KR20210111250A - 소변 샘플 저장 및 dna 추출을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20210111250A
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양 우
강 리우
닝 루
이요우 첸
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항저우 뉴 호리즌 헬스 테크놀로지 코. 엘티디.
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Abstract

본 개시내용은 생물학적 샘플, 예컨대, 소변 샘플을 저장하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 게다가, 생물학적 샘플, 예컨대, 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

소변 샘플 저장 및 DNA 추출을 위한 조성물 및 방법
교차-참조
본 출원은 2019년 1월 3일에 제출된 PCT 출원 번호 PCT/CN2019/070276의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
발명의 분야
본 개시내용은 소변 샘플 저장 및 소변 샘플로부터 DNA 추출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
편리하고 간단한 생물학적 샘플의 타입으로서, 소변 샘플은 분자 진단 및 질환 모니터링 및 치료의 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 현재 임상 실시에서, 소변 샘플의 저장은 대부분 저온 환경에 의존하며, 이는 추가적인 장비를 필요로 하고, 또한 더 높은 비용으로 이어진다. 본 개시내용은 비교적 더 높은 온도, 예컨대, 실온에서 소변 샘플을 저장하기 위한 조성물 및 방법을 제공하여, 소변 샘플의 보존 및 수송을 용이하게 한다.
보통의 소변 DNA 추출 시약 및 방법은 2 개의 카테고리로 나눌 수 있다. 첫 번째는 소변에서 세포를 침전시키기 위해 원심분리하고, 세포 펠렛에서 DNA를 추출하는 것이다. 두 번째는 원심분리 후에 세포 침전물을 버리고, 상청액에서 유리 DNA를 추출하는 것이다. 본 개시내용은 더 높은 DNA 추출 효율로 이어지는, 소변에서 유리 DNA 및 세포성 DNA를 동시에 추출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
전통적인 DNA 추출 방법은 페놀 클로로포름 방법, 염석 방법, NaI 방법 및 실리카 고체상 담체 방법을 포함하나, 이들 모두는 복잡한 조작의 단점을 가지고 있으며, 자동 가공 또는 지연 부피의 샘플에 적합하지 않다. 반면에, 소변 샘플의 조성은 복잡하고, 보통의 DNA 추출 방법에 의해 소변 샘플로부터 추출된 DNA는 종종 다운스트림 PCR의 적용에 영향을 미칠 억제제를 함유한다. 따라서, 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 데 특히 적합한 개선된 DNA 추출 조성물 및 방법을 개발할 필요성이 남아 있다.
발명의 요약
본 개시내용은 대상체로부터 수득된 소변 샘플을 저장하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제를 포함하거나, 필수적으로 이를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, pH 완충액은 조성물의 pH를 미리선택된 범위 내로 조정하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 아세트산 및 아세트산의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미리선택된 pH의 범위는 약 5.0 내지 6.5이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 6.0이다.
일부 실시양태에서, 아세트산의 염은 소듐 아세테이트이다. 일부 실시양태에서, 소듐 아세테이트는 약 0.5 내지 1.0 mol/L, 예를 들어, 약 0.5-0.7 mol/L, 또는 약 0.6-0.7 mol/L의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 아미노폴리카복실산이다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다. 일부 실시양태에서, EDTA는 약 10 내지 20 mmol/L, 예를 들어, 약 15-20 mmol/L, 약 16-20 mmol/L 또는 약 16-18 mmol/L의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, 음이온성 계면활성제는 도데실 하이드로겐 설페이트의 염이다. 일부 실시양태에서, 염은 소듐 염이고, 음이온성 계면활성제는 소듐 도세실 설페이트 (SDS)이다. 일부 실시양태에서, SDS는 약 5 % 내지 10 % (m/v), 예를 들어, 약 5 %-8 %, 약 5 %-7 %, 약 6 %-8 %, 또는 약 6 %-7 %의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 보존제, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제를 함유하지 않는다.
본 개시내용은 또한 가공된 소변 샘플을 제공한다. 소변 샘플은 즉시 또는 저장 후 DNA 추출에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플은 대상체로부터 수집된 소변 샘플, pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 조성물의 pH를 미리선택된 범위 내로 조정하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 아세트산 및 아세트산의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세트산의 염은 소듐 아세테이트이다.
일부 실시양태에서, 미리선택된 pH의 범위는 약 5.0 내지 6.5이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 pH는 약 6.0이다. 일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플 중 소듐 아세테이트는 약 0.05 내지 0.1 mol/L, 예를 들어, 약 0.05-0.07 mol/L 또는 약 0.06-0.07 mol/L의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 아미노폴리카복실산이다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다. 일부 실시양태에서, EDTA는 약 1 내지 2.5 mmol/L, 예를 들어, 약 1.5-2 mmol/L, 약 1.6-2 mmol/L 또는 약 1.6-1.8 mmol/L의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, 음이온성 계면활성제는 도데실 하이드로겐 설페이트의 염이다. 일부 실시양태에서, 염은 소듐 염이고, 음이온성 계면활성제는 소듐 도세실 설페이트 (SDS)이다. 일부 실시양태에서, SDS는 약 0.5 % 내지 1.5 % (m/v), 예를 들어, 약 0.5 %-0.8 %, 약 0.5 %-0.7 %, 약 0.6 %-0.8 % 또는 약 0.6 %-0.7 %의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플은 방부제, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제를 함유하지 않는다.
본 개시내용은 저장을 위해 가공된 소변 샘플을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물과 혼합하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 저장하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제, 또는 본원에 기재된 본 개시내용의 조성물과 혼합하여 저장 준비가 된 소변 샘플을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제는 대상체로부터 수집된 소변 샘플, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물과 혼합되기 전에 혼합물로 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 수집된 소변 샘플은 대상체의 세포 및 하나 이상의 바이러스 병원체를 함유하고, 세포 및 바이러스 병원체 둘 모두는 소변 샘플이 저장 준비가 된 후에 용해된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 병원체는 인간 유두종바이러스 (HPV)이다. 일부 실시양태에서, 소정의 온도, 예컨대, 4 ℃, -20 ℃, -80 ℃ 또는 실온에서 저장 준비가 된 소변 샘플을 저장하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소변 샘플 중 DNA 함량은 15-일 내지 30-일 저장 시간 후에 안정하다. 일부 실시양태에서, 소변 샘플 중 DNA 함량은 1-주 내지 2-주 저장 시간 후에 안정하다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 하나 이상의 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 가공된 소변 샘플을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 바이러스 또는 바이러스로부터 유래된 임의의 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 HPV이다. 일부 실시양태에서, 분석물의 검출은 바이러스의 DNA를 검출하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 조성물의 컬렉션 및 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 키트는 용해 용액, 자성 나노입자, 프로테아제, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액, 용리 완충액 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 필수적으로 이를 포함하거나, 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X 100, Tris-HCl, EDTA, 이소프로판올 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 2 내지 6 M의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Triton X 100은 약 1 내지 5 %의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tris-HCl은 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖고, 여기서 용해 용액은 약 6.5의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, EDTA는 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 다른 모든 구성요소가 함께 혼합된 후에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 약 50 % 내지 200 % (v/v)의 투여량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 2 내지 6 M의 농도를 갖거나, Triton X-100은 약 1 내지 5 %의 농도를 갖거나, Tris-HCl은 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖거나, 용해 용액은 약 6.5의 pH를 갖거나, EDTA는 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖거나, 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 용해 용액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl 및 EDTA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 용액은 이소프로판올을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 용해 용액의 약 50 % 내지 200 % (v/v)의 투여량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 1 내지 2 M의 농도를 갖거나, Triton X-100은 약 1 내지 2 %의 농도를 갖거나, Tris-HCl은 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖거나, 용해 용액은 약 6-7의 pH를 갖거나, EDTA는 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖거나, 이소프로판올은 용해 용액의 약 50 % 내지 80 %의 부피를 갖거나, 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 1.67 M의 농도를 갖거나, Triton X-100은 약 1.33 %의 농도를 갖거나, Tris-HCl은 약 8.33 mM의 농도를 갖거나, 용해 용액은 약 6.5의 pH를 갖거나, EDTA는 약 3.33 mM의 농도를 갖거나, 이소프로판올은 용해 용액의 약 66.7 %의 부피를 갖거나, 이들의 임의의 조합이다.
일부 실시양태에서, 자성 나노입자는 내부 코어 층 및 외부 쉘 층을 갖는다. 일부 실시양태에서, 내부 코어 층은 코어-쉘 타입 자성 나노입자로 구성되며, 여기서 외부 쉘 층은 SiO2로 구성된다. 일부 실시양태에서, 자성 나노입자는 약 100 내지 1000 nm의 직경 및 약 50 mg/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 자성 나노입자는 약 10-20 μL, 예를 들어, 약 20 μL의 부피를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Tris-HCl, NaCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tris-HCl은 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, NaCl은 약 50 내지 200 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에탄올은 약 40 % 내지 60 % (v/v)의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 Tris-HCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액 중 Tri-HCl은 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖고, 제2 세척 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에탄올은 약 70 % 내지 80 % (v/v)의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는 Tris-EDTA 완충액이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 프로테아제 K이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 K는 약 10 내지 20 mg/ml의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 K는 약 2.5 내지 25 μg, 예를 들어, 약 25 μg의 투여량을 갖는다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같이 DNA 추출을 위한 키트 또는 조성물의 컬렉션을 사용하는 단계를 포함하는, 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 다음을 포함하거나, 본질적으로 이를 포함하거나, 이로 이루어진다: (1) 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계; (2) 단계 (1)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계; (3) 단계 (2)에서 수득된 소변 샘플로부터의 DNA를 함유하는 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; (4) 단계 (3)에서 수득된 소변 샘플로부터의 DNA를 함유하는 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; (5) 용리 완충액으로 단계 (4)에서 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출된 DNA를 수득하는 단계. 일부 실시양태에서, 용해 용액, 자성 나노입자, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액, 용리 완충액, 프로테아제는 본원의 본 개시내용에 기재된 것들이다.
일부 실시양태에서, DNA 추출 방법의 단계 (1)은 (a) 소변 샘플을 자성 나노입자와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계; (b) 혼합물을 원심분리하거나 자성 분리 장치를 활용하여 침전물 및 상청액을 형성하는 단계; (c) 침전물을 프로테아제와 접촉시켜 반응 시스템을 형성하는 단계; 및 (d) 소정의 시간 동안 적합한 조건 하에서 반응 시스템을 가열하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, DNA 추출 방법의 단계 (3), (4) 및/또는 (5)는 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 키트 또는 조성물의 컬렉션을 사용하여 소변 샘플로부터 추출된 DNA를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 바이러스, 예컨대, HPV이다. 일부 실시양태에서, 분석물의 검출은 바이러스의 DNA를 검출하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 가공된 소변 샘플을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 가공된 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계는 (a) 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계; (c) 단계 (b)에서 수득된 소변 샘플로부터의 DNA를 함유하는 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; (d) 단계 (c)에서 수득된 소변 샘플로부터의 DNA를 함유하는 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; (e) 용리 완충액으로 단계 (d)에서 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출된 DNA를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 용액, 자성 나노입자, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액, 용리 완충액, 프로테아제는 본원의 본 개시내용에 기재된 것들이다.
일부 실시양태에서, 대상체의 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법은 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재에 기반하여 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 키트를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 다음을 포함한다: (1) 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계; (2) 단계 (1)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계; (3) 단계 (2)에서 수득된 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; (4) 단계 (3)에서 수득된 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; (5) 단계 (4)에서 수득된 소변 샘플에서 자성 나노입자를 수집하는 단계; 및 (6) 용리 완충액으로 단계 (5)에서 수득된 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출된 DNA를 수득하는 단계.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl, EDTA 및 이소프로판올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 1 내지 2 M의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Triton X 100은 약 1 내지 2 %의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tris-HCl은 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용해 용액은 약 6-7의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, EDTA는 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 용해 용액의 약 50 % 내지 80 % (v/v)의 부피를 갖는다.
일부 실시양태에서, 자성 나노입자는 내부 코어 층 및 외부 쉘 층을 가지며, 여기서 내부 코어 층은 코어-쉘 타입 자성 나노입자로 구성되고, 외부 쉘 층은 SiO2로 구성되며, 자성 나노입자는 약 100 내지 1000 nm의 직경 및 약 50 mg/ml의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Tris-HCl, NaCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 50 내지 100 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tris-HCl은 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, NaCl은 약 50 내지 200 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에탄올은 약 40 % 내지 60 % (v/v)의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 Tris-HCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액 중 Tri-HCl은 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 에탄올은 약 70 % 내지 80 % (v/v)의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는 Tris-EDTA 완충액이다. 일부 실시양태에서,
일부 실시양태에서, 프로테아제는 프로테아제 K이고, 여기서 프로테아제 K는 약 10 내지 20 mg/ml의 농도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법의 단계 (1) ("소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계")은 다음을 포함한다: (a) 소변 샘플을 자성 나노입자와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계; (b) 혼합물을 원심분리하거나 자성 분리 장치를 활용하여 침전물 및 상청액을 형성하는 단계; (c) 침전물을 프로테아제와 접촉시켜 반응 시스템을 형성하는 단계; 및 (d) 소정의 시간 동안 적합한 조건 하에서 반응 시스템을 가열하는 단계.
일부 실시양태에서, 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법에서 자성 나노입자를 세척 및/또는 수집하는 단계는 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 키트를 사용하여 소변 샘플로부터 추출된 DNA를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석물은 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 HPV이다. 일부 실시양태에서, 분석물의 검출은 바이러스의 DNA를 검출하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 다음을 포함한다: (1) 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항의 가공된 소변 샘플을 사용하는 단계; 및 (2) 다음을 포함하는, 가공된 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계: (a) 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계; (c) 단계 (b)에서 수득된 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계; (e) 단계 (d)에서 수득된 소변 샘플에서 자성 나노입자를 수집하는 단계; 및 (f) 용리 완충액으로 단계 (e)에서 수득된 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출 DNA를 수득하는 단계.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl, EDTA 및 이소프로판올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 이소티오시아네이트는 약 1 내지 2 M의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Triton X 100은 약 1 내지 2 %의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Tris-HCl은 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용해 용액은 약 6-7의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, EDTA는 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 용해 용액의 약 50 % 내지 80 % (v/v)의 부피를 갖는다.
