁性粒子ごとに、約５００～１０００μｌの第１の洗浄緩衝剤が使用される。
いくつかの実施形態において、試料中の磁性粒子は、事前に決定された時間の間洗浄される。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１～１０分間、例えば、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分以上洗浄される。
磁性粒子が第１の洗浄緩衝剤中で洗浄された後、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器などの磁性物体を使用することによって、磁性粒子が再び収集される。
いくつかの実施形態において、収集された磁性粒子は、第２の洗浄緩衝剤（洗浄緩衝剤ＩＩ）中で洗浄される。
いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、ｐＨ緩衝剤、及びアルコール（例えば、ヒドロキシル官能基（－ＯＨ）が炭素に結合する有機化合物）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌである。いくつかの実施形態において、アルコールは、エタノールである。
いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、約５．５～６．５、例えば、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５のｐＨを有する。
いくつかの実施形態において、本開示の第２の洗浄緩衝剤は、希釈スケールに応じて、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、１０Ｘ、１５Ｘ、２０Ｘ、２５Ｘ、３０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘ、６０Ｘ、７０Ｘ、８０Ｘ、９０Ｘ、１００Ｘ以上などの、磁性粒子を洗浄するために使用される前に濃縮状態であり得る。いくつかの実施形態において、希釈スケールは、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：９９などであり得る。希釈スケールに基づいて、洗浄緩衝剤は好適な溶媒によって希釈されるため、最終作業濃度が達成される。
いくつかの実施形態において、各成分の作業濃度は、
（ａ）約１０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、例えば、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ以上；及び
（ｂ）約７０％～８０％のエタノール、例えば、約７１％、約７２％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％である。
いくつかの実施形態において、０．１ｍｇ～１ｍｇの磁性粒子ごとに、約５００～１０００μｌの第２の洗浄緩衝剤が使用される。
いくつかの実施形態において、試料中の磁性粒子は、第２の洗浄緩衝剤中で事前に決定された時間の間洗浄される。いくつかの実施形態において、磁性粒子は、約１～１０分間、例えば、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分以上洗浄される。
いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤で洗浄された後、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器などの磁性物体を使用することによって、磁性粒子が再び収集される。
いくつかの実施形態において、収集された磁性粒子は、溶出緩衝剤中で処理されて、単離されたＤＮＡ分子を放出する。
いくつかの実施形態において、溶出緩衝剤は、ＴＥ緩衝剤である。いくつかの実施形態において、ＴＥ緩衝剤は、約１０ｍＭのＴｒｉｓ及び約１ｍＭのＥＤＴＡを含む１倍のＴＥ緩衝剤である。いくつかの実施形態において、ＴＥ緩衝剤のｐＨは、ＨＣｌで約８．０にされる。
いくつかの実施形態において、磁性粒子が溶出緩衝剤によって処理される前に、それらは、事前選択された温度で事前に決定された時間静置される。
いくつかの実施形態において、事前に決定された時間は、約１～１０分、例えば、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分以上である。
いくつかの実施形態において、事前選択された温度は、室温、より高い、またはより低い温度、例えば、約－８０℃～約３７℃であり得る。
いくつかの実施形態において、洗浄除去ステップは、磁性粒子を含有する溶出緩衝剤を、約５０℃～約７５℃など、例えば、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃以上の適切に高い温度で加熱することを含む。
尿試料保存及び／またはＤＮＡ抽出のためのキット
キットはまた、尿試料保存のために、及び／または尿試料からＤＮＡを抽出するために、本開示において提供される。
いくつかの実施形態において、キットは、尿試料などの生体試料を保存するために使用することができる本明細書に記載の１つ以上の構成要素を含み得るか、それらからなり得るか、または本質的にそれらからなり得る。いくつかの実施形態において、キットは、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び／または界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態において、ｐＨ緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウムであり、キレート剤は、ＥＤＴＡであり、界面活性剤は、ＳＤＳである。尿試料を保存するためのキット中の構成要素の濃度は、上記に記載される。いくつかの実施形態において、キットの１つ以上または全ての構成要素は、液体形態で存在する。いくつかの実施形態において、キットの１つ以上または全ての構成要素は、固体形態で存在する。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、濃縮状態にあり、使用する前に希釈する必要がある。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、作業濃度であり、直接使用することができる。いくつかの実施形態において、キットは、溶液を作成するための溶媒を含有する。いくつかの実施形態において、キットは、尿試料を収集するための容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の測定容器を含む。いくつかの実施形態において、測定容器は、尿試料の体積を測定するために使用される。いくつかの実施形態において、キットは、尿試料がキット中の構成要素と混合された後に、尿試料を保存するための容器を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、溶解溶液、磁性ナノ粒子、プロテアーゼ、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、及び／または溶出緩衝剤などのＤＮＡ抽出のために本明細書に記載される１つ以上の構成要素を、含み得るか、それらからなり得るか、またはそれらから本質的になり得る。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、及びイソプロパノールを含む。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は内側コア層及び外側シェル層を有し、内側コア層はコアシェル型磁性ナノ粒子から構成され、外側シェル層はＳｉＯ２から構成される。いくつかの実施形態において、第１の洗浄緩衝剤は、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、第２の洗浄緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及びエタノールを含む。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、プロテアーゼＫである。いくつかの実施形態において、溶出緩衝剤は、１倍のＴＥ緩衝剤であり、約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、キット中の構成要素の濃度は、上記に記載される。いくつかの実施形態において、キットの１つ以上または全ての構成要素は、液体形態で存在する。いくつかの実施形態において、キットの１つ以上または全ての構成要素は、固体形態で存在する。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、濃縮状態にあり、使用する前に希釈する必要がある。いくつかの実施形態において、１つ以上の構成要素は、作業濃度であり、直接使用することができる。いくつかの実施形態において、キットは、溶液を作成するための溶媒を含有する。いくつかの実施形態において、キットは、ＤＮＡ抽出のための１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態において、容器は、自動核酸抽出システムに好適である。いくつかの実施形態において、容器は、多ウェルプラント、例えば、４８ウェルプラント、９６ウェルプレート、または３８４ウェルプレートである。いくつかの実施形態において、キットは、試料から抽出されたＤＮＡを保存するための容器を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、生体試料（例えば、尿試料）を保存するため、かつ該生体試料からＤＮＡを抽出するため、本明細書に記載される１つ以上の構成要素を含み得るか、それらからなり得るか、または本質的にそれらからなり得る。
加えて、本開示のキットは、本明細書に記載の方法の実践のための指示（例えば、プロトコル）を含む説明書を含み得る。
医学的状態の診断
