CN110331140A - 一种膀胱内尿液细菌基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，主要包括尿液样品采集、离心提取沉淀物、细菌细胞的溶解、磁珠提取液提取DNA、磁珠提取液的洗脱、PCR扩增及产物的DNA电泳检测等步骤。该方法是针对膀胱尿液中微生物含量低、现有的肠道样品细菌DNA提取试剂盒在提取膀胱尿液DNA时无法提取足够量的DNA以用于后续研究的现状设计的，针对性强，步骤简单易操作，提取效率高。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取技术领域，具体是涉及一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法。
背景技术
进行微生态研究的前提条件是成功提取样品中微生物的DNA。膀胱这一机体部位一直一来都被人们视为是无菌的，然而，近年来科研人员通过耻骨上膀胱穿刺采集尿标本，并结合扩增培养的方式获知膀胱其实和机体肠道、子宫、阴道等部位一样，是可以培养出细菌的。扩增培养虽然较传统的微生物学培养方法来说，可将培养成功率提高70%，但仍旧有培养失败的可能性存在。
因此，如需对膀胱微生态结构进行充分了解，还需采用高通量测序技术对基因组进行细致全貌的分析。然而，高通量测序应用的先决条件是样品中含有足够量的细菌DNA用于后续测序。虽然膀胱中的尿液是有菌的，但其微生物含量非常低，用普通的肠道样品细菌DNA提取试剂盒无法提取足够量的DNA，导致研究工作或临床检测难以完成。因此，有必要针对该种情况设计一种专用于膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足，提供一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，提取效率高，保证后续研究工作的顺利进行。
本发明的技术方案为：一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，具体包括如下步骤：
1.使用碘伏消毒会阴部和尿道外口，采用导尿术采集不少于40 mL尿液至50 mL无酶无DNA离心管中，以防止外源性污染，将尿液放在置有冰袋的泡沫盒内于半小时内送至实验室；
2.从本步骤开始，所有操作在生物净化台内完成，将尿液放在高速低温离心机内离心1小时，于15000×g条件下进行离心，温度为4℃；
3.用5 mL移液枪及灭过菌的无菌枪头吸去大部分上清液，仅留下沉淀物及底部约1.5mL的上清液，利用移液枪将余留的上清液和沉淀物吹打混匀，并移至1.5 mL无菌离心管中；
4.将上述1.5 mL离心管置于高速离心机内，于20000×g条件下进行离心，离心1小时，温度为4℃；
5.移去上清液，保留沉淀物，将250 µL细菌细胞裂解液加在沉淀物中，吹打混匀，直至无可见团块状物质为止；
6.将上一步样本置于60℃水浴箱中，水浴30分钟，然后移于液氮中，保持30分钟，此步骤循环不少于6次；
7.取上一步样本120 µL至PCR管，再加磁珠提取液（Sera-MagTM SpeedBeadsCarboxylate-Modified Magnetic Particles）60 µL，反复吹打混匀，掌上离心机离心30秒后将PCR管放置在磁力架上保持10分钟，吸去上清液，保留磁珠，掌上离心机离心30秒，再次吸去上清液；
8.在PCR管中加入磁珠洗脱液反复洗脱磁珠2次，吸去磁珠洗脱液，此步骤在磁力架上进行，掌上离心机离心30秒，再将PCR管置于磁力架上，吸去洗脱液；
9.加30 µL无菌去离子水至PCR管中，反复吹打混匀，直至无可见磁珠，此步骤不可在磁力架上进行；
10.将上一步样本置于磁力架上，静置10分钟，吸去上清液，即DNA；
11. 对细菌16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增并对产物进行DNA电泳检测。
进一步地，步骤11中进行PCR扩增的引物为515F和806R，PCR反应体系50 µL，包括PCR Mix Buffer 25 µL，DMSO 3 µL，F/R引物各3 µL，gDNA 10 µL，去离心水6 µL，PCR反应条件为：98℃预变性30 s→98℃变性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸15 s，变性-延伸循环反应30次→72℃终延伸1 min→4℃保温。
进一步地，步骤7中吸去上清液的过程中枪头不可触碰磁珠。
进一步地，步骤8中所用的磁珠洗脱液为80%乙醇+3%盐酸的混合溶液。
首先，本方法利用大量尿液进行高速离心，使细菌得以富集，从而提高了细菌DNA的含量，其次，增加细菌细胞裂解液和反复冻融可使细菌DNA充分释放，最后，当DNA释放后加入磁珠提取液，利用磁力架的磁力使磁珠在高浓度盐存在的条件下选择性地结合DNA，而在洗脱时，又可利用磁力架的磁力将与磁珠结合的DNA与水相分离，进一步保证DNA的提取量。
本发明的有益效果为：
本发明公开一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，主要是针对膀胱尿液中微生物含量低、现有的肠道样品细菌DNA提取试剂盒在提取膀胱尿液DNA时无法提取足够量的DNA以用于后续研究的现状设计的，针对性强，易操作，提取效率高。
附图说明
图1为本发明实施例中提取获得DNA进行PCR扩增检测后的电泳图，其中，NTC为PCR的阴性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
实施例一
一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，具体包括如下步骤：
