CN111690719A - 确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法 - Google Patents

Abstract

确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将含有阴离子交换部分的表面与样品在适合诱导所述细胞和表面之间结合的条件下接触；b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；c)从细胞释放核酸；d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；和e)检测所述杂交体的存在或不存在。本发明提供快速和可自动化的方法，其中通过与阴离子交换表面的结合从周围的液体介质，如液基细胞学介质细胞收集细胞，如源自子宫颈拭子样品的上皮细胞。细胞以高亲和力和快速动力学特征直接结合于优选由携带阴离子交换部分的磁性颗粒提供的阴离子交换表面。结合于阴离子交换表面的细胞易与周围介质分离，可以直接重悬于适合在步骤d)中进行的后续杂交体捕获测定的组合物以检测，例如病原体核酸，如HPV核酸。

Description

确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法

本申请是2013年8月16日提交的发明名称为“确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法”的申请号为2013800456094的中国发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及检测含有细胞的液体样品中靶核酸存在或不存在的方法。

发明背景

为检测靶核酸存在或不存在，现有技术中已知几种方法是基于捕获包含待检测靶核酸的杂交体，在此称为杂交捕获检测(hybrid capturing assay)。各技术的基础描述于，例如WO 93/10263，进一步的发展描述于WO 2010/127223。各技术用于检测和表征特定的核酸序列和序列改变，例如检测指示感染的病毒或细菌核酸序列存在或不存在、疾病和癌症相关的哺乳动物基因的等位基因的变体的存在和法医样品中发现的核酸来源的鉴定，以及胎儿诊断，例如亲子鉴定。基于杂交体捕获的所述技术得到广泛应用，可用于检测DNA或RNA(反向杂交捕获)，特别是在临床诊断领域。FDA批准的检测是digene HC2 HPV DNA测定，它采用手动转换程序处理两种

和

LBC介质，以便后续通过digene HC2 High-Risk HPV DNA测定进行测试。相应手工方案需要耗时、手动的转换方法，包括许多重复的动作。为收集临床样品中的细胞，必须将它们离心，必须除去上清液，然后制备细胞以供随后的测定。每天处理500至2500份样本的高容量实验室由于重复的手工步骤而面临大量的人体工程学相关损伤，例如腕管综合症，该情况在较低容量的实验室中也有较低程度的存在。因此，本领域非常需要能避免手动步骤以及样品制备的自动化。

为各杂交捕获检测准备样品的自动化方法由QIAGEN公司以

AXpH DNA程序为名所开发。这是基于阴离子交换层析的DNA提取方案，根据所使用的细胞学介质，可以在4.5至6.5小时中自动制备最多96个样本。由于甲醛固定作用，收集在

介质中的样品需要延长细胞溶解时间的改进方案并添加蛋白酶K以从甲醛固定的

样品纯化DNA。这延长的运行时间使得客户无法在一个班期(8小时)内处理满盘的88个样本以及校准品和对照品，包括hc检测。因此，客户的以下需求仍未解决，即，以高通量HPV测试实现更快的周转时间，并减少人工干预的次数。

本发明的目的是提供快速和适于自动化地检测细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法。

发明概述

本发明提供了一种快速和可自动化的方法，其中将细胞，如源自宫颈拭子样品的上皮细胞，结合到阴离子交换表面，从而将其自周围的液体介质中收集。本发明特别适合于从液基细胞学介质中收集细胞。细胞以高亲和力和快速动力学特性直接结合于阴离子交换表面，所述阴离子交换表面优选由携带阴离子交换部分的磁性颗粒提供。结合于阴离子交换表面的细胞易于从周围介质中分离，并且可以直接重悬于适合后续杂交捕获测定的组合物，进行该测定以检测核酸，例如病原体核酸，特别是病毒核酸或细胞核酸。此外，令人惊讶地发现，不必在进行杂交捕获测定之前主动除去、各自分开阴离子交换表面。这显著减少了必要的准备步骤。因此，本发明的方法相对于现有的手动或自动样品制备方法提供了相当大的改进，因为它是快速、自动化的，并且只需要少量的准备步骤。与现有技术的方法相比，无需耗时的手工细胞制备步骤，此外，无需特殊的预处理，如调整结合条件。这节省了化学(试剂)，且优点还在于，机器人系统的整体操作容量可用于样品容积。如实施例所示，该方法提供了可靠的结果，并且不易出错，这是诊断学领域的重要特征。因此，本发明提供了一种针对上述客户需求的解决方案。

根据第一个方面，提供了测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)在适合诱导所述细胞和所述表面之间结合的条件下，将包含阴离子交换部分的表面与细胞样品接触；

b)将含有结合细胞的表面与剩余样品分开以收集细胞；

c)从细胞释放核酸；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；

e)检测所述杂交体的存在或不存在。

如实施例所示，该方法能够快速制备用于杂交捕获测定的细胞样品进而能够快速进行杂交捕获测定。该方法可靠、快速、适合于自动化。因此，它特别适用于诊断领域。此外，该方法对于高通量领域特别有用。

还提供了用于本发明方法的试剂盒，它包括：

a)磁性粒子，其中，所述磁性粒子的表面包含阴离子交换部分；

b)变性剂，其是含有碱，优选NaOH或KOH的碱性溶液；和

c)含有离液剂和选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂的任选的一种或多种添加剂的组合物。

相应的试剂盒用于快速制备用于杂交捕获测定的细胞样品。优选地，所述试剂盒以药盒的形式提供，其中所述试剂盒组分a)到c)包括在所述药盒的单独槽中。相应的药盒适用于能够处理磁性颗粒的机器人系统。

还提供了用于进行杂交捕获测定的试剂盒，其包括：

a)磁性粒子，其中，该磁性粒子的表面包含阴离子交换部分；

b)至少一种适合与靶核酸杂交的探针；和

c)至少一种能够结合双链核酸杂交体的粘合剂。

本领域技术人员从以下描述和所附权利要求会明白本申请的其它目的、特征、优点和各方面。然而，应当理解，以下描述、所附的权利要求书，和具体的实施例虽然显示了本申请的优选实施方式，但这些仅是通过举例说明的方式给出。通过阅读下文，本领域技术人员容易理解本发明所公开的构思和范围内的各种变化和修改。

附图简述

图1：手动AXpH-direct和手动转换I的比较。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是应用不同的珠悬浮液I-VII的HPV阴性临床样本的结果。手动转换(MC)作为参比。

图2：手动AXpH-direct和手动转换II的比较。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是应用不同的珠悬浮液I-VII的HPV阳性临床样本的结果。手动转换(MC)作为参比。

图3：AXpH-direct对于自动化I的适应性。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是采用了手动转换(MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的HPV阴性临床样本的结果。

图4：AXpH-direct对于自动化II的适应性。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是采用了手动转换(MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的HPV阳性SiHa细胞培养的结果。

图5：AXpH-direct对于自动化III的适应性。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是采用了手动转换(MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的来自临床库(库1)的HPV阳性样品的结果。

图6：AXpH-direct对于自动化IV的适应性。显示的HPV测定结果(RLU/CO[MW])是采用了手动转换(MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的另一临床库(库2)的HPV阳性样品的结果。

图7：AXpH-direct对于

和

样品的适应性。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是采用了手动转换(MC)作为参比、手动AXpH-direct方案或自动化AXpH-direct方案的不同HPV阳性(临床库)和阴性临床样品(阴性库)以及HPV阳性细胞培养物(细胞)的结果。所述样品含有

(PC)或

(SP)培养基。

图8：负责细胞与珠I结合的参数。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同的细胞与珠结合条件下(pH 5、7或9，iPrOH＝异丙醇)的珠部分和上清液部分(SN)的结果。利用PEI改性珠或二氧化硅珠(MAS G)。

图9：负责细胞与珠II结合的参数。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同的细胞与珠结合条件下(pH 5、7或9，iPrOH＝异丙醇)的珠部分和上清液部分的结果。利用DEAPS改性珠或二氧化硅珠(MAS G)。

图10：负责细胞与珠III结合的参数。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同的细胞与珠结合条件下(pH 5、7或9，iPrOH＝异丙醇)的珠部分的结果。比较了PEI改性珠和DEAPS改性珠。

图11：HPV测定结果I的一致性。显示的HPV测定结果(RLU/CO＝0,1-10,000)是72份个体样品的复制品。为在手动转换(MC)和手动AXpH-direct方案之间作比较，将各RLU/CO值描绘成x-y图。r²是相关系数。

图12：洗脱缓冲液的影响。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO[MW])是将2000μl或700μl样本应用于自动化AXpH-direct方案(分别是QS-SP-2000μl方案或者700μl方案)和施加STM/DNR或NaOH作为洗脱缓冲液的结果。手动转换(MC)作为参比。

图13：负责细胞与珠IV结合的参数。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同的细胞与珠结合条件下(pH 5、7或9，iPrOH＝异丙醇)的珠部分的结果。比较PEI改性珠和DEAPS改性珠。手动转换(MC)与700μl的样品输入用作参比。

图14：细胞结合过程中电导率的影响。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是在细胞与PEI改性珠结合过程中应用不同浓度的KH₂PO₄(0-1000mM)的洗脱液部分和上清液部分的结果。手动转换(MC)作为参比。

图15：样品酸化和稀释的影响。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是将未稀释的、水或醋酸稀释的样品进行手动AXpH-direct方案时洗脱液部分的结果。利用PEI改性珠。手动转换(MC)作为参比。

图16：优化珠的量I。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液的洗脱液部分的结果。手动转换(无珠)作为参比。

图17：优化珠的量II。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液的洗脱液和上清液部分的结果。手动转换(MC)作为参比。

图18：细胞培养物对照的结合。显示的HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液时，洗脱液和上清液部分的结果。SiHa和HeLa细胞用作样品。手动转换(MC)作为参比。

图19a)和b)：干扰物质。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是向样品添加各种干扰物质(CJ＝避孕胶冻，LJ＝润滑剂胶冻，AC＝抗真菌药膏，CS＝避孕杀精剂，D＝冲洗剂)并应用AXpH-direct方法的。无干扰的相应样品作为参比(w/o Inh)。

图20：检出限。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是使用HPV阳性临床库(库，稀释液1-5)的样品的不同稀释液并采用手动转换(MC)或AXpH-direct方法的结果。对于每一稀释液，可以从右侧的表格看出检测为阳性的阳性临床库样品。HPV阴性临床库(阴性库)作为对照。

图21：细胞构成(cellularity)对细胞结合的影响。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是使用HPV阳性临床库的样品的不同稀释液(8x-1/128x)并应用手动转换(MC)或自动化AXpH-direct方法的结果。HPV阴性临床库(阴性库)作为对照。

图22：洗脱体积的影响。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是为洗脱应用不同体积STM/DNR时的结果。手动转换(MC)作为参比。

图23：样品输入体积的影响。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是使用不同体积的样品输入时的结果。利用两个不同临床库的样品(库1和库2)。使用AXpH珠，手动转换(MC)作为参比。

图24：利用PEI改性珠以制备

样品。显示的所得HPV HC测定结果(RLU/CO)是两个不同的HPV阳性临床库(库1和库2)的结果。手动转换(MC)与2.0ml样品输入用作参比。

图25：PEI改性珠(

样本)的结合效率分析。显示的所得HPV HC测定结果(RLU/CO)是应用不同体积珠悬浮液(珠体积)时，临床库样品的上清液部分和洗脱液部分的结果。手动转换(MC)与2.0毫升样品输入用作参比。

图26：自动样品制备I(

样本)的珠用量微调。显示的所得HPV HC测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液(珠体积)时，HPV低阳性SiHa细胞(顶部)以及HeLa细胞培养物(底部)的样品的结果。手动转换(MC)与2.0毫升的样品输入用作参比。

图27：自动样品制备II(

样本)的珠用量微调。显示的所得HPV HC测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液(珠体积)时，HPV中等/高阳性SiHa细胞(顶部)以及HeLa细胞培养物(底部)的样品的结果。手动转换(MC)与2.0毫升的样品输入用作参比。

图28：自动样品制备III(

样本)的珠用量微调。显示的所得HPVHC测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的PEI改性珠悬浮液(珠体积)时，HPV高(顶部)、中等(中间)以及低(底部)阳性临床库的样品的结果。手动转换(MC)与2.0毫升的样品输入用作参比。

图29：自动AXpH-direct方法(AXpH)和RCS(快速捕获系统)(

样本)之间的关系。显示的所得HPV HC测定结果(RLU/CO)是阴性和阳性临床库的样品以及SiHa细胞培养物样品的结果。HC 2.0测定的执行有所不同。手动转换(MC)与2.0毫升的样品输入用作参比。

图30：参考HPV HC测定结果(

样本)，与手动转换(MC)的一致性。显示的HPV测定结果是394个独立品的重复结果。为在手动转换(MC)和自动AXpH-direct方案之间作比较，将各RLU/CO值绘制成一x-y图。r²是相关系数。

图31：通过提高样品输入量(

样本)来增强HPV HC测定灵敏度。显示的所得HPV测定结果(RLU/CO)是应用不同体积的样品输入时，Caski细胞培养物的样品和低阳性临床库的样品的结果。手动转换(MC)作为参比。

图32a和b：手动转换与AXpH-direct方法的2X2和散点图分析(Scatter plotsanalysis)。分析了Prequot

样品。

图33a和b：手动转换与AXpH-direct方法的2X2和散点图分析。分析了残留Prequot

样品。

发明详述

本发明提供一种方法，该方法能够利用阴离子交换表面收集细胞来制备细胞以供后续靶核酸检测。该方法可用于，例如，实验室研究和临床诊断目的，包括但不限于病原性生物或病毒的检测和鉴定，对特定疾病的遗传易感性检测以及用于肿瘤或其他疾病的诊断领域。尤其是，它可以用于病毒检测领域，特别是HPV的检测。

根据第一方面，本发明提供测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)在适合于诱导细胞与表面结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与液体细胞样品接触；

b)将含有结合细胞的表面与剩余样品分离以便收集细胞；

c)从所述细胞释放核酸；

d)在靶核酸与该靶核酸的特异性探针之间产生杂交体；

e)检测所述杂交体的存在或不存在。

下文详细描述了每个单独的步骤、所使用的材料以及合适的和优选的实施方式。

步骤A)

在步骤a)中，在适合于诱导细胞与所述表面结合的条件下，将细胞样品与包含阴离子交换部分的表面接触。

表面

用于步骤a)的所述表面是固体或半固体，并且包含阴离子交换部分。本文所用的术语“表面”尤其指在固相与液相接触时，固相中与液体接触的部分。固相提供的表面提供(例如携带)阴离子交换部分。阴离子交换部分将在下文详细描述。合适的固相可以由选自下组的材料制成，或者特别是可在它们的表面包含选自下组的材料：

-包含或由硅，例如二氧化硅和聚硅酸材料、石英、硼硅酸盐、硅酸盐、硅藻土或玻璃构成的材料，

-包含以下聚合物或由以下聚合物构成的材料，例如聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol)、聚丙烯酰胺、二乙烯基苯聚合物、苯乙烯二乙烯基苯聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或甲基丙烯酸甲酯聚合物；

-包含或由多糖，例如琼脂糖(agarose)、纤维素、葡聚糖或琼脂糖(凝胶)(sepharose)构成的材料；

-包含或由矿物质构成的材料；

-包含或由金属氧化物，例如氧化铝、氧化镁、氧化钛或氧化锆构成的材料；

-包含或由金属，例如金或铂构成的材料；和

-包含或由上述物质的衍生物构成的材料。

此外，固相也可以包含多于一种的上述材料。优选地，含有阴离子交换部分的表面至少由上述材料之一或它们的混合物构成。适合于阴离子交换层析的任何固相也可用作固相以提供包含阴离子交换部分，例如用阴离子交换部分官能化的表面。

固相的优选形式包括但不限于颗粒，例如珠、膜、过滤器、板、柱、容器和试纸条。根据一实施方式，包含阴离子交换部分的表面由一容器提供，例如，容器的内表面旨在接收细胞样品。表面的内表面或其各部分可以用阴离子交换部分作官能化，例如进行涂覆。可以用阴离子交换部分作官能化的各容器的实例包括但不限于：微管和微板的孔。在该实施方式中，细胞因所提供的阴离子交换部分而结合于容器(例如孔)的内表面，藉此易于从样品收集细胞。

根据优选的实施方式，表面可由固相提供，所述固相可作为悬浮液提供，并且可以与液相分离。当与液相(例如基于含细胞液体的细胞学介质，其作为细胞样品实例)接触时，含有阴离子交换部分的表面与液相接触以便进行细胞结合。含有阴离子交换部分的表面优选由颗粒提供，所述颗粒在其表面包含阴离子交换部分。所述颗粒的平均尺寸可以选自如下范围：100nm-50μm、200nm-40μm、300nm-35μm、400nm-30μm、450nm-25μm、500nm-20μm、550nm-15μm、600nm-12.5μm、650nm-10μm、700nm-7.5μm、750nm-5μm、800nm-3.5μm、800nm-3μm、800-2,5μm、800nm-2μm和800nm-1.5μm。相应尺寸，特别是较小尺寸的颗粒易于操作并可以很好地重悬于细胞样品中，例如10μm或更小、7.5μm或更小，优选为5μm或更小、2.5μm或更小、或1.5μm或更小。此外，相应的小颗粒能提供较大表面积，从而可以结合并因此可以从剩余样品(例如液基细胞学收集介质)中有效地收集细胞。此外，较小的颗粒易于在步骤d)中除去，而无需磁性分离步骤。用于提供或制备颗粒的合适材料如上所述。该颗粒也可包含多于一种的上述材料，例如包含含有或由不同材料制成的两层或更多层，以提供颗粒体。下文也会描述合适的实施方式。

优选地，磁性颗粒用于提供结合细胞的阴离子交换表面。使用磁性颗粒具有这样的优点，即，它们可以经处理并借助磁场移动。磁性颗粒可以具有例如超顺磁性、顺磁性、铁淦氧磁(ferrimagnetic)或铁磁特性。优选地，采用超顺磁性颗粒。磁性颗粒可以包含掺入颗粒和/或与颗粒结合的磁性材料。为了避免磁性材料的浸出，磁性材料宜完全包封，例如由提供表面的材料，如二氧化硅、聚硅酸、玻璃或聚合材料，如聚丙烯酸酯包封。所述磁性材料可提供颗粒的一个或多个芯，可以包含在所述芯中和/或可以涂敷在颗粒的芯上。

根据一实施方式，所述颗粒包含聚合物芯，如聚苯乙烯制成的芯，它由至少一个聚合物层包围，优选至少两个聚合物层，优选为聚乙烯亚胺层和/或聚丙烯酸酯层。优选颗粒表面由聚丙烯酸酯构成或包含聚丙烯酸酯。然后用阴离子交换部分，优选聚乙烯亚胺使所述颗粒表面官能化。如果利用磁性颗粒，磁性材料，例如氧化铁可以沉积在聚苯乙烯芯上。随后施加至少一个，优选至少两个如上所述的聚合物层，然后用阴离子交换部分，优选聚乙烯亚胺使得到的磁性颗粒表面官能化，以提供能提供阴离子交换表面的最终磁性颗粒。

