CN114959111A - 用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法，该试剂或试剂盒包括引物探针组，该引物探针组针对VP2基因，包括上游引物FPVF、下游引物FPVR以及探针FPVP，所述FPVF、FPVR和FPVP的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。该试剂或试剂盒还包括PCR反应液和核酸释放剂，并基于特定的反应程序条件实现快速荧光PCR扩增。通过该方案，在保证检测精确度的前提下，能够简化检测流程及检测时间，显著提高检测效率。
Description
技术领域
本申请涉及一种用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
猫瘟热病毒(FelinePanleukopeniaVirus，FPV)又称猫泛白细胞减少症是由猫细小病毒引起的一种急性高度接触性传染病，该病毒属于细小病毒。细小病毒是直径18至28纳米的单链DNA，属于最小的病毒。FPV可感染所有猫科动物，甚至浣熊、狐狸与貂。FPV多发于1岁以下的幼猫，以3～5个月龄未接种疫苗的幼猫最易感，感染率可达70％，病死率为50％～60％，成年猫感染后通常呈隐性，一般在经历各种应激情况、免疫力低下或者感染其他细菌或寄生虫时，会转变为显性感染。FPV会引起猫出现高热、呕吐、腹泻、厌食、共济失调以及全身性白细胞数量锐减。本病通过直接接触及间接接触而传播，患病的猫为本病的主要传染源，病猫的呕吐物尿液、唾液、鼻和眼分泌物尤其是粪便中含有大量的病毒。所以一旦猫群中出现发病病例，极难彻底清除。
目前医院的检验方式除血液生化学等检测外，还会对病原体进行检测，如胶体金免疫层析法、荧光免疫层析等，此类方法均利用抗原抗体反应检测猫瘟病毒抗原，但是免疫反应的灵敏度有限，漏检率高，经常出现假阴性，因此医生还会对胶体金阴性的疑似病例进行核酸检测而确诊，无形中增加时间及资金成本。目前核酸检测的方法也很多，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、恒温扩增反应等，其中PCR以其出色的灵敏度及特异性成为检测猫瘟病毒最理想的方法。但是传统的检测方案中，核酸的提取一般采用磁珠法或柱提法，再加上核酸扩增时间，整个流程在1.5-2h之间，耗时耗力，成本较高；且由于宠物医院检验人员并未进行过专业的PCR知识及技能的培训，因此此类方案并不被终端认可和接受。而恒温扩增方式检测，如重组酶聚合酶链反应(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)或者环介导的等温扩增反应(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术，检测时间短，但是灵敏度及特异性均不及PCR，且成本较高，终端用户不能接受。
因此建立一种低成本、快速、准确、操作简单的检测猫瘟病毒的方法尤为重要，可为临床诊断和治疗提供技术支持。
发明内容
本申请的目的在于提供一种用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法，能够简化检测流程及检测时间，显著提高检测效率。
第一方面，本申请提供一种用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒，其包括引物探针组，上述引物探针组针对VP2基因，包括上游引物FPVF、下游引物FPVR以及探针FPVP，上述FPVF、FPVR和FPVP的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
通过本申请实施例的技术方案，上述试剂或试剂盒能有效扩增VP2基因，并且，上下游引物与探针之间不存在二级结构引起的非特异性扩增。同时，本申请实施例的实验数据表明，该引物探针组具有较高灵敏度，可达20copies/反应；且特异性强，与常见的猫类传染病病原物无交叉。
在一些可能的实施方式中，还包括用于检测猫管家基因的管家基因引物探针组，上述管家基因引物探针组包括上游引物IF、下游引物IR以及探针IP，上述IF、IR和IP的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
通过本申请实施例的技术方案，除检测猫瘟病毒核酸外，同时还检测猫的管家基因核酸，用来监测采样及扩增过程，防止假阴性的出现，从而保证试剂或试剂盒的检测精确度。
在一些可能的实施方式中，上述引物FPVP和IP的5’端标记有荧光基团，上述引物FPVP和IP的3’端标记有淬灭基团；上述FPVP和IP分别标记不同的荧光基团。
在一些可能的实施方式中，上述荧光基团选自HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC中的至少一种；和/或，上述淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY4中的至少一种。