対象から収集された尿試料中などの生体試料中の１つ以上の分析物の存在もしくは不在、またはレベルを検出するための方法がさらに提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して試料からＤＮＡを抽出することと、生体試料中の１つ以上の分析物の存在または不在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は、より長い保存期間のために、本明細書に記載される組成物によって処理される。いくつかの実施形態において、処理された尿試料は、それが分析される前の期間の間保存されている。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの分析物は、試料中のＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ分子は、医学的状態のバイオマーカーである。
本開示の組成物及び方法は、多くの医学的状態の診断及び／または治療に好適である。いくつかの実施形態において、医学的状態は、生殖泌尿器系の１つ以上の器官または組織に関連する。いくつかの実施形態において、医学的状態は、病原体感染及び／またはがんに関連する。本開示の組成物及び方法は、尿試料を保管し、尿試料からＤＮＡを抽出するための便宜的、非侵襲的、かつ安価な方法を提供する。組成物及び方法はまた、同じ対象から収集された複数の試料、または複数の対象から収集された試料からＤＮＡを抽出することを、技術的かつ経済的に可能にする。加えて、本明細書に開示される組成物及び方法は、大規模自動尿試料処理及びＤＮＡ抽出に好適である。特に、組成物及び方法は、低温保存装置を使用せずに、長期間（例えば、数週間～数ヶ月）にわたって同じ対象から収集される比較的大きな体積（例えば、約０．１～１０ｍｌ）を有する尿試料を分析するために好適であり、低コストで繰り返して分析を実施して、対象における医学的状態を監視することを可能にする。分析される尿試料の比較的大きな体積（１ｍｌ未満の体積を有する尿試料を通常扱う以前の方法と比較して）に起因して、本開示の組成物及び方法は、より安定した信頼性の高い診断結果を低コストで提供する。
したがって、本開示の処理された試料は、診断、監視、及び／または治療目的のために使用することができる。いくつかの実施形態において、診断、監視、及び／または治療は、対象における１つ以上の医学的状態に関するものである。いくつかの実施形態において、医学的状態は、痛みの障害；体温の変化（例えば、発熱）；神経系機能障害（例えば、失神、筋肉痛、運動障害、しびれ、感覚喪失、せん妄、認知症、記憶喪失、または睡眠障害）；目、耳、鼻、喉に関連する状態；循環機能及び／または呼吸機能に関連する状態（例えば、呼吸困難、血、肺水腫、咳、喀血、高血圧、心筋梗塞、低酸素症、チアノーゼ、心血管虚脱、うっ血性心不全、浮腫、またはショック）；胃腸機能に関連する状態（例えば、嚥下障害、下痢、便秘、消化管出血、黄疸、腹水、消化不良、吐き気、嘔吐）；腎及び尿路機能に関連する状態（例えば、アシドーシス、アルカローシス、体液及び電解質の不均衡、高窒素血症、または尿の異常）；性機能及び生殖に関連する状態（例えば、勃起不全、月経障害、多毛症、男性化、不妊症、妊娠関連障害及び標準測定値）；皮膚に関連する状態（例えば、湿疹、乾癬、ざ瘡、酒さ、皮膚感染症、免疫学的皮膚疾患、または光線過敏症）；血液に関連する状態（例えば、血液学）；遺伝子の状態（例えば、遺伝性疾患）；薬物反応に関連する状態（例えば、薬物有害反応）；及び栄養の状態（例えば、肥満、摂食障害、または栄養評価）を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態が有用性を見出す他の医療分野には、腫瘍学（例えば、新生物、悪性腫瘍、血管新生、新生物形成症候群、または腫瘍学的緊急事態）；血液学（例えば、貧血、血球異常症、巨芽球性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血、骨髄異形成、骨髄不全、真性赤血球増加症、骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ系悪性腫瘍、形質細胞障害、輸血生物学、または移植）；止血（例えば、凝固及び血栓の障害、または血小板及び血管壁の障害）；及び感染症（例えば、敗血症、敗血症性ショック、不明熱、心内膜炎、咬傷、火傷、骨髄炎、膿瘍、食中毒、骨盤内炎症性疾患、細菌性（例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、雑菌性（ノカルジア、アクチモイス、混合）、マイコバクテリア、スピロケタール、リケッチア、またはマイコプラズマ）；クラミジア；ウイルス（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、真菌及び藻類感染；原虫及び寄生虫様感染；内分泌疾患；栄養疾患；ならびに代謝疾患が含まれる。
いくつかの実施形態において、医学的状態は、生殖泌尿器系と関連付けられる。いくつかの実施形態において、医学的状態は、男性または女性の生殖泌尿器系と関連付けられる。いくつかの実施形態において、医学的状態は、脊柱、直腸、精嚢、射精管、肛門、精巣上体、精巣、陰嚢、尿管、膀胱、精管、勃起組織、陰茎、尿道、陰茎、腎臓などの男性生殖器系の組織、臓器、または一部に関連する。いくつかの実施形態において、医学的状態は、腎臓、尿管、膀胱、尿道、子宮、卵管、卵巣、及び膣などの女性生殖器泌尿器系の組織、臓器、または一部に関連する。
いくつかの実施形態において、医学的状態には、急性糸球体腎炎、腎症症候群、慢性糸球体腎炎、腎炎、腎症、急性腎不全、慢性腎不全、腎感染、腎盂腎炎、水腎症、腎臓及び尿管の結石、下部尿路感染症、膀胱炎、尿道炎、尿道炎、尿道狭窄、前立腺肥大、前立腺の炎症性疾患、陰嚢水腫、精巣炎及び精巣上体炎、過長包皮及び包茎、不妊、陰茎障害、良性乳房異形成症、卵巣、卵管、骨盤細胞組織、及び腹膜の炎症性疾患、頸部以外の子宮の炎症性疾患、頸部、膣、及び外陰の炎症性疾患、子宮内膜症、生殖器脱、子宮の障害、性的感染症が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、医学的状態は、１つ以上の病原体と関連付けられる。
いくつかの実施形態において、病原体はウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペックスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ジカウイルス、デングウイルス、チングンヤウイルス、エボラウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球性ウイルス、リンパ膜炎ウイルス（ＬＭＣＶ）、エプスタイン－バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルス、インフルエンザ、ロタウイルス、ヒトアデノウイルス、ルベラウイルス、ヒトエンテロウイルス、水痘ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、小痘ウイルス、ワキニアウイルス、ルベラウイルス、及びハンタウイルス、または任意の他のトランスレナルウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスは、ＨＰＶである。
いくつかの実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、２６、５３、及び６６などの高リスクＨＰＶである。いくつかの実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ型６、１１、４２、４３、及び４４などの低リスクＨＰＶである。
いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲは、所与のＨＰＶサブタイプの存在または不在を決定するために使用される。いくつかの実施形態において、陽性反応は、蛍光シグナルの蓄積によって検出される。サイクル閾値（Ｃｔ）は、蛍光シグナルが閾値を通過する（例えば、バックグラウンドレベルを超える）のに必要なサイクル数として定義される。いくつかの実施形態において、閾値は、ｑＰＣＲ機器のソフトウェアまたは他の好適な方法によって自動的に決定される。いくつかの実施形態において、閾値は、陰性対照試料中の末端蛍光値をちょうど上回る（例えば、約０．０１％、０．１％、１％、５％、または１０％高い）ように設定される。いくつかの実施形態において、試験試料中のＨＰＶサブタイプ増幅に関連するＣｔ値が約３５、３４、３３、３２、３１、３０以下（≦）である場合、試料は、ＨＰＶサブタイプを含有するもの（陽性結果）として決定され、そうでなければ試料は、ＨＰＶサブタイプを含有しないもの（陰性結果）として決定される。参照対照遺伝子増幅については、試料中の対照遺伝子増幅に関連するＣｔ値が約３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９以下（≦）である場合、参照対照遺伝子増幅は、陽性であると決定され、そうでなければ参照対照遺伝子増幅は、陰性であると決定される。参照対照遺伝子増幅が陰性であると決定され、ＨＰＶ遺伝子増幅結果も陰性である場合、試験結果は無効となる。
いくつかの実施形態において、病原体は、細菌である。いくつかの実施形態において、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ菌種、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。
いくつかの実施形態において、病原体は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、またはＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍである。