阴离子交换部分

本发明中，用于从细胞样品结合细胞并由此收集细胞的表面包含阴离子交换部分。阴离子交换部分包括能够作阴离子交换的一种或多种基团，例如胺基。在适当条件下，特别是在合适的pH条件下，阴离子交换部分能够结合阴离子。然而，它们并不需要与阴离子相关。

根据一实施方式，阴离子交换部分由固相的表面材料提供。如果制成该表面的材料含有在表面与液体接触时能与细胞接近的阴离子交换基团，则该实施方式是适宜的。阴离子交换部分也可以形成结合于固相表面的化合物或组合物的一部分。优选用包含一种或多种阴离子交换基团的一种或多种阴离子交换部分使表面官能化。术语“部分”不包括对尺寸的任何限制。如果所述部分包括一种以上的阴离子交换基团，则相同或不同的阴离子交换基团可以存在于同一个部分。合适的阴离子交换部分的实例包括但不限于单胺、二胺、聚胺和含氮芳香族或脂肪族杂环基以及环胺、芳族胺和杂环胺。优选地，所述阴离子交换部分包括至少一种伯氨基，仲氨基和/或叔氨基。在优选的实施方式中，阴离子交换部分包括下式所示的伯、仲或叔胺或由它们构成：

R₃N、R₂NH、RNH₂和/或X-(CH₂)_n-Y

式中

X是R₂N、RNH或NH₂，

Y是R₂N、RNH或NH₂，

R是彼此独立为直链、支链或环状烷基、烯基、炔基或芳基取代基，可包括一个或多个杂原子，优选选自O、N、S或P，和

n是0至20的整数，优选为0-18。

因此，阴离子交换部分包括阴离子交换基团，并任选可以具有彼此可相同或不同的多个阴离子交换基团。阴离子交换基团优选是在高pH值下呈中性或不带电荷的并在低pH值下质子化、从而具有正电荷的化学基团。阴离子交换基团带正电的pH值取决于其pKa值。阴离子交换基团的pKa值可在约7.5-14的范围内，8-约14，优选约8.5-约13.5，8.75-13，更优选9-12.5，9.25-12，9.5-11.5或约9.5-约11。至少为8、优选至少为8.5，更优选至少为9、最优选至少为9.5的pKa值是有利的，因为在低到中等的pH值下所述阴离子交换部分是正离子化的，因而带正电。如此确保在标准细胞样品常规提供的宽pH值范围内和由此的pH值下细胞的强效结合。因此，在大多数情况下，结合条件无需具体调整，因为在细胞样品提供的pH值或pH环境中，至少部分阴离子交换基团是带正电的，从而允许细胞结合。

所述阴离子交换部分在适当pH值下正离子化，从而能吸引和结合带负电荷的分子，尤其是能吸引并结合细胞样品中所含有的细胞。如实施例所示，阴离子交换部分能够高效结合细胞，例如特别是宫颈细胞。优选地，本发明方法中所用的阴离子交换表面耐受分解酶、蛋白酶的降解、化学物质并耐受最高85℃，优选最高90℃，更优选最高95℃的高温。例如，PEI改性的表面满足各要求。如果在步骤d)之前不除去阴离子交换表面、分别与剩余的样品分开，使用相应的耐受性阴离子交换表面的优点在于它们在步骤d)时不会降解。

氨基可带有烷基、烯基、炔基和/或芳族取代基，包括环状取代基和与氮原子一起形成杂环或杂芳环的取代基。该取代基优选包含1-20个碳原子、更优选1-12个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1或2个碳原子。它们可以是直链或支链的，并且可以包括杂原子，如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟、氯、溴)原子，也可取代。取代基宜包括不超过4个、更优选不超过3个、不超过2个或不超过1个杂原子。

在一个实施方式中，阴离子交换部分带有1-30、1-25、1-20、1-15，1-10、2-8或2-6个氨基。

阴离子交换部分的具体实例包括但不限于：氨基甲基(AM)、氨基乙基(AE)、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基，如二乙基氨基乙基(DEAE)、N,N-二乙基氨基丙基三甲氧基硅烷(DEAPS)，乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、三甲氨基(TMA)、三乙基氨基乙基(TEAE)、直链或支链的聚乙烯亚胺(PEI)、羧化或羟烷基化的聚乙烯亚胺、聚醚胺(jeffamine)、精胺、亚精胺、3-(丙基氨基)丙胺、聚酰胺-胺(PAMAM)枝状聚合物、聚烯丙基胺，聚乙烯基胺、N-吗啉基乙基、聚赖氨酸和四氮杂环烷烃。优选的阴离子交换部分包括二烷基氨基，特别是二乙基氨基或直链或支链的聚乙烯亚胺(PEI)。最优选地，该表面包括分别被聚乙烯亚胺官能化，以提供所述阴离子交换部分。线性聚乙烯亚胺(PEI)含有仲胺，而相比之下，支链PEI包含伯胺、仲胺和叔胺基团。根据一实施方式，阴离子交换部分非多肽或蛋白。

在一实施方式中，所述阴离子交换部分包含选自下组的实体：下式所示的伯、仲和叔单胺和聚胺：

R₁R₂R₃N,

R₁R₂N(CH2)_nNR₃R₄,

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)_mNR₄R₅,

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)_mNR₄(CH2)_oNR₅R₆

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)mNR₄(CH2)_oNR₅(CH2)_pNR₆R₇

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)mNR₄(CH2)_oNR₅(CH2)_pNR₆(CH2)_qNR₇R₈

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)_mNR₄(CH2)_oNR₅(CH2)_pNR₆(CH2)_qNR₇(CH2)_rNR₈R₉

R₁R₂N(CH2)_nNR₃(CH2)_mNR₄(CH2)_oNR₅(CH2)_pNR₆(CH2)_qNR₇(CH2)_rNR₈(CH2)_sNR₉R₁₀

式中

m、n、o、p、q、r和s彼此独立地可以是2-8，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀可以相同或不同的选自H、烷基(支链或非支链的，饱和或不饱和的，优选包含1至10个C原子)或芳基。

在一实施方式中，阴离子交换部分包括N-丙基-1,3-丙二胺或五亚乙基六胺。在某些实施方式中，阴离子交换部分选自精胺或亚精胺。如上所述，虽然优选用聚乙烯亚胺使表面官能化，但优选为颗粒表面，更优选的为磁性颗粒表面。

本发明的表面可以包含多于一类的阴离子交换部分，并且可以相应地采用多种阴离子交换部分进行官能化。因此，表面上还可以存在两种或更多种不同的阴离子交换部分。因此，包含不同阴离子交换部分的混合物的表面属于本发明的范围之内。然而，主要地或专门使用一类阴离子交换部分也落在本发明的范围内。

为用阴离子交换部分使表面官能化，可采用若干种方法。阴离子交换部分可以共价或非共价地，通过静电方式直接结合于表面，和/或可形成聚合物或其它组合物的一部分，所述聚合物或组合物形成表面涂层或者在固相的表面提供。阴离子交换部分也可以沉淀在固相上。根据一实施方式，阴离子交换部分以涂层形式在固相上提供。

根据一实施方式，采用共价偶联策略。根据一实施方式，固相在其表面包含适合与阴离子交换部分共价连接的官能团。例如，所述表面可以包含选自下组的官能团：Si-O-Si、Si-OH、醇、二醇或多元醇、羧基、胺、磷酸酯或膦酸酯。阴离子交换部分可以连接于固相，例如，通过使用环氧化物、羧基，特别是活化的羧基，硅烷、酸酐、酰氯、甲酰基、三氟乙基磺酰基(tresyl group)、五氟苯基磺酰氯或马来酰亚胺基。用于偶联阴离子交换部分的官能团可以直接连接于固相或经(直链或支链的)间隔基团，例如烃类，如-(CH₂)n-基团、碳水化合物、聚乙二醇和聚丙二醇连接于固相。或者，还可利用由包含阴离子交换基团，如氨基官能团的单体组成的聚合物在固相的表面上提供阴离子交换部分。在某些实施方式中，所述固相材料具有含硅的表面，例如聚硅酸表面，阴离子交换部分用硅烷基偶联于所述表面。根据一优选的实施方式，固相的表面包含可用于共价偶联阴离子交换部分如PEI的羧基。优选由聚丙烯酸酯层提供相应的羧基。

阴离子交换部分可以通过接头基团连接于固相的表面。连接基团优选直链、支链或环状亚烷基、亚烯基或亚炔基，优选包含1-20个碳原子、更优选1-12个、1-8个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或1或2个碳原子。它可以进一步包含杂原子，如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟，氯，溴)原子，最好不超过4个，更优选不超过3个，不超过2个或不超过1个杂原子。在优选的实施方式中，连接基团是烯烃基(alkylene)，特别是丙烯基(propylene)。

根据一实施方式，为产生阴离子交换表面，将表面进行活化从而促进或使阴离子交换部分能够偶联。优选进行化学活化。化学活化包括但不限于使用氧化试剂。根据一实施方式(如果利用COOH基团作偶联，这是优选的)，采用碳二亚胺，如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)用于活化表面，特别是带有COOH基的表面。EDS是适用于偶联胺的羧基活化剂，从而得到酰胺键。然而，EDC也可用于活化磷酸酯基。EDC可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，或磺基-NHS联用以提高偶联效率和/或产生稳定的胺反应活性产物。

表面的额外官能化

在某些实施方式中，除了阴离子交换基团，所述表面还包含额外的官能团。非限制性的实例描述如下。所述官能团可由表面材料本身提供，例如酸性基团，如羧基(例如，如果表面是由聚丙烯酸酯制成的)，或各官能团可以由共价或非共价连接于该表面的配体来提供。所述官能团可如本文中为阴离子交换部分所述施加于表面。

根据一实施方式，所述官能团的pKa值为0至7的范围内，优选1至5。合适的例子包括离子交换剂，特别是阳离子交换剂，优选酸性基团，如羧基。其它合适的基团包括甜菜碱、磺酸根、膦酸根和磷酸根基。如本文所述，固相可包含羧基，以允许与阴离子交换部分相连。当连接所述阴离子交换部分时，可选择阴离子交换部分的浓度，以便使得所述羧基的至少一部分不与阴离子交换部分结合，因此，其中羧基是在表面处接触。

根据一实施方式，所述表面包含惰性配体。尤其是，惰性配体在2-14、3-13、4-12的pH值范围下是中性的或不带电荷的，优选为亲水性的。惰性配体可如本文中阴离子交换部分所述连接于表面。优选地，惰性配体是有机部分，特别是烷基、烯基、炔基或芳族部分，可以是直链、支链或环状的，并且其优选包含至少一个杂原子，如氧、氮、硫、硅和卤素(例如氟、氯、溴)原子。惰性配体优选包含1-20个碳原子，更优选1-12、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2个碳原子，和至多4个，更优选至多3、至多2、或至多1个杂原子。特别优选的是含有至少一个羟基，特别是至少2个羟基的惰性配体，如包含2,3-二羟基丙基的配体。惰性配体的具体实例为(2,3-二羟基丙基)氧丙基。惰性配体可用于降低阴离子交换部分偶联过程中连接于固相的阴离子交换部分的用量。因此，可以为固相的后续应用控制并调节固相表面上的阴离子交换部分的密度。特别是，固相可包含的阴离子交换部分和惰性配体的比率为约1:1至约1:10，优选约1:2至约1:5，更优选约1:3。

在另一个实施方式中，固相不包含此类惰性配体。根据一实施方式，固相仅包含阴离子交换部分，并且不包括其它配体。根据一实施方式，固相含有含硅的表面，优选聚硅酸表面，衍生自含有阴离子交换基团的硅烷化合物，且并不由其它硅烷化合物衍生。

合适的固相、阴离子交换基团、官能团和惰性配体(含有中性基团N)的实例描述于WO 2010/072834、DE10 2008 063 001A1和DE 10 2008 063 003，各自的内容通过引用并入本文。

阴离子交换表面的优选实施方式

根据一特别优选的实施方式，阴离子交换表面是这样一种表面，优选为羧化的表面，其包含阴离子交换部分，优选含有胺基。优选地，聚乙烯亚胺(PEI)作为阴离子交换部分，以便从液体样品中结合细胞。优选地，以颗粒的形式、更优选以磁性颗粒的形式提供所述阴离子交换表面。阴离子交换表面的这种优选实施方式将进一步详细说明。

聚乙烯亚胺(PEI)是一种聚合物，其分子构建自亚乙基亚胺(ethyleneimine)重复单元(也称为吖丙啶，aziridine)，其3元环在聚合过程中打开。

示范性PEI分子如下式所示：

因此，PEI通常是通过氮原子成键的亚乙基亚胺单元构建的支链分子。在某些实施方式中，PEI的使用形式是从西格马-奥德里奇化学公司(“Sigma-Aldrich”)购买的产品，产品号408719(100毫升)。该分子是乙二胺封端的聚乙烯亚胺，通过光散射(LS)检测(根据西格马-奥德里奇公司)的平均分子量约800，通过凝胶渗透色谱(GPC)测定的平均分子量约600。亚乙基亚胺(CH2CH2NH)的分子量为43，假设如西格马-奥德里奇公司所报告的PEI分子的平均分子量为800，该分子具有约18个单元的CH2CH2NH，其中一些可以是支链的。在本质上它具有约18个伯胺(-NH2)、仲胺(-NHR)或叔胺(-NR2)基团(其中R是通过碳原子连接键合到胺氮的含碳基团)。

适用于本文的PEI的形式当然不限于可得自西格马-奥德里奇公司的该产物。PEI在本质上是聚合性的，允许有各种广泛的形式，在其合成期间允许聚合程度至少部分受控。因此，具有各种不同数目的重复单元和不同支链量的许多PEI变体适用于本发明。例如，具有10-30个CH2CH2NH单元是合适的，例如具有12-24个单元的，例如具有16-20个单元的。通常有适合细胞捕获的长度范围。另外，也可以使用乙二胺的不同封端来制备适用于本发明的PEI变体。这样封端可以包括，但不限于，1,2-丙二胺、1,3-丙二胺、1,2-丁二胺、1,3-丁二胺、1,4-丁二胺。

可通过分子量表征适合在本发明中用作阴离子交换部分的PEI分子。尤其是，合适的PEI分子具有600-800Da的分子量。当由LS测量时，合适的PEI分子的分子量经测量为700-900Da，当由GPC测定时，适宜的PEI分子的分子量经测量为500-700Da。

为提供包含PEI作为阴离子交换部分的表面，PEI通常固定在，例如结合到固体支持物，例如颗粒，优选磁性颗粒子的表面。通常利用易于PEI结合的材料来形成颗粒。可形成此类颗粒的示范性材料包括经修饰可连接配体的聚合物材料。通常情况下，此类固体支持物本身可以衍生得到易与PEI分子反应并在表面与PEI之间产生化学键的表面官能团。经常采用的理想表面官能团是羧基(-COOH)。提供或经修饰后可提供羧基和/或氨基以供连接PEI的示范性聚合材料包括例如，聚苯乙烯、胶乳聚合物(如，聚羧酸盐涂布胶乳)、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚丙烯酸酯及其衍生物。可用于形成合适颗粒的聚合材料在授予Mathiowitz等的美国专利第6235313号中有描述。其它材料包括玻璃、二氧化硅、琼脂糖、氨基-丙基-三乙氧基硅烷(APES)改性材料和上述材料。

PEI分子与羧化颗粒(如磁性颗粒)的反应过程中，PEI分子上所有可能的胺基，例如上述西格马-奥德里奇公司的产品中18个可能的基团中的一个胺基被用于与颗粒表面的COOH基团反应形成碳化二亚胺键。总的胺基的剩余部分，例如上述西格马-奥德里奇公司的产品中的17个基团可用于质子化，从而可提供阴离子交换功能。在一些实施方式中，合成方案包括：用碳酸盐和MES缓冲液洗涤一定数量的微球；制备磺基-NHS和EDAC；微球与磺基-NHS和EDAC温育30分钟；用MES和硼酸盐缓冲液洗涤微球；微球与PEI接触8-10小时；和漂洗未结合微球的PEI。制备优选用于本发明方法中的PEI官能化颗粒的合适方法描述于US2010/0009351中，其通过引用并入本文。

可用于结合PEI并用于本文所述方法中的颗粒有各种来源，例如：色拉丹磁性羧基改性磁珠(零件号3008050250，色拉丹公司(Seradyn))，Polysciences BioMag(PB公司)羧基珠，具有羧基涂层的Dynal聚合物包封的磁性珠粒，和可购自PolyScience(PS公司)的Polybead羧酸盐改性微球，目录号09850。

颗粒表面PEI分子的密度之高甚至能利用少量颗粒就效地捕获样品中的细胞。

如上所述，颗粒宜是磁性的。优选磁性颗粒，因为将它们从其悬浮的溶液中分离通常不需要离心。磁性颗粒可以通过施加磁场使之移动，因此其适合于自动化。合适的和优选的颗粒尺寸在上文中进行了描述，这些尺寸也适用于本优选的实施方式，其中的PEI基团用作阴离子交换部分。

因为氮原子是三价的，并且由于聚合反应的条件下，各PEI分子可以具有伯、仲和叔胺基团的混合物。因此，聚乙烯分子表现出在一定范围内的多个pKa，大致与伯、仲和叔脂肪胺的pKa范围一致。所以，PEI的pKa通常大于9.0。因此，在低pH下，PEI通常带正电，甚至可以因胺基在低于其pKa的pH下的质子化而使每个分子携带多个正电荷，从而能够强力结合溶液中的细胞。因此，使用PEI官能化颗粒对于浓缩和因此从含有细胞的样品中收获细胞特别有效。

PEI分子在本发明中优选用作阴离子交换部分的优点还在于，因为它们耐受，例如免受分解酶所致的降解，刺激性的化学品如去污剂，并能加热到最高95℃。这是尤其有利的，因为它能使含有PEI作为阴离子交换部分的阴离子交换表面，优选本文描述的PEI官能化的磁性颗粒，维持存在于样品/处理混合物中，即便在细胞裂解后，并在可维持存在于核酸变性和杂交体的生成和捕获期间。因此，如实施例所示，无需在进行裂解、变性以及进行杂交体捕获测定之前先分离携带PEI作为阴离子交换部分的细胞收集磁性颗粒。这是重要的优点，因为省去了操作步骤，还使得该方法对用户非常便利。如实施例所示，该实施方式是合适的并且良好起作用是非常出乎意料的，因为PEI本身可用作酶解过程的抑制剂，或者能捕获释放的核酸。因此，未曾预料到含有PEI基团作为阴离子交换部分的阴离子交换表面能在核酸释放、变性和杂交体的产生及捕获期间维持在样品/处理混合物中，然而，这在本文显示是可能的。