도 1은 본 개시내용의 저장 시약에 의해 가공되거나 가공되지 않은 소변 샘플에서 β-액틴 유전자의 형광 정량적 PCR 증폭 곡선을 묘사한다.
도 2는 소변 샘플이 소변 저장 시약과 혼합된 후에 0-4 주 동안 4 ℃에서 소변 저장 시약에 의해 가공된 소변 샘플에서 β-액틴 내부 표준물질의 변화를 묘사한다.
도 3은 소변 샘플이 소변 저장 시약과 혼합된 후에 0-4 주 동안 실온에서 소변 저장 시약에 의해 가공된 소변 샘플에서 β-액틴 내부 표준물질의 변화를 묘사한다.
도 4는 소변 샘플이 소변 저장 시약과 혼합된 후에 0-4 주 동안 4 ℃에서 소변 저장 시약에 의해 가공된 소변 샘플에서 HPV 유전자의 변화를 묘사한다.
도 5는 소변 샘플이 소변 저장 시약과 혼합된 후에 0-4 주 동안 실온에서 소변 저장 시약에 의해 가공된 소변 샘플에서 HPV 유전자의 변화를 묘사한다.
도 6a 내지 도 6d는 상이한 방법/키트를 사용하여 소변 샘플로부터 추출된 DNA에서 β-액틴 유전자 또는 HPV 유전자의 증폭 곡선을 묘사한다. 도 6a 및 6b는 본 개시내용의 시약 및 방법을 Quick-DNA 소변 키트 (ZYMO RESEARCH, D3061)와 비교한다. 도 6c 및 6d는 본 개시내용의 시약 및 방법을 자성 비드 비뇨기 게놈 DNA 추출 키트 (Enriching biotechnology, UDE-5005) 및 FineMag 큰-부피 자성 비드 - 혈장 유리 DNA용 DNA 추출 키트 (Genefine Biotech, FM107)와 비교한다.
샘플 저장을 위한 조성물 및 방법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플을 저장하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 생물학적 샘플의 비-제한적인 예는 다른 것들 중에서, 혈액, 땀, 눈물, 소변, 타액, 정액, 혈청, 혈장, 뇌척수액 (CSF), 대변, 질액 또는 질 조직, 객담, 비인두 흡인물 또는 면봉, 누액, 점액, 또는 상피 면봉 (협측 면봉), 조직, 기관, 뼈, 치아 또는 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체로부터 수집된 소변 샘플이다. 소변 샘플은 대상체의 세포, 대상체를 감염시키는 병원체, 또는 세포 및 병원체의 단편 및 분자를 함유하기 때문에 분자 진단에 널리 사용된다. 그러나, 수집된 소변 샘플을 비용-효율적인 방식으로 저장하는 동시에 샘플에서 잠재적으로 중요한 분자의 안정성을 유지하는 것은 어려웠다. 예를 들어, 샘플이 비교적 더 낮은 온도 하에서 저장되지 않는 경우, 세포 및 병원체로부터 유래된 DNA 분자는 소변 샘플을 수집한 후 몇 시간 또는 며칠 내에 빠르게 분해될 수 있다. 소변 샘플을 4 ℃ 미만의 냉장고에 저장하더라도, 소변 샘플을 아무것도 첨가하지 않고 그대로 두면 소변 샘플 중 DNA 분자가 몇 주 내에 더 이상 진단에 적합하지 않게 된다.
본 출원에서 제공된 조성물 및 방법은 생물학적 샘플 중 DNA를 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 샘플 중 세포를 파괴하여 세포 중 DNA 및 샘플에 존재할 수 있는 병원체 중 DNA를 방출함으로써, 후속 DNA 추출 및 DNA-기반 진단을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA는 병원체로부터 방출된다. 일부 실시양태에서, DNA는 샘플 중 세포-유리 DNA이다. 일부 실시양태에서, DNA는 비뇨기 순환 종양 DNA (ctDNA)이다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 소변 샘플과 혼합되고 이에 의해 희석되기 전에 농축된 상태, 예컨대, 희석 스케일에 따라, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 또는 100X 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 희석 스케일은 또한 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 및 1:99 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 희석 스케일에 기반하여, 조성물을 소변 샘플과 혼합하고 이에 의해 희석시켜, 처리된 소변 샘플에서 최종 작동 농도 (1X)를 달성한다.
소변 샘플을 저장하기 위한 본 개시내용의 조성물은 pH 완충액를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 생물학적 시스템에 적합한 완충액이다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 ACES N-(2-아세트아미도)-아미노에탄설폰산, AMP (2-아미노-2-메틸-1-프로판올), ADA (N-(2-아세트아미도)-이미노디아세트산), BES (N,N-비스-(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), 바이카보네이트, 비신 (N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-글리신), Bris-Tris ([비스-(2-하이드록시에틸)-이미노]-트리스-(하이드록시메틸메탄)), 비스-트리스-프로판 (1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판), 붕산, 카코딜레이트 (디메틸아르신산), CAPS (3-(사이클로헥실아미노)-프로판설폰산), CAPSO 3-((사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산), 카보네이트 (소듐 카보네이트), CHES (사이클로헥실아미노에탄설폰산), 시트르산의 염, DIPSO (3-[N-비스(하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판설폰산), 포름산의 염, 글리신, 글리실글리신, HEPES (N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-에탄설폰산), HEPPS, EPPS (N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-3-프로판설폰산), HEPPSO (N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산), 이미다졸, 말레산, MES (2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산), MPOS (3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), POPSO (피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)), 포스페이트 (인산의 염), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), POPSO (피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판설폰산)), TAPS (3-{[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-아미노}-프로판설폰산), TAPSO (3-[N-트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]-2-하이드록시프로판설폰산), TEA (트리에탄올아민), TES (2-[트리스(하이드록시메틸))-메틸아미노]-에탄설폰산), 트리신 (N-[트리스(하이드록시메틸)-메틸]-글리신), 트리스 (트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄) 및 아세테이트 (아세트산의 염)를 포함한다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 아세트산-소듐 아세테이트 시스템이다.
일부 실시양태에서, pH 완충액은 소변 샘플과 혼합된 후에 소정의 범위 내에서 pH를 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소정의 pH는 약 4.5 내지 6.5, 예컨대, 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 및 주어진 범위 사이의 임의의 간격이다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 아세트산-소듐 아세테이트 시스템이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 소듐 아세테이트의 농도는 소정의 희석 스케일에 기반하여 미리-결정될 수 있으며, 조성물을 소변 샘플과 혼합할 때 약 0.05 M 내지 약 0.1 M, 예컨대, 약 0.05 M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, 0.1 M의 최종 작동 농도로 이어질 수 있다. 예를 들어, 10X 조성물의 경우, 소듐 아세테이트의 농도는 약 0.5 M 내지 약 1.0 M, 예컨대, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M 또는 1.0 M이며, 이는 1:9의 비율로 소변 샘플로 희석될 수 있다.
소변 샘플을 저장하기 위한 본 개시내용의 조성물은 킬레이팅제를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 킬레이팅제는 분자가 단일 금속 이온에 대해 여러 결합을 형성할 수 있는 물질을 지칭한다. 킬레이팅제는 1,1,1-트리플루오로아세틸아세톤, 1,4,7-트리메틸-1,4,7-트리아자사이클로노난, 2,2'-비피리미딘, 아세틸아세톤, 알리자린, 아미드옥심, 미드옥심 기, 아미노에틸에탄올아민, 아미노메틸포스폰산, 아미노폴리카복실산, ATMP, BAPTA, 바토쿠프로인, BDTH2, 벤조트리아졸, Bidentate, 비피리딘, 2,2'-비피리딘, 비스(디사이클로헥실포스피노)에탄, 1,2-비스(디메틸아르시노)벤젠, 1,2-비스(디메틸포스피노)에탄, 1,4-비스(디페닐포스피노)부탄, 1,2-비스(디페닐포스피노)에탄, 칼릭사렌, 카세란드, 카테콜, 카비탄드, 킬레이팅 수지, Chelex 100, 시트레이트, 시트르산, 클라트로킬레이트, 코롤, 크립탄드, 2.2.2-크립탄드, 사이클람, 사이클렌, 사이클로덱스트린, 데페라시록스, 데페리프론, 데페록사민, Denticity, 덱스라족산, 디아세틸 모녹심, 트랜스-1,2-디아미노사이클로헥산, 1,2-디아미노프로판, 1,5-디아자-3,7-디포스파사이클로옥탄, 1,4-디아자사이클로헵탄, 디벤조일메탄, 디에틸렌트리아민, 디그림, 2,3-디하이드록시벤조산, 디머캅롤, 2,3-디머캅토-1-프로판설폰산, 디머캅토석신산, 1,2-디메틸에틸렌디아민, 1,1-디메틸에틸렌디아민, 디메틸글리옥심, DIOP, 디페닐에틸렌디아민, 1,5-디티아사이클로옥탄, 도모산, DOTA (킬레이터), DOTA-TATE, DTPMP, EDDHA, EDDS, EDTA, EDTMP, EGTA (화학물질), 1,2-에탄디티올, 에틸렌디아민, 에틸렌디아민디아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 에티드론산, Fluo-4, Fura-2, 갈산, 글루콘산, 글루탐산, 글리옥살-비스(메시틸이민), 글리포세이트, 헥사플루오로아세틸아세톤, 호모시트르산, 이미노디아세트산, Indo-1, 이소사카린산, 카인산, 리간드, 말산, 금속 아세틸아세토네이트, 금속 디티오렌 복합체, 메탈라크라운, 니트릴로트리아세트산, 옥살산, 옥심, 펜데타이드, 페니실라민, 펜테트산, 파네포스, 페난트롤린, O-페닐렌디아민, 포스포네이트, 프탈로시아닌, 피토킬라틴, 피콜린산, 폴리아스파르트산, 포르핀, 포르피린, 3-피리딜니코틴아미드, 4-피리딜니코틴아미드, 피로갈롤, 살리실산, 사르코파진, 소듐 시트레이트, 소듐 디에틸디티오카바메이트, 소듐 폴리아스파르테이트, 테르피리딘, 테트라메틸에틸렌디아민, 테트라페닐포르피린, 테노일트리플루오로아세톤, 티오글리콜산, TPEN, 1,4,7-트리아자사이클로노난, 트리부틸 포스페이트, 트리덴테이트, 트리에틸렌테트라민, 트리포스, 트리소듐 시트레이트, 1,4,7-트리티아사이클로노난, TTFA, 이들의 기능적 변이체 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 아미노폴리카복실산, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 이의 임의의 기능적 유도체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 EDTA 농도는 소정의 희석 스케일에 기반하여 미리-결정될 수 있으며, 조성물을 소변 샘플과 혼합하고 이에 의해 희석시킬 때 약 1 내지 약 2.5 mM, 예컨대, 약 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.1 mM, 2.2 mM, 2.3 mM, 2.4 mM 또는 2.5 mM의 최종 작동 농도로 이어질 수 있다. 예를 들어, 10X 조성물의 경우, EDTA의 농도는 약 10 내지 25 mM, 예컨대, 약 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM이며, 이는 이어서 1:9의 비율로 소변 샘플로 희석된다.
소변 샘플을 저장하기 위한 본 개시내용의 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 계면활성제는 2 개의 액체 사이, 기체 및 액체 사이, 또는 액체 및 고체 사이의 표면 장력 (또는 계면 장력)을 낮추는 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 양이온성 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 주이터이온성 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 비-제한적인 예는 이들의 머리에 음이온성 기능 기, 예컨대, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실레이트 등을 함유하는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 암모늄 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트 (소듐 도데실 설페이트, SLS 또는 SDS), 관련된 알킬-에테르 설페이트 소듐 라우레스 설페이트 (소듐 라우릴 에테르 설페이트 또는 SLES), 소듐 미레스 설페이트, 도쿠세이트, 퍼플루오로옥탄설포네이트 (PFOS), 퍼플루오로부탄설포네이트, 알킬-아릴 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 포스페이트, 소듐 스테아레이트, Triton™ X-100, 논옥시놀-9, 폴리소르베이트, Span®, 폴록사머, Tergitol™, Antarox®, PENTEX® 99 (디옥틸 소듐 설포석시네이트 (DOSS)), PFOS, Calsoft® (선형 알킬벤젠 설포네이트), Texapon® (소듐 라우릴 에테르 설페이트), Darvan® (리그노설포네이트) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 계면활성제는 SDS이다. 조성물 중 SDS 농도는 소정의 희석 스케일에 기반하여 미리-결정될 수 있으며, 조성물을 소변 샘플과 혼합하고 이에 의해 희석시킬 때 약 0.4 내지 1.5 % (m/v), 예컨대, 약 0.4 %, 0.5 %. 0.6 %, 0.7 %, 0.8 %, 0.9 %, 1.0 %, 1.1 %, 1.2 %, 1.3 %, 1.4 %, 1.5 % 등의 최종 작동 농도로 이어질 수 있다. 예를 들어, 10× 조성물의 경우, SDS의 농도는 약 4 % 내지 15 % (m/v), 예컨대, 약 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % 등이며, 이는 이어서 1:9의 비율로 소변 샘플로 희석된다.
일부 실시양태에서, 소변 샘플을 저장하기 위한 본 개시내용의 조성물은 EDTA, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제 이외의 방부제를 함유하지 않으므로, 총 비용을 감소시키고 다운스트림 진단의 잠재적 억제를 최소화한다.