いくつかの実施形態において、医学的状態は、がんである。いくつかの実施形態において、がんには、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、泌尿器科癌、腎臓癌、精巣癌、尿路上皮癌、大腸癌、膵臓癌、及び胃癌が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本開示の処理された尿試料などの本開示の処理された試料は、対象における１つ以上の医学的状態を診断するために使用することができる。いくつかの実施形態において、試料中の１つ以上の医学的状態と関連付けられる１つ以上のバイオマーカーの存在もしくは不在、またはレベルが決定される。
膀胱癌のバイオマーカーには、ＣＡ９、ＣＣＬ１８、ＭＭＰ１２、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＭＭＰ９、ＳＥＭＡ３Ｄ、ＥＲＢＢ２、ＣＲＨ、及びＭＸＲＡ、ＦＩＸＡ１、アポリポプロテインＡ１（ＡＰＯＡ１）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ペルオキシレドキシン２（ＰＲＤＸ２）、ヘパリン補因子２前駆体（ＨＣＩＩ）、血清アミロイドＡ－４タンパク質（ＳＡＡ４）、シスタチンＢ、ＧＤＦ１５プロモーター領域、ＨＳＰＡ２プロモーター領域、及びＴＭＥＦＦ２プロモーター領域からなる群から選択されるプロモーター領域に由来するＣｐＧアイランド、ＡＢＣＣ１３、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ８、ＡＬＸ４、ＡＰＣ、ＢＣＡＲ３、ＢＣＬ２、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＮＩＰ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＲ１、ＣＢＲ３、ＣＣＮＡ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＦＴＲ、ＣＯＸ２、ＤＡＰＫ１、ＤＲＧ１、ＤＲＭ、ＥＤＮＲＢ、ＦＡＤＤ、ＧＡＬＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＮＦ３Ｂ、ＨＰＰ１、ＨＴＥＲＴ、ＩＣＡＭ１、ＩＴＧＡ４、ＬＡＭＡ３、ＬＩＴＡＦ、ＭＡＧＥＡ１、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＭＩＮＴ１、ＭＩＮＴ２、ＭＴ１ ＧＭＴ、ＭＩＮＴ１、ＭＩＮＴ２、ＭＴ１Ａ、ＭＴＳＳ１、ＭＹＯＤ１、ＯＣＬＮ、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＰＲＭ、ＲＵＮＸ３、ＳＡＬＬ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＴＡＴ１、ＴＭＳ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＷＷＯＸ、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３０３００１号及び第２０１７／０３５０８９４号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
前立腺癌のバイオマーカーには、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺癌抗原３（ＰＣＡ３）、α－メチルアシル－ＣｏＡラセマーゼ、アネキシンＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ、個々の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＧＦ－β１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、好中球対リンパ球比、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ７３、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、細胞傷害性ＣＤ８腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔｒｅｇ腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ならびに米国特許第８５１８６５０号、第８７８４７９５号、第１００４８２６５号、及び米国特許出願公開第２０１０／０２９２３３１号、第２０１７／００５８３５２号、第２０１４／００９４３８０号、第２０１４／０１０６３６９号、第２０１３／０２１７６４７号、第２０１３／０１１６１４２号、第２０１５／０１６０２２４号、第２０１３／０１１６１３３号、第２０１７／００１６９０３号、第２０１３／０１１６１３１号、第２０１６／００２４５９２号、第２０１０／０２１６６５４号、第２０１５／０３２９９１２号、第２０１８／００２４１３２号、第２０１１／０２３６９１０号、第２０１３／０１１５６０４号、第２０１５／０２９９８０７号、第２０１６／００２５７３４号、第２０１１／０３１１９９８号、第２０１６／００４１１７３号、第２０１４／００３８８３８号、第２００９／０２２１６７２号、第２０１７／０３６２６６３号、第２００５／０２４４９７３号、第２０１６／００９７０８２号、第２０１５／０２１８６５５号、第２０１６／０２９９１４５号、第２０１５／０１３３３２７号、第２０１７／０１７６４４３号、第２０１６／０２０９４１６号、第２０１６／０３５５８８７号、第２０１５／０２５２４２５号、第２０１６／０２５８９５８号、第２０１８／００５１３４０号、第２０１５／０３２９９１１号、第２００８／０２４８５００号、第２０１５／０２７６７４６号、第２０１３／０３３１２７９号、第２０１１／００５４００９号、第２００６／００８８８９４号、第２０１４／０２７４７６７号、第２０１３／０１８４１６９号、第２０１５／００２４９６１号、第２００８／０２５４４８１号、第２００７／０００９９７０号、第２０１１／００４５０５３号、及び第２０１４／００５１０８２号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
卵巣癌のバイオマーカーとしては、Ｃｙｒ６１、ＡｐｏＡ１、β－２マイクログロブリン、ＣＡ１２５、ならびに米国特許第５７６９０７４号、第７６６６５８３号、第８０５３１９８号、第８２８８１１０号、第８２０６９３４号、第９８１６９９５号、米国出願公開第ＵＳ２００９／００６８６９０号、２００９／００７５３０７号、第２００９／００８１６８５号、第２０１４／０２７４７８７号、第２０１３／０２６７４３９号、第２００７／０２１２７２１号、第２０１５／００８０２２９号、第２０１８／０１９６０５４号、第２００８／０２８６８１４号、第２０１１／０２５６５６０号、第２０１０／０１９７５６１号、第２０１５／０１６８４１４号、第２００７／００５４３２９号、第２０１０／０２２１７５２号、第２０１０／００８６９４８号、第２００６／００２９９５６号、第２０１８／００７４０６３号、第２０１０／０１０５０６７号、第２０１６／００４７８１５号、第２００９／００８７８４９号、第２０１０／００５５６９０号、第２０１５／０１４７８２３号、第２０１３／００９６０２２号、第２０１７／０２７６６８０号、第２０１２／００４６１８５号、第２０１５／０３６２４９７号、第２００５／０２１４７６０号、第２０１１／０２７５５３４号、第２００７／０１７２９０２号、第２０１４／０２５６５９１号、第２０１１／０２１７２３８号、第２０１８／０２３１５５９号、第２０１３／００２２９９８号、第２０１５／０１２６３８４号、第２０１５／０３２２５３０号、第２０１２／０１７１６９４号、第２０１０／０２２７３３５号、第２０１５／０１９８６００号、第２００８／０２５４０４８号、第２０１４／０１２１１２７号、第２０１０／０２２７３４３号、第２０１６／０００２７３２号、第２０１４／０２２１２４０号、及び第２００９／０００４６８７号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
大腸癌のためのバイオマーカーには、ＢＭＰ３、ＴＦＰＩ１、ＮＤＲＧ４、Ｓｅｐｔｉｎ９、ＴＦＰＩ２、ＯＰＬＡＨ、ＦＬＩ１、ＰＤＧＦＤ、ＳＦＭＢＴ２、ＣＨＳＴ２、ＶＡＶ３、ＤＴＸ１、ならびに米国特許第９０９５５４９号、第９８３５６２６号、第８４２６１５０号、第１００４２９８３号、及び米国出願公開第２００９／０１４２３３２号、第２０１８／０２８２８１５号、第２００５／００１４１６５号、第２０１７／０２０５４１４号、第２０１３／０３４５３２２号、第２０１３／０３２３２５３号、第２０１２／００４０３８３号、第２００８／００２０９４０号、第２０１０／０３０４４１０号、第２０１５／００７２３４１号、第２０１２／０２６４１３１号、第２０１７／０１７６４４１号、第２０１２／０２０７８５６号、第２０１５／０２１２０８８号、第２００８／０２８６８０１号、第２０１６／０１６０２９６号、第２０１８／００９４３２２号、第２０１８／０１６４３２０号、第２０１４／００４５１８０号、第２０１４／０１１３８２９号、第２０１３／０２８８２４７号、第２０１４／０２１２４１５号、第２００９／０１１２１２０号、第２００６／００８８８６２号、第２０１３／０１６４２７９号、第２０１２／０２３８４６３号、第２０１５／０３４４９６９号、第２０１６／０１０８４７６号、第２０１５／０１６８４１０号、第２０１４／０２５６５８６号、第２０１５／０１９８６００号、第２０１５／０１９７８１９号、第２０１６／０００２７３２号、第２０１６／０１５３０５４号、第２０１２／０２３８４６４号、第２０１２／０２３７９２９号、第２０１４／０３４２９２４号、第２０１０／０２０３５２２号、第２０１５／０２９２０２３号、第２０１８／００８０９３７号、第２０１２／０１８３５５４号、第２０１５／０１３３３３０号、第２０１２／００８９５４１号、第２０１５／０１７６０８２号、第２０１３／０１０２４８７号、第２０１８／０１１２２７３号、第２０１４／００３７６２５号、第２０１８／０３０６８００号、第２０１７／０１０８５０１号、及び第２０１７／０２３４８７４号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