颗粒悬液

携带本文所述阴离子交换部分的颗粒可以悬浮液的形式提供。优选地，它们包含在水性溶液中。在一简单的实施方式中，颗粒在水中提供的。根据一实施方式，含有颗粒的悬浮液的pH值为13或更低、12个或更低、11或更低、10或更低、9或更低、8.5或更低、8或更低、7.5或更低、7或更低，优选具有低于6.5的pH值。优选的pH值可以选自3.5-10、3.75-9、4-8、4.25-7、4.5-6.5、5-6.25和5.5-6.25。根据一实施方式，所述溶液包含选自下组的一种或多种添加剂：缓冲液，特别是本文描述的生物学缓冲液(例如TRIS、MES或MOPS)、清洁剂，优选非离子型去污剂(例如浓度为2.5％或更低，更优选1％或更低、0.5％或更低、0.25％或更低、或0.175％或更低)和防腐剂，如叠氮化物(例如，浓度为0.5％或更低、0.25％或更低、0.2％或更低、0.1％或更低、0.05％或更低)。该溶液的设计会影响颗粒的沉降特性。含有所有前述添加剂的溶液具有良好的沉降特性，并特别适合于含有胺基的颗粒，特别是经聚乙烯亚胺官能化的磁性颗粒。用于提供颗粒悬浮液的溶液优选能够稳定存储的，从而使所述颗粒悬浮液至少存储3个月、至少6个月、优选至少12个月。这些特性由可用于提供颗粒悬浮的上述溶液实现。提供颗粒悬浮液的合适缓冲液也描述于US 2010/0009351中，其通过引用并入本文。

根据一实施方式，颗粒悬浮液包含提供阴离子交换表面的颗粒，所述颗粒优选如上所述的磁性颗粒，其浓度选自：1mg/ml-100mg/ml、1mg/ml-75mg/ml、2mg/ml-60mg/ml、2mg/ml-50mg/ml、2.5mg/ml-40mg/ml、2.5mg/ml-35mg/ml、3mg/ml-30mg/ml、4mg/ml-27.5mg/ml、5mg/ml-25mg/ml、7.5mg/ml-22.5mg/ml、10mg/ml-20mg/ml和12.5mg/ml-17.5mg/ml。在10-50mg/ml，优选10mg/ml-20mg/ml的浓度下实现好的结果。最优选地，包含在悬浮液中的颗粒，浓度大约为15mg/ml。合适的和优选的颗粒尺寸和磁性颗粒的例子如上所述。

细胞样品

细胞样品含有细胞。所述细胞可以是原核或真核细胞。优选地，所述细胞是真核细胞，更优选的细胞是哺乳动物细胞。根据一优选的实施方式，所述细胞是人细胞。所述细胞可以来源于，例如生物学，特别是临床样品。细胞样品可以从人，例如患者，使用细胞收集装置，诸如拭子、宫颈梳(cervical broom)、宫颈刷、刮片、一次性拭子(floqswab)或类似收集装置或通过采集体液，如血液、尿液、体液、精液等来收集。因此，基本上任何存在细胞的样品均可以使用，包括但不限于：细胞悬浮液，含有细胞的标本或培养物(例如，细胞和组织培养物)；临床和实验室的生物学样品；食品和农业样品；和法医样品，包括精液、毛发、血液、皮肤和唾液样品；从哺乳动物，优选人获得的含细胞样品，特别是身体样品，如体液和组织，特别是全血、骨髓穿刺液、淋巴液、尿液、羊水，精子/精液、支气管灌洗液，体内分泌物、鼻腔分泌物、阴道分泌物、伤口分泌物或从前述体液和组织得到的含细胞样品。样品可以来自任何哺乳动物，包括人，并且明确地包括液体、固体(例如，粪便)或组织，以及液体和固体食物，饲料产品和成分，例如乳制品、肉和肉副产品，以及废料。明确包括的是直接从哺乳动物取得的样品以及存储在防腐剂中的样品，包括但不限于：石蜡包埋的组织样本，存储在液基细胞学介质中的细胞和组织或细胞样品。细胞包含在可以至少部分源自生物样品本身的液体中(例如在血液，或细胞培养物的情况下)，或者可以部分或完全由用于接收所述细胞和/或用于接收含细胞的生物样品的收集介质来提供。例如，通过使用拭子或其它细胞收集装置(如刮片或刷)获得的细胞样品可以与收集介质接触，例如液基细胞学介质。这是在处理上皮细胞，如宫颈细胞时是特别优选的。根据一实施方式中，细胞是上皮细胞。相应的细胞可以从，例如细胞培养物收集，或可通过使用适当的收集装置从患者获得。根据一实施方式，细胞是宫颈细胞。相应的细胞可以，例如通过使用拭子或其它合适的收集装置(如刮片或刷)自女性收集。然后在运输和/或储存期间，收集的细胞通常与液基细胞学介质接触以保存细胞。本文所用的术语“细胞样品”还包括包含在相应的收集和/或存储介质中的细胞或与相应的收集和/或存储介质接触的细胞样品，特别是包含在液基细胞学介质中的细胞。

在一实施方式中，细胞样品包含至少一种固定剂。在一实施方式中，样品包括交联的和/或非交联的固定剂。交联固定剂通过在样品的蛋白之间产生化学键，从而导致它们在样品中沉淀和固定来起作用。示例性的交联固定剂包括，但不限于，甲醛和多聚甲醛。非交联固定剂不会化学性地改变样品中的蛋白质；它们只是简单地使得蛋白质在发现它们的样本中沉淀。非交联固定剂包括乙醇、丙酮、甲醇及其混合物。

在优选的实施方式中，细胞包含在液基细胞学介质中。液基细胞学介质是众所周知的，广泛使用在现有技术中，因此，无需在此详细描述。示范性液基细胞学介质包括但不限于：

(马萨诸塞州贝德福德的Hologic公司-Hologic,Inc.,Bedford,MA)(基于甲醇的液基细胞学介质)；

(新泽西州富兰克林湖的碧迪公司-Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)(含有醇和醛的液基细胞学介质)；M4(Remel)、M4RT(Remel)、Copan UTM(通用传输介质)和Eagle最低必需培养基(EMEM)。所用的液基细胞学介质保存细胞，因此不诱导或基本上不诱导细胞裂解。如实施例所示，收集在液基细胞学介质中的基础样品材料可以采用本发明方法分析。如果需要的话，可以预先从基础样品材料中取出细胞的一部分用于其它目的。这些细胞可用于，例如其它分析目的，例如细胞学检查。根据一实施方式，先将包含在样品材料中的细胞悬浮，再作处理，例如通过涡旋振荡。如果只有基础样品材料的等分试样进行处理，那么这就是可行的。根据一实施方式，细胞样品是

使用前(pre-quot)样本。在

使用前(pre-quot)样品中，对收集在

介质中的基础材料进行处理。例如，可使用本发明的方法处理该基础材料的含细胞部分。优选对基础材料作处理，因为它避免了样品的制备步骤，从而节省了操作步骤。根据一实施方式，细胞样品是

使用后(post-quot)样品。

使用后(post-quot)样品通过样品制备步骤从基础

样品得到，以允许，例如通过细胞学，如PAP测试平行分析所收集的细胞。例如，从密度梯度获得收集的细胞，如子宫颈细胞，在

介质中再次悬浮。这种富集的细胞悬浮液在本领域称为“post-quot(使用后)”或“梯度后”样品。如实施例所示，这两类

样品可以用本发明的方法进行处理。此外，残留的pre-quot(使用前)样品可以如实施例所示进行处理。

接触条件

在步骤a)中，在适合诱导细胞和表面结合的条件下，将细胞样品与包含阴离子交换部分的表面接触。结合由细胞与表面之间的直接相互作用介导，特别是在细胞和阴离子交换部分之间。因此，细胞与表面的结合不是由特定结合伴侣(如抗体)或类似的结合分子介导的。将细胞与阴离子交换表面接触足够长的时间，如足以使细胞本身与阴离子交换表面结合/附着于的时间。这样的一段时间应至少为10秒、优选至少15秒、更优选至少20秒、并且优选选自：至少30秒、至少1分钟、至少1.5分钟、至少2分钟、至少2.5分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟或至少6分钟。合适的温育时间也可以由技术人员确定。如实施例所示，很短的温育期已经合适细胞快速结合到本文所述的阴离子交换表面。

根据一实施方式，将上述颗粒悬浮液的等分试样接触细胞样品，其中细胞包含在液体中，优选上述液基细胞学介质。根据一实施方式，包含液体的细胞样品的体积选自：0.05ml-10ml、0.1ml-7.5ml、0.2ml-6ml、0.25ml-5ml、0.3ml-4ml、0.35ml-3.5ml、0.4ml-3ml和0.5-2.75ml。本发明方法尤其有利的是小体积和大体积样品均能处理。此外，也可以从稀释的样品中捕获细胞。增加样品体积的重要优势在于该方法的总体灵敏度可以得到提高。此外，由于通常无需化学物质来调节细胞结合条件，尤其是调节细胞结合的pH值，机器人系统的整个处理容积基本上可作为样品体积。所选的样品体积接触颗粒悬浮液的等分试样。颗粒悬浮液的合适等分试样体积可以选自，例如5μl-150μl、7.5μl-125μl、10μl-100μl、15μl-85μl、20μl-75μl、25μl-65μl、30μl-55μl和35μl-50μl。优选地，颗粒悬浮液包含所述颗粒，优选磁性颗粒，其浓度选自上述颗粒悬浮液的范围。机器人系统更易于处理至少15μL、至少20μL、至少25μL、优选至少30μL的较大体积等分试样，因此是优选的。颗粒悬浮液和样品可以按任何次序进行接触。例如，提供所需量的颗粒悬浮液的相应试样可以在一容器中提供，将样品加入颗粒悬浮液，或反之亦然。包含样品和颗粒悬浮液的所得混合物优选包含选自以下浓度的颗粒：50μg/ml-2000μg/ml、75μg/ml-1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml-1250μg/ml、140μg/ml-1200μg/ml、150μg/ml-1150μg/ml和165μg/ml-1100μg/ml。当使用平均尺寸为5μm或更低、优选3μm或更低、优选尺寸在500nm-2μm、优选800nm-1.5μm的颗粒，优选磁性颗粒时，这些浓度是优选的。最优选的，磁性颗粒的平均尺寸为约1μm。如上所述，优选使用聚乙烯亚胺官能化的磁性颗粒。

如上所述，在优选的实施方式中，细胞样品包含上皮细胞，例如收集在液基细胞学介质中的子宫颈细胞。如果所处理的细胞样品中，液基细胞学介质含有交联固定剂(例如，

样品)，含有细胞样品与颗粒悬浮液的混合物优选包含以下浓度的上述颗粒，优选磁性颗粒：300μg/ml-2000μg/ml、400μg/ml-1500μg/ml和500μg/ml-1250μg/ml。例如，0.5ml-1ml体积的样品(例如，

样品)可以与35μL-50μL的上述颗粒悬浮液接触，优选包含的颗粒浓度为10-50mg/ml，优选10-20mg/ml，特别是约15mg/ml。相应的颗粒浓度也适用于利用含较高浓度细胞的液基细胞学介质。如果所处理的细胞样品中，液基细胞学介质不包括交联固定剂(例如，

样品)，包含样品和颗粒悬浮液的混合物优选包含以下浓度的上述颗粒，优选磁性颗粒：100μg/ml-750μg/ml、125μg/ml-600μg/ml、150μg/ml-500μg/ml和165μg/ml-400μg/ml。例如，体积为2ml到3ml的细胞样品(例如，

样品)可与35μL-50μL的上述颗粒悬浮液接触，优选包含的颗粒浓度为10-20mg/ml，特别是15mg/ml。相应的颗粒浓度也适用于细胞浓度较低的液基细胞学介质的利用。如上所述，优选地，使用聚乙烯亚胺官能化的磁性颗粒。所述颗粒还可在它们的表面包含羧基。优选地，所述磁性颗粒的平均尺寸为5μm或更低、优选3μm或更低、优选的平均尺寸在750nm-2μm、优选800nm-1.5μm的范围内。最优选地，磁性颗粒的平均尺寸为约1μm。

如实施例所示，根据本文描述的教导，使用阴离子交换表面能在各种条件下结合细胞。这是尤其有利的，因为它产生了这样一个事实，即本发明的方法是可靠且不易出错。如实施例所示，细胞样品，特别是子宫颈细胞样品中所含的许多污染物并不会明显干扰细胞结合的性能。这是在诊断学领域，特别是HPV的诊断中是重要的优势，其中细胞样品，如子宫颈样品可包含污染物。

此外，如实施例所示，细胞与阴离子交换表面的结合可以发生在不同的pH值下。合适的pH范围也依赖于阴离子交换部分的阴离子交换基团的pKa值，这是因为阴离子交换基团应该带正电荷以确保细胞有效结合。因此，根据一实施方式，结合发生在其中阴离子交换部分的阴离子交换基团带正电的pH值下。根据一实施方式，细胞结合发生在步骤a)中，在选自以下的pH值下：9.5或更低的pH值、9或更低的pH值、8.75或更低的pH值、8.5或更低的pH值、8.25或更低的pH值、8或更低的pH值、7.75或更低的pH值、7.5或更低的pH值、7.25或更低的pH值、7或更低的pH值、6.75或更低的pH值、6.5或更低的pH值、6或更低的pH值。优选地，根据细胞样品，细胞结合发生在选自以下的pH值下：3至8.5、3.5至8.0、3.5至7.75、3.5至7.5、3.5至7.25、3.75至7或4至6.5。如实施例所示，优选结合发生在8.5或更低的pH值下，优选8或更低、更优选7.5或更低、特别是在7或更低或6.5或更低的中性或酸性pH值下，细胞与阴离子交换表面的结合效率得到提高，结合非常迅速。当用胺，例如聚乙烯亚胺官能化表面时，所述的pH值和范围是特别优选的。本发明方法的特别优点是，细胞与阴离子交换表面的结合可以在各种条件下，特别是各种pH值下发生。藉此，本发明的方法可以应用于大量的细胞样品，而无需对包含细胞的液体作特别调整，特别是pH值的调整。例如，上皮细胞，如子宫颈细胞通常在收集/保存介质中收集/保存。根据所使用的收集/保存介质，所述介质可以具有中等到或微碱性至酸性的pH值。因此，如果细胞包含在收集介质，例如液基细胞学介质中，通常提供或存在上述pH值。例如，标准的收集介质SUREPATH的pH值约为7，而标准收集介质

的pH值为4至5。如实施例所示，本发明的方法可以这两种收集介质联用，即使它们的pH值相差很大。当如本文所述包含在相应收集介质中的细胞接触阴离子交换表面时，细胞以快速动力学特性直接结合于所述表面。因此，处理这样的样本时，使用本发明的技术无需特别调整结合条件。无需通过向细胞样品中加入结合缓冲液或通过调节pH值来实现特定的pH值范围，就能使细胞与阴离子交换表面结合。这是一个重要的优势，因为它节省了处理步骤，节约成本，使得该方法适用于许多不同类型的细胞样品并降低了处理失误导致结果失真的风险。因此，根据一实施方式，结合条件无需调整，特别是pH值无需调整，阴离子交换表面，优选包含阴离子交换部分的磁性颗粒与细胞样品简单接触，然后进行温育就能使细胞结合。

然而，如实施例所示，结合也能在有添加剂，例如醇的存在下发生。因此，如果需要，可以在结合步骤中加入相应的添加剂，例如具有1至5个碳原子的支链或直链醇，如异丙醇，或各醇的混合物。然而，加入相应的添加剂并非必要，如实施例所示，细胞与阴离子交换表面的结合不一定藉此得到改善。因此，为简便起见，优选不将醇或其它添加剂加入细胞样品以支持细胞与阴离子交换表面的结合。如上所述以及实施例所证明的，在本发明的范围内优选提供悬浮液形式的阴离子交换表面，特别是包含阴离子交换部分的磁性颗粒。因此在结合步骤，就存在有用于提供颗粒悬浮液的液体。如果，例如要处理具备相当碱性的细胞样品，这种液体可以用来作特定的pH调整。通过使用酸性悬浮介质来悬浮所述阴离子交换颗粒，可以降低含有颗粒和细胞样品的结合混合物的pH值，而不增加处理步骤，且无需单独添加结合剂。

步骤a)后，细胞结合至包含阴离子交换基团的表面。

步骤B)

在步骤b)中，细胞所结合的表面与其余的样品分开，藉此收集细胞。在此，为分离结合有细胞的表面与其余样品，可采用不同的操作模式，这也取决于所使用的固相。非限制性的实例如下所述。

例如，如果利用容器，其中该容器的内壁至少部分用本文所述的阴离子交换部分官能化，其余样品可以通过倾析丢弃，或者可以通过抽吸或类似的方法除去。结合的细胞因阴离子交换部分而维持与该容器的内表面相连。相应的分离步骤可以采用机器人系统来进行以分开其余样品。

根据一优选的实施方式，包含阴离子交换部分的颗粒，特别是用聚乙烯亚胺在其表面作官能化的颗粒用于提供阴离子交换表面。如果颗粒是非磁性的，可以通过，例如根据一实施方式中离心的协助下，通过过滤或沉降收集它们。使用磁性颗粒是优选的，因为可以借助磁场，例如使用永磁铁简单地处理含有结合细胞的磁性颗粒。该实施方式是优选的，因为它与能够处理磁性颗粒的已有机器人系统兼容。在此，现有技术中存在不同的机器人系统可与本发明联用来处理结合细胞的磁性颗粒。根据一实施方式，磁性颗粒收集在反应容器的底部或侧面，而其余的液体样品则从反应容器中除去，留下收集到的细胞结合磁性颗粒。可通过倾析或抽吸去除剩余样品。此类系统是现有技术中熟知的，因此无需在此详细描述。

在已知用于处理磁性颗粒的替代系统中，将磁体投入反应容器来收集磁性颗粒，所述磁体通常覆有盖子或外壳。然后可将携带所结合细胞的磁性颗粒转移，例如新的反应容器中，例如包含重悬液，优选变性组合物的容器中，下文将描述。由于相应的系统是现有技术中熟知的，也可以商品化购得(例如

凯杰公司-QIAGEN)，无需在此对其进行详细描述。

在已知用于处理磁性颗粒的进一步的替代系统中，可将包含磁性颗粒的样品吸入移液管尖端，可通过将磁体置于例如移液管尖一侧的位置从而将磁性颗粒收集在移液管尖端。然后，自移液管尖端释放剩余的样品，而收集的携带结合细胞的磁性颗粒保持在移液管尖端。然后可以进一步处理所收集的磁性颗粒。此类系统也是现有技术中熟知的，并且也可商品化购得(例如BioRobot EZ1，凯杰公司)，因此，在此无需任何详细的描述。