일부 실시양태에서, 각각의 구성요소의 혼합물을 포함하는 시약을 형성하기 위해 상기 언급된 각각의 구성요소를 미리혼합하는 대신, 상기 언급된 구성요소는 각각의 구성요소에 대해 원하는 최종 작동 농도를 달성하는 한, 하나씩 소변 샘플과 직접 혼합될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 또한 저장 및/또는 다운스트림 DNA 추출 및 진단을 위한 가공된 소변 샘플을 제공한다. 상기 가공된 소변 샘플은 이를 필요로 하는 대상체로부터 수집된 소변, 및 본원에 기재된 바와 같은 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제를 포함한다.
가공된 소변 샘플은 동일한 대상체로부터 수집된 가공되지 않은 소변 샘플과 비교하여 더 긴 저장 기간을 갖는다. 일부 실시양태에서, 진단은 소변 샘플에서 DNA 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 가공된 소변 샘플 중 DNA 분자는 장기간에 걸쳐 다운스트림 진단에 충분히 안정하다. 본원에 사용된 바와 같이, 주어진 기간 동안 저장된 소변 샘플 중 DNA 분자는 동일한 대상체에 대해 방금 수집된 소변 샘플 중 DNA 분자와 비교하여 유의한 분해가 없는 경우 안정적이므로, 소변 샘플 중 DNA 분자는 DNA 기반 진단, 예컨대, PCR 진단에 충분히 양호한 품질 및 양호한 양이다. 일부 실시양태에서, 주어진 기간 동안 저장된 소변 샘플 중 DNA 분자는 동일한 대상체로부터 방금 수집된 소변 샘플 중 DNA 분자의 약 90 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 % 또는 약 99 % 이상이다.
일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플이 약 -20 ℃에서 저장될 때, 처리된 소변 샘플 중 DNA 분자는 소변 샘플을 본 출원의 조성물로 가공한 후 약 10 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일, 60 일, 70 일, 80 일, 90 일, 100 일, 200 일, 300 일, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 8 년 또는 9 년 이상 후에 안정하다.
일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플이 약 -20 ℃에 저장될 때, 처리된 소변 샘플 중 DNA 분자는 소변 샘플을 본 출원의 조성물로 가공한 후 약 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일, 35 일, 40 일, 45 일, 50 일, 55 일, 60 일, 65 일, 70 일, 75 일, 80 일, 85 일, 90 일, 95 일, 100 일, 110 일, 120 일, 130 일, 140 일, 150 일, 200 일, 250 일, 300 일, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년 또는 5 년 이상 후에 안정하다.
일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플이 약 4 ℃에서 저장될 때, 처리된 소변 샘플 중 DNA 분자는 소변 샘플을 본 출원의 조성물로 가공한 후 약 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일, 35 일, 40 일, 45 일, 50 일, 55 일 또는 60 일 이상 후에 안정하다.
일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플이 실온에서 저장될 때, 처리된 소변 샘플 중 DNA 분자는 소변 샘플을 본 출원의 조성물로 처리한 후 약 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일 또는 20 일 이상 후에 안정하다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실온"은 약 15 ℃ 내지 25 ℃ (± 2 ℃)를 지칭한다.
따라서, 본 개시내용은 또한 비교적 더 낮은 온도 (예컨대, 약 4 ℃, 약 -20 ℃ 또는 약 -80 ℃) 또는 비교적 더 높은 온도, 예컨대, 실온 하에서의 저장을 위한 가공된 소변 샘플을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제와 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물과 혼합하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 비교적 더 낮은 온도 (예컨대, 약 4 ℃, 약 -20 ℃ 또는 약 -80 ℃) 또는 비교적 더 높은 온도, 예컨대, 실온 하에서 저장하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제와 혼합하는 단계, 및 소정의 기간 동안 처리된 소변 샘플을 저장하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 소정의 기간 동안 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 조성물과 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소정의 기간은 비교적 더 낮은 온도 (예컨대, 약 4 ℃, 약 -20 ℃ 또는 약 -80 ℃) 하에서 약 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일, 35 일, 40 일, 45 일, 50 일, 55 일, 60 일, 70 일, 80 일, 90 일, 100 일, 150 일, 200 일, 250 일, 300, 1 년, 2 년 또는 3 년 이상이다. 일부 실시양태에서, 기간은 실온 하에서 약 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 가공된 소변 샘플은 임의의 유의한 분해없이 2 주 이상 동안 실온에서 저장되거나, 1 개월 이상 동안 4 ℃에서 저장될 수 있다. 가공된 샘플은 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 보다 더 긴 시간 동안 저장될 수 있다.
DNA 추출을 위한 조성물 및 방법
본 개시내용은 또한 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유류 대상체, 예컨대, 인간으로부터 수집된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변 샘플이다. 생물학적 샘플의 비-제한적인 예는 다른 것들 중에서, 혈액, 땀, 눈물, 소변, 타액, 정액, 혈청, 혈장, 뇌척수액 (CSF), 대변, 질액 또는 질 조직, 객담, 비인두 흡인물 또는 면봉, 누액, 점액, 또는 상피 면봉 (협측 면봉), 조직, 기관, 뼈, 치아 또는 종양을 포함한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 생물학적 샘플, 예컨대, 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 간단하고 비용-효율적인 방식을 제공한다. 특히, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 생물학적 샘플에서 박리된 세포로부터 DNA 및 샘플에서 하나 이상의 병원체로부터 DNA를 동시에 추출하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 DNA 추출 조성물 및 방법은 소변 샘플에서 DNA를 보다 효과적으로 추출할 수 있다. 게다가, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 자동화된 DNA 추출을 수행할 수 있게 하여, 전체 처리량을 증가시키면서 노동 강도를 감소시킨다.
본 개시내용에 의해 제공된 소변 자성 비드 추출 방법은 PCR 억제제를 잘 제거할 수 있으며 자동 DNA 추출을 구현하기 쉽다. 고순도의 핵산을 생산하는 본 개시내용의 자성 비드 핵산 추출 방법은 조작이 간단하고 자동화를 달성하기 쉽다. 일부 실시양태에서, 방법은 큰 부피의 소변 샘플을 다루는 데 보다 유용하며, 이는 결과적으로 소변 샘플 중 DNA 분자에 기반한 진단에서 더 높은 검출 민감도로 이어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플로부터 DNA 추출을 위한 시약을 제공한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변 샘플이다. 일부 실시양태에서, 시약은 자성 입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 용해 용액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 제1 세척 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 제2 세척 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시약은 용리 완충액을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시약은 키트로서 제공되거나, 사용 전에 별도로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 자성 입자 및 프로테아제는 소변 샘플을 전처리하고 DNA 추출을 위해 준비하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 용해 용액, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액 및 용리 완충액은 전처리된 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 DNA 추출은 자성 입자, 예컨대, 자성 나노입자 (예컨대, 자성 나노 비드)를 기반으로 한다.
일부 실시양태에서, 자성 입자는 코팅에 의해 보호된 자성 코어를 갖는다. 코팅은 자성 입자의 비가역적 응집을 방지하고 DNA 흡착을 위한 리간드의 부착에 의해 기능화를 허용한다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 최적의 흡착을 달성하는 데 필요한 기간 동안 샘플에서 항온처리된다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 철 옥사이드, 예컨대, Fe3O4 또는 Fe2O3을 함유한다. 일부 실시양태에서, 철 옥사이드 재료는 그 크기를 수 나노미터로 감소시킴으로써 자성 '안료'로 가공된 다음, 자성 '안료'는 생체기능화되고 생명 과학 응용분야에 사용될 수 있는, 비-자성 매트릭스, 예컨대, 실리카, 폴리비닐 알콜 (PVA), 덱스트란, 아가로스, 세파로스 및 폴리스티렌 중에 캡슐화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 자성 입자는 코어-쉘 구조를 갖는다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 임베딩된 구조를 갖는다.
코어-쉘 구조의 경우, 자성 입자는 폴리머 또는 실리카 표면 코팅을 포함하는 단일 초상자성 코어, 예컨대, SiO2 쉘로 둘러싸인 자성 코어로 구성된다. 일부 다른 실시양태에서, 자성 입자는 초상자성 입자로 둘러싸이고 표면 코팅으로 보호된 폴리스티렌 또는 폴리비닐 알콜 (PVA) 코어로 구성된다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 캡슐화 재료와 교대로 나타나는 초상자성 입자의 다중 층을 갖는다.
임베딩된 구조의 경우, 초상자성 비드는 단분산 매트릭스, 예컨대, 폴리스티렌, 아가로스 또는 세파로스로 구성될 수 있으며, 이는 다중 철-옥사이드 나노입자 ("자성 안료")로 함침된다. 이러한 비드는 전형적으로 직경이 수백 나노미터이며 자성 안료의 손실을 방지하는 재료로 밀봉된다.
DNA 추출을 위한 자성 입자의 비-제한적인 예는 미국특허 번호 6514688, 6673631, 6027945, 8710211, 6033878, 6368800, 8324372, 8729252, 미국 출원 공개공보 번호 20030087286, 20150141258, 20160102305, 20130096292, 20020086326, 20050287583, 20100009351, 20110171640, 20110008797, 20180195035, 20080132694, 20040002594, 20090131650, 20160369263, 20140288398, 20030224366, 및 WO/2001/037291A1, WO/2001/045522A1, WO/1998/031840A1, WO/2005/021748A1, WO/2017/051939A1, WO/2017/137192A1, WO/2010/005444A1, WO/1992/008805A1, WO/2013/164319A1, WO/2015/126340A1, WO/2017/156336A1, WO/2009/102632A3, WO/2009/102632A2, WO/2009/012185A1, WO/2009/012185A9, WO/2009/115335A1, WO/2015/120445A1, WO/2015/123433A2, WO/2007/050327A2, WO/2007/050327A3 및 WO/2013/028548A2에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
일부 실시양태에서, 자성 입자는 실리카로 코팅된 하이드록실 자성 비드이다.
일부 실시양태에서, 자성 입자는 약 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 950 nm 또는 1000 nm 이상의 평균 직경을 갖는 자성 비드이다.
자성 입자를 함유하는 용액을 또한 제공한다. 용액 중 자성 입자의 농도는 필요에 따라 미리결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 5 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 200 mg/ml, 약 200 mg/ml 내지 300 mg/ml, 약 300 mg/ml 내지 400 mg/ml 또는 약 400 mg/ml 내지 500 mg/ml 이상이다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 10 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 300 mg/ml, 약 400 mg/ml 또는 약 500 mg/ml 이상이다.
일부 실시양태에서, 자성 입자를 함유하는 용액은 DNA를 함유하는 샘플과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 샘플과 혼합된 후 자성 입자의 최종 농도(concertation)는 샘플에서 DNA의 잠재적 또는 실제 양에 기반하여 미리결정된다. 일부 실시양태에서, DNA를 함유하는 샘플과 혼합된 후 자성 입자의 최종 작동 농도는 약 0.01 내지 0.5 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 최종 작동 농도는 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.15 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.35 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.45 mg/ml 또는 0.5 mg/ml 이상이다.
일부 실시양태에서, 자성 입자를 DNA를 함유하는 샘플과 혼합한 후, 혼합물을 소정의 시간 동안 흔들어 준다. 일부 실시양태에서, 임의로 혼합물은 혼합된 후에 특정 기간 동안 부동으로 설정된다. 이어서, 혼합물을 소정의 속도로 원심분리하여 자성 입자를 침전시킨다. 일부 실시양태에서, 상청액은 제거되고 침전된 자성 입자는 DNA 추출을 위해 추가로 가공된다.
일부 실시양태에서, 침전된 자성 입자는 프로테아제에 의해 가공된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 넓은-스펙트럼 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 아스파틱 프로테아제, 글루타믹 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파라긴 펩티드 리아제이다.
일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 프로테아제 K (EC 3.4.21.64, 프로테이나제 K, 엔도펩티다제 K, 트리티라키움 알칼리 프로테이나제, 트리티라키움 알붐 세린 프로테이나제, 트리티라키움 알붐 프로테이나제 K)이다. 일부 실시양태에서, 용어 프로테아제 K는 또한 자연적 프로테아제 K의 임의의 기능적 변이체를 포함한다.
프로테아제, 예컨대, 프로테아제 K를 함유하는 용액을 또한 제공한다. 용액 중 프로테아제의 농도는 필요에 따라 미리결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, 농도는 약 1 mg/ml, 약 2 mg/ml, 약 3 mg/ml, 약 4 mg/ml, 약 5 mg/ml, 약 6 mg/ml, 약 7 mg/ml, 약 8 mg/ml, 약 9 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 11 mg/ml, 약 12 mg/ml, 약 13 mg/ml, 약 14 mg/ml, 약 15 mg/ml, 약 16 mg/ml, 약 17 mg/ml, 약 18 mg/ml, 약 19 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml 또는 약 100 mg/ml 이상이다.
일부 실시양태에서, 침전된 자성 입자는 프로테아제, 예컨대, 프로테아제 K를 포함하는 용액과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 혼합된 후 프로테아제의 최종 농도는(concertation) 미리결정된다. 일부 실시양태에서, 침전된 자성 입자와 혼합된 후 프로테아제의 최종 작동 농도는 약 5 내지 500 μg/ml이다. 일부 실시양태에서, 최종 작동 농도는 약 5 μg/ml, 6 μg/ml, 7 μg/ml, 8 μg/ml, 9 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 300 μg/ml, 350 μg/ml, 400 μg/ml, 450 μg/ml 또는 500 μg/ml 이상이다.
일부 실시양태에서, 침전된 자성 입자 및 프로테아제의 혼합물은 소정의 시간 동안 원하는 온도에서 부동으로 설정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 온도는 프로테아제의 바람직한 효소 반응 온도이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 프로테아제 K이고, 온도는 약 20 ℃ 내지 약 60 ℃이다. 일부 실시양태에서, 온도는 약 50 ℃ 내지 약 60 ℃이다. 일부 실시양태에서, 온도는 약 55 ℃ (± 2 ℃)이다.