在一些可能的实施方式中，上述试剂或试剂盒用于快速荧光PCR反应程序，其中，PCR反应液包括10-200mM Tris-HCL、10-70mM KCl、1-6mM MgCl2、0.2-0.6mM dNTPs、0.5-4UDNA聚合酶、0.1-0.8μM FPVF、0.1-0.8μM FPVR、0.1-0.8μM FPVP、0.01-0.8μM IF、0.01-0.8μM IR、0.01-0.8μM IP以及双蒸水。反应程序为：
预变性反应：92-98℃反应1-5min；
扩增反应：92-98℃1-15s，55-60℃5s-25s，30-45cycles。
在一些可能的实施方式中，还包括核酸释放剂，上述核酸释放剂包括10-500mMHEPES，1-100mM氯化钾,5-50mM氨基三乙酸，0.1-3.5mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01-1M氢氧化钠或氢氧化钾，1-50mM三聚磷酸钠、0.2-30mM十二烷基苯磺酸钠，1-50mM乙二胺四乙酸二钠溶液。
通过本申请实施例的技术方案，采用上述核酸释放剂可以消除待测样本中的PCR抑制物并释放核酸，无需再采用传统的磁珠法或柱提法来提取核酸。并且，本申请实施例的实验数据表明，该核酸释放剂可以长时间保持待测样本中核酸的稳定性，从而作为样本保存液使用。
第二方面，本申请提供一种上述引物组或上述的试剂或试剂盒在制备检测猫瘟病毒的产品中的应用。
通过本申请实施例的技术方案，上述检测猫瘟并督的产品成本低廉，通量高，应用场景多。
第三方面，本申请提供一种不以疾病诊断治疗为目的的猫瘟病毒的检测方法，其采用上述的试剂或试剂盒对待测样本进行快速荧光PCR扩增，再对扩增产物进行检测判断。
通过本申请实施例的技术方案，上述试剂或试剂盒可以应用在快速荧光PCR反应中，例如便携式的荧光定量PCR仪。上述试剂或试剂盒结合可便携式的荧光定量PCR仪，可直接在采样现场进行检测，且能在短时间内完成高通量的样本测试(在不影响检测灵敏度的情况下将检测时间由传统的1.5h缩短至30min以内)，不仅能应用于医院的常规检测，还可用于宠物出入境的检测、流浪动物疾病的筛查、宠物赛事前的筛查等，具有广泛的应用前景。
在一些可能的实施方式中，在对上述待测样本进行快速荧光PCR扩增前，还包括将上述待测样本置于核酸释放剂中，混匀静置；其中，上述核酸释放剂包括10-500mM HEPES，1-100mM氯化钾,5-50mM氨基三乙酸，0.1-3.5mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01-1M氢氧化钠或氢氧化钾，1-50mM三聚磷酸钠、0.2-30mM十二烷基苯磺酸钠，1-50mM乙二胺四乙酸二钠溶液。
通过本申请实施例的技术方案，将核酸释放剂与快速荧光PCR反应程序结合起来，由于无需采用传统的磁珠法或柱提法来提取核酸，从取样到结果完成，只需操作人员进行取样及加样两步操作，全程30-35min左右。并且，整个反应过程无需专业培训，操作简单，准确度高，同时还对环境友好。
在一些可能的实施方式中，上述检测判断的标准为：如果FPV通道有明显扩增曲线，则判定为阳性；如果FPV通道没有扩增曲线则判定为阴性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本申请实施例提供的引物探针组的线性扩增图；
图2为本申请实施例提供的灵敏度检测的扩增曲线；
图3为本申请实施例提供的临床实施例1-13的PCR扩增图；
图4为本申请实施例提供的临床对比例1-13的PCR扩增图；
图5为本申请实施例提供的临床实施例14和临床对比例14的PCR扩增图，其中，1表示临床实施例14；2表示临床对比例14；
图6为本申请实施例提供的临床样本稳定性测试对比PCR扩增图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是：本申请中，“精确度”是指测量或计算的数量(测试报告值)与其实际(或真实)值的符合程度。临床精确度是指真实输出(真阳性(TP)或真阴性(TN)与误分类输出(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例，并且除了别的测量以外，可以表述为灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)、Matheus相关系数(MCC)，或似然度、让步比、接受者操作特性(ROC)曲线、曲线下面积(AUC)。
对于本申请的诊断性(或预后性)干预，由于各输出(其在疾病分类诊断测试中可能为TP、FP、TN、或FN)承担不同成本，健康经济效用函数可能基于临床情况和个体输出成本和值，优选倾向灵敏度超过特异性，或PPV超过NPV，因此提供健康经济性能和值的另一个测量，该测量可能不同于更直接临床或分析性能测量。这些不同测量和相对折衷一般将仅在具有零误差率的完美测试(也称零预测对象输出误分类或FP和FN)的情况下会聚，所有性能测量将倾向不完美，但程度不同。
“测量”、“测定”、“检测”或“检查”是指评价临床中给定物质或者对象衍生样品(包含这种物质的定性或定量浓度水平的衍生)的存在、不存在、数量或量(其能是有效量)，或另外评估对象的非分析物临床参数或临床-决定因素的值或分类。