在本发明的范围内优选在步骤b后将结合的细胞与液体组合物接触。该实施方式的优点在于，如果使用磁性颗粒的话，它尤其可以支持细胞收集，特别是如果使用机器人系统、将磁体投入反应容器来收集磁性颗粒。通过将收集的仍与磁性颗粒结合的细胞与液体组合物接触，在该实施方式中可确保含有结合细胞的颗粒有效地与磁体分开并再分散在液体组合物中。然而，当使用如本文所述的其它磁性分离系统或其它阴离子交换表面时，收集的细胞与液体组合物接触还具有额外的通用优点。液体组合物尤其可以用于制备收集的细胞以供杂交体捕获测定。因此，液体组合物与随后的下游工序相兼容，特别是在步骤d)和e)进行的杂交体捕获测定。可将液体组合物添加到收集的与阴离子交换表面结合的细胞中，例如添加到携带结合细胞的磁性颗粒，或反之亦然。根据一实施方式，将携带结合细胞的阴离子交换表面与液体组合物接触使得至少部分的所收集细胞释放，从而自阴离子交换表面洗脱。如果需要的话，然后可将阴离子交换表面与释放的细胞分离。在此，可采用任何分离方式，合适的方式包括但不限于：收集含有所释放细胞的液体组合物，例如通过抽吸或者，如果使用磁性颗粒，可以利用磁场收集并分离磁性颗粒与含有释放细胞的其余液体组合物。然而，如实施例所示，不一定要在步骤c)和d)之前去除、分别分离阴离子交换表面，这是本发明特有的优点，其再次省去了处理步骤。只要核酸从中释放(见步骤c)，细胞可以甚至维持与阴离子交换表面的结合。

步骤C)

在步骤c)中，核酸从收集的细胞中释放，优选也经过了变性。在此，可以有数个选择，合适的和优选的实施方式将在下文进行说明。

根据一优选的实施方式，液体组合物与前段所述的收集细胞接触。如上所述，所述液体组合物可协助这种释放，从而将细胞自阴离子交换表面洗脱(然而这不是必须的)，。然而，优选地，所述液体组合物是在步骤c)中有助于核酸从细胞中释放的组合物。

根据一实施方式，收集的细胞与包含离液剂的液体组合物接触。能导致蛋白质或核酸紊乱的任何离液剂可以用于此目的，所述离液剂通过，例如但不限于改变的蛋白质或核酸的二级、三级或四级结构。优选利用离液盐(chaotropic salt)。离液盐优选包括胍、硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、三氯乙酸盐和/或三氟乙酸盐作为离液离子。优选地，所述离液剂选自下组：胍(guandinium)盐、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钠、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、三氟乙酸钠和尿素。也可使用离液剂的混合物。优选地，胍盐，例如盐酸胍、硫氰酸胍或异硫氰酸胍用作在步骤c)中辅助核酸释放的组合物中的离液剂。所述液体组合物可包含离液剂，优选如上所述的离液盐，其浓度范围选自：约0.1M到最高饱和极限、约0.2M-5M、约0.3M-4M、约0.4M-3M、约0.5M-2.5M、约0.6M-约2M、约0.6M-约1.5M和0.6M-约1M。优选地，所述液体组合物是裂解溶液，例如裂解缓冲液。

根据一实施方式，该组合物包含螯合剂，优选EDTA。螯合剂是一有机化合物，能够该有机化合物的两个或两个以上的原子与金属形成配位键。合适的螯合剂包括，但不限于二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N，N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。根据一优选的实施方式，使用EDTA。如本文所用，术语“EDTA”尤其表示EDTA化合物的EDTA部分，例如K₂EDTA、K₃EDTA或Na₂EDTA。

根据一实施方式，该组合物包含洗涤剂。洗涤剂可以是非离子型、离子型、阴离子型、阳离子型或两性离子型。

此外，该组合物可包含防腐剂，如叠氮钠。此外，该组合物可包含缓冲剂。优选地，该组合物中包含生物缓冲液，如HEPES、MES、MOPS、TRIS、BIS-TRIS丙烷和其它生物缓冲液。优选使用Tris缓冲液。

在步骤c)中，释放的核酸也优选进行过变性。这可以通过，例如加入变性剂，如碱和/或加热来实现，如下文所述。特别是，如果靶核酸是双链分子，例如DNA分子，优选在步骤c)中将双链靶核酸转化为单链靶核酸分子，以使所述核酸在步骤d)可进行杂交。

优选地，有助于或实现从细胞释放核酸的液体组合物具有的碱性pH值能实现或支持所释放核酸的变性。此外，人们发现，使用具有碱性pH值的液体组合物也有助于结合的细胞由于碱性pH值诱导的电荷转移而从阴离子交换表面释放，并由此洗脱。根据一实施方式，所述液体组合物的pH值选自：10或更高的pH值、11或更高的pH值、11.5或更高的pH值、12或更高的pH值、12.5或更高的pH值、12.75或更高的pH值、13或更高的pH值和13.25或更高的pH值。高碱性的pH值支持核酸的释放，此外，还使释放的核酸变性，从而为步骤d)制备核酸。该实施方式是特别优选的，如果靶核酸是DNA，因为这样的碱性pH都将切割和降解样本中的大多数内部RNA。优选地，加热支持变性，如下文所述。此外，碱处理能破坏肽和核酸之间的相互作用，以提高靶核酸和降解蛋白质的可接触性。此外，碱处理蛋白质能有效地匀浆样本，以确保给定样本分析结果的可再现性。它也可以降低样品的粘度，以提高动力学特性，均质化样品，并通过破坏样品中的任何内源性单链RNA核酸，DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体来降低背景。这也有助于灭活在样品中可能存在的酶，如RNA酶和DNA酶。本领域技术人员应该理解，如果RNA是靶核酸(与DNA相反)，可优选不同的试剂。为建立上述的碱性pH值，可以加入碱，优选化学碱，如氢氧化钠或氢氧化钾，分别包含在液体组合物中。

如果靶核酸是DNA的话，使用上述的强碱性液体组合物是特别合适的。如果靶核酸是RNA，则优选更温和的条件以便保持该RNA的完整性。例如，液体组合物的pH值可以是7.5-10、8-9.5或8.5-9，特别是如果使用在8或更低，优选7或更低的pH值下能够释放细胞的阴离子交换表面。

与所收集细胞接触的液体组合物，可以通过一种组合物(例如一种溶液)来提供，或者可以通过将细胞与两种或多种分立(separate)的组合物接触来准备。根据一实施方式，将收集的细胞与两种或多种分立的组合物接触，从而提供上述释放和变性的条件。根据一实施方式，先将两种或多种组合物混合以提供上述液体组合物，再将所述组合物与结合有细胞的阴离子交换表面(优选磁性颗粒)接触。根据一实施方式，第一组合物包含离液剂和任选的上述其他成分(例如，组合物STM可以用作第一种组合物，参见实施例)，和分立的第二组合物含有变性剂(例如，DNR作为第二组合物，参见实施例)。优选地，所述第二组合物是碱性溶液。能够使得第一和第二组合物混合得到的液体组合物具有上述pH范围的任何碱均是合适的。碱的合适浓度包括约1.0N至约2.0N或约1.25N至约1.75N。然而，较高浓度的碱溶液也可用于实现上述pH范围内的pH值。合适的碱包括但不限于NaOH和KOH。将两种(或多种)组合物混合在一起提供有助于核酸释放和变性的液体组合物，从而提供了上述的条件，特别是实现上述碱性pH值。优选通过混合两种或多种分立的组合物制备液体组合物以实现上述优选的条件，尤其优选分别加入上述变性剂。根据一实施方式，首选提供含有变性剂的第二组合物，再将含有离液剂的第一组合物加入该第二组合物，以提供上述的液体组合物。然后优选将相应获得的液体组合物与收集的结合至阴离子交换部分的细胞接触。

根据一实施方式，所述表面由磁性颗粒提供，结合到磁性颗粒的收集细胞与选自以下用量的上述液体组合物接触：25μl-500μl、30μl-400μl、35μl-300μl、40μl-250μl、50μl-200μl、60μl-175μl、70μl-150μl、80μl-125μl和85μl-100μl。根据一实施方式，液体组合物加入的体积使得重悬后的颗粒浓度为选自2000μg/ml-15000μg/ml、2500μg/ml-12500μg/ml、3000μg/ml-10000μg/ml、3500μg/ml-9500μg/ml、4000μg/ml-9000μg/ml、4500μg/ml-8750μg/ml和5000μg/ml-8500μg/ml。当结合有细胞的磁性颗粒重悬在一定体积的液体组合物中，使得在150μl，优选125μl，更优选100μl或更低的体积中有1mg或更少的颗粒时，可以获得特别良好的效果。如实施例所示，各体积，特别是超过60μl、超过70μl、更优选超过80μl的液体组合物体积在后续的杂交捕获测定中提供了特别好的结果。如果磁性颗粒没有在实施步骤d)之前移除，这尤其(有利)。对于液体组合物，85μl-100μl的范围是最优选的。

不用或优选除了上述变性剂，还可以采用其它变性方法，例如采用加热步骤，例如将样品加热到至少80℃或至少95℃以分开核酸链。优选加入碱性变性剂，其可包含在上述液体组合物中，同时进行加热的步骤以有效地使释放的核酸变性。

根据一实施方式，细胞接触上述液体组合物，优选碱性液体组合物后，将所得混合物加热以促进核酸的变性。优选地，所述混合物加热到至少55℃，优选至少60℃。合适的温度范围包括55℃至90℃，优选60℃至85℃，更优选65℃至80℃。优选地，至少加热30分钟，优选至少35分钟，更优选至少40分钟。合适的时间段可以选自：30分钟到150分钟，35分钟到130min，40分钟到120分钟和45分钟到100分钟。所述的时间和温度条件应在可接受的时间量内提供核酸的高效变性，而使得靶核酸处于合适的条件下以便进行步骤d)。合适的时间段也依赖于所处理的样品。例如，当处理含有特定固定剂的含细胞样品，例如

样品时，在至少60℃，优选约65℃的温度下进行90分钟(如果需要的话或更长)的较长温育时间是优选的。当处理不含有交联固定剂的含细胞样品，例如

样品时，在至少60℃，优选约65℃的温度下的较短温育时间，例如45分钟(如果需要的话或较长时间)是足够的。合适的时间段也可以由技术人员确定。本领域普通技术人员不难理解，可以在较低温度下的较长温育时间或在较高温度下的较短温育时间之间进行权衡以提供与本文所述条件类似的效果。还可以通过振荡来促进核酸的释放。例如，用上述液体组合物处理的样品可以通过手工混合或约800rpm、900rpm、约1000rpm、约600至约1000rpm、约600-1200rpm的机械振荡来混合。

根据一实施方式，将包含液体组合物、细胞和任选的阴离子交换表面，例如磁性颗粒的样品混合物，或所述混合物的等分试样转移到新的容器中，优选的多孔设备，如96孔板，然后进行加热。这种实施方式是有利的，因为它易于集成在已有的杂交捕获测定工作流(work-flow)中，也可以集成在自动处理系统中，其中对相应的多孔装置作通常处理，因此可以使用现有的设备。

在进行步骤c)之后，获得样品，它含有释放的并优选还经变性的核酸。如果不在步骤c)之前或期间分离磁性颗粒，所述样品还任选地含有阴离子交换表面，例如磁性颗粒，这对于安全处理步骤是优选的。

执行步骤c)之后获得的样品可以先存储在例如4℃或以下，然后执行步骤d)和e)。

步骤D)和步骤E)

在步骤d)中，靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体。优选进行杂交捕获测定，所述杂交体优选是RNA/DNA杂交体。如之前提到的，不移除阴离子交换表面而在步骤d)之前相应分离是可能的，所述的阴离子交换表面优选由含有阴离子交换部分(优选为PEI)磁性颗粒提供。阴离子交换表面可维持在步骤d)期间是非常令人惊讶的，因为已知阴离子交换表面结合有核酸。因此，有这样的顾虑，即，释放的核酸、核酸探针和/或杂交体可以结合到阴离子交换表面，从而不可用于杂交和捕获。然而，如实施例所示，阴离子交换表面可维持存在于杂交体的产生和捕获期间是可能的，特别是如果采用经PEI官能化的表面作为阴离子交换表面的话。这是特别出乎意料的，因为已知PEI还可以干扰酶的活性和扩增反应。

下文描述执行步骤d)和e)的合适的、非限制性的实施方式。

根据一实施方式，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

步骤e)：

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。

优选地，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

步骤e)：

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。

如上所述，用于结合细胞的磁性颗粒优选在其表面上含有PEI。

优选地，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地分离所述双链核酸杂交体与未结合的核酸；

步骤e)：

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。

优选地，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地分离所述双链核酸杂交体与未结合的核酸，藉此也除去至少一部分的磁性颗粒；

步骤e)：

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。

如上所述，用于结合细胞的磁性颗粒优选在其表面上含有PEI。

根据一实施方式，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；

-分离该双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸；

-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

-任选地洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

步骤e)：

-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。

根据一实施方式，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；

-分离该双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸，藉此也除去至少一部分的磁性颗粒；

-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

-洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余的磁性颗粒，如果仍存在的话；

步骤e)：

-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。

如上所述，用于结合细胞的磁性颗粒优选在其表面上含有PEI。

根据一实施方式，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-将所述双链核酸杂交体捕获在包被有第一结合剂的固体支持物上，所述第一结合剂结合有该双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/固体支持物复合物；

-分离该双链核酸杂交体/固体支持物复合物与未结合的核酸；

-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物；

-任选地洗涤该双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物；

步骤e)：

-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。

根据一实施方式，本发明的方法包括以下步骤d)和e)：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-将所述双链核酸杂交体捕获在包被有第一结合剂的固体支持物上，所述的第一结合剂结合有该双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/固体支持物复合物；

-分离该双链核酸杂交体/固体支持物复合物与未结合的核酸，藉此也除去至少一部分的磁性颗粒；

-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物；

-用洗涤缓冲液洗涤该双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余的磁性颗粒，如果仍存在的话；

步骤e)：

-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。

如上所述，用于结合细胞的磁性颗粒优选在其表面上含有PEI。

步骤d)和e)的合适的和优选的实施方式和诸方面还将在下文中描述：

探针和杂交条件

在上述步骤c)中发生的核酸释放和变性之后，在适合一种或多种探针与靶核酸杂交以形成双链核酸杂交体的条件下，将变性的靶核酸与一种或多种探针接触。探针优选多核苷酸探针。所述探针可以是全长的，截短的或合成的DNA或全长的，截短的或合成的RNA。此外，只要能形成杂交体，包含RNA和DNA核苷酸或包含经修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物的探针都可以使用。如果靶核酸是DNA，则优选的探针是RNA，如果靶核酸是RNA，则优选的探针是DNA。因此，优选形成RNA/DNA杂交体。所述探针被设计为与靶核酸分子杂交或结合。在一方面，所述探针能够与HPV和HPV高风险变体杂交或结合。在额外的方面，探针对HPV和HPV高风险变体具有特异性。高风险(HR)探测器可以包括以下高风险HPV类型的探针：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82。

探针的用量可以有所不同，每次测定每类HPV约7.5ng到约60ng、或每次测定每类HPV约20ng至约45ng，或每次测定每类HPV约30ng探针。因此，在一方面，HR探针由或基本上由以下高风险HPV类型的一种或多种探针构成：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82，或由或基本上由以下低风险HPV类型的一种或多种探针构成：6、11、40、43、53、61、67、69、70、71、72、81和83。RNA探针可以是只特异性结合靶核酸分子的短合成RNA探针。

在非限制性的方面，所用的一种或多种探针可以与靶核酸分子杂交或结合，所述靶核酸分子与HPV相关的核酸分子、HPV的遗传变体、高风险HPV类型的HPV DNA、或高风险HPV类型的HPV RNA、或任一高风险HPV类型、或任一低风险HPV类型有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％、至少99％、或100％的相同性，所述高风险HPV类型是16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82，所述低风险HPV类型是6、11、40、43、53、61、67、69、70、71、72、81和83。在另一方面，所使用的一种或多种探针与HPV、HPV的遗传变体、高风险HPV类型的HPV DNA、高风险HPV类型的HPV RNA、或任一高风险HPV类型、或任一低风险HPV类型互补，所述高风险HPV类型是16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82，所述低风险HPV类型是6、11、40、43、53、61、67、69、70、71、72、81和83。靶核酸的DNA或RNA片段也可使用。

根据一实施方式，如果在碱性条件下进行变性的话，变性样品在加入探针之前或期间经中和，。根据一实施方式，一种或多种探针在也可作为中和杂交缓冲液的探针稀释剂中稀释。为中和在步骤c)中用于释放和变性核酸的碱性pH值，该实施方式是有利的。用于DNA或RNA探针的探针稀释剂因为DNA与RNA稳定性所需的不同要求而有所不同。例如，如果探针是RNA，优选先中和样品，然后添加一种或多种探针，或者，同时向样品中加入RNA探针和中和剂(探针稀释剂)，因为强碱性的pH值可以破坏RNA。所述探针稀释剂可用于溶解和稀释探针，也有利于将样品恢复至约中性或弱碱性pH值，例如，约pH 6至约pH 9、优选6.5至8、更优选6.5至约7.5，以便为杂交提供更有利的环境。可利用足量体积的探针稀释剂，例如样品的一半体积，来中和碱处理的样品。

在一方面，所述探针稀释剂包含缓冲剂、聚丙烯酸、NaOH和叠氮钠。探针稀释剂可包含乙酸。在一方面，所述探针稀释剂包含2.2M BES(N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)，2.6％的聚丙烯酸(PAA)，0.7N NaOH和0.05％的叠氮钠。探针稀释剂可包含约1.2M-约2.6MBES、约1.5M-约2.5M BES、约1.75M-2.25M BES、约2M-2.4M BES或约2.2M BES，以及所述范围内的任何数字。在一方面，探针稀释剂可包含约2％至约3.0％的PAA，以及所述范围内的任何数字。在另一方面，PAA浓度为约2.2％-约2.7％。在还有另一方面，PAA浓度为约2.6％。在进一步的方面，探针稀释剂可包含约0.6N至约0.8N NaOH，例如，约0.7N NaOH。NaOH浓度通常随着BES用量的增加而增加。

对于大的探针，可将加热的碱溶液加入样品，然后可在室温下将探针稀释剂加入样品，然后再加热样品。此过程能够抑制二级结构的形成。结合剂(例如抗体)易于结合于具有二级结构的结构体。当使用非全长探针，例如截短或合成探针时，可能无需加热溶液或样品，因为不存在二级结构的问题。在一方面，与截短或合成探针联用时，样品不加热。用变性试剂处理后，可在适当条件下将等分的中和缓冲液(在一方面是溶解有一种或多种探针的探针稀释剂)加入样品，以允许探针和靶核酸发生杂交或结合。中和缓冲液可包含一种缓冲盐。在一方面，中和缓冲液中不包含多于一种的缓冲盐。杂交条件足以使得一种或多种多核苷酸探针与样品中相应的互补核酸序列(如果存在的话)退火，从而形成双链核酸杂交体。