1.使用碘伏消毒会阴部和尿道外口，采用导尿术采集40 mL尿液至50 mL无酶无DNA离心管中，以防止外源性污染，将尿液放在置有冰袋的泡沫盒内于半小时内送至实验室；
2.从本步骤开始，所有操作在生物净化台内完成，将尿液放在高速低温离心机内离心1小时，于15000×g条件下离心，温度为4℃；
3.用5 mL移液枪及灭过菌的无菌枪头吸去大部分上清液，仅留下沉淀物及底部约1.5mL的上清液，利用移液枪将余留的上清液和沉淀物吹打混匀，并移至1.5 mL无菌离心管中；
4.将上述1.5 mL离心管置于高速离心机内，于20000×g条件下离心1小时，温度为4℃；
5.移去上清液，保留沉淀物，将250 µL细菌细胞裂解液加在沉淀物中，吹打混匀，直至无可见团块状物质为止；
6.将上一步样本置于60℃水浴箱中，水浴30分钟，然后移于液氮中，保持30分钟，此步骤循环6次；
7.取上一步样本120 µL至PCR管，再加磁珠提取液（Sera-MagTM SpeedBeadsCarboxylate-Modified Magnetic Particles）60 µL，反复吹打混匀，掌上离心机离心30秒后将PCR管放置在磁力架上保持10分钟，吸去上清液，保留磁珠，吸去上清液时，枪头不可触碰磁珠，掌上离心机离心30秒，再次吸去上清液；
8.在PCR管中加入80%乙醇+3%盐酸的混合溶液反复洗脱磁珠2次，吸去混合溶液，此步骤在磁力架上进行，掌上离心机离心30秒，再将PCR管置于磁力架上，吸去混合溶液；
9.加30 µL无菌去离子水至PCR管中，反复吹打混匀，直至无可见磁珠，此步骤不可在磁力架上进行；
10.将上一步样本置于磁力架上，静置10分钟，吸去上清液，即DNA。
实施例二
对细菌16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增，引物为515F和806R， PCR反应体系50 µL（PCR Mix Buffer 25 µL，DMSO 3 µL，F/R引物各3 µL，gDNA 10 µL，去离心水6 µL）。PCR反应条件为：98℃预变性30 s→98℃变性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸15 s，变性-延伸循环反应30次→72℃终延伸1 min→4℃保温。
PCR产物进行DNA电泳检测，结果如图1所示，提取的所有样品都扩增出了条带，并且条带明亮，为进一步研究提供了基础。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。
Claims (5)
1.一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）使用碘伏消毒会阴部和尿道外口，采用导尿术采集不少于40 mL尿液至50 mL无酶无DNA离心管中，以防止外源性污染，将尿液放在置有冰袋的泡沫盒内于半小时内送至实验室；
2）将尿液放在高速低温离心机内离心1小时，于15000×g条件下离心，温度为4℃；
3）用5 mL移液枪及灭过菌的无菌枪头吸去大部分上清液，仅留下沉淀物及底部1.5 mL的上清液，利用移液枪将余留的上清液和沉淀物吹打混匀，并移至1.5 mL无菌离心管中；
4）将上述1.5 mL离心管置于高速离心机内，于20000×g条件下离心1小时，温度为4℃；
5）移去上清液，保留沉淀物，将250 µL细菌细胞裂解液加在沉淀物中，吹打混匀，直至无可见团块状物质为止；
6）将上一步样本置于60℃水浴箱中，水浴30分钟，然后移于液氮中，保持30分钟，此步骤循环不少于6次；
7）取上一步样本120 µL至PCR管，再加磁珠提取液60 µL，反复吹打混匀，掌上离心机离心30秒后将PCR管放置在磁力架上保持10分钟，吸去上清液，保留磁珠，掌上离心机离心30秒，再次吸去上清液；
8）在PCR管中加入磁珠洗脱液反复洗脱磁珠2次，吸去磁珠洗脱液，此步骤在磁力架上进行，掌上离心机离心30秒，再将PCR管置于磁力架上，吸去洗脱液；
9）加30 µL无菌去离子水至PCR管中，反复吹打混匀，直至无可见磁珠，此步骤不可在磁力架上进行；
10）将上一步样本置于磁力架上，静置10分钟，吸去上清液，即DNA；
11）对细菌16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增并对产物进行DNA电泳检测。
2.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，从步骤2开始之后的所有操作均在生物净化台内完成。
3.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤8中所用的磁珠洗脱液为80%乙醇+3%盐酸的混合溶液。
4.如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤7中吸去上清液的过程中枪头不可触碰磁珠。
5. 如权利要求1所述的一种膀胱内尿液细菌基因组DNA的提取方法，其特征在于，步骤11中进行PCR扩增的引物为515F和806R，PCR反应体系50 µL ，包括PCR Mix Buffer 25 µL，DMSO 3 µL，F/R引物各3 µL，gDNA 10 µL，去离心水6 µL，PCR反应条件为：98℃预变性30 s→98℃变性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸15 s，变性-延伸循环反应30次→72℃终延伸1min→4℃保温。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191015 |