本申请上下文中的“样本”是从对象中分离的生物样品，并且能包括，例如但不限于，全血、血清、血浆、口水、黏液、呼吸的空气、尿液、CSF、唾液、汗、粪便、毛发、精液、活检物、鼻液溢、组织活检物、细胞学样品、血小板、网状细胞、白细胞、上皮细胞、或全血细胞。
本申请上下文中的数据均满足统计学要求(统计学显著)，所谓“统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期(可以是“假阳性”)。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限值在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。p值是0.05或更小时，通常认为结果显著性高。
需要说明的是，以下实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
实施例一 引物探针组、试剂、试剂盒的形成
本实施例针对犬细小病毒VP2基因设计了多组引物，经一系列创造性劳动后，筛选获得如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示检测引物和探针，该引物探针组能有效扩增VP2基因，并且，上下游引物与探针之间不存在二级结构引起的非特异性扩增。具体为：
FPVF：5’-cattgggcttaccaccattt-3’
FPVR：5’-tatcttgttgaactcctatat-3’
FPVP：5’-caaacaaatagagcattgggcttaccac-3’。
其中，FPVP引物的5’端标记荧光基团，3’端标价淬灭基团，荧光基团可为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、TEXAS RED、NED、ALEXA FLOUR或VIC中的至少一种，淬灭基团可为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY4中的至少一种。
本实施例还基于上述引物探针组来制备试剂和试剂盒。
试剂和试剂盒中还包括用于检测猫管家基因的管家基因引物探针组，上述管家基因引物探针组包括如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的上游引物IF、下游引物IR以及探针IP，具体为：
IF：5’-tcctgaccctcaagtacc-3’
IR：5’-cgcgcagctcgttgtaga-3’
IP：5’-agaagatctggcaccacacct-3’。
其中，IP引物的5’端标记荧光基团，3’端标价淬灭基团，荧光基团可为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、TEXAS RED、NED、ALEXA FLOUR或VIC中的至少一种，淬灭基团可为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY4中的至少一种。并且，IP与FPVP引物分别标记不同的荧光基团来区分被检物。
试剂和试剂盒中还包括核酸释放剂，上述核酸释放剂包括10-500mM HEPES，1-100mM氯化钾,5-50mM氨基三乙酸，0.1-3.5mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01-1M氢氧化钠或氢氧化钾，1-50mM三聚磷酸钠、0.2-30mM十二烷基苯磺酸钠，1-50mM乙二胺四乙酸二钠溶液。
试剂盒中还包括PCR反应液、阳性质控以及阴性质控，其中，PCR反应液包括10-200mM Tris-HCL、10-70mM KCl、1-6mM MgCl2、0.2-0.6mM dNTPs、0.5-4U DNA聚合酶、0.1-0.8μM FPVF、0.1-0.8μM FPVR、0.1-0.8μM FPVP、0.01-0.8μM IF、0.01-0.8μM IR、0.01-0.8μM IP以及双蒸水；通过将VP2基因克隆至pUC57载体中，构建成本实施例的阳性质控；阴性质控可为生理盐水。
作为本实施例的一个方案，FPVP引物的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，IP引物的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基因；诚然，在其他实施例中，FPVP和IP的荧光基团和淬灭基团可以根据实际需要进行选择，但需满足IP与FPVP引物分别标记不同的荧光基团。
实施例二 快速PCR扩增反应程序优化
本实施例采用实施例一中的试剂盒，使用Qubit仪器对阳性质粒进行定量，由106copies/μL倍比稀释至20copies/μL，取2μL 20copies/μL的阳性质粒加入到猫瘟反应液中，猫瘟反应液包括1.2μL 1M Tris-HCL，1μL 1M KCl，1.2μL 50mM MgCl2，0.6μL 10mMdNTPs，0.3μL DNA聚合酶，0.4μL 10μM FPVF、0.4μL 10μM FPVR、0.4μL 10μM FPVP、0.2μL10μM IF、0.2μL 10μM IR、0.2μL 10μM IP、双蒸水补足至18μL。