采用适合于所用的具体探针和稀释剂的杂交条件。例如，探针和样品核酸可以温育一段杂交时间，从而足以允许所述一种或多种多核苷酸探针与相应的互补靶核酸序列退火，优选至少约5至约120分钟、约10至约100分钟、约20至约80分钟、或约30分钟至约60分钟，以及所述范围内的任何数字。杂交条件可以包括至少约55℃、至少约60℃、优选约60℃至约75℃、优选65℃至约70℃的杂交温度，以及所述范围内的任何数字。对于给定的靶核酸和给定的探针，本领域普通技术人员不难通过常规实验确定所需的杂交条件和杂交时间。本领域普通技术人员将进一步了解，杂交的时间和温度必须相对于彼此进行优化。严格杂交条件可以通过提高温度、将离子条件提高到0.5M以上(例如，氯化钠)或降低PAA的浓度来控制，但不限于此。作为一非限制性例子，严格杂交条件可包括在高温，例如至少约65℃下进行杂交反应。

捕获

在一种或多种探针与靶核酸分子杂交并形成双链核酸杂交体后，通过结合所形成的双链核酸杂交体的分子捕获所述杂交体。此类分子在本文中称为第一结合剂或抗杂交体结合剂。由此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物。双链核酸杂交体的特异性结合剂包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、蛋白质、例如但不限于RNA酶H、核酸，包括但不限于适配体，或序列特异性核酸。在一方面，结合了所形成的双链核酸杂交体的抗体被用作结合剂，相应的抗体也称为抗杂交体抗体。因此，可以使用双链核酸杂交体的特异性抗体或抗体片段来捕获和检测本发明形成的双链核酸杂交体。随后，我们将参考抗体来描述合适的和优选的实施方式。然而，所述描述同样适用于能够结合该杂交体的抗体片段，例如Fab片段，或者可以用作第一结合剂的其它合适的抗杂交体结合剂。

所述抗体是双链杂交体的特异性抗体，例如但不限于RNA/DNA杂交体、DNA/DNA杂交体、RNA/RNA杂交体及其模拟物，其中模拟物是指特性类似于RNA/DNA、DNA/DNA或RNA/RNA杂交体的分子。所用的抗双链核酸杂交体抗体，即，抗杂交抗体取决于形成的双链核酸杂交体的类型。在一方面，所述抗杂交体抗体对于RNA/DNA杂交体具备免疫特异性。本领域技术人员可以理解，在本发明中，可利用和/或将多克隆抗体或单克隆抗杂交体抗体偶联和/或固定在载体上，如下所述。在一方面，单克隆抗体支持捕获步骤期间的高严格性温育温度。就捕获和检测而言，第一和另一结合剂(优选为抗体)可以相同，或者可以彼此不同。在一方面，就捕获和检测而言，第一和另一结合剂(可进行标记，见下文)(优选均为单克隆抗体)是相同的，对RNA-DNA杂交体具有特异性。如上所述，双链杂交体特异性的抗体免疫片段或衍生物也适合作为结合剂，此类片段或衍生物包含抗体的结合区。

在本发明的一方面，利用了源自杂交瘤细胞系的单克隆抗-RNA/DNA杂交体抗体。此类杂交瘤细胞系描述于美国专利第4,865,980号、美国专利第4,732,847号和美国专利第4,743,535号。杂交体特异性单克隆抗体也可以采用本领域的标准技术制备。杂交体特异性单克隆抗体可同时用于捕获和检测靶核酸。适合特异性结合所形成的杂交体的其它结合剂也可用作第一结合剂以便捕获杂交体。

在一方面，采用本领域的标准技术将第一抗杂交体结合剂，例如抗杂交体抗体固定于支持物。合适的固定化技术的例子包括共价键或吸附，例如，蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-G珠、生物素-链霉亲和素相互作用、EDAC以连接羧基或甲苯磺酰基等，采用，例如亲和柱或涂覆方案中的序列特异性核酸直接杂交到固体支持物上。

支持物包括但不限于：反应容器，包括微量滴定板，其中一个或多个孔被能结合杂交体的分子官能化，优选被抗杂交体抗体、颗粒，磁性颗粒，柱，板，滤纸和试纸条官能化的微量滴定板。。可利用任何支持物，只要它可允许移除，例如提取液相。如果施加磁场来固定结合有杂交体的颗粒或磁性颗粒，磁性颗粒是有用的，因为它们可留在溶液中，液相可作提取或倾析，使用上述系统除去。优选小且具有高表面积的颗粒，例如直径约0.5μm至10μm、0.75μm至7.5μm、0.75μm至5μm、0.75μm至2.5μm和最优选1μm的颗粒。然而，当利用磁性颗粒作为结合杂交体的第一结合剂的固体支持物时，优选实施步骤e)之前实施最终的磁性分离步骤，以确保磁性颗粒不干扰检测。

用于固定结合所产生的杂交体的第一结合剂的支持物优选是一反应容器。优选地，所述支持物由多孔装置(例如微量滴定板)提供，其中所述孔经第一结合剂作至少部分的官能化。该实施方式是有利的，因为它能在测定过程中方便地除去用于结合细胞的颗粒，如果所述颗粒未在步骤d)之前分离的话，而这样操作是优选的。所产生的杂交体由结合剂捕获并由此固定于反应容器，从而能方便地除去含有用于结合细胞的颗粒的剩余样品，例如通过抽吸和/或洗涤。

杂交体与连接于支持物的抗杂交体结合剂温育足够的时间以便通过固定的抗杂交体结合剂捕获双链核酸杂交体。由此形成了双链核酸杂交体/固体支持物复合物，其还包含用于捕获所述杂交体的第一结合剂。如上所述，在一优选的方面，支持物是反应容器，优选为用一种或多种抗杂交体结合剂(例如抗杂交体抗体)官能化的微量滴定板。抗杂交体抗体可以是单克隆或多克隆的。在一方面，所述抗体是单克隆抗体。在一方面，所述抗体通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDAC)接头偶联于所述支持物。

在一方面，支持物是聚苯乙烯珠。在一方面，用珠稀释缓冲液稀释偶联于结合剂(优选抗体)的支持物或珠。珠稀释缓冲液有助于最大程度地降低珠上的蛋白变性。珠稀释缓冲液的一个例子包括：6％的酪蛋白，10 0mM Tris-HCl，300mM NaCl和0.05％叠氮钠。

在一方面，涂覆有抗杂交体抗体的支持物与样品一起温育。温育可以在室温下或在高温下进行。温育时间可以为约5至约120分钟，约10至约100分钟，或约20至约80分钟，或约30分钟至约60分钟，以及足以进行捕获的所述范围内的任何数字。如果用于结合所形成杂交体的第一结合剂未结合于固体支持物的话，相同的温育时间是合适的。可在所述温育期间振荡样品。本领域技术人员会理解，温育时间、温度和/或振荡条件可视需要而改变以实现其它捕获动力学特性。

靶核酸/探针杂交体结合和由此的捕获后，可将捕获的杂交体与其余样品分离。如果第一结合剂固定于固体支持物，分离就特别容易。在这种情况下，未结合的样品可以，例如简单地吸出，在实施例中也有描述。根据一实施方式，进行一个或多个洗涤步骤以洗去未捕获的核酸和剩余样品。如上所述，如果用于结合细胞的颗粒在杂交体的产生和捕获过程中仍存在，它们会在所述分离步骤和/或后续洗涤步骤中部分除去，如果优选如此实施的话。如上所述，所述颗粒优选磁性颗粒，优选在其表面上携带PEI作为阴离子交换部分。有利的是，无需专门除去颗粒，例如在利用磁性颗粒的情况下借助磁体，因为它们会在分离剩余样品和/或后续洗涤步骤时自动去除，优选如此实施。这再次节省了处理步骤。

根据一实施方式，步骤d)中用到了另一结合剂。另一结合剂可包含可检测标记物。另一结合剂用于检测双链核酸杂交体的存在。如果所述第一结合剂固定于固体支持物的话，另一结合剂可以直接或间接连接于第一结合剂结合时形成的复合物，从而捕获所形成的杂交体，藉此提供双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物或双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物。在一方面，另一结合剂包含必须与底物反应以提供可检测信号的标记物。另一结合剂可以溶解于适当的缓冲液。在一方面，缓冲液包含100mMTrisHCl，pH 7.4，0.5M NaCl，0.1mM ZnCl₂、1.0mM MgCl₂、0.25％吐温20、0.2mg/ml RNA酶A，4％羟丙基-β-环糊精(环糊精)、30％的如前所述珠稀释缓冲液，0.05％的山羊IgG，0.05％的叠氮钠。优选地，另一结合剂是抗体或其片段，优选为单克隆抗体。

根据一实施方式，另一结合剂包含可检测标记物并且结合与双链核酸杂交体。或者，包含可检测标记物的另一结合剂与第一结合剂结合。或者，可用未直接标记的第二结合剂来检测形成的双链核酸杂合体。在本实施方式中，第二结合剂可以用于结合双链核酸杂交体或第一结合剂，所述第二结合剂能够结合包含可检测标记物的另一结合剂。例如，第二结合剂可以是由经标记的第三抗体检测到的小鼠免疫球蛋白，例如山羊抗小鼠抗体。适合于提供含可检测标记物的复合物的相应结合方案策略是现有技术中熟知的，因此无需在此进一步说明。

在一方面，经标记的结合剂与含有捕获杂交体的复合物之间的结合反应在室温下发生。在一方面，结合反应在室温下进行约15分钟-120分钟，20分钟-100分钟，25分钟-80分钟，30分钟-60分钟或30分钟-45分钟。该结合反应可在室温下或高温下发生。

本领域技术人员会理解，可利用任何可检测标记物，例如但不限于，酶、放射性分子、荧光分子或金属颗粒，例如金颗粒。在某些方面，可检测标记物是碱性磷酸酶。将标记物偶联于抗体的方法是已知的。例如，可用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体，得到单价抗体片段。还原的抗体随后可通过Ishikawa等(J.Immunoassay 4:209-237(1983))和Means等(Chem.1:2-12(1990))的方法直接偶联于马来酸化的碱性磷酸酶，所述文献内容各自通过引用全文并入，得到的偶联物可以通过HPLC纯化。所述偶联物也可以采用任何类型的体积排阻色谱法纯化。纯化的一个好处是可将含有一蛋白和一抗体的偶联物与具有其它蛋白抗体比例的那些偶联物分开。

洗涤

与包含可检测标记物的另一结合剂结合后，可以用洗涤缓冲液洗涤样品。洗涤缓冲液可包含一种或多种洗涤剂，或者可以不含洗涤剂。如果洗涤缓冲液含有洗涤剂，该洗涤剂优选离子型或非离子型洗涤剂。非离子型洗涤剂的一实例是Triton-X。洗涤缓冲液中洗涤剂的存在浓度约为0.05％-约1.5％，或约0.075％-约1.0％，或约0.1％-约0.75％，或者约0.5％，或所述范围内的任何数字。合适的洗涤缓冲液的一个实例含有40mM Tris，pH8.2，100mM NaCl，0.5％Triton-X 100和0.05％叠氮钠。

样品可以用洗涤缓冲液洗涤1-10次，或3-7次，或4-6次，或5次，或所述范围内的任何数字。样品也可以用单一的洗涤缓冲液，或多种洗涤缓冲液洗涤。每次洗涤可以利用相同的洗涤缓冲液或不同的洗涤缓冲液。例如，含洗涤剂的洗涤缓冲液可用于一次洗涤，而不含洗涤剂的洗涤缓冲液可用于另一次洗涤。在一方面，洗涤缓冲液之一不含Triton。

实施所述一个或多个洗涤步骤的优点是，用于结合细胞并存在于杂交体捕获期间的剩余微量磁性颗粒可被有效洗去，因此可在进行检测步骤e)之前除去它们。如果这些颗粒的尺寸为7.5μm或更小，优选5μm或更小，更优选为2.5μm或更小，它们尤其易于洗去。因此，根据一优选的实施方式，在步骤d)之前不进行磁性分离步骤，以便除去用于收集细胞的磁性颗粒。

步骤e)-检测

在步骤e)中，检测另一结合剂上存在的标记物，从而指示靶核酸分子的存在或不存在。检测各种标记物的方法现有技术中是已知的。例如，Coutlee等.,J.Clin.Microbiol.27:1002-1007(1989)描述的比色法、放射性方法、表面等离子体共振或化学发光方法，该文献的内容通过引用全文并入本文。

例如，可利用检测试剂，例如LUMI-PHOS 530试剂(Lumigen公司，底特律，密歇根州)或DR2仪(Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚州)，利用检测器，例如FVLUMINA光度计(Source Scientific Systems,Inc.-SSS公司，加登格罗夫，加利福尼亚州)，OPTOCOMP I光度计(MGM仪器公司，哈姆登，康涅狄格州)等，例如Veritas微板光度计(特纳生物系统公司-Turner Biosystems)，通过化学发光来检测结合碱性磷酸酶的偶联物。多种检测技术也可以序贯或并行使用。例如，可以通过化学发光和/或荧光来检测偶联物。在另一方面，可以通过化学发光来检测偶联物。

如本文所述，标记物的检测表明了样品中与一种或多种探针互补的一种或多种靶核酸分子的存在。洗涤(见上文)后，将样品悬浮在检测缓冲液中，例如包含了标记结合剂上的标记物底物。

为何可在短时间内确定HPV或其它靶核酸分子存在的原因之一是基于杂交体捕获的方法不需要在检测前扩增靶核酸分子。不扩增靶标，可利用信号放大来精确地检测HPV或其它靶核酸分子的存在。在一方面，本发明的方法可包括信号放大步骤。在一方面，本发明的方法不包括靶标扩增步骤，特别是在步骤d)中不包括PCR扩增步骤，或者优选地，完全不包括靶标扩增步骤。在另一方面，本发明的方法可包括信号放大步骤，而没有靶核酸的扩增步骤。

本发明还提供了通过采用上述方法检测样品中靶核酸分子(例如HPV)的存在，来检测癌症或确定所患癌症(例如宫颈癌)风险的方法和试验。

本领域技术人员会理解，可在多个平台进行检测，包括但不限于，试管、试纸条、微阵列、微板、384孔板、其他微量滴定板和微流体系统。

靶核酸

靶核酸可以是任何类型的，可以选自：细胞核酸，优选基因组DNA或细胞RNA，来源于肿瘤的核酸，来源于病原体的核酸，例如病原体核酸，特别是病毒核酸。在示范性实施方式中，靶核酸来源于病原体，例如微生物或病毒。在进一步的实施例中，核酸来源于病毒。在进一步的方面，病毒核酸是在完整的病毒或病毒衣壳中与细胞相关的病毒来源DNA分子；维持在细胞附加体内；或整合入细胞DNA分子，如细胞的染色体。在进一步的实施方式中，病毒核酸是由病毒基因编码的mRNA或从此类mRNA衍生的cDNA分子。如果靶核酸是cDNA，则采用逆转录步骤。在进一步的实施方式中，靶核酸是衍生自人乳头瘤病毒。在进一步的实施方式中，所述自动化方法是分析或筛选临床样品中高风险人乳头瘤病毒存在的方法。

在一个实施方式中，所述靶核酸分子与以下任何样品相关的核酸分子或以下任何样品包含的核酸分子有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％、至少99％或100％的相同性：宫颈样品(例如，从子宫颈拭子取得的样品)或宫颈细胞样品、腺样细胞、肛门上皮细胞、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰液、尿液和精液、其他含有病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫的细胞样品，例如巨细胞病毒(CMV)、HPV、疱疹病毒、HIV、H1N1、衣原体、淋病细菌，奈瑟淋球菌(Neisseriagonorrhoeae，GC)，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)，阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，结核菌，SARS相关冠状病毒或流感病毒或疑似含有相应病原体的细胞样品。

在一实施方式中，所述靶核酸分子衍生自人乳头瘤病毒(HPV)，包括HPV的遗传学变体。变体包括靶核酸的多态性、突变体、衍生物、经修饰的、改变等形式。在一方面，靶核酸是HPV核酸。在另一方面，HPV核酸是高风险HPV类型的HPV DNA。在另一方面，HPV核酸是高风险HPV类型的HPV RNA。在另一方面，靶核酸是以下高风险HPV类型的任一种：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82，或者以下低风险HPV类型的任一种：6、11、40、43、53、61、67、69、70、71、72、81和83。在一方面，靶核酸分子与HPV、HPV的遗传变体、高风险HPV类型的HPV DNA、或高风险HPV类型的HPV RNA中的任一种相关的核酸分子具有至少70％，至少为80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。在另一方面，靶核酸与以下高风险HPV类型的任一种相关的核酸分子或以下低风险HPV类型的任一种相关的核酸分子有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少98％，至少99％，或100％的相同性，所述高风险HPV类型是16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82，所述低风险HPV类型是6、11、40、43、53、61、67、69、70、71、72、81和83。

靶核酸分子可以是DNA或RNA。在一方面，待检测的靶核酸为DNA(例如，HPV基因组DNA或cDNA)或RNA(例如，mRNA、核糖体RNA、核RNA、转运RNA、病毒RNA、异源核RNA、小的非编码RNA、siRNA、miRNA)，其中一种或多种多核苷酸探针分别是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，或它们的混合物。所述探针还可以包含修饰的核苷酸。当靶核酸分子为DNA时，多核苷酸探针优选RNA，当靶核酸是RNA时，多核苷酸探针优选DNA。然而，DNA探针可用于DNA靶核酸分子，RNA探针可用于RNA靶核酸分子。在一优选的方面，双链核酸杂合体是由靶DNA和探针RNA杂交形成DNA-RNA杂交体，并且可以使用RNA-DNA杂交体的免疫特异性抗体检测。

在一优选的实施方式中，靶核酸来源于病原体，例如微生物或病毒。在进一步的实施例中，靶核酸来源于病毒。在进一步的方面，病毒核酸是病毒来源的DNA分子，可以是存在于完整的病毒或病毒衣壳中，可以附加体的形式包含在细胞中或可整合在细胞DNA分子，如细胞的染色体中。在进一步的实施方式中，病毒核酸是由病毒基因编码的mRNA或从此类mRNA衍生的cDNA分子。在一实施方式中，靶核酸衍生自人乳头瘤病毒。在一实施方式中，所述的自动化方法是分析或筛选临床样品中高风险人乳头瘤病毒的存在的方法。

本发明方法的特别有利之处在于，它可以完全自动化。使用包含阴离子交换部分的表面，特别是以包含阴离子交换部分(如PEI)的磁珠形式能进行细胞分离、裂解和核酸分析，而无需离心步骤，从而能作高通量的样品处理和分析。