일부 실시양태에서, 침전된 자성 입자 및 프로테아제의 혼합물은 소정의 기간 동안 부동으로 설정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시간은 약 5 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 20 분, 약 25 분, 약 30 분, 약 35 분, 약 40 분, 약 45 분, 약 50 분, 약 55 분, 약 60 분, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간 또는 약 5 시간 이상이다.
일부 실시양태에서, 소변 샘플을 자성 입자 및 프로테아제로 전처리한 후, DNA 추출을 위해 다음 단계로 이동한다. 일부 실시양태에서, 용해 용액, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액 및 용리 완충액이 순차적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure pct00001
화학식 (I), 여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 알콕시카보닐, 치환된 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 치환된 아릴옥시카보닐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴 알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, 헤테로알킬이다.
일부 실시양태에서, 화합물은 구아니디늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 이의 기능적 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 계면활성제, pH 완충액, 킬레이팅제 및 알콜 (예컨대, 하이드록실 기능기 (-OH)가 탄소에 결합된 유기 화합물)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 Triton X 100이다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 Tris-HCl이다. 일부 실시양태에서, 킬레이팅제는 EDTA이다. 일부 실시양태에서, 알콜은 이소프로판올이다.
일부 실시양태에서, 용해 용액은 약 6.2 내지 6.8, 예컨대, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7 또는 약 6.8의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 용해 용액은 DNA를 함유하는 샘플 (예컨대, 액체 샘플)에 첨가되기 전에 농축된 상태, 예컨대, 희석 스케일에 따라, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 또는 100X 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 희석 스케일은 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 및 1:99 등일 수 있다. 희석 스케일에 기반하여, 용해 용액을 DNA를 함유하는 샘플과 혼합시켜, 1X의 최종 작동 농도를 달성한다.
일부 실시양태에서, 희석 스케일은 3:1이다 (예컨대, 용해 용액의 3 부피가 DNA를 함유하는 샘플의 1 부피에 첨가됨). 이 경우에서, 용해 용액의 제조는 a) 약 2-6 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 약 1 % 내지 약 5 % Triton X 100, 약 20 mM 내지 약 50 mM Tris-HCl, 약 10 내지 약 50 mM EDTA를 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및 b) 약 50 % 내지 약 200 % (v/v) 투여량의 이소프로판올을 용액에 첨가하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 용해 용액을 DNA를 함유하는 샘플과 혼합한 후, 각각의 구성요소의 작동 농도 (1X)는 다음과 같다:
(a) 약 1.0 M 내지 5.0 M, 예컨대, 약 1.0 M, 약 1.5 M, 약 2.0 M, 약 2.5 M, 약 3.0 M, 약 3.5 M, 약 4.0 M, 약 4.5 M 또는 약 5.0 M 이상의 구아니디늄 이소티오시아네이트;
(b) 약 0.5 % 내지 약 4 %, 예컨대, 약 0.5 %, 약 0.75 %, 약 1.0 %, 약 1.25 %, 약 1.5 %, 약 1.75 %, 약 2.0 %, 약 2.25 %, 약 2.55, 약 2.75 %, 약 3.0 %, 약 3.255, 약 3.5 %, 약 3.75 % 또는 약 4 % 이상의 Triton X-100;
(c) 약 5 mM 내지 약 30 mM, 예컨대, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM 또는 약 30 mM 이상의 Tris-HCl;
(d) 약 2 mM 내지 약 20 mM, 예컨대, 약 2 mM, 약 5 mM, 약 8 mM, 약 11 mM, 약 14 mM, 약 17 mM 또는 약 20 mM 이상의 EDTA;
(e) 약 30 % 내지 약 150 % (v/v), 예컨대, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %, 약 55 %, 약 60 %, 약 65 %, 약 70 %, 약 75 %, 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 100 %, 약 105 %, 약 110 %, 약 115 %, 약 120 %, 약 125 %, 약 130 %, 약 135 %, 약 140 %, 약 145 % 또는 약 150 % 이상의 투여량의 이소프로판올.
일부 실시양태에서, 자성 입자를 함유하는 샘플을 용해 용액과 혼합한 후, 혼합물을 담은 용기를 소정의 시간 동안 흔들어 준다. 일부 실시양태에서, 용기를 약 10 내지 20 분, 예컨대, 약 10 분, 약 11 분, 약 12 분, 약 13 분, 약 14 분, 약 15 분, 약 16 분, 약 17 분, 약 18 분, 약 19 분 또는 약 20 분 이상 흔들어 준다.
일부 실시양태에서, 자성 입자를 함유하는 샘플을 본 개시내용의 용해 용액에 의해 용해시킨 후, 샘플 중 자성 입자를 자성 물체, 예컨대, 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용함으로써 수집한다.
일부 실시양태에서, 수집된 자성 입자는 제1 세척 완충액 (세척 완충액 Ⅰ)으로 세척된다.
일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물을 포함한다
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화학식 (I), 여기서 R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 수소, 할로겐, 아실, 치환된 아실, 알콕시카보닐, 치환된 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 치환된 아릴옥시카보닐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, 헤테로알킬이다. 일부 실시양태에서, 화합물은 구아니디늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 이의 기능적 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 pH 완충액, 염 및 알콜 (예컨대, 하이드록실 기능기 (-OH)가 탄소에 결합된 유기 화합물)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, pH 완충액은 Tris-HCl이다. 일부 실시양태에서, 염은 소듐 염, 예컨대, NaCl이다. 일부 실시양태에서, 알콜은 에탄올이다.
일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 약 4.5 내지 5.5, 예컨대 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제1 세척 완충액은 자성 입자를 세척하는 데 사용되기 전에 농축된 상태, 예컨대, 희석 스케일에 따라, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 또는 100X 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 희석 스케일은 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 및 1:99 등일 수 있다. 희석 스케일에 기반하여, 세척 완충액을 적합한 용매로 희석시켜, 최종 작동 농도를 달성한다.
각각의 구성요소의 작동 농도는 다음과 같다:
(a) 약 50 내지 약 100 mM, 예컨대, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM 이상의 구아니디늄 이소티오시아네이트;
(b) 약 20 mM 내지 약 50 mM, 예컨대, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM 이상의 Tris-HCl;
(c) 약 50 mM 내지 약 200 mM, 예컨대, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 약 105 mM, 약 110 mM, 약 115 mM, 약 120 mM, 약 125 mM, 약 130 mM, 약 135 mM, 약 140 mM, 약 145 mM, 약 150 mM, 약 155 mM, 약 160 mM, 약 165 mM, 약 170 mM, 약 175 mM, 약 180 mM, 약 185 mM, 약 190 mM, 약 195 mM 또는 약 200 mM 이상의 NaCl; 및
(d) 약 40 % 내지 약 60 % (v/v), 예컨대, 약 40 %, 약 45 %, 약 50 %, 약 55 % 또는 약 60 % 이상의 에탄올.
일부 실시양태에서, 0.1 mg 내지 1 mg의 자성 입자 각각에 대해, 약 500 내지 1000 μl의 제1 세척 완충액이 사용된다.
일부 실시양태에서, 샘플 중 자성 입자는 소정의 기간 동안 세척된다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 약 1 내지 10 분, 예컨대, 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 4 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분, 약 9 분 또는 약 10 분 이상 동안 세척된다.
자성 입자를 제1 세척 완충액으로 세척한 후, 자성 입자를 자성 물체, 예컨대, 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용함으로써 다시 수집한다.
일부 실시양태에서, 수집된 자성 입자는 제2 세척 완충액 (세척 완충액 Ⅱ)으로 세척된다.
일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 pH 완충액 및 알콜 (예컨대, 하이드 록실 기능기 (-OH)가 탄소에 결합된 유기 화합물)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, pH 완충액은 Tris-HCl이다. 일부 실시양태에서, 알콜은 에탄올이다.
일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 약 5.5 내지 6.5, 예컨대, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5의 pH를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제2 세척 완충액은 자성 입자를 세척하는 데 사용되기 전에 농축된 상태, 예컨대, 희석 스케일에 따라, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X, 80X, 90X 또는 100X 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 희석 스케일은 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 및 1:99 등일 수 있다. 희석 스케일에 기반하여, 세척 완충액을 적합한 용매로 희석시켜, 최종 작동 농도를 달성한다.
일부 실시양태에서, 각각의 구성요소의 작동 농도는 다음과 같다:
(a) 약 10 mM 내지 약 50 mM, 예컨대, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM 또는 약 50 mM 이상의 Tris-HCl; 및
(b) 약 70 % 내지 80 %, 예컨대, 약 71 %, 약 72 %, 약 72 %, 약 73 %, 약 74 %, 약 75 %, 약 76 %, 약 77 %, 약 78 %, 약 79 %, 약 80 %의 에탄올.
일부 실시양태에서, 0.1 mg 내지 1 mg의 자성 입자 각각에 대해, 약 500 내지 1000 μl의 제2 세척 완충액이 사용된다.
일부 실시양태에서, 샘플 중 자성 입자는 소정의 기간 동안 제2 세척 완충액으로 세척된다. 일부 실시양태에서, 자성 입자는 약 1 내지 10 분, 예컨대, 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 4 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분, 약 9 분 또는 약 10 분 이상 동안 세척된다.
일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액으로 세척한 후, 자성 입자를 자성 물체, 예컨대, 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용함으로써 다시 수집한다.
일부 실시양태에서, 수집된 자성 입자는 단리된 DNA 분자를 방출시키기 위해 용리 완충액으로 처리된다.
일부 실시양태에서, 용리 완충액은 TE 완충액이다. 일부 실시양태에서, TE 완충액은 약 10 mM Tris 및 약 1 mM EDTA를 포함하는 1X TE 완충액이다. 일부 실시양태에서, TE 완충액의 pH는 HCl을 사용하여 약 8.0이 된다.
일부 실시양태에서, 자성 입자를 용리 완충액으로 처리하기 전에, 미리선택된 온도에서 소정의 시간 동안 부동으로 설정된다.
일부 실시양태에서, 소정의 시간은 약 1 내지 10 분, 예컨대, 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 4 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분, 약 9 분 또는 약 10 분 이상이다.
일부 실시양태에서, 미리선택된 온도는 실온, 더 높거나 더 낮은 온도, 예컨대, 약 -80 ℃ 내지 약 37 ℃일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세척-제거 단계는 관련있는 높은 온도, 예컨대, 약 50 ℃ 내지 약 75 ℃, 예컨대, 약 50 ℃, 약 55 ℃, 약 60 ℃, 약 65 ℃, 약 70 ℃ 또는 약 75 ℃ 이상에서 자성 입자를 함유하는 용리 완충액을 가열하는 단계를 포함한다.
소변 샘플 저장 및/또는 DNA 추출을 위한 키트
본 개시내용은 소변 샘플 저장 및/또는 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 키트를 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플, 예컨대, 소변 샘플을 저장하는 데 사용될 수 있는 본원에 기재된 하나 이상의 구성요소를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 pH 완충액, 킬레이팅제 및/또는 계면활성제를 함유한다. 일부 실시양태에서, pH 완충액은 아세트산-소듐 아세테이트이고; 킬레이팅제는 EDTA이고; 계면활성제는 SDS이다. 소변 샘플을 저장하기 위한 키트의 구성요소의 농도는 상기 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 키트의 하나 이상의 또는 모든 구성요소는 액체 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 키트의 하나 이상의 또는 모든 구성요소는 고체 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 구성요소는 농축된 상태이고 사용하기 전에 희석되어야 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 구성요소는 작동 농도에 있고 직접 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 용액을 만들기 위한 용매를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 소변 샘플을 수집하기 위한 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 측정 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 측정 용기는 소변 샘플의 부피를 측정하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 키트는 소변 샘플이 키트 중 구성요소와 혼합된 후에 소변 샘플을 저장하기 위한 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 DNA 추출을 위한 본원에 기재된 하나 이상의 구성요소, 예컨대, 용해 용액, 자성 나노입자, 프로테아제, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액, 및/또는 용리 완충액을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 용액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X 100, Tris-HCl, EDTA 및 이소프로판올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자성 나노입자는 내부 코어 층 및 외부 쉘 층을 가지며, 여기서 내부 코어 층은 코어-쉘 타입 자성 나노입자로 구성되며, 여기서 외부 쉘 층은 SiO2로 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 세척 완충액은 구아니디늄 이소티오시아네이트, Tris-HCl, NaCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세척 완충액은 Tris-HCl 및 에탄올을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 프로테아제 K이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충액은 약 8.0의 pH를 갖는 1X TE 완충액이다. 일부 실시양태에서, 키트 중 구성요소의 농도는 상기 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 키트의 하나 이상의 또는 모든 구성요소는 액체 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 키트의 하나 이상의 또는 모든 구성요소는 고체 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 구성요소는 농축된 상태이고 사용하기 전에 희석되어야 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 구성요소는 작동 농도에 있고 직접 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 용액을 만들기 위한 용매를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 DNA 추출을 위한 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 자동화된 핵산 추출 시스템에 적합하다. 일부 실시양태에서, 용기는 다중-웰 플레이트(plant), 예컨대, 48-웰 플레이트(plant), 96-웰 플레이트 또는 384-웰 플레이트이다. 일부 실시양태에서, 키트는 샘플로부터 추출된 DNA를 저장하기 위한 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 생물학적 샘플 (예컨대, 소변 샘플)을 저장하는 것, 상기 생물학적 샘플로부터 DNA를 추출하는 것 둘 모두를 위한 본원에 기재된 하나 이상의 구성요소를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
게다가, 본 개시내용의 키트는 본원에 기재된 방법의 실시를 위한 지시 (예컨대, 프로토콜)을 함유하는 교육용 재료를 포함할 수 있다.