腎臓癌のためのバイオマーカーとしては、限定されないが、ソルビトール、フルクトース、ソルビトール６－リン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩及びステアリン酸塩、アクアポリン－１（ＡＱＰ１）、アジポフィリン（ＡＤＦＰ）、ならびに米国特許第８４２６１５０号、第８３３５５５０号、第８２１１６５３号、及び米国出願公開第２０１６／０２４５８１４号、第２０１４／０３４３８６５号、第２０１０／０２６１２２４号、第２０１５／０１９８６００号、第２００６／００８４１２６号、第２０１１／０２３７４５０号、第２０１７／０１０８５０１号、第２００７／００５４２８２号、第２０１７／０２４０９７１号、第２０１１／０１５１４６０号、第２０１７／０２３４８８４号、第２０１４／０２１３４７５号、第２０１８／００６８０８３号、第２０１６／０３０５９４７号、第２０１５／００１７６３８号、第２０１６／０２１５３４９号、第２０１２／０２０７８５６号、第２００８／０１３９４０２号、第２００３／０１９０６０２号、第２００３／０１９９６８５号、第２０１０／０２３３０８０号、第２０１１／００２０８３６号、第２０１７／０２９０９１３号、第２０１６／０１６６６８５号、第２０１６／０００３８３５号、第２００８／０２６１２５８号、第２０１８／０１７１０２２号、第２００７／００２６４１５号、第２０１５／０３０７６１７号、第２００８／０１２４３２９号、第２０１０／００２８３４４号、第２０１５／０３０１０５８号、第２０１６／００２２６３８号、第２００９／０２９９１５４号に記載されるものが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、全ての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
尿路上皮癌のためのバイオマーカーには、限定されないが、ＳＬＣ２Ａ１、Ｓ１００Ａ１３、ＧＡＰＤＨ、ＫＲＴ１７、ＧＰＲＣ５Ａ、Ｐ４ＨＡ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ユビキリン２、ＥＧＦ、ＩＬ１β、ｓＴＮＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＦＡＳが含まれるが、これらに限定されない。
定義
「一実施形態」、「実施形態」、「一実施例」、及び「実施例」への言及は、そのように説明される実施形態（複数可）または実施例（複数可）が、特定の特徴、構造、特質、特性、要素、または制限を含み得るが、全ての実施形態または実施例が必ずしもその特定の特徴、構造、特質、特性、要素、または制限を含むわけではないことを示す。さらに、「一実施形態において」という語句の繰り返しの使用は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、引用される数字のプラスまたはマイナス１０％もしくは５％を指す。
本明細書で使用される場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写される一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの変異体が、所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸及びその相補体を包含する。一本鎖は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。核酸は、一本鎖配列もしくは二本鎖配列であり得るか、または二本鎖及び一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボ及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成方法によってまたは組換え方法によって得ることができる。
本明細書で使用される場合、核酸を指す「変異体」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部の相補体、（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）厳密な条件下で、参照核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一である配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
本明細書で使用される場合、「診断すること」という用語は、病理学、または症状を分別し、病理学的重症度（例えば、グレードまたは段階）を決定し、病理学的進行を監視し、病理学的成果及び／または回復の見通しを予測することを指す。
「から本質的になる」という語句は、組成物または方法が追加の成分及び／またはステップを含み得るが、追加の成分及び／またはステップが特許請求の範囲に記載の組成物または方法の基本的かつ新規の特質を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。
「任意選択で」という単語は、「いくつかの実施形態において提供され、他の実施形態において提供されない」を意味するために本明細書で使用される。本発明の任意の特定の実施形態は、そのような特徴が対立しない限り、複数の「任意の」特徴を含み得る。
本明細書で使用される場合、「イソプロパノールの用量（ｖ／ｖ）」は、最終溶液の調製中に、溶液中に全ての他の成分を含む溶液の体積に対するイソプロパノールの体積の比を意味する。例えば、「イソプロパノールは、約５０％～２００％（ｖ／ｖ）の用量を有する」は、最終溶液を調製する際に、添加されたイソプロパノールの体積が、最終溶液中に全ての他の成分を含む溶液の体積の約５０％～２００％であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「Ｃｔ値」という用語は、蛍光シグナルが閾値を横切る（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）のに必要なサイクル数であるサイクル閾値を指す。Ｃｔレベルは、試料中の標的核酸の量に反比例する。
本開示のある特定の実施形態は、以下の実施例にさらに記載される。これらの実施例は、例示のみによって与えられることが理解されるべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本質的な特質を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の実施形態の種々の変更及び修正を行い、種々の使用及び条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の実施形態の種々の修正は、前述の説明から当業者には明白であろう。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内にあるように意図される。
実施例１：尿試料保存のための溶液の調製
酢酸－酢酸ナトリウム緩衝剤（２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝６．０）、ＳＤＳ溶液（１０％（Ｍ／Ｖ））、及びＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．４）を１０：２０：１の体積比で混合して、尿試料保存のための溶液を作成した。例えば、３１０ｍＬ溶液を調製するために、１００ｍｌの酢酸－酢酸ナトリウム緩衝剤、２００ｍｌのＳＤＳ溶液、及び１０ｍｌのＥＤＴＡ溶液を混合した。
実施例２：尿試料ＤＮＡ抽出のための試薬の調製
尿試料からＤＮＡを抽出するために、以下の試薬を提供した：
磁性ビーズ：３００ｎｍの粒子サイズ、及び５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する市販のシリコンヒドロキシル磁性ビーズ
プロテアーゼＫ市販の２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、脱イオン水で１０ｍｇ／ｍｌに希釈した
溶解溶液：最初に、５Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液を調製し、次いで、溶液に２００％（Ｖ／Ｖ）の用量のイソプロパノールを添加し、その最終ｐＨを６．５に調整した。最終溶解溶液は、１．６７Ｍのグアニジウムイソチオシアネート、１．３３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、８．３３ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、３．３３ｍＭのＥＤＴＡ、及び６６．７％（溶解溶液のｖ／ｖ）のイソプロパノールを有する。
洗浄緩衝剤Ｉ：５０ｍＭのイソチオシアネート、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び６０％のエタノール、ならびにその最終ｐＨを５．０に調整した。
洗浄緩衝剤ＩＩ：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）及び７０％のエタノール。
溶出緩衝剤：１倍のＴＥ（ｐＨ８．０）。
実施例３：尿試料保存試薬の有効性の検証
ヒト尿試料を、複数のヒト対象から収集した。各尿試料を２部分に分割した。第１の部分を実施例１で調製した保存溶液に１０：１（尿試料：保存溶液）の比率で添加し、第２の部分を対照として同じ量の滅菌脱イオン水を添加した。熱加速実験のために、すべての試料を摂氏３７度に配置した。
試料を、０、４、及び７日目にそれぞれ収集した。収集した試料中のＤＮＡを、実施例２で調製した尿ＤＮＡ抽出試薬を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ中のβ－アクチン遺伝子を定量ＰＣＲによって増幅した。βーアクチン遺伝子を検出するためのプライマー及びプローブ配列は、ＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣ（上流プライマー、配列番号１）、ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣ（下流プライマー、配列番号２）、及び５’－ＦＡＭ－ＴＧＡＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣ－３’ＢＨＱ１（プローブ、配列番号３）だった。蛍光定量ＰＣＲの結果を使用して、熱加速実験後の試料中のＤＮＡ品質を決定した。結果を下記の表１及び図１に示す。