在一实施方式中，检测步骤e)包括利用包含以下的分析器：(1)加热元件；和(2)检测可检测信号的装置，例如荧光计或发光计。

在进一步的实施方式中，提供了用于检测靶核酸的自动化方法，所述方法包括如上固定所述哺乳动物细胞、裂解细胞，从而释放裂解物中的核酸；并通过产生DNA:RNA杂交体的方法来检测核酸。

在进一步的实施方式中，提供了分析或筛选临床样品疾病状态的自动化方法，所述方法包括：(a)将样品中所含的细胞固定于含有阴离子交换部分的表面，如上所述；(b)分离或浓缩细胞，如上所述；(c)裂解细胞以产生裂解物；(d)和在该裂解物中检测靶核酸的存在，其中该裂解物中生物分子的存在或不存在指示疾病的状态。任何与自动化兼容的检测方法均可采用。例如但不限于，检测方法可以包括将核酸探针与裂解物中的核酸杂交。例如但不限于，杂交产生DNA:RNA杂交体。在进一步的实施方式中，通过将DNA:RNA杂交体特异性抗体与DNA:RNA杂交体结合，从而检测该DNA:RNA杂交体，所述的DNA:RNA杂交体在核酸探针和裂解物的核酸之间。

在进一步的实施方式中，提供了分析或筛选临床样品疾病状态的自动化方法，所述方法包括执行上述步骤a)到e)，其中细胞裂解物中靶核酸的存在或不存在指示着疾病的状态。任何与自动化兼容的检测方法均可采用。例如但不限于，核酸探针与裂解物的靶核酸杂交。例如但不限于，杂交产生DNA:RNA杂交体。在进一步的实施方式中，通过将DNA:RNA杂交体特异性抗体与该DNA:RNA杂交体结合，从而捕获DNA:RNA杂交体，所述的DNA:RNA杂交体在核酸探针和裂解物的靶核酸之间。然后检测所述捕获的杂交体。

特别优选的实施方式

上文详述了本发明的合适的和优选的实施方式，本领域技术人员亦会理解a)至e)的各步骤以及所用的组分和试剂，所述方法中利用的各步骤和组分及试剂的内容可以相互组合。各特征相应组合得到的主题也属于本发明。下文将强调本发明的非限制性的、特别优选的实施方式。

根据第一特别优选的实施方式，确定细胞样品中靶核酸的存在或不存在的方法包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中细胞结合发生在阴离子结合部分的阴离子结合基团带正电的pH值下，其中，优选细胞结合发生在选自以下范围的pH值下：3-8.5、3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7；

b)分离结合有细胞的表面与剩余样品，以收集细胞；

c)从细胞释放核酸和将释放的核酸进行变性；

d)在靶核酸和该靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交体；

-利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地分离所捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸；

-任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示靶核酸的存在或不存在。

上文详细描述了阴离子交换表面、细胞样品与步骤a)至e)的合适和优选的实施方式，它参考上述公开内容，这些内容在这里也适用，并可与所述第一特别优选的实施方式组合。例如上面详述的那样，优选由磁性颗粒提供阴离子交换表面，特别是PEI官能化的磁性颗粒。此外，所述表面还可以包含额外的官能团，优选酸性基团，如羧基。所述羧基可用于上文详述的PEI官能化。可参考上述内容。此外，如上所述，如果利用磁性颗粒，所述磁性颗粒优选不在步骤d)之前除去，以节省处理步骤。因此，优选地，阴离子交换表面耐受步骤d)所用条件下的降解。此外，如上所述，优选的细胞样品包括包含在液基细胞学介质中的细胞，特别是子宫颈细胞。可参考以上内容。

根据第二特别优选的实施方式，确定细胞样品中靶核酸的存在或不存在的方法包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中所述阴离子交换部分包含至少一种伯胺、至少一种仲胺和/或至少一种叔胺基团，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7，其中所述阴离子交换部分的氨基在所述pH值下带正电，其中不对结合条件作调整；

b)分离结合有细胞的表面与剩余样品以收集细胞；

c)将所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其中所述液体组合物具有以下特征i到v中的一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的：

i.它包含一离液剂；

ii.它具有碱性pH值；

iii.它具有的pH值选自：12或更高、12.5或更高、13或更高、或13.25或更高；

iv.它包含一种或多种添加剂，优选

aa)螯合剂；

bb)缓冲剂；和/或

cc)防腐剂

v.所述液体组合物通过将两种或多种组合物混合获得，其中所述组合物之一包含离液剂，所述组合物之一是包含碱性试剂(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度优选1.0N至2.0N；

和从细胞释放核酸并变性释放的核酸，其中，释放和/或变性核酸包括加热，并且其中优选先将含有液体组合物、细胞和/或裂解细胞和任选的阴离子交换表面的样品混合物、或所述混合物的等分试样转移到新的容器中，优选多孔装置的孔中，再进行加热；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交体；

-利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地分离所捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸；

-任选洗涤该捕获的双链核酸杂交体；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。

上文详细描述了阴离子交换表面、细胞样品、液体组合物与步骤a)至e)的合适和优选的实施方式，它参考上述公开内容，这些内容在这里也适用，并可与所述第二特别优选的实施方式组合。例如上面详述的那样，优选由磁性颗粒提供阴离子交换表面，特别是PEI官能化的磁性颗粒。此外，所述表面还可以包含额外的官能团，优选酸性基团，如羧基。所述羧基还可如上文详述的作PEI官能化。可参考上述内容。此外，如上所述，如果利用磁性颗粒，所述磁性颗粒优选不在步骤d)之前除去，以节省处理步骤。因此，优选地，阴离子交换表面耐受步骤d)所用条件下的降解。此外，如上所述，细胞样品优选包括包含在液基细胞学介质中的细胞，特别是子宫颈细胞。可参考以上内容。

根据第三特别优选的实施方式，确定细胞样品中靶核酸的存在或不存在的方法包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中所述表面由磁性颗粒提供，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7，其中所述阴离子交换部分的阴离子交换基团在所述pH值下带正电，其中优选不对结合条件进行调整；

b)分离结合有细胞的磁性颗粒与剩余样品以收集细胞；

c)将所收集的磁性颗粒结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其中所述液体组合物具有以下特征i到v中的一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的：

i.它包含一离液剂；

ii.它具有碱性pH值；

iii.它具有的pH值选自：12或更高、12.5或更高、13或更高、或13.25或更高；

iv.它包含一种或多种添加剂，优选

aa)螯合剂；

bb)缓冲剂；和/或

cc)防腐剂

和/或

v.所述液体组合物通过将两种或多种组合物混合获得，其中所述组合物之一包含离液剂，所述组合物之一是包含碱性试剂(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度优选1.0N至2.0N；

和从细胞释放核酸并变性释放的核酸；其中，释放和/或变性核酸包括加热，并且其中优选先将含有液体组合物、细胞和/或裂解细胞和磁性颗粒的样品混合物、或所述混合物的等分试样转移到新的容器中，优选多孔装置的孔中，再进行加热；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中未在步骤d)之前磁性分离所述磁性颗粒，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；

-分离双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸，藉此除去至少一部分磁性颗粒；

-使该复合物与用标记有可检测标记物的另一结合剂结合以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

-洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余磁性颗粒，如果仍存在的话；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。

上文详细描述了磁性颗粒、细胞样品、液体组合物与步骤a)至e)的合适和优选的实施方式，它参考上述公开内容，这些内容在这里也适用，并可与所述第三特别优选的实施方式组合。由磁性颗粒提供的阴离子交换表面优选耐受步骤d)中所用条件下的降解。例如，如上文详述的，优选利用PEI官能化的磁性颗粒，更优选所述磁性颗粒的平均尺寸为7.5μm或更小、更优选5μm或更小。磁性颗粒还可以在其表面携带酸性官能团，例如羧基，如上所述，所述官能团还可用于表面的PEI官能化。磁性颗粒、磁性颗粒的使用浓度和/或本发明方法中使用的其它试剂或组分的进一步细节可参考上述内容。此外，如上所述，细胞样品优选包括包含在液基细胞学介质中的细胞，特别是子宫颈细胞。可参考以上内容。

根据第四特别优选的实施方式，第三特别优选的实施方式的方法的步骤d)和e)包括：

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-将该双链核酸杂交体捕获在包被有结合该双链核酸杂交体的第一结合剂的固体支持物上，藉此形成双链核酸杂交体/固体支持物复合物；

-分离该双链核酸杂交体/固体支持物复合物与未结合的核酸，藉此除去至少一部分磁性颗粒；

-将该复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合以形成双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物；

-用洗涤缓冲液洗涤该双链核酸杂交体/固体支持物/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余磁性颗粒，如果仍存在着的话；

步骤e)：

-检测所述另一结合剂的标记物的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。

根据第五特别优选的实施方式，第三或第四特别优选的实施方式中方法的特征在于，在步骤a)中将细胞样品与磁性颗粒接触后，所述磁性颗粒包含在所得混合物中，其浓度选自：50μg/ml–2000μg/ml、75μg/ml–1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml–1250μg/ml和150μg/ml–1100μg/ml。此外，如上所述，所收集的磁性颗粒结合细胞优选与选自下组的体积的所述液体组合物接触：50μl-200μl、60μl-175μl、70μl-150μl、80μl-125μl和85μl-100μl。

如上所述，本发明方法和由此的第一、第二、第三、第四或第五特别优选的实施方式的方法优选是自动化方法，其中用机器人系统进行样品处理。如果利用磁性颗粒提供阴离子交换表面，这是特别可行的。所述方法可用于分析样品，例如临床样品的疾病状态和/或病原体核酸的存在或不存在。特别是，如实施例所示，所述方法可用于HPV诊断邻域，以确定液基细胞学介质中收集的宫颈样本中HPV核酸，特别是高风险HPV核酸的存在或不存在。

试剂盒

此外，本发明提供了适合于实施本发明方法的试剂盒。

根据一实施方式，提供了试剂盒，包括

a)磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面包含阴离子交换部分；

b)变性剂，其是含有碱(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，优选浓度范围是1.0N-2.0N；和

c)含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物。

根据所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包括含有多个槽的药盒，其中

a)所述药盒的第一槽包含磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面包含阴离子交换部分；

b)所述药盒的第二槽包含变性剂，其是含有碱(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，优选浓度为1.0N-2.0N；和

c)所述药盒的第三槽包含含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物。

所述药盒可以密封(例如用盖)，以避免所含试剂的污染。相应的药盒可以与能够处理磁性颗粒的自动系统(如机器人系统)联用。上文描述了各自动化系统的合适的和优选的实例。各药盒插入自动化系统，从而提供根据本发明第一方面的方法利用自动化系统处理样品所需的试剂。因此，本发明还涉及能够处理磁性颗粒的自动化系统，所述系统包括上述药盒。药盒可以插入所述机器人系统。上文详述了磁性颗粒、变性剂、包含离液剂的组合物，自动化系统和第一方面的方法的细节。可参考上述内容。优选地，除了所述药盒外，所述试剂盒装有含有多个孔的洗脱板，其中所述孔适于接收所收集的细胞。利用上述试剂药盒经自动系统进行样品处理后，将通过与磁性颗粒结合而从个体样品收集的细胞与磁性颗粒一起转移到洗脱板的孔中。然后含有所收集细胞的相应洗脱板可以进行上述的杂交体捕获测定。

上文已结合方法描述了磁性颗粒、合适的和优选的阴离子交换部分、粒径、磁体等的细节。可参考上述内容，它们也适用于此。

如上所述，磁性颗粒优选用聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分进行官能化。优点如上文解释的。如上所述，优选以颗粒悬浮液的形式提供磁性颗粒。所述颗粒悬浮液的合适的和优选的实施方式如上所述，可参考相应的内容，它们也适用于此。如上所述，颗粒悬浮液的pH值优选为7.5或更低、7或更低、6.5或更低。此外，如上所述，所述颗粒优选包含在悬浮液中，其浓度选自：5mg/ml-50mg/ml、10mg/ml-25mg/ml、10mg/ml-20mg/ml和12.5mg/ml-17.5mg/ml。

所述试剂盒包含变性剂，其是含有碱(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度范围优选为1.0N-2.0N。然而，也可以使用较高浓度的碱溶液。此外，该试剂盒包含含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物。通过将变性剂和包含离液剂的组合物混合，提供了有助于核酸释放和/或核酸变性的液体组合物。细节如上所述，可参考相应的内容，它们也适用于此。优选利用上述自动化系统执行相应的混合步骤。

任选地，该试剂盒还可以包括进行杂交体捕获测定的试剂，例如

-至少一种适合与靶核酸杂交的探针；和

-至少一种能够结合双链核酸杂交体的结合剂。

因此，该试剂盒可包含适合与靶核酸杂交的至少一种探针。上文已结合本发明方法描述了关于合适和优选的探针及靶核酸的信息，可参考相应的内容，这些内容也适用于此。探针优选多核苷酸探针，特别是RNA探针，其与单链靶DNA结合后相应形成DNA:RNA杂交体。所述至少一种探针优选适合与HPV靶核酸杂交。上文结合本发明方法描述了细节；可参考以上内容，这些也适用于此。此外，该试剂盒可包含能够结合双链核酸杂交体的至少一种结合剂。所述结合剂优选抗杂交体抗体或其抗杂交体结合片段。上文结合方法描述了所述第一结合剂的合适的和优选的实施方式；可参考上述内容。如上所述，所述至少一种结合剂优选连接到固体支持物，如反应容器的内表面；可参考上述内容。优选地，试剂盒包含至少一种含可检测标记物的另一结合剂。上文结合方法描述了对于所述另一结合剂和适宜的标记物的细节；可参考上述内容。另一结合剂优选与碱性磷酸酶作为可检测标记物偶联。此外，该试剂盒可包含一种或多种检测试剂。上文结合方法描述了细节，可参考上述内容。例如，可以包含能由碱性磷酸酶处理的化学发光底物，从而产生光。此外，该试剂盒可包含一种或多种洗涤缓冲液。上文结合方法的步骤d)描述了合适的实施方式。可参考相应的内容，这些内容也适用于此。

根据一方面，提供了试剂盒，它包括：

a)磁性颗粒，其中，该磁性颗粒的表面包含阴离子交换部分；

b)至少一种适合与靶核酸杂交的探针；和

c)至少一种能够结合双链核酸杂交体的粘合剂。

还可以通过组合两个单独的试剂盒，例如两个上述试剂盒提供所述试剂盒。该试剂盒的组件如上所述。

本文所用的术语“溶液”，例如裂解液，尤其是指液体组合物，优选水性组合物。它可以是仅有一相的均质混合物，但根据本发明使用的包含固体组分(如沉淀物)的溶液也属于本发明的范围。

根据一实施方式，本文所述的主题是指由相应步骤或成分构成的主题，在方法的情况下包括某些步骤，在组合物、溶液和/或缓冲液的情况下包括某些成分。

本发明不限于本文公开的示范性的方法和材料，与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不受本发明各方面或实施方式的限制，这些标题与说明书作为整体参考。最好选择和结合本文所述的优选实施方式，优选实施方式的相应组合产生的特定主题也属于本发明。

本申请要求2012年8月30日提交的在先申请US 61/695,042和2012年8月30日提交的EP12182339.7的优先权，这些在先申请的全部内容通过引用并入本文。

现在借助非限制性实施例描述本发明的方法。

实施例

实施例1：手动AXpH-direct和手动转换的比较

1.1)参比：通过手动转换(MC)的样品制备

在作为标准现有技术方法的MC中，样品制备如下：利用均在

培养基中配制的HPV阴性临床库和HPV阳性临床库的样品(见下文)。通过密度梯度离心获得

梯度后样品，如下所述进一步处理相应得到的样品。

首先，将样品彻底涡旋振荡。将2.8ml各样品转移到15ml离心管中并以800g离心10分钟。离心后，将上清液倾析，离心管(开口朝下)在布上轻拍3次。将200μl样品运输培养基(Specimen Transport Medium-STM，Digene公司-包含离液剂)加入各沉淀物，即样品，并以最大速度涡旋振荡15秒，直到全部沉淀物重悬。

100μl变性试剂(DNR，1.75M NaOH)加入各样品并以最大速度涡旋振荡5秒。然后将样品在65℃水浴中温育90分钟。由此，细胞裂解以释放核酸并将释放的核酸变性。将75μl各样品(双测定)转移到96孔板。将平板贮存在4℃直至进行Digene HC2 HPV DNA测试(凯杰公司-Qiagen)进行(参见下文2.)。

1.2)通过手动AXpH-direct法的样品制备(本发明)

在手动AXpH-direct法的情况中，样品制备如下进行：利用

培养基配制的HPV阴性和HPV阳性临床库的

梯度后样品。首先，将样品彻底涡旋振荡。将2.8ml各样品转移到5ml PP-管中(葛莱娜第一生化股份有限公司-Greiner,bio-one)。加入50μl携带不同阴离子交换部分的各类磁性珠的悬浮液。悬浮液包含15毫克珠/毫升或40毫克/毫升(见下文)。

表1：所测试珠悬液概况

SCN缓冲液主要包含50mM MES，叠氮化物，非离子型洗涤剂，pH值为6.1。

每轮设置测试11个样品。用盖子锁管，小心地反转10次，涡旋振荡30秒。然后将样品在室温下温育5分钟。温育后，将样品放置在磁体上以分离珠。随后，弃去上清液，将200μl的STM加入该分离的珠并以最大速度涡旋振荡15秒。将100μl DNR加入该样品并以最大速度涡旋振荡5秒。将75μl包含磁性珠的各样品(双重测定)转移到96孔板。然后将样品在微板加热器中在65℃下温育90分钟。该加热步骤可以确保高效溶解和释放的核酸变性。温育后，将板储存在4℃直至进行digene HC2 HPV DNA测试(参见下文2.)。

2)通过digene HC2 HPV DNA测试分析样品

利用Digene HYBRID

系统(凯杰公司)，按照生产商的使用说明书进行digene HC2 HPV DNA测试。

制备1体积份的高风险HPV探针和25体积份的探针稀释液的探针/稀释剂混合物。由此，高风险HPV探针不直接吸移入探针稀释剂中，而仅仅到容器的边缘。所述测试中使用的探针是RNA探针。然后，进行彻底涡旋振荡，将25μl探针/稀释剂混合物加入经上述步骤1.1)和1.2)后得到的各样品。给微板加盖后，在Digene HYBRID

系统旋转振荡器上以1100rpm进行混合3分钟，然后利用Digene微板加热器I在65℃温育60分钟。在所述温育步骤中，RNA探针可以与其DNA靶标杂交，由此形成的RNA:DNA杂交体。