의학적 병태의 진단
대상체로부터 수집된 생물학적 샘플, 예컨대, 소변 샘플에서 하나 이상의 분석물의 존재 또는 부재, 또는 수준을 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 조성물 및 방법을 사용하여 샘플로부터 DNA를 추출하는 단계, 및 생물학적 샘플에서 하나 이상의 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 더 긴 저장 시간을 위해 본원에 기재된 조성물에 의해 가공되었다. 일부 실시양태에서, 가공된 소변 샘플은 분석되기 전에 일정 기간 동안 저장되었다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 분석물은 샘플 중 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 의학적 병태의 바이오마커이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 많은 의학적 병태의 진단 및/또는 치료에 적합하다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 비뇨생식계의 하나 이상의 기관 또는 조직과 연관된다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 병원체 감염 및/또는 암과 연관된다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 소변 샘플을 저장하고 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 편리하고, 비-침습적이며, 저렴한 방식을 제공한다. 조성물 및 방법은 또한 동일한 대상체로부터 수집된 다중 샘플 또는 다중 대상체로부터 수집된 샘플로부터 DNA를 기술적으로 경제적으로 추출하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 큰-스케일 자동화된 소변 샘플 가공 및 DNA 추출에 적합하다. 특히, 조성물 및 방법은 저온 저장 장비를 사용하지 않고 장기간 (예컨대, 몇 주 내지 몇 개월)에 걸쳐 동일한 대상체로부터 수집된 비교적 큰 부피 (예컨대, 약 0.1 내지 10 ml)를 갖는 소변 샘플을 분석하는데 적합하며, 이는 적은 비용으로 반복적으로 분석을 수행하고 대상체의 의학적 병태를 모니터링하는 것을 가능하게 한다. 분석된 소변 샘플의 비교적 더 큰 부피로 인해 (1 ml 미만의 부피를 갖는 소변 샘플을 일반적으로 다루는 이전 방법과 비교하여), 본 개시내용의 조성물 및 방법은 적은 비용으로 보다 안정적이고 신뢰할 수 있는 진단 결과를 제공한다.
따라서, 본 개시내용의 가공된 샘플은 진단, 모니터링 및/또는 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단, 모니터링 및/또는 치료는 대상체에서 하나 이상의 의학적 병태에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 통증의 장애; 체온의 변경 (예컨대, 발열); 신경계 기능장애 (예컨대, 실신, 근육통, 운동 장애, 무감각, 감각 손실, 섬망, 치매, 기억 손실 또는 수면 장애); 눈, 귀, 코 및 목과 연관된 병태; 순환기 및/또는 호흡기 기능과 연관된 병태 (예컨대, 호흡곤란, 폐 부종, 기침, 객혈, 고혈압, 심근경색, 저산소증, 청색증, 심혈관 허탈, 울혈성 심부전, 부종 또는 쇼크); 위장 기능과 연관된 병태 (예컨대, 연하곤란, 설사, 변비, 위장관 출혈, 황달, 복수, 소화불량, 메스꺼움, 구토); 신장 및 요로 기능과 연관된 병태 (예컨대, 산증, 알칼리증, 유체 및 전해질 불균형, 질소혈증 또는 비뇨기 이상); 성기능 및 생식과 연관된 병태 (예컨대, 발기 부전, 월경 장애, 다모증, 남성화, 불임, 임신 연관된 장애 및 표준 측정); 피부와 연관된 병태 (예컨대, 습진, 건선, 여드름, 주사비, 피부 감염, 면역학적 피부 질환 또는 광과민성); 혈액과 연관된 병태 (예컨대, 혈액학); 유전자의 (예컨대, 유전적 장애); 약물 반응과 연관된 병태 (예컨대, 약물 유해 반응); 및 영양의 (예컨대, 비만, 섭식 장애 또는 영양 판정)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시양태가 유용성을 찾는 다른 의학적 분야는 종양학 (예컨대, 신생물, 악성종양, 혈관신생, 부신생물 증후군 또는 종양학적 응급상황); 혈액학 (예컨대, 빈혈, 혈행동병증(hemoactinopathies), 거대적아구성 빈혈(megalooblastic anemias), 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 골수이형성증, 골수 부전, 진성 적혈구증가증, 골수증식성 질환, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프성 악성종양, 형질 세포 장애, 수혈 생물학, 또는 이식); 지혈 (예컨대, 응고 및 혈전증의 장애, 또는 혈소판 및 혈관벽의 장애); 및 전염성 질환 (예컨대, 패혈증, 패혈성 쇼크, 불명열, 심장내막염(endocardidtis), 물림, 화상, 골수염, 농양, 식중독, 골반 염증성 질환, 세균성 (예컨대, 그람 양성, 그람 음성, 기타 (노카르디아, 액티모이세스, 혼합), 마이코박테리아성, 스피로키타성, 리케치아 또는 마이코플라즈마); 클라미디아; 바이러스 (DNA, RNA), 진균 및 조류 감염; 원생동물 및 기생충 감염; 내분비 질환; 영양 질환; 및 대사 질환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 비뇨생식계와 연관된다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 남성 또는 여성 비뇨생식계와 연관된다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 조직, 기관 또는 남성 비뇨생식계의 일부, 예컨대, 척추, 직장, 정낭, 사정관, 항문, 부고환, 고환, 음낭(scrotom), 요관, 방광, 정관, 발기 조직, 음경, 요도, 음경, 콩팥 등과 연관된다. 일부 실시양태에서, 의학적 병태는 조직, 기관 또는 여성 비뇨생식계의 일부, 예컨대, 콩팥, 요관, 방광, 요도, 자궁, 나팔관, 난소 및 질과 연관된다.
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 급성 사구체신염, 신 증후군, 만성 사구체신염, 신염, 신병증, 급성 신장 부전증, 만성 신장 부전증, 콩팥 감염, 신우신염, 수신증, 콩팥 및 요관의 결석, 하부 요로 감염, 방광염, 요도염, 요도염, 요도 협착, 전립선 증식증, 전립선의 염증성 질환, 음낭수종, 고환염 및 부고환염, 과잉 포피 및 포경, 불임, 음경의 장애, 양성 유선 이형성증, 난소, 나팔관, 골반 세포 조직 및 복막의 염증성 질환, 자궁경부를 제외한 자궁의 염증성 질환, 자궁 경부, 질 및 외음부의 염증성 질환, 자궁내막증, 생식기 탈출증, 자궁의 장애, 성적으로 전염되는 질환 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 하나 이상의 병원체와 연관된다.
일부 실시양태에서, 병원체는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 인간 유두종바이러스 (HPV), 단순 헤르펙스 바이러스 (HSV), 인간 거대세포바이러스 (HCMV), 인간 헤르페스바이러스 (HHV), 인간 내인성 레트로바이러스 (HERV), 지카 바이러스, 뎅기 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 에볼라 바이러스, 인간 T-세포 림프영양성 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LMCV), 엡스타인-바 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, JC 바이러스, 파보바이러스, 인플루엔자, 로타바이러스, 인간 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 인간 엔테로바이러스, 수두 바이러스, 멈프스 바이러스, 폴리오바이러스, 에코바이러스, 콕사키바이러스, 천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 풍진 바이러스 및 한타바이러스 또는 임의의 다른 트랜스레날바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 HPV이다.
일부 실시양태에서, HPV는 고-위험 HPV, 예컨대, HPV 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 26, 53 및 66이다. 일부 실시양태에서, HPV는 저-위험 HPV, 예컨대, HPV 타입 6, 11, 42, 43 및 44이다.
일부 실시양태에서, qPCR은 주어진 HPV 서브타입의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 양성 반응은 형광 신호의 축적에 의해 검출된다. 사이클 역치 (Ct)는 형광 신호가 (예컨대, 배경 수준을 초과하는) 역치를 통과하는 데 필요한 사이클의 수로서 정의된다. 일부 실시양태에서, 역치는 qPCR 기기의 소프트웨어 또는 다른 적합한 방법에 의해 자동적으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 역치는 음성 대조군 샘플에서 종결 형광 값 바로 초과로 (예컨대, 약 0.01 %, 0.1 %, 1 %, 5 % 또는 10 % 더 높게) 설정된다. 일부 실시양태에서, 테스트 샘플에서 HPV 서브타입 증폭과 연관된 Ct 값이 약 35, 34, 33, 32, 31 또는 30 이하의 이하 (≤)인 경우, 샘플은 HPV 서브타입을 함유하는 것으로서 결정되고 (양성 결과), 그렇지 않으면 샘플이 HPV 서브타입을 함유하지 않는 것으로서 결정된다 (음성 결과). 기준 대조군 유전자 증폭의 경우, 샘플에서 대조군 유전자 증폭과 연관된 Ct 값이 약 35, 34, 33, 32, 31, 30 또는 29 이하의 이하 (≤)인 경우, 기준 대조군 유전자 증폭은 양성인 것으로 결정되고, 그렇지 않으면 기준 대조군 유전자 증폭은 음성인 것으로 결정된다. 기준 대조군 유전자 증폭이 음성인 것으로 결정되고 HPV 유전자 증폭 결과가 또한 음성인 경우, 테스트 결과는 무효화된다.
일부 실시양태에서, 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 대장균, 나이세리아 고노로이에, 렙토스피로시스 종 또는 마이코박테리움 터버큘로시스이다.
일부 실시양태에서, 병원체는 클라미디아 트라코마티스, 마이코플라즈마 제니탈리움, 트리코모나스 바지날리스 또는 우레아플라즈마 우레아리티쿰이다.
일부 실시양태에서, 의학적 병태는 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 비뇨기과암, 콩팥암, 고환암, 요로상피암, 결장직장암, 췌장암 및 위암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 가공된 샘플, 예컨대, 본 개시내용의 가공된 소변 샘플은 대상체에서 하나 이상의 의학적 병태를 진단하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 하나 이상의 의학적 병태와 연관된 하나 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재, 또는 수준이 결정된다.
방광(baldder)암에 대한 바이오마커는 CA9, CCL18, MMP12, TMEM45A, MMP9, SEMA3D, ERBB2, CRH 및 MXRA, FIXA1, 아포지단백질 A1 (APOA1), 아포지단백질 A2 (APOA2), 퍼옥시레독신 2 (PRDX2), 헤파린 보조인자 2 전구체 (HCII), 혈청 아밀로이드 A-4 단백질 (SAA4), 시스타틴 B, GDF15 프로모터 영역, HSPA2 프로모터 영역 및 TMEFF2 프로모터 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터 영역으로부터의 CpG 섬, ABCC13, ABCC6, ABCC8, ALX4, APC, BCAR3, BCL2, BMP3B, BNIP3, BRCA1, BRCA2, CBR1, CBR3, CCNA1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CFTR, COX2, DAPK1, DRG1, DRM, EDNRB, FADD, GALC, GSTP1, HNF3B, HPP1, HTERT, ICAM1, ITGA4, LAMA3, LITAF, MAGEA1, MDR1, MGMT, MINT1, MINT2, MT1 GMT, MINT1, MINT2, MT1A, MTSS1, MYOD1, OCLN, p14ARF, p16INK4a RASSF1A, RPRM, RUNX3, SALL3, SERPINB5, SLC29A1, STAT1, TMS1, TNFRSF10A, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF21, WWOX, 및 각각이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 출원 공개공보 번호 20140303001 및 20170350894에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
전립선암에 대한 바이오마커는 전립선 특이적 항원 (PSA), 전립선 암 항원 3 (PCA3), α-메틸아실-CoA 라세마제, Annexin A3, TMPRSS2: ERG, 개별 염증성 사이토카인 (예컨대, IL-6, IL-8, TGF-β1), C-반응성 단백질 (CRP), Toll-유사 수용체 (TLR), 호중구-대-림프구 비율, PD-1/PD-L1 (B7-H1), CD276 (B7-H3), CD73, 종양-연관된 대식세포 (TAM), 세포독성 CD8 종양-침윤성 림프구 (TIL), Treg 종양-침윤성 림프구 (TIL), 및 각각이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국특허 번호 8518650, 8784795, 10048265 및 미국 출원 공개공보 번호 20100292331, 20170058352, 20140094380, 20140106369, 20130217647, 20130116142, 20150160224, 20130116133, 20170016903, 20130116131, 20160024592, 20100216654, 20150329912, 20180024132, 20110236910, 20130115604, 20150299807, 20160025734, 20110311998, 20160041173, 20140038838, 20090221672, 20170362663, 20050244973, 20160097082, 20150218655, 20160299145, 20150133327, 20170176443, 20160209416, 20160355887, 20150252425, 20160258958, 20180051340, 20150329911, 20080248500, 2.0150276746, 20130331279, 20110054009, 20060088894, 20140274767, 20130184169, 20150024961, 20080254481, 20070009970, 20110045053 및 20140051082에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
난소암에 대한 바이오마커는 Cyr61, ApoA1, Beta-2 마이크로글로불린, CA125, 및 각각이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 번호 5769074, 7666583, 8053198, 8288110, 8206934, 9816995, 미국 출원 공개공보 번호 US20090068690, 20090075307, 20090081685, 20140274787, 20130267439, 20070212721, 20150080229, 20180196054, 20080286814, 20110256560, 20100197561, 20150168414, 20070054329, 20100221752, 20100086948, 20060029956, 20180074063, 20100105067, 20160047815, 20090087849, 20100055690, 20150147823, 20130096022, 20170276680, 20120046185, 20150362497, 20050214760, 20110275534, 20070172902, 20140256591, 20110217238,20180231559, 20130022998, 20150126384, 20150322530, 20120171694, 20100227335, 20150198600, 20080254048, 20140121127, 20100227343, 20160002732, 20140221240 및 20090004687에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
결장직장암에 대한 바이오마커는 BMP3, TFPI1, NDRG4, Septin9, TFPI2, OPLAH, FLI1, PDGFD, SFMBT2, CHST2, VAV3, DTX1, 및 각각이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 번호 9095549, 9835626, 8426150, 10042983 및 미국 출원 공개공보 번호 20090142332, 20180282815, 20050014165, 20170205414, 20130345322, 20130323253, 20120040383, 20080020940, 20100304410, 20150072341, 20120264131, 20170176441, 20120207856, 20150212088, 20080286801, 20160160296, 20180094322, 20180164320, 20140045180, 20140113829, 20130288247, 20140212415, 20090112120, 20060088862, 20130164279, 20120238463, 20150344969, 20160108476, 20150168410, 20140256586, 20150198600, 20150197819, 20160002732, 20160153054, 20120238464, 20120237929, 20140342924, 20100203522, 20150292023, 20180080937, 20120183554, 20150133330, 20120089541, 20150176082, 20130102487, 20180112273, 20140037625, 20180306800, 20170108501 및 20170234874에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
콩팥암에 대한 바이오마커는 소르비톨, 프럭토스, 소르비톨 6-포스페이트, 미리스테이트, 팔미테이트 및 스테아레이트, 아쿠아포린-1 (AQP1), 아디포필린 (ADFP), 및 각각이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 번호 8426150, 8335550, 8211653, 미국 출원 공개공보 번호 20160245814, 20140343865, 20100261224, 20150198600, 20060084126, 20110237450, 20170108501, 20070054282, 20170240971, 20110151460, 20170234884, 20140213475, 20180068083, 20160305947, 20150017638, 20160215349, 20120207856, 20080139402, 20030190602, 20030199685, 20100233080, 20110020836, 20170290913, 20160166685, 20160003835, 20080261258, 20180171022, 20070026415, 20150307617, 20080124329, 20100028344, 20150301058, 20160022638, 20090299154에 기재된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
요로상피암에 대한 바이오마커는 SLC2A1, S100A13, GAPDH, KRT17, GPRC5A, P4HA1, HSD17B2, 유비퀼린 2, EGF, IL1β, sTNFR, VEGF, CK18, vWF 및 FAS를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
정의
"일 실시양태", "실시양태", "일 예" 및 "예"에 대한 언급은 그렇게 기재된 실시양태(들) 또는 예(들)가 특정 특징, 구조, 특성, 속성, 요소 또는 제한을 포함할 수 있으나, 모든 실시양태 또는 예가 반드시 특정 특징, 구조, 특성, 속성, 요소 또는 제한을 포함하는 것은 아님을 나타낸다. 더욱이, 어구 "일 실시양태에서"의 반복적인 사용은 반드시 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니나, 그럴 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 기준된 수의 플러스 또는 마이너스 10 % 또는 5 %를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유 연결된 2 개 이상의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포괄한다. 핵산의 많은 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포괄한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA 또는 혼성체 둘 모두일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
핵산을 지칭하는 본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 (i) 기준된 뉴클레오티드 서열의 일부; (ii) 기준된 뉴클레오티드 서열의 상보체 또는 이의 일부; (iii) 기준된 핵산과 실질적으로 동일한 핵산 또는 이의 상보체; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 기준된 핵산, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 혼성화하는 핵산을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "진단하는"은 병리 또는 증상을 분류하고, 병리의 중증도 (예컨대, 등급 또는 단계)를 결정하고, 병리 진행을 모니터링하고, 병리의 결과 및/또는 회복 가능성을 예측하는 것을 지칭한다.