Figure 2022516175000003
結果は、尿保存試薬と混合した尿試料を０日に収集した尿試料と比較した場合、ｑＰＣＲ Ｃｔ値によって検証されるように、尿試料を３７℃で７日間保存した後であっても、β－アクチン遺伝子の量及び質に関して有意差はなかったことを示した。これに反し、０日目に収集された尿試料と、保存試薬無添加で、３７℃でわずか４日間保存された尿試料との間に有意差があった。結果は、尿試料が高温で保存された場合でさえ、尿保存試薬が尿試料中のＤＮＡを保存するのに有効であることを示した。
実施例４：尿試料保存試薬の安定性の検証
この実験は、尿試料中のＤＮＡの安定性を試験するために、実施例１で生成された尿試料保存試薬によってそれらを処理した後に実施した。
１２名のヒト対象から収集された高リスクＨＰＶ陽性尿試料の群を選択した。各尿試料を、実施例１で生成した尿保存試薬と１０：１の比率で混合した。各混合物の小分けを４℃及び室温で保存した。
実施例２で生成したＤＮＡ抽出試薬を使用して、ＤＮＡをこれらの小分けから、混合物を作成した０、１、２、３、及び４週間後に抽出した。ＤＮＡを使用し、高リスクヒトパピローマウイルス検出キット（Ｈｙｂｒｉｂｉｏ Ｂｉｏ）を使用してＨＰＶのＤＮＡを検出し、尿試料中のＤＮＡの安定性を決定した。
表２及び図２は、４℃における０、１、２、３、及び４週後のβ－アクチン遺伝子のＤＮＡの安定性を示し、蛍光定量ＰＣＲにおけるβ－アクチン遺伝子のＣｔ値によって示される。
表３及び図３は、室温における０、１、２、３、及び４週後のβ－アクチン遺伝子のＤＮＡの安定性を示し、蛍光定量ＰＣＲにおけるβ－アクチン遺伝子のＣｔ値によって示される。
Figure 2022516175000004
Figure 2022516175000005
表４及び図４は、４℃における０、１、２、３、及び４週後のＨＰＶマーカー遺伝子のＤＮＡの安定性を示し、蛍光定量ＰＣＲにおけるＨＰＶマーカー遺伝子のＣｔ値によって示される。
表５及び図５は、室温における０、１、２、３、及び４週後のＨＰＶマーカー遺伝子のＤＮＡの安定性を示し、蛍光定量ＰＣＲにおけるＨＰＶマーカー遺伝子のＣｔ値によって示される。
Figure 2022516175000006
Figure 2022516175000007
上記の実験結果は、尿試料を本開示の尿保存試薬と混合した後、４℃で１週間、２週間、３週間、４週間保存された尿試料中のヒトβ－アクチン遺伝子及び高リスクＨＰＶ ＤＮＡのＤＮＡ分子が、０週に収集された尿試料中のＤＮＡに匹敵し、ｑＰＣＲによって測定されるＤＮＡの質及び量に関して有意な変化がなかったことを示す。本開示の尿保存試薬と混合された後に室温で保存された尿試料については、０週に収集された試料と比較して１週間または２週間後に有意な変化はなかったが、試料は３週間または４週間後に不安定になり始めた。結果は、本開示の尿保存試薬が、処理された試料が４℃で保存された場合に少なくとも４週間、または室温で少なくとも２週間、尿試料中のＤＮＡを安定して保存することを示唆する。
実施例５：尿試料におけるＤＮＡ抽出試薬の有効性の検証
高リスクＨＰＶを含有する尿試料中のＤＮＡを、いくつかの異なる方法／キットを使用して抽出した。該方法／キットには、Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ尿キット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ、Ｄ３０６１）、磁性ビーズ尿ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＤＥ－５００５）、ＦｉｎｅＭａｇ無血漿ＤＮＡ用大容量磁性ビーズ－ＤＮＡ抽出キット（Ｇｅｎｅｆｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＦＭ１０７）、及び本開示の尿ＤＮＡ抽出試薬が含まれる。ＤＮＡ抽出後、Ｈｙｂｒｉｂｉｏのハイリスクヒトパピローマウイルス検出試薬を使用して、ＤＮＡをＨＰＶのリアルタイム定量ＰＣＲ検出に供した。試験したキットの各々の説明書に従った。
本開示のＤＮＡ抽出試薬を使用して、尿試料からＤＮＡを抽出するために、以下のステップを行った：
１．尿試料の前処理：１０ｍｌの尿試料を、５０ｍｌの遠心管に加えた。２０μｌのヒドロキシル磁性ビーズを試料中に添加し、ボルテックスによって混合した。管を１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。その後、上清を慎重に廃棄し、５００μｌのペレットを新しい１．５ｍｌの遠心管に入れた。２．５μｌのプロテイナーゼＫをペレットと混合した。管を金属浴中で、５６℃で３０分間加熱した。
２．抽出試薬分配：溶解溶液、洗浄緩衝剤Ｉ、洗浄緩衝剤ＩＩ、及び溶出緩衝剤を、９６ウェルのディープウェル抽出プレートに、それぞれ７５０μｌ、６００μｌ、６００μｌ、及び５０μｌの体積で添加した。
表６は、可能性のある試料負荷計画を実証した。その中で、８列Ａ～Ｈの各々について、ＤＮＡ抽出のために２つの試料を保持することができる。９６ウェルプレートについて、１６試料からのＤＮＡを抽出することができる。
Figure 2022516175000008
７５０μｌの溶解溶液と、２５０μｌの上記前処理尿試料とを、カラム１、２、７、及び８の各ウェル中で混合した。６００μｌの洗浄緩衝剤Ｉを、カラム３及び９の各ウェルに添加した。６００μｌの洗浄緩衝剤ＩＩを、カラム４及び１０の各ウェルに添加した。５０μｌの溶出緩衝剤を、カラム６及び１２の各ウェルに添加した。
３．自動ＤＮＡ抽出装置を使用したＤＮＡ抽出：上述の９６ウェル含有試料を、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｘｉ’Ａｎ Ｔｉａｎ Ｌｏｎｇ、モデルＮＰ９６８－Ｓ）に入れた。製造マニュアルに基づいて、以下のプログラムを使用した。
Figure 2022516175000009
これらの異なる方法／キットを使用してＤＮＡ分子を尿試料から抽出した後、抽出されたＤＮＡ分子は、蛍光定量ＰＣＲを使用してＨＰＶ遺伝子を検出するために使用し、これらの方法／キットの各々に関連するＤＮＡ抽出効率を決定した。同じ量の尿試料を各ＤＮＡ抽出方法／キットについて使用し、各方法で抽出したＤＮＡをＰＣＲのために同じ体積に希釈し、それによって意味のある比較を行うことができた。結果を図６Ａ～図６Ｄに示す。
結果は、本開示の試薬及び方法が、試験された既存の市販製品と比較して、尿試料からＤＮＡを抽出するために、より有効な方法を提供することを示す。
実施例６：尿ＤＮＡ抽出試薬の製剤の最適化
尿中のＤＮＡ抽出の抽出及び精製の効率を改善するために、溶解溶液、洗浄緩衝剤Ｉ、洗浄緩衝剤ＩＩの製剤及び／または用量、磁性ビーズ及びプロテアーゼＫの用量を最適化した。
溶解溶液の最適化：グアニジンイソチオシアネートの５Ｍの一定濃度及びイソプロパノールの２００％の用量で、５つの異なる濃度のＥＤＴＡ（５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）とともに４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む溶解溶液の製剤を試験し、５つの異なる濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（１％、２％、４％、６％、８％）とともに１０ｍＭのＥＤＴＡを含む溶解溶液の製剤を試験した。本明細書で使用される「濃度」は、イソプロパノールを添加する前の溶液中の各成分の濃度を指す。いくつかの実施形態において、イソプロパノールは、全ての他の成分が一緒に混合された後に添加される。ＤＮＡ抽出は、異なる製剤のこれらの溶解溶液を使用して同じ尿試料について実行された（表８を参照されたい）。尿試料からＤＮＡを抽出は、本発明の実施例３の方法に従って実行し、洗浄緩衝剤として７５％エタノール、溶出緩衝剤として１倍のＴＥ、３００ｎｍヒドロキシ磁性ビーズ、及び１０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ濃度を用いた。定量ＰＣＲ増幅は、異なる製剤の溶解溶液から抽出された尿中のβ－アクチン遺伝子について実行し、異なる製剤の溶解溶液の抽出効率を、β－アクチン遺伝子の含有量（測定されたＣｔ値に反比例した）によって決定した。βーアクチン遺伝子を検出するためのプライマー及びプローブ配列は、ＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣ（上流プライマー、配列番号１）、ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣ（下流プライマー、配列番号２）、及び５’－ＦＡＭ－ＴＧＡＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣ－３’ＢＨＱ１（プローブ、配列番号３）だった。結果を表９に示す。
Figure 2022516175000010
Figure 2022516175000011
表９に示すように、β－アクチン遺伝子含有量は、製剤２の溶解溶液から抽出されたＤＮＡにおいて最も高い（Ｃт値は最も低い）ため、溶解溶液中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びＥＤＴＡ濃度は、それぞれ４％及び１０ｍＭとして設定される。