使用表1中的4个程序进行扩增检测，每个程序重复10次检测。结果见表2，结果均为阳性，且CT值的cv值≤5％，说明不同扩增程序，时间从20分钟到40分钟均能很好的扩增出目的序列。
表1 PCR反应程序条件
表2不同PCR反应条件下的结果
| 序号 | 程序1 | 程序2 | 程序3 | 程序4 |
| 1 | 34.41 | 36.97 | 37.85 | 34.99 |
| 2 | 39.47 | 35.89 | 33.73 | 36.21 |
| 3 | 34.57 | 36.77 | 35.26 | 36.17 |
| 4 | 36.04 | 35.23 | 36.23 | 37.08 |
| 5 | 34.8 | 35.16 | 35.25 | 36.28 |
| 6 | 35.64 | 36.11 | 35.66 | 35.01 |
| 7 | 34.95 | 35.72 | 35.97 | 34.44 |
| 8 | 36.82 | 35.17 | 37.13 | 37.34 |
| 9 | 34.33 | 36.04 | 35.03 | 35.44 |
| 10 | 37.5 | 35.54 | 34.72 | 36.3 |
| 平均值 | 35.85 | 35.86 | 35.68 | 35.93 |
| cv值 | 4.63 | 1.77 | 3.33 | 2.61 |
基于上述情况，后续实施例均以程序2作为扩增反应条件。
实施例三 线性检测
本实施例采用实施例一中的试剂盒，以阳性质粒为模板，由106copies/μL倍比稀释至10copies/μL，取2μL 10copies/μL质粒加入到PCR反应液中，PCR反应液包括1.2μL 1MTris-HCL，1μL 1M KCl，1.2μL 50mM MgCl2，0.6μL 10mM dNTPs，0.3μL DNA聚合酶，0.4μL10μM FPVF、0.4μL 10μM FPVR、0.4μL 10μM FPVP、0.2μL 10μM IF、0.2μL 10μM IR、0.2μL10μM IP、双蒸水11.9μL。随后上机检测，反应程序为：预变性：95℃2min；扩增反应：95℃5s，55℃15s，45cycles。结果如图1所示，由图可知，该试剂盒中的引物探针组的线性范围为106copies/μL至10copies/μL。
实施例四 灵敏度检测
本实施例采用实施例一中的试剂盒，将定量过的阳性质粒用TE缓冲液倍比稀释至10copies/μL，然后按照实施例三中的PCR反应液配方及程序重复20次检测，结果均为阳性，结果如图2所示，由图可知，本实施例的试剂盒和方法灵敏度可达20copies/反应。
实施例五 临床样本检测
本实施例中，临床实施例采用实施例一中的试剂或试剂盒，并结合快速荧光PCR进行检测，其方法流程如下：
(1)将临床样本置于核酸释放液中，颠倒混匀；
(2)取混匀后的核酸释放液直接加入到PCR反应液管中，进行快速荧光PCR检测，最终根据CT值对结果进行判断。
可选的，本实施例中采用的为可便携式的荧光定量PCR仪，可直接在采样现场进行检测，且能在短时间内完成高通量的样本测试，不仅能应用于医院的常规检测，还可用于宠物出入境的检测、流浪动物疾病的筛查、宠物赛事前的筛查等。特别的，市面上的产品为解决运输保存问题常以冻干型方式提供反应液，终端使用时需增加一步复溶，操作步骤增多，对于宠物医院工作人员来说，并未进行专业的PCR培训，无形中会增加污染及操作失误的可能。
具体的：
肛拭子样本
从宠物医院收集到13例猫瘟病毒阳性样本的肛拭子，每例样本各两个肛拭子。
临床实施例(1-13)
采用一步释放法，各取13例样本其中的1个肛拭子直接插入到1mL释放液中，所述1mL释放液组分包括10mM HEPES，50mM氯化钾,5Mm氨基三乙酸，0.2mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01M氢氧化钠，1mM三聚磷酸钠、0.2mM十二烷基苯磺酸钠和50mM乙二胺四乙酸二钠溶液，上下颠倒混匀，使拭子上的病毒脱落到释放液中，室温静置5min后，取2μL加入到猫瘟反应液中，上机检测，结果如图3所示。
临床对比例(1-13)
采用磁珠提取法，各取13例样本中的另外1个肛拭子插入到500μL生理盐水中，颠倒混匀后，各取50μL用磁珠法进行提取，50μL双蒸水洗脱后，取2μL加入到猫瘟反应液中，上机检测，结果如图4所示。
粪便样本
临床实施例(14)
取一例猫瘟阳性的猫粪便，用牙签挑取黄豆粒大小的粪便加入到1mL释放液中，震荡混匀后，室温静置5min，5000rpm离心5min，使粪渣离心至管底，取2μL上清液直接加入到猫瘟反应液中，上机检测，结果如图5所示，其中1表示临床实施例的数据。
临床对比例(14)