어구 "본질적으로 이로 이루어지는"은 조성물 또는 방법이 추가적인 성분 및/또는 단계를 포함할 수 있으나, 추가적인 성분 및/또는 단계가 청구된 조성물 또는 방법의 기본 및 신규 특성을 물질적으로 변경하지 않는 경우만을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "단수형"은 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "하나 이상의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
단어 "임의로"는 "일부 실시양태에서 제공되고 다른 실시양태에서 제공되지 않는"을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 이러한 특징이 충돌하지 않는 한 복수의 "임의적" 특징을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "이소프로판올의 투여량 (v/v)"은 최종 용액의 제조 동안 용액 중 다른 모든 구성요소를 포함하는 용액의 부피에 대한 이소프로판올의 부피의 비를 의미한다. 예를 들어, "이소프로판올은 약 50 % 내지 200 % (v/v)의 투여량을 갖는다"는 최종 용액을 제조할 때, 첨가된 이소프로판올의 부피가 최종 용액 중 다른 모든 구성요소를 포함하는 용액의 부피의 약 50 % 내지 200 %임을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Ct 값"은 형광 신호가 역치를 통과하는 데 필요한 (즉, 배경 수준을 초과하는) 사이클의 수인 사이클 역치를 지칭한다. Ct 수준은 샘플 중 표적 핵산의 양에 반비례한다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 다음의 실시예에서 추가로 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 방식으로 제공된다는 것을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본질적 특성을 확인할 수 있으며, 이의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 용도 및 조건에 적응하기 위해 본 발명의 실시양태의 다양한 변화 및 변형을 할 수 있다. 따라서, 본원에 도시되고 설명된 것들 이외에 본 발명의 실시양태의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 소변 샘플 저장을 위한 용액의 제조
아세트산-소듐 아세테이트 완충액 (2 mol/L, pH = 6.0), SDS 용액 (10 % (M/V)) 및 EDTA 용액 (0.5 mol/L, pH 8.4)을 부피 대비 10:20:1의 비율로 혼합하여, 소변 샘플 저장을 위한 용액을 생산하였다. 예를 들어, 310 mL 용액을 제조하기 위해, 100 ml의 아세트산-소듐 아세테이트 완충액, 200 ml의 SDS 용액 및 10 ml의 EDTA 용액을 혼합하였다.
실시예 2: 소변 샘플 DNA 추출을 위한 시약의 제조
소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위해 다음의 시약을 제공하였다:
마그네틱 비드: 300 nm의 입자 크기 및 50 mg/ml의 농도를 갖는 상업화된 실리콘 하이드록실 자성 비드
프로테아제 K: 탈이온수를 이용하여 10 mg/ml로 희석된 상업적으로 이용가능한 20 mg/ml 프로테이나제 K
용해 용액: 먼저 5 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 4 % Triton X 100, 25 mM Tris-HCl (pH 6.5), 10 mM EDTA를 포함하는 용액을 준비한 다음, 용액에 200 % (V/V) 투여량의 이소프로판올을 첨가하고, 이의 최종 pH를 6.5로 조정하였다. 최종 용해 용액은 1.67 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 1.33 % Triton X 100, 8.33 mM Tris-HCl, 3.33 mM EDTA 및 66.7 % (용해 용액의 v/v) 이소프로판올을 갖는다.
세척 완충액 I: 50 mM 이소티오시아네이트, 50 mM Tris-HCl (pH 5.0), 100 mM NaCl 및 60 % 에탄올 및 이의 최종 pH를 5.0으로 조정하였다.
세척 완충액 II: 10 mM Tris-HCl (pH 6.0) 및 70 % 에탄올.
용리 완충액: 1 x TE (pH 8.0).
실시예 3: 소변 샘플 저장 시약의 유효성 검증
인간 소변 샘플을 다중 인간 대상체로부터 수집하였다. 각각의 소변 샘플을 2 개의 부분으로 나누었다. 제1 부분을 10:1 (소변 샘플 : 저장 용액)의 비율로 실시예 1에서 제조된 저장 용액에 첨가하였고, 제2 부분은 대조군과 동일한 양의 멸균 탈이온수를 첨가하였다. 모든 샘플을 열 가속 실험을 위해 섭씨 37도에 배치하였다.
샘플은 각각, 0, 4 번째, 7 번째 일에 채취되었다. 수집된 샘플 중 DNA는 실시예 2에서 제조된 소변 DNA 추출 시약을 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA 중 β-액틴 유전자를 정량적 PCR로 증폭하였다. β-액틴 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 서열은 다음과 같다: CGTGCTCAGGGCTTCTTGTC (업스트림 프라이머, 서열번호 1), CTCGTCGCCCACATAGGAATC, (다운스트림 프라이머, 서열번호 2) 및 5'-FAM-TGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3'BHQ1 (프로브, 서열번호 3). 형광 정량적 PCR의 결과는 열 가속 실험 후 샘플 중 DNA 품질을 결정하는 데 사용되었다. 결과는 아래 표 1 및 도 1에 도시되어 있다.
표 1: 소변 샘플 저장 시약의 검증
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결과는 소변 저장 시약과 혼합된 소변 샘플을 0 일차에 수집된 소변 샘플과 비교하였을 때, qPCR Ct 값에 의해 검증된 바와 같이 심지어 소변 샘플을 7 일 동안 37 ℃에서 저장한 후에도 β-액틴 유전자의 양 및 품질면에서 유의한 차이가 없었음을 나타냈다. 그에 반해서(In contract), 0 일차에 수집된 소변 샘플과 저장 시약없이 단 4 일 동안 37 ℃에 저장된 소변 샘플간에 유의한 차이가 있었다. 결과는 소변 저장 시약이, 심지어 소변 샘플을 고온에서 저장하더라도 소변 샘플 중 DNA를 보존하는 데 효과적이라는 것을 보여주었다.
실시예 4: 소변 샘플 저장 시약의 안정성 검증
이 실험은 실시예 1에서 생산된 소변 샘플 저장 시약으로 가공된 후 소변 샘플 중 DNA 안정성을 테스트하기 위해 수행되었다.
12 명의 인간 대상체로부터 수집된 고-위험 HPV-양성 소변 샘플 그룹을 선택하였다. 각각의 소변 샘플을 10:1의 비율로 실시예 1에서 생산된 소변 저장 시약과 혼합하였다. 각각의 혼합물의 분취량을 4 ℃ 및 실온에서 저장하였다.
실시예 2에서 생산된 DNA 추출 시약을 사용하여, 혼합물을 만든 후 0, 1, 2, 3 및 4 주에 이들 분취량으로부터 DNA를 추출하였다. 이 DNA는, 소변 샘플 중 DNA의 안정성을 결정하기 위해 고-위험 인간 유두종바이러스 검출 키트 (hybribio Bio)를 사용하여 HPV의 DNA를 검출하는 데 사용되었다.
표 2 및 도 2는 형광 정량적 PCR에서 β-액틴 유전자의 Ct 값으로 표시된 바와 같이, 4 ℃에서 0, 1, 2, 3 및 4 주 후에 β-액틴 유전자의 DNA의 안정성을 보여준다.
표 3 및 도 3은 형광 정량적 PCR에서 β-액틴 유전자의 Ct 값으로 표시된 바와 같이, 실온에서 0, 1, 2, 3 및 4 주 후에 β-액틴 유전자의 DNA의 안정성을 보여준다.
표 2: 4°C 에서 저장 시약을 포함하는 소변 샘플에서 β-액틴 내부 표준물질의 안정성 (0 내지 4 주, qPCR Ct 값으로 표시된 바와 같음)
Figure pct00004
표 3: 실온에서 저장 시약을 포함하는 소변 샘플에서 β-액틴 내부 표준물질의 안정성 (0 내지 4 주, qPCR Ct 값으로 표시된 바와 같음)
Figure pct00005
표 4 및 도 4는 형광 정량적 PCR에서 HPV 마커 유전자의 Ct 값으로 표시된 바와 같이, 4 ℃에서 0, 1, 2, 3 및 4 주 후에 HPV 마커 유전자의 DNA의 안정성을 보여준다.
표 5 및 도 5는 형광 정량적 PCR에서 HPV 마커 유전자의 Ct 값으로 표시된 바와 같이, 실온에서 0, 1, 2, 3 및 4 주 후에 HPV 마커 유전자의 DNA의 안정성을 보여준다.
표 4: 4°C에서 저장 시약을 포함하는 소변 샘플에서 HPV 마커 유전자의 안정성 (0 내지 4 주, qPCR Ct 값으로 표시된 바와 같음)
Figure pct00006
표 5: 실온에서 저장 시약을 포함하는 소변 샘플에서 HPV 마커 유전자의 안정성 (0 내지 4 주, qPCR Ct 값으로 표시된 바와 같음)
Figure pct00007
상기 실험 결과는 qPCR에 의해 측정된 바와 같이 DNA 품질 및 양의 측면에서 유의한 변화가 없었기 때문에, 소변 샘플을 본 개시내용의 소변 저장 시약과 혼합한 후, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주 동안 4 ℃에 저장된 소변 샘플 중 인간 β-액틴 유전자의 DNA 분자 및 고-위험 HPV DNA가 0 주차에 수집된 소변 샘플 중 DNA와 비슷함을 나타낸다. 본 개시내용의 소변 저장 시약과 혼합한 후에 실온에서 저장된 소변 샘플의 경우, 0 주차에 수집된 샘플과 비교하여 1 또는 2 주 후에 유의한 변화가 없었으나, 샘플은 3 또는 4 주 후에 불안정해지기 시작하였다. 이 결과는 본 개시내용의 소변 저장 시약이 가공된 샘플을 4 ℃에서 저장할 경우 4 주 이상 동안 또는 실온에서는 2 주 이상 동안 소변 샘플 중 DNA를 안정적으로 보존함을 시사한다.
실시예 5: 소변 샘플에 대한 DNA 추출 시약의 유효성 검증
고-위험 HPV를 함유하는 소변 샘플 중 DNA를 여러 가지 상이한 방법/키트를 사용함으로써 추출하였다. 상기 방법/키트는 Quick-DNA 소변 키트 (ZYMO RESEARCH, D3061), 자성 비드 비뇨기 게놈 DNA 추출 키트 (Enriching biotechnology, UDE-5005), FineMag 큰-부피 자성 비드 - 혈장 유리 DNA용 DNA 추출 키트 (Genefine Biotech, FM107) 및 본 개시내용의 소변 DNA 추출 시약을 포함한다. DNA 추출 후, 그 DNA는 Hybribio의 고-위험 인간 유두종바이러스 검출 시약을 사용하여 HPV의 실시간 정량적 PCR 검출의 대상이 되었다. 테스트된 각각의 키트의 지침을 따랐다.
본 개시내용의 DNA 추출 시약을 사용하여 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위해, 다음 단계를 취하였다:
1. 소변 샘플의 전처리: 10 ml의 소변 샘플을 50 ml의 원심분리 튜브에 첨가하였다. 20 μl의 하이드록실 자성 비드를 샘플에 첨가하고 볼텍싱으로 혼합하였다. 튜브를 10000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 조심스럽게 버리고, 500 μl의 펠릿을 새로운 1.5 ml 원심분리 튜브에 넣었다. 2.5 μl의 프로테이나제 K를 펠릿과 혼합하였다. 튜브를 금속 배쓰에서 56 ℃에서 30 분 동안 가열하였다.