温育后，所有的样品被转移到捕获微板(白色)。所述捕获微板的孔中包被有RNA:DNA杂交体的特异性抗体。然后在旋转振荡器上以1100rpm将样品混合60分钟，以便通过抗体捕获DNA:RNA杂交体。除去微板的液体，将微板在纤维素布上轻拍。将75μl检测试剂1(粉红色)加入各孔，给板加盖，室温下温育30分钟。检测试剂I包含RNA:DNA杂交体的特异性碱性磷酸酶偶联抗体。各抗体偶联数个碱性磷酸酶分子。多个偶联的抗体可结合到每个捕获的RNA:DNA杂交体，从而导致信号放大。

样品用1×洗涤缓冲液洗涤6次。为此目的，洗涤缓冲液加入孔中，直到它们溢出，除去微板的液体，然后在最后的洗涤步骤之后，将板在纤维素布上轻拍干。将75μl检测试剂2加入各孔，给平板加盖，以保护它免受光照。所述检测试剂2包含碱性磷酸酶的底物。当底物被包含在检测试剂1(见上文)的偶联于抗体的碱性磷酸酶切割时，有光发射，可以利用光度计测量，即相对光单位(RLU)。室温下(避光)温育15分钟后，用Digene DML 2000光度计对板读数。射出光的强度表示样本中靶DNA的存在或不存在。

在AXpH-direct法(本发明)中，用于收集细胞的磁珠存在于上述1.2)步骤之后获得的样品中。因此，磁性颗粒存在于探针杂交期间和RNA:DNA杂交体捕获期间。随后，按照digene HC2 HPV DNA测试的使用说明书，自动除去磁性颗粒。具体地说，在捕获RNA:DNA杂交体后，在除去液体之时除去磁性颗粒，然后加入检测试剂1。此外，在加入检测试剂1之后、加入检测试剂2之前进行的洗涤步骤期间有效除去可能的残留磁性颗粒。该实施例表明，无需在杂交体捕获测定之前或期间进行单独的磁性颗粒除去步骤，例如磁分离步骤，因为磁性颗粒出乎意料地不干扰杂交和捕获步骤，随后在用光度计检测所发出信号之前的正常过程中自动去除。在光度计检测步骤之前除去磁性颗粒是有利的，因为磁性颗粒可能干扰所发光的读数。

3)结果

所得到的结果示于图1和2。在HPV阴性样品(图1)的情况中，施加的所有类型珠悬浮液(见上文)导致与手动转换(MC)(即参比方法)类似水平的RLU/CO值。

对于MC，平均值因异常值而提高。在HPV阳性样品(图2)的情况中，手动转换显示珠悬浮液I和珠悬浮VII之后的RLU/CO值最高。该实施例表明在其表面包含不同阴离子交换部分的各类珠可用于本发明的方法(AXpH-direct法)。

实施例2：AXpH-direct法对于自动化的适用性

在实施例2中，处理下列样品：

1)

介质中的HPV阴性临床库(RLU/CO约0.2)，

2)

介质中的SiHa细胞(HPV阳性；1×10⁵个细胞/毫升)，

3)

介质中的HPV阳性临床库1(RLU/CO约186.4)，和

4)

介质中的HPV阳性临床库2(RLU/CO约530)。

1.1)参比：手动转换(MC)

手动转换(MC)方案见实施例1。

1.2)手动AXpH-direct法

首先，将样品彻底涡旋振荡。将2.8ml的各样品，即，与1.4ml

介质混合的1.4ml原始样品，转移至5ml PP-管。加入50μl的珠悬浮液I(见实施例1)。用盖子锁管，小心地反转10次，涡旋振荡30秒。然后将样品在室温下温育5分钟。温育后，将样品放置在磁体上以分离珠。随后，弃去上清液，将100μl的STM加入分离的珠中并以最大速度涡旋振荡15秒。将50μl的DNR加入该样品并以最大速度涡旋振荡5秒。将包含磁珠的75μl各样品(双重测定)转移到96孔板中。然后将样品在微板加热器中以65℃温育90分钟。温育后，将板储存在4℃直至进行digene HC2 HPV DNA测试(见下文)。

1.3)自动AXpH-direct法(QIASYMPHONY)

利用QIASYMPHONY系统(凯杰公司)对样品进行自动样品制备，用于处理珠。给1.4ml各样品提供1.4ml

介质(总共2.8ml)。从珠槽向样品制备盒提供35-50μl珠悬浮液I，其在SCN缓冲液中含有15mg/ml珠(参见实施例1)。然后，将SUREPATH缓冲液配制的0.7-1.0ml样品加入珠中，在室温下温育约6分钟。同时，向新的样品盒中分别提供60μl和30μl各STM和DNR。收集磁珠并转移到STM/DNR混合物中。随后，将STM、DNR和磁珠的整个混合物转移到96孔板。为释放核酸并变性，然后将样品在65℃下在微板加热器中温育90分钟。

2)通过digene HC2 HPV DNA测试分析样品

根据实施例1进行digene HC2 HPV DNA测试。

3)结果

自动化AXpH-direct方案(本发明)所需的总时间为2小时8分钟。这相当节省时间，相比之下，其它可用的自动化方案，例如标准自动化SUREPATH方案(凯杰公司)需要6小时23分钟。

digene HC2 HPV DNA测试的所得结果示于图3、4、5和6。图3显示了阴性临床库的结果。该测试对于确定背景是非常重要的。结果应低于1，优选低于0.5。所采用的测试方案实现了这点。在HPV阳性样品的情况中(图4-6)，应用自动AXpH-direct方案(本发明)时，所获得的RLU/CO值与手动AXpH-direct法(本发明)和手动转换(MC-现有技术)得到的那些结果相当。在此，重要的是注意，最高RLU/CO值不一定是决定性的。相反，得到一致和可靠的结果是重要的，即，正确结果的数量要高。后续实施例显示采用本发明方法实现了这点。然而，高RLU/CO值是有利的，因为它确保了该方法非常灵敏。

实施例3：AXpH-direct法对于

和

样品的适用性处理以下样品：

1.

(PC)介质中的HPV阳性细胞培养物(SiHa细胞)；

2.

(SP)介质中的HPV阳性细胞培养物(SiHa细胞)；

3.

(PC)介质中的阳性临床样品库；

4.

(SP)介质中的阳性临床样品库；

5.

(PC)介质中的阴性临床样品库；

6.

(SP)介质中的阴性临床样品库。

1.1)参比：手动转换(MC)

所有样品1-6采用MC方案处理。样品制备参见实施例11.1。

1.2)手动AXpH-direct法(本发明)

样品1、3、4和5采用此方案处理。这里，根据实施例8描述的方案，然而，采用手动处理PEI改性珠，而非利用机器人系统。

1.3)自动AXpH-direct法(QIASYMPHONY-本发明)

采用此方案处理样品2、4和5。对于

样品，相关样品制备的详细信息参见实施例2(自动AXpH-direct方案)，对于

样品，样品制备的详细信息参见实施例8。

2)通过digeneHC2HPVDNA测试分析样品

根据实施例1进行digene HC2 HPV DNA测试。

3)结果

所得到的结果示于图7。当应用手动AXpH-direct法时，所有得到的RLU/CO值大致与手动转换(MC)(即参比方法)获得的一样高，在图7中左侧可见。同样适用于自动化AXpH-direct法(图7，右侧)。

实施例4：各种条件下细胞与珠的结合

1)样品制备

为了研究哪些参数和条件是负责或适合于将细胞结合于各种珠，进行了不同结合条件的测试。为此，将不同pH值的水溶液以及异丙醇加入样品。在本实施例中，利用表面经PEI作为阴离子交换部分进行官能化的羧化磁性Seradyn珠制成的珠(PEI珠)和由磁性二氧化硅颗粒作为运载体材料制成的珠，其中所述二氧化硅表面用N,N-二乙基氨基丙基三甲氧基硅烷(DEAPS)作为阴离子交换部分作官能化(DEAPS珠)。为作比较，对磁性二氧化硅珠进行了测试(MAS G，凯杰公司-参见EP 1 266 385)。

利用

介质配制的各HPV阳性临床库的8个梯度后样品(RLU/CO约70,6)。700μl的各样品与以下混合：

A：50μl PEI珠悬液(15mg/ml)，150μl水和

1)100μl Tris HCl pH＝5，

2)100μl Tris HCl pH＝7，

3)100μl Tris HCl pH＝9，或

4)500μl异丙醇，

B：水配制的50μl DEAPS珠悬液，150μl水和

1)100μl Tris HCl pH＝5，

2)100μl Tris HCl pH＝7，

3)100μl Tris HCl pH＝9，或

4)500μl异丙醇

C：50μl MAS G珠和

1)800μl异丙醇，100μlNaCl(2M)；

2)800μl H₂O，100μl NaCl(2M)

根据手动AXpH-direct法，将珠经过

MPC温育和磁性分离后，每批次(1-8)获得两部分：各为珠部分和上清液部分。珠部分重悬于80μl STM/DNR混合物中，而上清液部分进行手动转换，即，该部分经离心，弃去所得上清液，将沉淀物(pellet)也重悬于80μlSTM/DNR混合物中(参见实施例1)。所有部分在65℃的水浴中温育90分钟。

作为参比，700μl原始样品直接进行手动转换(n＝16)。

2)通过digene HC2 HPV DNA测试进行样品分析

按照实施例1进行Digene HC2 HPV DNA测试HC2.0。

3)结果

所得结果示于图8、9和10。图8描绘了利用PEI珠粒时得到的RLU/CO值。pH＝5以及pH值＝7时在结合介质中的结合性能优异，特别是与手动转换方案(MC)相比较。然而，估计手动转换方案中有误，因为MC方案的数值异常低。对于MC方案，数值通常位于样品的范围内(约70)。然而，本发明方法检测到的RLU/CO值与所用样品的RLU/CO值(约70)相当。在相应的上清液部分几乎没有检测到信号，表明细胞适当而有效率地与珠进行了结合。与此相反，当在结合介质中采用pH＝9时，结合性能相当低，即，不是所有细胞均与测试的珠结合。在这种情况下，上清液部分中检测到的信号大约是珠部分检测到四分之一。使用异丙醇(iPrOH)作为结合介质也获得优异的结合性能。在测试条件下，磁性二氧化硅珠不适合实现适当的细胞结合。

图9描述了施用DEAPS珠粒时得到的RLU/CO值。其结果与图8中利用PEI珠获得的那些结果相当。与MC相比，应用pH＝5以及pH＝7或iPrOH也产生优异的结合性能，而pH＝9的性能相当低。

图10比较了PEI珠和DEAPS珠的结合性能，所述结合性能通过珠部分中相应的RLU/CO值表示。在所有情况下，PEI珠的性能较高。因此，优选使用PEI官能化的表面。

实施例5：样品制备和分析的工艺方案

表2示出了采用本发明获得的AXpH direct洗脱液(包含磁性珠，优选PEI官能化的磁性珠)，在快速捕获系统(RCS，Digene公司)上实施杂交体捕获(HC)测定的步骤。所述AxpHdirect洗脱液可以如实施例1 1.2)，实施例2 1.3)实施例3或实施例8中所述获得，其中描述了

样品和

样品的处理。

表2：快速捕获系统(RCS)的步骤

实施例6：测定结果的可重复性

比较了手动转换法(MC-现有技术)和手动AXpH-direct法(本发明)。因此，分析了72份个体临床样本-HPV阳性和阴性，同一细胞沉淀物利用各两个复制品。对于每一对复制品，检测到的成对RLU/CO值描绘在图中。在各方法之间进行了比较(图11)，以便分别确定HPV HC测定结果的再现性和一致性。完美的重现性/一致性，即，100％相同的结果将是截距为0，斜率为1和相关系数R²为1。

结果

与手动转换法(MC)相比，使用AXpH-direct法导致HPV HC测定结果的高度一致性。

实施例7：样品制品的不同参数对HPV HC测定性能的影响

为证实样品制品的不同参数对HPV HC测定性能的影响，应用QIASYMPHONY系统(自动AXpH-direct方案)或采用手动AXpH-direct法(二者参加实施例2)实施本发明的方法。手动转换法(MC-现有技术)仍是用作参比方法(见实施例1)。

1)洗脱缓冲液的影响

用5.2ml水稀释

介质配制的2.8ml各样品。将2000μl各稀释样品或700μl

介质配制的各未稀释样品用于QIASYMPHONY系统(自动AXpH-direct方案：分别是QS-SP-2000μl方案和QS-SP-700μl方案)。在这两种情况下，样品的施加总量相同。用STM/DNR，即，digene HC2 HPV DNA测试的洗脱缓冲液，或含75mM NaOH的洗脱缓冲液分别重悬细胞/颗粒的洗脱液。

结果：

如图12所示，所得的RLU/CO值几乎相同表示两种缓冲液均足以用于接收收集的细胞。

2)pH对细胞结合的影响

测试了不同pH值和结合条件，如图13所示。从中可以看到，PEI珠粒I(见上文)比DEAPS珠性能更好(见上文)，因此优选使用。对于DEAPS珠，可以通过加入异丙醇改善结合。

3)细胞结合期间电导率的影响

应用手动AXpH-direct法，利用

介质配制的各0.7ml未稀释样品。降低KH₂PO₄量(1000至0mM)，对与珠结合的条件进行调整。利用PEI珠。

结果：

从图14可以看出，低导电率改善PEI珠的结合性能。16或8mM KH₂PO₄获得最好的结果。在这些浓度下，发现洗脱部分的RLU/CO信号最高，而在上清液部分未检测到信号。

4)样品酸化和稀释的影响

用5.2ml水稀释

介质配制的2.8ml各样品，或者，用5.2ml乙酸(盐)稀释。对2000μl各稀释样品或700μl

介质配制的各未稀释样品用于手动AXpH-direct法。使用PEI珠(见上文)。

结果：

未观察到样品稀释或酸化的正面作用(图15)。这表明在不同的结合条件下，细胞的结合均很有效。

5)优化珠用量I

进行手动转换，50倍和不同量的PEI珠以15mg/ml悬浮液的形式掺入所得库。样品制备后，进行digene HC2 HPV DNA测试。

结果：

如图16所示，PEI珠量升高未导致试验性能降低。该实施例证实不必在进行杂交体捕获测定前分离磁性颗粒。

6)优化珠用量II

将700μl

介质配制的各未稀释样品用于QIASYMPHONY系统(自动AXpH-direct方案)。不同量的PEI珠(见上文)以15mg/ml悬浮液的形式施加。作为参比，用700μl样品进行手动转换。样品制备后，用洗脱液和上清液部分进行digene HC2 HPV DNA测试。

结果：

如图17所示，40和50μl用量的PEI珠分散体在洗脱液/上清液部分产生最佳RLU/CO信号比，即，珠的结合性能最佳。

7)细胞培养物对照的结合

细胞培养物样品–使用

介质中的SiHa或HeLa细胞来研究这些细胞培养物是否可在本发明方法中用作阳性HPV对照。不同量的PEI珠以15mg/ml悬浮液的形式施加。

系统用于样品制备。手动转换作为参比。样品制备后，用洗脱液和上清液部分进行digene HC2 HPV DNA测试。

结果：

如图18所示，降低PEI珠用量在洗脱液/上清液部分产生较低的RLU/CO信号比。仍发现50μl珠悬液的结合性能最佳。因此，应用PEI珠有可能将SiHa和HeLa细胞均用作HPV HC测定的阳性对照。

8)干扰物质

对几种能够潜在干扰HPV HC测定的物质进行了测定。采用BD密度梯度来接收使用后样品。从该使用后样品产生的样品中掺加各种干扰物质：避孕胶冻(CJ)，润滑剂胶冻(LJ)、抗真菌药膏(AC)，避孕杀精剂(CS)和冲洗剂(D)或血液1x和血液0.3X(图19)。随后，通过实施AXpH-direct法进行样品制备。

结果：

如图19所示，当采用AXpH-direct法时，与阴性对照(w/o Imh)相比，仅在避孕胶冻(CJ)的情况中发现掺加样品有干扰。血液1x检测到轻微干扰。因此，本发明方法非常可靠，不易受干扰。

9)检测限

为了确定AXpH-direct法的检测限(LOD)，通过从8ml使用后库分离细胞，将它们重悬在1ml水性

介质中来制备HPV阳性8x样本库(库)。该8x样品库作一系列1:2稀释。以此方式得到下列稀释液(见图20)：4x(稀释液1)、2x(稀释液2)、1x(稀释液3)、1/2x(稀释液4)、1/4x(稀释液5)。12份复制品各自通过digene HC2 HPV DNA测试进行分析。利用各阴性样品库(阴性库)作为阴性对照。手动转换(MC)作为参比方法。

结果：

如图20的表格所示，AXpH-direct法的LOD与MC的相当。对于第四稀释液(稀释液4)，这两种方法仍然检测到12份复制品中4份为阳性，而对于第五稀释液(稀释液5)，这两种方法没有检测到更多的阳性复制品。此外，AXpH-direct法的信号强度约为MC的85％。

10)细胞构成对细胞结合的影响

为确定细胞构成对自动化AXpH-direct法(QIASYMPHONY)的细胞结合的影响，通过从8ml使用后库分离细胞，将它们重悬在1ml水性

介质中来制备HPV阳性8x样品库。该8x样品库作一系列1:2稀释。以此方式得到下列稀释液(参见图21)：4x、2x、1x、1/2x、1/4x、1/16x、1/32x、1/64x、1/128x。

结果：

如图21所示，对于自动化AXpH-direct法(QIASYMPHONY)，高细胞构成，即，高细胞密度对细胞结合的影响较低，与MC相当。此外，自动化AXpH-direct法(QIASYMPHONY)的信号强度约是MC的85％。

11)洗脱体积的影响

为了研究是否可能降低洗脱体积，进行自动化AXpH direct法(QIASYMPHONY)并与手动转换(MC)进行比较。为洗脱/重悬收集的颗粒/细胞，利用40μl STM与20μl DNR的混合物(总计60μl)、50μl STM与25μl DNR的混合物(总计75μl)和60μl STM与30μl DNR的混合物(总计90μl)。

结果：

如图22所示，洗脱/重浮体积降低导致HPV HC测定性能降低。发现90μl总体积的性能最佳。

12)样品输入体积的影响

为了了解提高样品输入量是否有利，进行自动化AXpH-direct法(QIASYMPHONY)，并与手动转换(MC)比较。对于MC，利用2.8ml样品，而对于AXpH-direct法，利用0.7ml、0.8ml和1ml样品。应用两个独立库(库1和库2)的样品。

结果：

如图23所示，AXpH-direct样品体积增加至少0.8-1.0ml是有益的。

实施例8：利用

介质中的样品的自动化AXpH-direct法

进行以下实验以进一步证实自动化AXpH-direct法对于制备包含在

介质中的样品的适宜性(也参见实施例3)。如果没有另外说明，对于所有的下列实验，按照实施例1进行digene HC2 HPV DNA测试HC 2.0。

1)采用PEI官能化珠时HPV HC测定结果的比较

根据实施例2并进行了部分改进，对于在

介质中来自两个不同阳性临床库(库1和库2)的样品进行样品制备。在自动AXpH-direct方案的情况下，从珠槽获得含15mg/ml PEI珠SCN缓冲液的35-50μl珠悬液(参见实施例1)。然后，加入2-3ml