同様の方法を使用して、溶解溶液の残りの成分を最適化した。グアニジンチオシアネートでは、試験した濃度勾配は２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、及び５Ｍであり、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでは、試験した濃度勾配は１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、及び１００ｍＭであり、イソプロパノール（Ｖ／Ｖ）の用量では、試験した勾配は５０％、１００％、１５０％、２００％の用量であり、ｐＨ値設定では、５．５、６．０、６．５、７．０の勾配を試験した。最終的に、本発明における溶解溶液の各成分における最適な製剤は、以下：５Ｍの異なるグアニジンチオシアネート、４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．５として得られる。この実施例で使用される「濃度」は、イソプロパノールを添加する前の溶液中の各成分の濃度を指す。
洗浄緩衝剤Ｉの最適化：洗浄緩衝Ｉの８つの異なる製剤を表１０に従って調製し、尿ＤＮＡ抽出試薬の他の成分と組み合わせて、次いで試料抽出のために同じ尿試料に適用し、ｑＰＣＲを使用してβ－アクチン遺伝子含有量を評価した（「溶解溶液の最適化」に記載の方法に従う）。結果を表１１に示す。
Figure 2022516175000012
Figure 2022516175000013
表１１のデータ分析により、洗浄緩衝剤Ｉの製剤５は、最善の抽出効果を有した。また、この条件下では、磁性ビーズは抽出プロセスにおいて凝集せず、洗浄効果がより良好であった。最終的に、洗浄緩衝剤Ｉの製剤を、０．０５ＭのＧｕＳＣＮ、０．１％のＰＶＰ４０、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、６０％のエタノール、１００ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ＝５．０として決定した。
洗浄緩衝剤ＩＩの最適化：１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含有する７５％エタノール（ｐＨ６．０）（新しい製剤）を調製し、７５％エタノール（元の製剤）と比較した。各緩衝剤を磁性ビーズ及び尿ＤＮＡ抽出試薬の他の成分と組み合わせて、３つの尿試料からそれぞれＤＮＡを抽出した。
ｑＰＣＲを使用して、β－アクチン遺伝子含有量を評価し（「溶解溶液の最適化」に記載の方法に従う）、洗浄中のＤＮＡ損失が低減され得るか確認した。結果を表１２に示す。
Figure 2022516175000014
表１２のデータ分析により、７５％エタノールのｐＨ値をｐＨ６．０に調整することは、洗浄中のＤＮＡ損失を低減することができ、そのため洗浄緩衝剤ＩＩ製剤は、７５％エタノール、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝６．０であることが決定される。
磁性ビーズ用量の最適化：磁性ビーズ用量を、１０ｕｌ、１５ｕｌ、及び２０ｕｌの３つの異なるレベルで設定した。各用量の磁性ビーズを、β－アクチンｑＰＣＲ評価に従って（「溶解溶液の最適化」に記載の方法に従う）、２つの尿試料からの試料抽出のために尿ＤＮＡ抽出試薬の残りの成分と組み合わせた。結果を表１３に示す。
Figure 2022516175000015
表１３のデータ分析により、磁性ビーズの量を２０ｕｌに増加させることは、抽出効率を向上させることができ、磁性ビーズ凝集の現象を抽出プロセスにおいて排除することができる。したがって、磁性ビーズの量は、２０ｕｌであることが決定された。
プロテアーゼＫ用量の最適化：プロテアーゼＫ用量を、０ｕｇ、２．５ｕｇ、及び２５ｕｇの３つのレベルで設定した。各用量のプロテアーゼＫを、３つの尿試料からの試料抽出のために尿ＤＮＡ抽出試薬の残りの成分と組み合わせ、次いでβ－アクチン遺伝子含有量についてｑＰＣＲによって試験した（「溶解溶液の最適化」に記載の方法に従う）。検出結果を以下の表１４に提供する。
Figure 2022516175000016
表１４のデータ分析により、プロテアーゼＫの量を２５ｕｇに増加させることは、抽出効率を向上させることができる。したがって、プロテアーゼＫ用量は、最終的に、２５ｕｇであることが決定された。
試料用量の最適化及び決定：３つの臨床尿試料を選択し、各尿試料について、試料用量（体積）を、４００ｕｌ、１０００ｕｌ、及び８０００ｕｌの３つのレベルで試験した。本発明に記載の尿ＤＮＡ抽出試薬及び方法をＤＮＡ抽出のために使用し、β－アクチン遺伝子についてｑＰＣＲによって試験して（「溶解液の最適化」に記載の方法に従う）、最適な試料用量を決定した。結果を表１５に示す。
Figure 2022516175000017
表１５のデータ分析により、試料用量を増加させることは、検出結果を有意に改善することができ、８０００μｌの試料サイズは、これら３つの試料投薬量の中で最善の結果を示す。操作を容易にするために、試料用量を最終的に１０ｍＬとして設定する。
本明細書で引用されるすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許刊行物、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用される参考文献、論文、刊行物、特許、特許刊行物、及び特許出願について言及することは、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいかなる国においても一般的な知識の一部を構成するという、認識もしくは任意の形態の示唆として見なされず、また見なされてはならない。
別段定義されない限り、本明細書のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。引用される全ての刊行物、特許、及び特許刊行物は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書において、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されているが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変更、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行的な実践に含まれ、前述される本質的な特徴に適用され得、かつ添付の請求項の範囲に含まれるような、本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
配列表
配列番号１、上流プライマー、β－アクチン
ＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣ、
配列番号２、下流プライマー、β－アクチン
ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣ、
配列番号３、ｑＰＣＲプローブ、β－アクチン
５’－ＦＡＭ－ＴＧＡＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣ－３’ＢＨＱ１

Claims (102)

  1. 対象から得られる尿試料を保存するための組成物であって、前記組成物が、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤を含む、前記組成物。
  2. 前記ｐＨ緩衝剤が、前記組成物のｐＨを、事前選択された範囲内に調整するように構成される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｐＨ緩衝剤が、酢酸及び酢酸の塩を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記酢酸の塩が、酢酸ナトリウムである、請求項３に記載の組成物。
  5. ｐＨの前記事前選択された範囲が、約５．０～６．５である、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記組成物の前記ｐＨが、約６．０である、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記酢酸ナトリウムが、約０．５～１．０ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項４に記載の組成物。
  8. 前記キレート剤が、アミノポリカルボン酸である、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記ＥＤＴＡが、約１０～２５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記陰イオン界面活性剤が、ドデシル水素スルファートの塩である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記塩が、ナトリウム塩であり、前記陰イオン界面活性剤が、ドセシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記ＳＤＳが、約５％～１０％（ｍ／ｖ）の濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、防腐剤、細胞固定剤、またはホルムアルデヒド消光剤を含有しない、請求項１に記載の組成物。
  16. 保存のための処理された尿試料であって、前記処理された尿試料が、対象から収集された尿試料、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤を含む、前記処理された尿試料。
  17. 前記ｐＨ緩衝剤が、組成物のｐＨを、事前選択された範囲内に調整するように構成される、請求項１６に記載の保存のための処理された尿試料。
  18. 前記ｐＨ緩衝剤が、酢酸及び酢酸の塩を含む、請求項１６に記載の保存のための処理された尿試料。
  19. 前記酢酸の塩が、酢酸ナトリウムである、請求項１８に記載の保存のための処理された尿試料。
  20. ｐＨの前記事前選択された範囲が、約５．０～６．５である、請求項１７に記載の保存のための処理された尿試料。
  21. 前記組成物の前記ｐＨが、約６．０である、請求項２０に記載の保存のための処理された尿試料。
  22. 前記処理された尿試料中の前記酢酸ナトリウムが、約０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項１９に記載の保存のための処理された尿試料。