2. 추출 시약 분배: 용해 용액, 세척 완충액 I, 세척 완충액 II 및 용리 완충액을 각각 750 μl, 600 μl, 600 μl 및 50 μl의 부피로 96-웰 딥 웰 추출 플레이트에 첨가하였다.
표 6은 가능한 샘플 로딩 계획을 보여준다. 이들 중에서, 8 열 A 내지 H 각각의 경우, DNA 추출을 위해 2 개의 샘플을 보유할 수 있다. 96-웰 플레이트의 경우, 16 개 샘플로부터 DNA를 추출할 수 있다.
표 6. 96-웰 플레이트에서 DNA 추출을 위한 샘플 로딩 계획.
Figure pct00008
750 μl의 용해 용액 및 250 μl의 상기 전처리된 소변 샘플을 컬럼 1, 2, 7 및 8의 각각의 웰에서 혼합하였다. 600 μl의 세척 완충액 I를 컬럼 3 및 9의 각각의 웰에 첨가하였다. 600 μl의 세척 완충액 II를 컬럼 4 및 10의 각각의 웰에 첨가하였다. 50 μl의 용리 완충액을 컬럼 6 및 12의 각각의 웰에 첨가하였다.
3. 자동화된 DNA 추출 장비를 사용한 DNA 추출: 상기 기재된 샘플을 함유하는 96-웰을 자동화된 DNA 추출 장비 (Xi'An Tian Long, 모델 NP968-S)에 넣었다. 제작 매뉴얼에 기반하여, 다음의 프로그램을 사용하였다:
표 7: 자동화된 DNA 추출 장비에 대한 프로그램
Figure pct00009
이러한 방법/키트 각각과 연관된 DNA 추출 효율을 결정하기 위해, 이러한 상이한 방법/키트를 사용하여 소변 샘플로부터 DNA 분자를 추출한 후, 추출된 DNA 분자를 사용하여 형광 정량적 PCR을 사용하여 HPV 유전자를 검출하였다. 각각의 DNA 추출 방법/키트에 동일한 양의 소변 샘플을 사용하고, 각각의 방법에서 추출된 DNA를 PCR을 위해 동일한 부피로 희석하여 의미있는 비교를 할 수 있었다. 결과는 도 6a 내지 도 6d에 도시된다.
결과는 본 개시내용의 시약 및 방법이 테스트된 기존의 상업적인 제품과 비교하여 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 데 보다 효과적인 방식을 제공함을 나타낸다.
실시예 6: 소변 DNA 추출 시약의 제형의 최적화
소변에서 DNA 추출의 추출 및 정제의 효율을 개선시키기 위해, 용해 용액, 세척 완충액 I, 세척 완충액 Ⅱ의 제형 및/또는 투여량, 마그네틱 비드 및 프로테아제 K의 투여량을 최적화하였다.
용해 용액의 최적화: 5 M에서 일정한 농도의 구아니딘 이소티오시아네이트 및 200 %의 이소프로판올의 투여량으로, 5 가지 상이한 농도의 EDTA (5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM)를 포함하는 4 % TritonX-100을 함유하는 용해 용액의 제형을 테스트하고, 5 가지 상이한 농도의 Triton X-100 (1 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 %)을 포함하는 10 mM EDTA를 함유하는 용해 용액의 제형을 테스트하였다. 본원에 사용된 바와 같은 "농도"는 이소프로판올을 첨가하기 전에 용액 중 각각의 구성요소의 농도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이소프로판올은 다른 모든 구성요소가 함께 혼합된 후에 첨가된다. DNA 추출은 이러한 상이한 제형의 용해 용액을 사용하여 동일한 소변 샘플에서 수행되었다 (표 8 참고). 소변 샘플로부터의 DNA의 추출은 세척 완충액으로서 75 % 에탄올, 용리 완충액으로서 1*TE, 300 nm 하이드록시 자성 비드 및 10 mg/ml 프로테아제 K 농도를 사용하여 본 발명의 실시예 3의 방법에 따라 수행되었다. 상이한 제형의 용해 용액으로부터 추출된 소변 중 β-액틴 유전자에 대해 정량적 PCR 증폭을 수행하였으며, 상이한 제형의 용해 용액의 추출 효율은 β-액틴 유전자의 함량 (이는 측정된 Ct 값에 반비례함)에 의해 결정되었다. β-액틴 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 서열은 다음과 같다: CGTGCTCAGGGCTTCTTGTC (업스트림 프라이머, 서열번호 1), CTCGTCGCCCACATAGGAATC, (다운스트림 프라이머, 서열번호 2) 및 5'-FAM-TGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3'BHQ1 (프로브, 서열번호 3). 결과는 표 9에 도시된다.
표 8: 용해 용액의 제형
Figure pct00010
표 9: 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 데 사용된 용해 용액의 상이한 제형에 대한 β-액틴 유전자 테스트 결과
Figure pct00011
표 9에 도시된 바와 같이, 제형 2의 용해 용액으로부터 추출된 DNA에서 제형 β-액틴 유전자 함량이 가장 높기 때문에 (Cт 값이 가장 낮음), 용해 용액 중 Triton X-100 및 EDTA 농도는 각각 4 % 및 10 mM으로 설정된다.
용해 용액의 나머지 구성요소를 최적화하기 위해 유사한 방법이 사용되었다. 구아니딘 티오시아네이트의 경우 테스트된 농도 구배는 2 M, 3 M, 4 M 및 5 M이였고; Tris-HCl의 경우 테스트된 농도 구배는 10 mM, 25 mM, 50 mM 및 100 mM이였고; 이소프로판올 (V/V)의 투여량의 경우 테스트된 구배는 50 %, 100 %, 150 %, 200 % 투여량이었으며; PH 값 설정을 위해 5.5, 6.0, 6.5, 7.0의 구배를 테스트하였다. 마지막으로, 본 발명에서 용해 용액의 각각의 구성요소에 대한 최적의 제형은 다음과 같이 수득된다: 5 M 상이한 구아니딘 티오시아네이트, 4 % TritonX-100, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH = 6.5. 이 실시예에서 사용된 바와 같은 "농도"는 이소프로판올을 첨가하기 전에 용액 중 각각의 구성요소의 농도를 지칭한다.
세척 완충액 I의 최적화: 표 10에 따라 8 개의 상이한 세척 완충액 I의 제형을 제조하였으며, 이를 소변 DNA 추출 시약의 다른 구성요소과 조합한 다음, 샘플 추출을 위해 동일한 소변 샘플에 적용하고, qPCR을 사용하여 β-액틴 유전자 함량을 평가하였다 ("용해 용액의 최적화"에 기재된 방법을 따름). 결과는 표 11에 도시된다.
표 10: 8 개의 상이한 세척 완충액 I의 제형
Figure pct00012
표 11: 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 데 사용된 세척 완충액 I의 상이한 제형에 대한 β-액틴 유전자 테스트 결과
Figure pct00013
표 11의 데이터 분석에 따르면, 세척 완충액 I의 제형 5가 최상의 추출 효과를 가졌다. 또한, 이 조건 하에서, 추출 과정에서 자성 비드가 결집되지 않았으며, 세척 효과가 우수하였다. 마지막으로, 세척 완충액 I의 제형은 0.05 M GuSCN, 0.1 % PVP40, 50 mM Tris-HCl, 60 % 에탄올, 100 mM NaCl 및 pH = 5.0으로서 결정되었다.
세척 완충액 II의 최적화: 10 mM Tris-HCl을 함유하는 75 % 에탄올 (pH 6.0) (새로운 제형)을 제조하고 75 % 에탄올 (원래 제형)과 비교하였다. 각각의 완충액을 자성 비드 및 소변 DNA 추출 시약의 다른 구성요소와 조합하여, 각각 3 개의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하였다.
qPCR을 사용하여 세척 동안에 DNA 손실을 감소시킬 수 있는지 확인하기 위해 β-액틴 유전자 함량을 평가하였다 ("용해 용액의 최적화"에 기재된 방법을 따름). 결과는 표 12에 도시된다.
표 12. 상이한 세척 완충액 II의 테스트 결과의 비교
Figure pct00014
표 12의 데이터 분석에 따르면, 75 % 에탄올의 pH 값을 pH 6.0으로 조정하는 것은 세척 동안에 DNA 손실을 줄일 수 있으므로, 세척 완충액 Ⅱ 제형은 75 % 에탄올, 10 mM Tris-HCl, pH = 6.0으로 결정된다.
자성 비드 투여량의 최적화: 자성 비드 투여량은 다음의 3 가지 상이한 수준으로 설정되었다: 10 ul, 15 ul 및 20 ul. β-액틴 qPCR 평가 ("용해 용액의 최적화"에 기재된 방법을 따름)에 따라 2 개의 소변 샘플로부터의 샘플 추출을 위해 각각의 투여량의 자성 비드를 소변 DNA 추출 시약의 나머지 구성요소와 조합하였다. 결과는 표 13에 도시된다.
표 13. 상이한 자성 비드 투여량의 검출 결과의 비교
Figure pct00015
표 13의 데이터 분석에 따르면, 마그네틱 비드의 양을 20 ul로 증가시키는 것은 추출 효율을 개선시킬 수 있으며, 추출 과정에서 마그네틱 비드 결집 현상을 없앨 수 있다. 따라서, 마그네틱 비드의 양은 20 ul로 결정되었다.
프로테아제 K 투여량의 최적화: 프로테아제 K 투여량은 다음의 3 가지 수준으로 설정되었다: 0 ug, 2.5 ug 및 25 ug. 3 개의 소변 샘플로부터 샘플 추출을 위해 각각의 투여량의 프로테아제 K를 소변 DNA 추출 시약의 나머지 구성요소와 조합한 다음, qPCR을 이용하여 β-액틴 유전자 함량을 테스트하였다 ("용해 용액의 최적화"에 기재된 방법을 따름). 결과는 하기 표 14에 도시된다.
표 14. 상이한 프로테아제 K 투여량의 테스트 결과의 비교
Figure pct00016
표 14의 데이터 분석에 따르면, 프로테아제 K 투여량의 양을 25 ug로 증가시키는 것은 추출 효율을 개선시킬 수 있다. 따라서, 최종적으로 프로테아제 K 투여량의 양은 25 ug로 결정되었다.
샘플 투여량의 최적화 및 결정: 3 개의 임상 소변 샘플을 선택하고, 각각의 소변 샘플에 대해 샘플 투여량 (부피)을 다음의 3 가지 수준에서 테스트하였다: 400 ul, 1000 ul 및 8000 ul. 본 발명에 기재된 소변 DNA 추출 시약 및 방법은 DNA 추출에 사용되었으며 최적의 샘플 투여량을 결정하기 위해 qPCR을 이용하여 β-액틴 유전자에 대해 테스트되었다 ("용해 용액의 최적화"에 기재된 방법을 따름). 결과는 표 15에 도시된다.
표 15: 상이한 샘플 투여량의 테스트 결과의 비교
Figure pct00017
표 15의 데이터 분석에 따르면, 샘플 투여량을 증가시키는 것은 검출 결과를 유의하게 개선시킬 수 있으며, 8000 μl 샘플 크기가 이러한 3 가지 샘플 투여량 중에서 최상의 결과를 나타낸다. 조작을 용이하게 하기 위해, 최종적으로 샘플 투여량은 10 mL로서 설정된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 공개물, 특허, 특허 공개공보 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 원용된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 공개물, 특허, 특허 공개공보 및 특허 출원에 대한 언급은 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 임의의 국가에서의 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제안으로서 간주되지 않으며, 간주되어서는 안된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원의 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다. 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 공개공보는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 원용된다.
본원에 논의된 공개물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 공개물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
본 발명이 이의 구체적 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 추가 변형이 가능하며 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 본 발명의 임의의 변경, 사용 또는 적응을 포함하고, 본 발명이 속하는 기술 내에서 공지된 또는 관례적인 실시 내에 있는 것으로서 및 상기 개시된 및 하기와 같이 첨부된 청구범위의 범주 내의 본질적인 특징에 적용될 수 있는 것으로서 본 개시내용으로부터 출발하는 것을 포함하는 것으로 의도된다는 것이 이해될 것이다.
서열목록
서열번호 1, 업스트림 프라이머, β-액틴
Figure pct00018
서열번호 2, 다운스트림 프라이머, β-액틴
Figure pct00019
서열번호 3, qPCR 프로브, β-액틴
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> HANGZHOU NEW HORIZON HEALTH TECHNOLOGY CO. LTD. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR URINE SAMPLE STORAGE AND DNA EXTRACTION <130> NEWH-006/01WO 333709-2024 <150> PCT/CN2019/070276 <151> 2019-01-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgtgctcagg gcttcttgtc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctcgtcgccc acataggaat c 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> FAM fluroescent dye attached <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> non-fluroescent dye BHQ1 attached <400> 3 tgacccatgc ccaccatcac gccc 24

Claims (102)

  1. 대상체로부터 수득된 소변 샘플을 저장하기 위한 조성물로서,
    상기 조성물이 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 조성물의 pH를 미리선택된 범위 내로 조정하도록 구성되는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 아세트산 및 아세트산의 염을 포함하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 아세트산의 염이 소듐 아세테이트인, 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 미리선택된 pH의 범위가 약 5.0 내지 6.5인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물의 pH가 약 6.0인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 소듐 아세테이트가 약 0.5 내지 1.0 mol/L의 농도를 갖는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 아미노폴리카복실산인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 EDTA가 약 10 내지 25 mmol/L의 농도를 갖는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 계면활성제가 음이온성 계면활성제인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 음이온성 계면활성제가 도데실 하이드로겐 설페이트의 염인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 염이 소듐 염이고, 상기 음이온성 계면활성제가 소듐 도세실 설페이트 (SDS)인, 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 SDS가 약 5 % 내지 10 % (m/v)의 농도를 갖는, 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 조성물이 방부제, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제를 함유하지 않는, 조성물.