介质配制的样品并在室温下温育6分钟以使细胞与珠结合。同时，给新的样本盒中提供各60μl和30μl的STM和DNR。收集磁珠并转移到STM/DNR混合物中。随后，将STM、DNR和磁珠的整个混合物转移到96孔板。为协助核酸的释放和变性，将样品在65℃下，在微板加热器中温育45分钟，并进行测定。

2.0ml样品输入手动转换(MC)(参见实施例1)作为参比。

结果：

结果示于图24。对于应用PEI珠，自动AXpH-direct法得到的RLU/CO值与手动转换(MC)得到的那些相当，甚至更高，即便杂交和所产生杂交体的捕获期间存在磁珠。

2)PEI珠结合效率的分析

按照本实施例的实验1)进行样品制备，其中，然而，QIASYMPHONY运行中利用不同体积的珠悬液。对获得的洗脱液和结合上清液均进行了分析。由此，通过手动转换(MC)分析上清液。此外，样品输入量为2.0ml的MC用作参比。

结果：

结果示于图25。对于PEI珠(见图25)，增加珠数量导致HPV HC测定信号更强，几乎与MC相当。然而，如之前实施例所示，也可以实现更高的信号。此外，结果表明，增加PEI珠量导致源自结合上清液的信号较弱，这表明细胞结合更有效了。然而，在30/40μl珠以上的转折点，只观察到结果有轻微的提高/变化。因此，更高的珠用量没有必要。因此，由于成本原因，还优选30μl-75μl，优选35μl-50μl的珠体积。利用35μl或更高的体积是有利的，因为在移液过程中的微小变化没有实质性影响。利用75μl或优选50μl或更低是有利的，因为可以节省材料和由此的成本。

3)自动样品制备的珠量微调

为了找出自动制备

样品的最佳珠量，根据实施例7的实验6)制备来自不同细胞培养物，或各种临床库的样品。

详细地说，利用以下细胞培养物和临床库：

1)SiHa细胞，HPV低阳性

2)HeLa细胞，HPV低阳性

3)SiHa细胞，HPV中/高阳性

4)HeLa细胞，HPV中/高阳性

5)临床库1，HPV高阳性

6)临床库2，HPV中等阳性

7)临床库3，HPV低阳性

测试了不同量的PEI珠：25μl、35μl或50μl含有15mg/ml珠的悬液。样品输入量为2.0ml的手动转换(MC)用作参比。对于细胞培养物样品，每批次分析22-23份复制品，而在临床库样品的情况下，每批次最多分析66份复制品。

结果：

结果示于图26、图27和图28。图26显示HPV低阳性SiHa(顶部)和HeLa细胞(底部)所获得的RLU/CO值。更高的RLU/CO值表示珠量的增加产生了更好的结合性能。50μl的PEI珠在此设置下性能最好。图27显示了HPV中/高阳性SiHa(顶部)和HeLa细胞(底部)所获得的RLU/CO值。更高的RLU/CO值表示珠量的增加也产生了更好的结合性能。35和50μl的PEI珠性能类似，均为最佳。图28表示HPV高(顶部)、中等(中间)和低(底部)阳性临床库(分别是库1、2和3)所得到的RLU/CO值。使用25μl至50μl珠时未发现性能有显著区别。

5)自动AXpH-direct法和RCS之间的联系

根据本实施例的实验1)，用来自HPV阴性和HPV阳性临床库以及HPV阳性SiHa细胞培养物的含

介质样品进行样品制备。应用样品输入量为4ml的手动转换(MC)和自动化AXpH-direct法(QIASYMPHONY)。然后对获得的洗脱液板使用快速捕获系统(RCS)进行手动HPV HC2.0测定，或者自动化HPV HC2.0测定(见实施例5)。用RCS进行的HPVHC2.0测定可任选地进行中断，用RCS外的旋转震荡器震荡3分钟，以允许在杂交过程中沉淀下来的珠完全转移入捕获板。

结果：

HPV阴性和阳性临床库的结果示于图29(分别为顶部和中部)。应用AXpH-direct法得到的RLU/CO值与应用手动转换(MC)得到的那些相当或略低。此外，在RCS上应用自动化HPV HC 2.0测定得到的RLU/CO值与应用手动HPV HC 2.0测定获得的那些相当。额外的振荡步骤对HPV HC 2.0测定的性能没有显著影响。

HPV阳性SiHa细胞培养物的结果示于图29的底部。在RCS上应用HPV HC 2.0测定比手动表现得略好一些。然而，在RCS上应用HPV HC 2.0测定并作额外的震荡步骤导致RLU/CO值与手动测定获得的相当。

6)检测限

为了确定自动AXpH-direct法(参见本实施例的实验1)的检测限(LOD)，对HPV阳性样品库(稀释液1)作11次1:2稀释(稀释液2-12)。对于各稀释水平，通过digene HC2 HPVDNA分析了24份复制品。进行手动转换(MC)作为FDA批准的参比方法。

结果：

如表3所示，当应用自动AXpH-direct法时，LOD与MC获得的相当，甚至略低(参见表中的命中数)。对于这两种方法，稀释液11无一复制品检测为阳性。相应地，自动化AXpH-direct法获得的信号强度与MC获得的相当，甚至略高。

表3：LOD

稀释液	MC命中数	AXpH-direct法命中数
			1	24	24
2	24	24
			3	24	24
4	24	24
			5	24	24
6	15	22
			7	6	10
8	2	3
			9	1	1
10	1	1
			11	0	0
12	0	1

7)参考HPV HC测定结果与手动转换(MC)的一致性

比较了自动AXpH-direct法(见本实施例的实验1：35μl的AXpH珠悬液)和手动转换(MC)关于HPV HC测定结果的一致性(ASCUS研究)。因此，分析了394份个体临床样品-HPV阳性(179)和阴性(215)。

详细的百分比为：

阳性RLU/CO>1:179(45％)

高阳性RLU/CO>10:118(30％)

阳性RLU/CO>2.5:44(11％)

复检区(Retest zone)RLU/CO＝1-2.5:17(4％)

阴性RLU/CO<1:215(55％)

同一细胞沉淀物各利用两份复制品。该实验由两位不同的操作员进行。自动AXpH-direct法和MC的样品输入分别各自为2.5ml(其中2.0ml进行处理)和4.0ml。对于每对复制品，检测到的成对RLU/CO值描绘在图中(图30)。完美的一致性，即，100％相同的结果将是截距为0，斜率为1和相关系数r²为1的情况。

结果：

所获得的数据示于图30，2×2表格(完整的，不包括所有复试结果)和散点图中。在复检区外没有获得假阳性结果，即，MC为阴性而自动AXpH-direct法为阳性，如此获得的HPVHC测定的特异性很高。然而，179份HPV阳性样品(MC检测到)中有21份检测为阴性，这表明，在自动AXpH-direct法的情况下，HPV HC测定的灵敏度较低。两种方法得到的结果的一致性相当高，截距为-0.14，斜率为1，相关系数r²为1。

8)通过提高样品输入来提高HPVHC测定灵敏度

为了研究样品输入对HPV HC测定灵敏度的影响，进行自动化AXpH-direct法(参见本实施例的实验1)，各样品输入体积是-1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.0ml。利用了来自Caski细胞的HPV阳性培养物以及HPV弱阳性临床库的样品。手动转换(MC)作为参比。

结果：

结果示于图31。提高样本输入还可以实现Caski细胞和弱阳性库的更高RLU/CO值，即，灵敏度提高了。应用4.0ml样品产生的RLU/CO值最高，甚至高于MC获得的那些。

实施例9：利用

pre-quot(使用前)样品的自动AXpH-direct法

(SP)Prequot(使用前)样品的临床性能通过将其用QIAsymphony(QS)经由AXpH-direct法处理并将它们与PrepMate制备的同一样品(“梯度后”或“post-quot(使用后)”)作比较来进行评估，并使用目前批准的手动转换方法处理。获得了收集在10ml

样品中的临床宫颈样品。首先从完整的10ml样品(Prequot-使用前)取得1000μl等分试样并用QS加工，如实施例2所述(参见1.3)。然后用PrepMate(梯度后)制备约8ml的同一样品并通过手动转换(MC)处理。此外，从未用于PrepMate梯度的剩余体积中取第三等分试样(Residual Prequo-残留使用前)，也是1000微升，用QS处理以便与先前的两个等分试样作比较。所有这三个处理样品在快速捕获系统(RCS)上进行hc2测定。

70℃下，将QSSP AXpH-direct提取样品在外部板加热器上变性90分钟并在4℃下储存过夜。次日，将样品萃取液在RCS上利用“C”脚本(script)进行处理。手动转换样品在RCS上利用“C”脚本在一单独运行中进行处理。对prequot(使用前)和residual prequot(残留使用前)材料进行单独分析。计算本发明的AXpH-direct法(SP Prequot)和目前批准的手动转换方法之间的正、负和总一致性。生成散点图，以便比较本发明方法与目前批准的手动转换方法。结果示于图32和图33。数据表明了AXpH-direct样品制备和手动转换方法的相同性能。卡方值表明AXpH-direct和手动转换方法之间没有显著差异。比较prequot(使用前)和residual prequot(残留使用前)时，一致性≥90％。

Claims (23)

1.一种测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)将含有阴离子交换部分的表面与样品在适合于诱导所述细胞和所述表面之间结合的条件下接触；

b)将含有结合细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；

c)从细胞释放核酸；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；和

e)检测所述杂交体的存在或不存在。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)之前不分离含有阴离子交换部分的表面。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有阴离子交换部分的表面具有至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或所有的以下特征：

i.所述阴离子交换部分包含胺基；

ii.所述表面包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分；

iii.所述阴离子交换部分耐受步骤d)中所用条件下的降解；

iv.所述表面由颗粒提供；

v.所述表面由磁性颗粒提供；

vi.所述表面由平均尺寸为5μm或更低、3μm或更低、2μm或更低和1.5μm或更低的颗粒提供；和/或

vii.所述表面由在颗粒表面包含羧基的磁性颗粒提供，其中至少一部分所述羧基用聚乙烯亚胺官能化以提供阴离子交换部分。

4.如权利要求1-3中一个或多个所述的方法，其特征在于，在细胞样品中，细胞包含在液体介质，优选液基细胞学介质中。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包含阴离子交换部分的表面由磁性颗粒提供，其中在所述磁性颗粒与样品接触后，所述磁性颗粒在得到的混合物中的浓度选自：50μg/ml-2000μg/ml、75μg/ml-1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml-1250μg/ml和150μg/ml-1100μg/ml。

6.如权利要求1-5中一个或多个所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，细胞结合发生在选自3-8.5、3.5-8.0、3.5-7.75、3.5-7.5、3.5-7.25或3.75–7的pH范围的pH值下。

7.如权利要求1-6中一个或多个所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从所述细胞释放的液体组合物接触，其中，任选地，在步骤c)中进行加热步骤以促进核酸的释放和/或变性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体组合物具有一种或多种，优选至少两种、至少三种和更优选所有的以下特征i到v：

i.它包含一离液剂；

ii.它具有碱性pH值；

iii.它具有的pH值选自：pH 12或更高、pH 12.5或更高、pH 13或更高、或pH 13.25或更高；

iv.它包含一种或多种添加剂，优选

aa)螯合剂；

bb)缓冲剂；和/或

cc)防腐剂

v.所述液体组合物通过混合两种或多种组合物获得，其中所述组合物之一包含离液剂，和所述组合物之一是包含碱性试剂的碱性溶液。

9.如权利要求1-8中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换表面由包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其中，所述磁性颗粒不在步骤c)和d)之间除去。

10.如权利要求1-9中一个或多个所述的方法，其特征在于，进行杂交体捕获测定，其中步骤d)和e)包括以下步骤：

步骤d)

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中，优选形成RNA/DNA杂交体；

-利用结合双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地将所述双链核酸杂交体与未结合的核酸分离；

步骤e)

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在，藉此表明所述靶核酸的存在或不存在。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表面由磁性颗粒提供，其中所述磁性颗粒存在于所述杂交体的生产和捕获期间并且不在步骤d)中借助磁体除去，而是在进行检测步骤e)之前、在分离剩余样品和/或进行一个或多个洗涤步骤时除去。

12.如权利要求1-11中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤d)和e)

步骤d)

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-捕获所述双链核酸杂交体；

-将所述双链核酸杂交体与未结合的核酸分离，从而也除去至少一部分所述磁性颗粒；

步骤e)

-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。

13.如权利要求1-12中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤d)和e)

步骤d)：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；

-将该双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸分离，从而也除去至少一部分所述磁性颗粒；

-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

-洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余的磁性颗粒，如果仍存在的话；

步骤e)

-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。

14.如权利要求1-13中一个或多个所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中细胞结合发生在所述阴离子交换部分的阴离子交换基团带正电的pH值下，优选地，细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3-8.5、3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7；

b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；

c)从细胞释放核酸并对释放的核酸进行变性；

d)在靶核酸和该靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交体；

-利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地将所捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸分离；

-任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示靶核酸的存在或不存在。

15.如权利要求1-14中一个或多个，特别是权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中所述阴离子交换部分包含至少一种伯胺、至少一种仲胺和/或至少一种叔胺基团，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7，其中所述阴离子交换部分的氨基在所述pH值下带正电，其中不对结合条件作调整；

b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；

c)将所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其中所述液体组合物具有一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的以下特征i到v：

i.它包含一离液剂；

ii.它具有碱性pH值；

iii.它具有的pH值选自：pH 12或更高、pH 12.5或更高、pH 13或更高、或pH 13.25或更高；

iv.它包含一种或多种添加剂，优选

aa)螯合剂；

bb)缓冲剂；和/或

cc)防腐剂

和/或

v.所述液体组合物通过将两种或多种组合物混合获得，其中所述组合物之一包含离液剂，所述组合物之一是包含碱性试剂(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度优选1.0N至2.0N；

和从细胞释放核酸并使释放的核酸变性，其中，优选进行加热步骤以促进核酸的释放和/或变性；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交体；

-利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；

-任选地将捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸分离；

-任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。

16.如权利要求1-14中一个或多个，特别是权利要求3和/或权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中所述阴离子交换表面由包含阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7，其中所述阴离子交换部分的阴离子交换基团在所述pH值下带正电，其中优选不对结合条件作调整；

b)将结合有细胞的磁性颗粒与剩余样品分离以收集细胞；

c)将所收集磁性颗粒结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其中所述液体组合物具有一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的以下特征i到v：

i.它包含一离液剂；

ii.它具有碱性pH值；

iii.它具有的pH值选自：pH 12或更高、pH 12.5或更高、pH 13或更高、或pH 13.25或更高；

iv.它包含一种或多种添加剂，优选

aa)螯合剂；

bb)缓冲剂；和/或

cc)防腐剂

和/或

v.所述液体组合物通过混合两种或多种组合物获得，其中所述组合物之一包含离液剂，所述组合物之一是包含碱性试剂(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度优选1.0N至2.0N；

和从细胞释放核酸并使释放的核酸变性，其中，优选进行加热步骤以促进核酸的释放和/或变性；

d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中未在步骤d)之前磁性分离磁性颗粒，其中步骤d)包括：

-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；

-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；

-将双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸分离，藉此也除去至少一部分磁性颗粒；

-使该复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；

-洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余的磁性颗粒，如果仍存在的话；

e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。

17.如权利要求1-16，特别是权利要求14-16中一个或多个所述的方法，其特征在于，包含阴离子交换部分的表面由包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其中，在步骤a)中将磁性颗粒与细胞样品接触后，所述磁性颗粒包含在所得混合物中的浓度优选为：50μg/ml–2000μg/ml、75μg/ml–1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml–1250μg/ml和150μg/ml–1100μg/ml。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所收集的磁性颗粒结合细胞与选自下组的体积的所述液体组合物接触：50μl-200μl、60μl-175μl、70μl-150μl、80μl-125μl和85μl-100μl，其中所述液体组合物包含离液剂，具有的pH值选自：pH 12或更高、pH12.5或更高、pH 13或更高、或pH 13.25或更高。

19.如权利要求1-18中一个或多个所述的方法，其特征在于，具有一种或多种，优选至少两种，更优选至少三种的以下特征i到ix：

i.所述方法是用于分析临床样品的疾病状态和/或用于确定在临床样品中病原体的存在或不存在的自动化方法；

ii.待检测的靶核酸是病原体核酸；

iii.待检测的靶核酸是病毒核酸；

iv.待检测的靶核酸是HPV核酸；

v.所述方法用于HPV诊断；

vi.包含在细胞样品中的细胞是上皮细胞；

vii.包含在样品中的细胞是子宫颈细胞；

viii.所述细胞样品是收集于选自

和

的液基细胞学介质中的子宫颈样品；和/或

ix.所述方法是用于确定收集于液基细胞学介质中子宫颈样品中HPV核酸，优选高风险HPV核酸的存在或不存在的自动化方法。

20.一种用于权利要求1-19中一个或多个所述方法的试剂盒，包括：

a)磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面含有阴离子交换部分；

b)变性剂，其是含有碱(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，优选浓度范围是1.0N-2.0N；和

c)含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有多个槽的药盒，其中

a)所述药盒的第一槽包含磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面包含阴离子交换部分；

b)所述药盒的第二槽包含变性剂，其是含有碱(优选NaOH或KOH)的碱性溶液，优选浓度为1.0N-2.0N；和

c)所述药盒的第三槽包含含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物，

其中任选地，所述药盒是密封的。

22.如权利要求20或21所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性颗粒具有一种或多种以下特征：

i)所述磁性颗粒用聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分作官能化；

ii)所述磁性颗粒包含在颗粒悬浮液中，所述颗粒悬浮液的pH值选自：7.5或更低、7或更低和6.5或更低；和/或

iii)所述磁性颗粒包含在颗粒悬浮液中，其中所述颗粒包含在所述悬浮液中的浓度选自：5mg/ml-50mg/ml、10mg/ml-20mg/ml和12.5mg/ml-17.5mg/ml。

23.如权利要求20-22中一个或多个所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有一种或多种以下特征：

a)该试剂盒包含含有多个孔的洗脱板；

b)该试剂盒包括至少一种适合与靶核酸杂交的探针，其中所述探针优选RNA探针；

c)该试剂盒包括能够结合双链核酸杂交体的至少一种结合剂，其中所述结合剂优选连接于固体支持物；

d)该试剂盒包括一种或多种洗涤缓冲液；

e)该试剂盒包括至少一种含有可检测标记物，优选碱性磷酸酶的另一结合剂；

f)该试剂盒包括一种或多种检测试剂；

和/或

g)该试剂盒包括至少一种适合与HPV靶核酸杂交的探针。

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