  23. 前記キレート剤が、アミノポリカルボン酸である、請求項１に記載の保存のための処理された尿試料。
  24. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項２３に記載の保存のための処理された尿試料。
  25. 前記ＥＤＴＡが、約１～２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項２４に記載の保存のための処理された尿試料。
  26. 前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項１６に記載の保存のための処理された尿試料。
  27. 前記陰イオン界面活性剤が、ドデシル水素スルファートの塩である、請求項２６に記載の保存のための処理された尿試料。
  28. 前記塩が、ナトリウム塩であり、前記陰イオン界面活性剤が、ドセシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項２６に記載の保存のための処理された尿試料。
  29. 前記ＳＤＳが、約０．５％～１．５％（ｍ／ｖ）の濃度を有する、請求項１６に記載の保存のための処理された尿試料。
  30. 前記処理された尿試料が、防腐剤、細胞固定剤、またはホルムアルデヒド消光剤を含有しない、請求項１６に記載の処理された尿試料。
  31. 保存のための処理された尿試料を生成するための方法であって、対象から収集された尿試料を、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と、または請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物と、混合することを含む、前記方法。
  32. 前記ｐＨ緩衝剤が、酢酸及び酢酸ナトリウムを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記処理された尿試料中の前記酢酸ナトリウムが、約０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡである、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記処理された尿試料中の前記ＥＤＴＡが、約１～２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記界面活性剤が、ＳＤＳである、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記処理された尿試料中の前記ＳＤＳが、約０．５％～１．５％（ｍ／ｖ）の濃度を有する、請求項３６に記載の方法。
  38. 対象から収集された尿試料を保存するための方法であって、前記対象から収集された前記尿試料を、ｐＨ緩衝剤、キレート剤、及び界面活性剤と混合して、保存の準備ができた尿試料を生成することを含む、前記方法。
  39. 前記ｐＨ緩衝剤、前記キレート剤、及び前記界面活性剤が、それらが前記対象から収集された前記尿試料と混合される前に、混合物で提供される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ｐＨ緩衝剤が、組成物のｐＨを、事前選択された範囲内に調整するように構成される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ｐＨ緩衝剤が、酢酸及び酢酸の塩を含む、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記酢酸の塩が、酢酸ナトリウムである、請求項４１に記載の方法。
  43. ｐＨの前記事前選択された範囲が、約５．０～６．５である、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記組成物の前記ｐＨが、約６．０である、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記保存の準備ができた尿試料中の前記酢酸ナトリウムが、約０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記キレート剤が、アミノポリカルボン酸である、請求項３８に記載の方法。
  47. 前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記保存の準備ができた尿試料中の前記ＥＤＴＡが、約１～２．５ｍｍｏｌ／Ｌの濃度を有する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項３８に記載の方法。
  50. 前記陰イオン界面活性剤が、ドデシル水素スルファートの塩である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記塩が、ナトリウム塩であり、前記陰イオン界面活性剤が、ドセシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記保存の準備ができた尿試料中の前記ＳＤＳが、約０．５％～１．５％（ｍ／ｖ）の濃度を有する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記保存の準備ができた尿試料が、防腐剤、細胞固定剤、またはホルムアルデヒド消光剤を含有しない、請求項３８に記載の方法。
  54. 前記対象から収集された前記尿試料が、前記対象の細胞及び少なくとも１つのウイルス病原体を含有し、前記細胞及び前記ウイルス病原体の両方が、前記尿試料が保存の準備ができた後に溶解される、請求項３８に記載の方法。
  55. 前記ウイルス病原体が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記保存の準備ができた尿試料を、４℃で保存することを含む、請求項３８に記載の方法。
  57. 前記保存の準備ができた尿試料を、室温で保存することを含む、請求項３８に記載の方法。
  58. 前記尿試料中のＤＮＡ含有量が、１５日～３０日の保存期間後に安定している、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記尿試料中のＤＮＡ含有量が、１週間～２週間の保存期間後に安定している、請求項５７に記載の方法。
  60. 対象から収集された尿試料中の１つ以上の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、前記方法が、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の処理された尿試料を使用することを含む、前記方法。
  61. 前記分析物が、ウイルスである、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記ウイルスが、ＨＰＶである、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記分析物の前記検出が、前記ウイルスのＤＮＡを検出することを含む、請求項６１に記載の方法。
  64. 対象の尿試料からＤＮＡを抽出するためのキットであって、前記キットが、溶解溶液、磁性ナノ粒子、プロテアーゼ、第１の洗浄緩衝剤、第２の洗浄緩衝剤、溶出緩衝剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記キット。
  65. 前記溶解溶液が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６４に記載のキット。
  66. 前記グアニジウムイソチオシアネートが、約２～６Ｍの濃度を有するか、前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が、約１～５％の濃度を有するか、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約２０～５０ｍＭの濃度を有するか、前記溶解溶液が、約６．５のｐＨを有するか、前記ＥＤＴＡが、約１０～５０ｍＭの濃度を有するか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６５に記載のキット。
  67. 前記溶解溶液が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、及びＥＤＴＡを含む、請求項６６に記載のキット。
  68. 前記溶解溶液が、イソプロパノールをさらに含む、請求項６６に記載のキット。
  69. イソプロパノールの用量が、約５０％～２００％（ｖ／ｖ）である、請求項６８に記載のキット。
  70. 前記グアニジウムイソチオシアネートが、約１～２Ｍの濃度を有するか、前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００が、約１～２％の濃度を有するか、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約５～１０ｍＭの濃度を有するか、前記溶解溶液が、約６～７のｐＨを有するか、前記ＥＤＴＡが、約３～５ｍＭの濃度を有するか、前記イソプロパノールが、前記溶解溶液の約５０％～８０％の体積を有するか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６９に記載のキット。
  71. 前記磁性ナノ粒子が、内側コア層及び外側シェル層を有し、前記内側コア層が、コアシェル型磁性ナノ粒子で構成され、前記外側シェル層が、ＳｉＯ２で構成される、請求項６４に記載のキット。
  72. 前記磁性ナノ粒子が、約１００～１０００ｎｍの直径、及び約５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項７１に記載のキット。
  73. 前記磁性ナノ粒子が、約１０～２０μＬの体積を有する、請求項７２に記載のキット。
  74. 前記第１の洗浄緩衝剤が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びエタノールを含む、請求項６４に記載のキット。