  16. 저장을 위한 가공된 소변 샘플로서,
    상기 가공된 소변 샘플은 대상체로부터 수집된 소변 샘플, pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제를 포함하는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 조성물의 pH를 미리선택된 범위 내로 조정하도록 구성되는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 아세트산 및 아세트산의 염을 포함하는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 아세트산의 염이 소듐 아세테이트인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 미리선택된 pH의 범위가 약 5.0 내지 6.5인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 조성물의 pH가 약 6.0인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 가공된 소변 샘플 중 소듐 아세테이트가 약 0.05 내지 0.1 mol/L의 농도를 갖는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 아미노폴리카복실산인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 EDTA가 약 1 내지 2.5 mmol/L의 농도를 갖는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  26. 제16항에 있어서,
    상기 계면활성제가 음이온성 계면활성제인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 음이온성 계면활성제가 도데실 하이드로겐 설페이트의 염인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 염이 소듐 염이고, 상기 음이온성 계면활성제가 소듐 도세실 설페이트 (SDS)인, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  29. 제16항에 있어서,
    상기 SDS가 약 0.5 % 내지 1.5 % (m/v)의 농도를 갖는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플.
  30. 제16항에 있어서,
    상기 가공된 소변 샘플이 보존제, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제를 함유하지 않는, 가공된 소변 샘플.
  31. 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제, 또는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 조성물과 혼합하는 단계를 포함하는, 저장을 위한 가공된 소변 샘플을 생산하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 아세트산 및 소듐 아세테이트를 포함하는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 가공된 소변 샘플 중 소듐 아세테이트가 약 0.05 내지 0.1 mol/L의 농도를 갖는 것인, 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 EDTA인 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 가공된 소변 샘플 중 EDTA가 약 1 내지 2.5 mmol/L의 농도를 갖는 것인, 방법.
  36. 제31항에 있어서,
    상기 계면활성제가 SDS인 것인, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 가공된 소변 샘플 중 SDS가 약 0.5 % 내지 1.5 % (m/v)의 농도를 갖는 것인, 방법.
  38. 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제와 혼합하여 저장 준비가 된 소변 샘플을 생산하는 단계를 포함하는, 대상체로부터 수집된 소변 샘플을 저장하기 위한 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 pH 완충액, 킬레이팅제 및 계면활성제가 대상체로부터 수집된 소변 샘플과 혼합되기 전에 혼합물로 제공되는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 조성물의 pH를 미리선택된 범위 내로 조정하도록 구성된 것인, 방법.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 pH 완충액이 아세트산 및 아세트산의 염을 포함하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 아세트산의 염이 소듐 아세테이트인 것인, 방법.
  43. 제40항에 있어서,
    상기 미리선택된 pH의 범위가 약 5.0 내지 6.5인 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 조성물의 pH가 약 6.0인 것인, 방법.
  45. 제42항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플 중 소듐 아세테이트가 약 0.05 내지 0.1 mol/L의 농도를 갖는 것인, 방법.
  46. 제38항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 아미노폴리카복실산인 것인, 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 킬레이팅제가 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)인 것인, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플 중 EDTA가 약 1 내지 2.5 mmol/L의 농도를 갖는 것인, 방법.
  49. 제38항에 있어서,
    상기 계면활성제가 음이온성 계면활성제인 것인, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 음이온성 계면활성제가 도데실 하이드로겐 설페이트의 염인 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 염이 소듐 염이고, 상기 음이온성 계면활성제가 소듐 도세실 설페이트 (SDS)인 것인, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플 중 SDS가 약 0.5 % 내지 1.5 % (m/v)의 농도를 갖는 것인, 방법.
  53. 제38항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플이 방부제, 세포 고정제 또는 포름알데히드 소광제를 함유하지 않는 것인, 방법.
  54. 제38항에 있어서,
    상기 대상체로부터 수집된 소변 샘플이 대상체의 세포 및 하나 이상의 바이러스 병원체를 함유하고, 상기 세포 및 바이러스 병원체 둘 모두가 소변 샘플이 저장 준비가 된 후에 용해되는 것인, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 바이러스 병원체가 인간 유두종바이러스 (HPV)인 것인, 방법.
  56. 제38항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플을 4 ℃에서 저장하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  57. 제38항에 있어서,
    상기 저장 준비가 된 소변 샘플을 실온에서 저장하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  58. 제56항에 있어서,
    상기 소변 샘플 중 DNA 함량이 15-일 내지 30-일 저장 시간 후에 안정한 것인, 방법.
  59. 제57항에 있어서,
    상기 소변 샘플 중 DNA 함량이 1-주 내지 2-주 저장 시간 후에 안정한 것인, 방법.
  60. 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 하나 이상의 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
    상기 방법은 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항의 가공된 소변 샘플을 사용하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    상기 분석물이 바이러스인 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 바이러스가 HPV인 것인, 방법.
  63. 제61항에 있어서,
    상기 분석물의 검출이 바이러스의 DNA를 검출하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  64. 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위한 키트로서,
    상기 키트는 용해 용액, 자성 나노입자, 프로테아제, 제1 세척 완충액, 제2 세척 완충액, 용리 완충액 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 키트.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 용해 용액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl, EDTA 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 키트.
  66. 제65항에 있어서,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 2 내지 6 M의 농도를 갖거나, Triton X-100이 약 1 내지 5 %의 농도를 갖거나, Tris-HCl이 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖거나, 용해 용액이 약 6.5의 pH를 갖거나, EDTA가 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖거나, 이들의 임의의 조합인, 키트.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 용해 용액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl 및 EDTA를 포함하는, 키트.
  68. 제66항에 있어서,
    상기 용해 용액이 이소프로판올을 추가로 포함하는, 키트.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 이소프로판올의 투여량이 약 50 % 내지 200 % (v/v)인, 키트.
  70. 제69항에 있어서,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 1 내지 2 M의 농도를 갖거나, Triton X-100이 약 1 내지 2 %의 농도를 갖거나, Tris-HCl이 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖거나, 용해 용액이 약 6-7의 pH를 갖거나, EDTA가 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖거나, 이소프로판올이 용해 용액의 약 50 % 내지 80 %의 부피를 갖거나, 이들의 임의의 조합인, 키트.
  71. 제64항에 있어서,
    상기 자성 나노입자가 내부 코어 층 및 외부 쉘 층을 가지며, 상기 내부 코어 층이 코어-쉘 타입 자성 나노입자로 구성되고, 상기 외부 쉘 층이 SiO2로 구성되는, 키트.
  72. 제71항에 있어서,
    상기 자성 나노입자가 약 100 내지 1000 nm의 직경 및 약 50 mg/ml의 농도를 갖는, 키트.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 자성 나노입자가 약 10-20 μL의 부피를 갖는, 키트.
  74. 제64항에 있어서,
    상기 제1 세척 완충액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Tris-HCl, NaCl 및 에탄올을 포함하는, 키트.
  75. 제74항에 있어서,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 50 mM의 농도를 갖는, 키트.
  76. 제74항에 있어서,
    상기 Tris-HCl이 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖는, 키트.
  77. 제76항에 있어서,
    상기 제1 세척 완충액이 약 5.0의 pH를 갖는, 키트.
  78. 제74항에 있어서,
    상기 NaCl이 약 50 내지 200 mM의 농도를 갖는, 키트.
  79. 제74항에 있어서,
    상기 에탄올이 약 40 % 내지 60 % (v/v)의 농도를 갖는, 키트.
  80. 제64항에 있어서,
    상기 제2 세척 완충액이 Tris-HCl 및 에탄올을 포함하는, 키트.
  81. 제80항에 있어서,
    상기 제2 세척 완충액 중 Tri-HCl이 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖고, 상기 제2 세척 완충액이 약 6.0의 pH를 갖는, 키트.
  82. 제80항에 있어서,
    상기 에탄올이 약 70 % 내지 80 % (v/v)의 농도를 갖는, 키트.
  83. 제64항에 있어서,
    상기 용리 완충액이 약 8.0의 pH를 갖는 Tris-EDTA 완충액인, 키트.
  84. 제64항에 있어서,
    상기 프로테아제가 프로테아제 K인, 키트.
  85. 제84항에 있어서,
    상기 프로테아제 K가 약 10 내지 20 mg/ml의 농도를 갖는, 키트.
  86. 제85항에 있어서,
    상기 프로테아제 K가 약 2.5-25 μg의 투여량을 갖는, 키트.
  87. 제64항 내지 제86항 중 어느 한 항의 키트를 사용하는 단계를 포함하는, 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법.
  88. 대상체의 소변 샘플로부터 DNA를 추출하는 방법으로서,
    (1) 상기 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 수득된 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 수득된 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 수득된 소변 샘플에서 자성 나노입자를 수집하는 단계; 및
    (6) 용리 완충액으로 단계 (5)에서 수득된 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출된 DNA를 수득하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  89. 제88항에 있어서,
    상기 용해 용액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl, EDTA 및 이소프로판올을 포함하며,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 1 내지 2 M의 농도를 갖고;
    상기 Triton X 100이 약 1 내지 2 %의 농도를 갖고;
    상기 Tris-HCl이 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖고 상기 용해 용액이 약 6-7의 pH를 가지며;
    상기 EDTA가 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖고;
    상기 이소프로판올이 용해 용액의 약 50 % 내지 80 % (v/v)의 부피를 갖는 것인, 방법.
  90. 제88항에 있어서,
    상기 자성 나노입자가 내부 코어 층 및 외부 쉘 층을 가지며, 상기 내부 코어 층이 코어-쉘 타입 자성 나노입자로 구성되고, 상기 외부 쉘 층이 SiO2로 구성되고, 상기 자성 나노입자가 약 100 내지 1000 nm의 직경 및 약 50 mg/ml의 농도를 갖는 것인, 방법.
  91. 제88항에 있어서,
    상기 제1 세척 완충액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Tris-HCl, NaCl 및 에탄올을 포함하며,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 50 내지 100 mM의 농도를 갖고;
    상기 Tris-HCl이 약 20 내지 50 mM의 농도를 갖고, 상기 제1 세척 완충액이 약 5.0의 pH를 가지며;
    상기 NaCl이 약 50 내지 200 mM의 농도를 갖고;
    상기 에탄올이 약 40 % 내지 60 % (v/v)의 농도를 갖는 것인, 방법.
  92. 제88항에 있어서,
    상기 제2 세척 완충액이 Tris-HCl 및 에탄올을 포함하고,
    상기 제2 세척 완충액 중 Tri-HCl이 약 10 내지 50 mM의 농도를 갖고,
    상기 제2 세척 완충액이 약 6.0의 pH를 갖고,
    상기 에탄올이 약 70 % 내지 80 % (v/v)의 농도를 갖는 것인, 방법.
  93. 제88항에 있어서,
    상기 용리 완충액이 약 8.0의 pH를 갖는 Tris-EDTA 완충액인 것인, 방법.
  94. 제88항에 있어서,
    상기 프로테아제가 프로테아제 K이고, 상기 프로테아제 K가 약 10 내지 20 mg/ml의 농도를 갖는 것인, 방법.
  95. 제88항에 있어서,
    단계 (1)이
    (a) 상기 소변 샘플을 자성 나노입자와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 원심분리하거나 자성 분리 장치를 활용하여 침전물 및 상청액을 형성하는 단계;
    (c) 상기 침전물을 프로테아제와 접촉시켜 반응 시스템을 형성하는 단계; 및
    (d) 소정의 시간 동안 적합한 조건 하에서 상기 반응 시스템을 가열하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  96. 제88항에 있어서,
    단계 (3), (4) 및/또는 (6)이 자성 프레임 또는 자동 핵산 추출 기기를 사용하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  97. 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
    제85항 내지 제86항 중 어느 한 항의 키트를 사용하여 소변 샘플로부터 추출된 DNA를 사용하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  98. 제97항에 있어서,
    상기 분석물이 바이러스인 것인, 방법.
  99. 제98항에 있어서,
    상기 바이러스가 HPV인 것인, 방법.
  100. 제98항에 있어서,
    상기 분석물의 검출이 바이러스의 DNA를 검출하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  101. 대상체로부터 수집된 소변 샘플에서 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
    (1) 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항의 가공된 소변 샘플 사용하는 단계; 및
    (2) 다음을 포함하는, 상기 가공된 소변 샘플로부터 DNA 추출하는 단계:
    (a) 상기 소변 샘플을 자성 나노입자 및 프로테아제와 접촉시켜 전-처리된 소변 샘플을 생산하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 수득된 전-처리된 소변 샘플을 용해 용액에 용해시켜 용해된 소변 샘플을 생산하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 수득된 자성 나노입자를 제1 세척 완충액으로 세척하는 단계;
    (d) 단계 (c) 단계에서 수득된 자성 나노입자를 제2 세척 완충액으로 세척하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 수득된 소변 샘플에서 자성 나노입자를 수집하는 단계; 및
    (f) 용리 완충액으로 단계 (e)에서 수득된 수집된 자성 나노입자로부터 DNA를 세척 제거하여 추출 DNA를 수득하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  102. 제101항에 있어서,
    상기 용해 용액이 구아니디늄 이소티오시아네이트, Triton X-100, Tris-HCl, EDTA 및 이소프로판올을 포함하며,
    상기 구아니디늄 이소티오시아네이트가 약 1 내지 2 M의 농도를 갖고;
    상기 Triton X 100이 약 1 내지 2 %의 농도를 갖고;
    상기 Tris-HCl이 약 5 내지 10 mM의 농도를 갖고 상기 용해 용액이 약 6-7의 pH를 가지며;
    상기 EDTA가 약 3 내지 5 mM의 농도를 갖고;
    상기 이소프로판올이 용해 용액의 약 50 % 내지 80 % (v/v)의 부피를 갖는 것인, 방법.
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