同样取临床实施例14中同一只猫瘟阳性的猫粪便，用牙签挑取黄豆粒大小的粪便加入到1mL生理盐水中，震荡混匀后，室温静置5min，5000rpm离心5min，使粪渣离心至管底，取50μL上清液用磁珠法提取，50μL双蒸水洗脱，取2μL洗脱产物加入到猫瘟反应液中，上机检测，结果如图5，其中2表示对比例的数据。
上述实施例及对比例中，猫瘟反应液组分为1.2μL 1M Tris-HCL，1μL 1M KCl，1.2μL 50mM MgCl2，0.6μL 10mM dNTPs，0.3μL DNA聚合酶，0.4μL 10μM FPVF、0.4μL 10μMFPVR、0.4μL 10μM FPVP、0.2μL 10μM IF、0.2μL 10μM IR、0.2μL 10μM IP、双蒸水11.9μL。
上述临床实施例及临床对比例中，PCR反应程序为95℃2min；95℃5s，55℃15s，45cycles。根据CT值判断结果阴阳性，临床实施例1-14和临床对比例1-14的CT值见表3：
表3临床数据
由表3中的数据可知，临床实施例与对比例均能检测出猫瘟热阳性样本，一致率100％，且两者CT值接近，甚至临床实施例结果优于对比例。而在粪便及肛拭子样本中，抑制物较多，会抑制PCR反应，因此市面上通常需要采用磁珠法或柱提法对样本进行纯化提取，操作费时费力，成本高，不被终端喜欢，且不利于大规模的筛查。本实施例的结果说明，通过采用核酸释放剂处理样本，与磁珠法在粪便及肛拭子样本提取方面效果相当。
针对上述的临床样本，发明人发现，临床实施例全程检测时间为30-35min，临床对比例全程检测时间在1.5h左右。
针对上述的临床样本，发明人除了采用示出的核酸释放剂的成分比例外，在其他未示出的实施例中采用了不同成分比例的核酸释放剂，均能起到相应效果。
实施例六 特异性实验
从宠物医院收集猫杯状、猫疱疹、猫支原体、猫衣原体、猫冠状病毒阳性样本，将收集到的拭子样本插入到本申请的释放液中，颠倒混匀后，室温放置5min后，取2μL加入到猫瘟反应液中，猫瘟反应液包括1.2μL 1M Tris-HCL，1μL1M KCl，1.2μL 50mM MgCl2，0.6μL10mM dNTPs，0.3μL DNA聚合酶，0.4μL10μM FPVF、0.4μL 10μM FPVR、0.4μL 10μM FPVP、0.2μL 10μM IF、0.2μL 10μM IR、0.2μL 10μM IP、双蒸水补足至18μL。PCR反应程序为：预变性95℃2min；扩增反应95℃5s，55℃15s，45cycles。
检测结果显示：FPV通道均为阴性，说明采样及扩增过程均没有问题，说明本申请所设计的引物探针组与猫杯状、猫疱疹、猫支原体、猫衣原体、猫冠状病毒均没有交叉反应，具有优异的特异性。
实施例七 样本保存稳定性
将实施例五中的14例样本放入到释放液后，2-8℃放置1个月后，再次取2μL上清液加入到猫瘟反应液中，反应液配方与PCR扩增程序均与实施例二中的一致，比较前后两者CT值的差异，结果如图6所示，对照组和2-8℃放置1个月后的CT值比较见表4。
表4稳定性实验对照数据
| 对照 | 放置1个月 | |
| 样本1 | 33.35 | 33.55 |
| 样本2 | 33.52 | 32.99 |
| 样本3 | 34.88 | 34.41 |
| 样本4 | 35.59 | 34.46 |
| 样本5 | 36.71 | 37.42 |
| 样本6 | 30.67 | 32.78 |
| 样本7 | 33.55 | 35.71 |
| 样本8 | 13.57 | 14.03 |
| 样本9 | 8.66 | 8.67 |
| 样本10 | 31.56 | 32.46 |
| 样本11 | 18.23 | 18.31 |
| 样本12 | 29.77 | 29.87 |
| 样本13 | 28.38 | 29.03 |
| 样本14 | 34.61 | 34.92 |
由表中数据可以看出，放置于本申请中的核酸释放剂中的肛拭子及粪便样在冰箱冷藏层中放置1个月后，CT值及信号值差异变化均不明显，说明本核酸释放剂可保护核酸不被降解，可作为样本保存液长期保存样本。
以上实施例虽然仅针对猫样本进行检测，但是不排除本申请的方法及方案可应用于动物或人任何一种病原物的检测，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例。
应理解，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示存在三种关系，例如，A和/或B，表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况，其中A，B是单数或者复数。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系，但也可能表示的是一种“和/或”的关系，具体可参考前后文进行理解。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一个”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单个或复数个的任意组合。例如，a，b，或c中的至少一个，表示：a，b，c，a-b，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c是单个或者多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 英科新创（苏州）生物科技有限公司