  75. 前記グアニジウムイソチオシアネートが、約５０ｍＭの濃度を有する、請求項７４に記載のキット。
  76. 前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約２０～５０ｍＭの濃度を有する、請求項７４に記載のキット。
  77. 前記第１の洗浄緩衝剤が、約５．０のｐＨを有する、請求項７６に記載のキット。
  78. 前記ＮａＣｌが、約５０～２００ｍＭの濃度を有する、請求項７４に記載のキット。
  79. 前記エタノールが、約４０％～６０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する、請求項７４に記載のキット。
  80. 前記第２の洗浄緩衝剤が、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及びエタノールを含む、請求項６４に記載のキット。
  81. 前記第２の洗浄緩衝剤中の前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約１０～５０ｍＭの濃度を有し、前記第２の洗浄緩衝剤が、約６．０のｐＨを有する、請求項８０に記載のキット。
  82. 前記エタノールが、約７０％～８０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する、請求項８０に記載のキット。
  83. 前記溶出緩衝剤が、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝剤である、請求項６４に記載のキット。
  84. 前記プロテアーゼが、プロテアーゼＫである、請求項６４に記載のキット。
  85. 前記プロテアーゼＫが、約１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項８４に記載のキット。
  86. 前記プロテアーゼＫが、約２．５～２５μｇの用量を有する、請求項８５に記載のキット。
  87. 対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法であって、請求項６４～８６のいずれか一項に記載のキットを使用することを含む、前記方法。
  88. 対象の尿試料からＤＮＡを抽出するための方法であって、
    （１）前記尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、
    （２）ステップ（１）で得られた前記前処理された尿試料を、溶解溶液に溶解して、溶解した尿試料を生成することと、
    （３）ステップ（２）で得られた前記磁性ナノ粒子を、第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、
    （４）ステップ（３）で得られた前記磁性ナノ粒子を、第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、
    （５）ステップ（４）で得られた前記尿試料中の前記磁性ナノ粒子を収集することと、
    （６）ステップ（５）で得られた前記収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを溶出緩衝剤で洗い流して、抽出されたＤＮＡを得ることと、を含む、前記方法。
  89. 前記溶解溶液が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、及びイソプロパノールを含み、
    前記グアニジウムイソチオシアネートが、約１～２Ｍの濃度を有し、
    前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００が、約１～２％の濃度を有し、
    前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約５～１０ｍＭの濃度を有し、前記溶解溶液が、約６～７のｐＨを有し、
    前記ＥＤＴＡが、約３～５ｍＭの濃度を有し、
    かつ
    前記イソプロパノールが、前記溶解溶液の約５０％～８０％（ｖ／ｖ）の体積を有する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記磁性ナノ粒子が、内側コア層及び外側シェル層を有し、前記内側コア層が、コアシェル型磁性ナノ粒子で構成され、前記外側シェル層が、ＳｉＯ２で構成され、前記磁性ナノ粒子が、１００～１０００ｎｍの直径、及び約５０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項８８に記載の方法。
  91. 前記第１の洗浄緩衝剤が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びエタノールを含み、
    前記グアニジウムイソチオシアネートが、約５０～１００ｍＭの濃度を有し、
    前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約２０～５０ｍＭの濃度を有し、前記第１の洗浄緩衝剤が、約５．０のｐＨを有し、
    前記ＮａＣｌが、約５０～２００ｍＭの濃度を有し、
    前記エタノールが、約４０％～６０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する、請求項８８に記載の方法。
  92. 前記第２の洗浄緩衝剤が、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及びエタノールを含み、
    前記第２の洗浄緩衝剤中の前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約１０～５０ｍＭの濃度を有し、
    前記第２の洗浄緩衝剤が、約６．０のｐＨを有し、かつ
    前記エタノールが、約７０％～８０％（ｖ／ｖ）の濃度を有する、請求項８８に記載の方法。
  93. 前記溶出緩衝剤が、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝剤である、請求項８８に記載の方法。
  94. 前記プロテアーゼが、プロテアーゼＫであり、前記プロテアーゼＫが、約１０～２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項８８に記載の方法。
  95. ステップ（１）が、
    （ａ）前記尿試料を、前記磁性ナノ粒子と接触させて、混合物を形成することと、
    （ｂ）前記混合物を遠心分離するか、または磁性分離デバイスを利用して、沈殿物及び上清を生成することと、
    （ｃ）前記沈殿物を前記プロテアーゼと接触させて、反応系を生成することと、
    （ｄ）前記反応系を、好適な条件下で事前に決定された時間加熱することと、を含む、請求項８８に記載の方法。
  96. ステップ（３）、（４）、及び／または（６）が、磁性フレームまたは自動核酸抽出機器を使用することを含む、請求項８８に記載の方法。
  97. 対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、前記方法が、請求項８５または８６に記載のキットを使用して、前記尿試料から抽出されたＤＮＡを使用することを含む、前記方法。
  98. 前記分析物が、ウイルスである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ウイルスが、ＨＰＶである、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記分析物の前記検出が、前記ウイルスのＤＮＡを検出することを含む、請求項９８に記載の方法。
  101. 対象から収集された尿試料中の分析物の存在または不在を検出するための方法であって、前記方法が、
    （１）請求項１６～３０のいずれか一項に記載の処理された尿試料を使用すること、ならびに
    （２）前記処理された尿試料からＤＮＡを抽出することであって、
    （ａ）前記尿試料を磁性ナノ粒子及びプロテアーゼと接触させて、前処理された尿試料を生成することと、
    （ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記前処理された尿試料を、溶解溶液に溶解して、溶解した尿試料を生成することと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記磁性ナノ粒子を、第１の洗浄緩衝剤で洗浄することと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）で得られた前記磁性ナノ粒子を、第２の洗浄緩衝剤で洗浄することと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）で得られた前記尿試料中の前記磁性ナノ粒子を収集することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）で得られた前記収集された磁性ナノ粒子からＤＮＡを溶出緩衝剤で洗い流して、抽出ＤＮＡを得ることと、を含む、前記抽出することを含む、前記方法。
  102. 前記溶解溶液が、グアニジウムイソチオシアネート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、及びイソプロパノールを含み、
    前記グアニジウムイソチオシアネートが、約１～２Ｍの濃度を有し、
    前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００が、約１～２％の濃度を有し、
    前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌが、約５～１０ｍＭの濃度を有し、前記溶解溶液が、約６～７のｐＨを有し、
    前記ＥＤＴＡが、約３～５ｍＭの濃度を有し、
    かつ
    前記イソプロパノールが、前記溶解溶液の約５０％～８０％（ｖ／ｖ）の体積を有する、請求項１０１に記載の方法。
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