<120> 用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒、其应用及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cattgggctt accaccattt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcttgttg aactcctata t 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaacaaata gagcattggg cttaccac 28
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctgaccct caagtacc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcgcagctc gttgtaga 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agaagatctg gcaccacacc t 21
Claims (10)
1.一种用于快速检测猫瘟病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，包括引物探针组，所述引物探针组针对VP2基因，包括上游引物FPVF、下游引物FPVR以及探针FPVP，所述FPVF、FPVR和FPVP的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括用于检测猫管家基因的管家基因引物探针组，所述管家基因引物探针组包括上游引物IF、下游引物IR以及探针IP，所述IF、IR和IP的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
3.如权利要求2所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述引物FPVP和IP的5’端标记有荧光基团，所述引物FPVP和IP的3’端标记有淬灭基团；所述FPVP和IP分别标记不同的荧光基团。
4.如权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC中的至少一种；和/或，所述淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY4中的至少一种。
5.如权利要求1至4中任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，还包括核酸释放剂，所述核酸释放剂包括10-500mM HEPES，1-100mM氯化钾,5-50mM氨基三乙酸，0.1-3.5mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01-1M氢氧化钠或氢氧化钾，1-50mM三聚磷酸钠、0.2-30mM十二烷基苯磺酸钠，1-50mM乙二胺四乙酸二钠溶液。
6.权利要求1至5中任一项所述的试剂或试剂盒在制备检测猫瘟病毒的产品中的应用。
7.一种不以疾病诊断治疗为目的的猫瘟病毒的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1至5中任一项所述的试剂或试剂盒对待测样本进行快速荧光PCR扩增，再对扩增产物进行检测判断。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，在对所述待测样本进行快速荧光PCR扩增前，还包括将所述待测样本置于核酸释放剂中，混匀静置；其中，所述核酸释放剂包括10-500mM HEPES，1-100mM氯化钾,5-50mM氨基三乙酸，0.1-3.5mM 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，0.01-1M氢氧化钠或氢氧化钾，1-50mM三聚磷酸钠、0.2-30mM十二烷基苯磺酸钠，1-50mM乙二胺四乙酸二钠溶液。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述快速荧光PCR扩增的反应程序条件为：预变性反应：92-98℃反应1-5min；扩增反应：92-98℃ 1-15s，55-60℃ 5s-25s，30-45cycles。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测判断的标准为：如果FPV通道有明显扩增曲线，则判定为阳性；如果FPV通道没有扩增曲线则判定为阴性。
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