CN117861624A - 一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 - Google Patents
一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117861624A CN117861624A CN202311751683.XA CN202311751683A CN117861624A CN 117861624 A CN117861624 A CN 117861624A CN 202311751683 A CN202311751683 A CN 202311751683A CN 117861624 A CN117861624 A CN 117861624A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic beads
- magnetic
- carboxyl
- stirring
- beads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 263
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 46
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 29
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 29
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 27
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 18
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 17
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 claims description 14
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 13
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 13
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 8
- NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K iron trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].Cl[Fe+]Cl NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004729 solvothermal method Methods 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000003980 solgel method Methods 0.000 claims description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 claims description 4
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- DNAJDTIOMGISDS-UHFFFAOYSA-N prop-2-enylsilane Chemical compound [SiH3]CC=C DNAJDTIOMGISDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 25
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 25
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 14
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 13
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 239000010724 circulating oil Substances 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 6
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 6
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000011553 magnetic fluid Substances 0.000 description 2
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 102100030569 Nuclear receptor corepressor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710153660 Nuclear receptor corepressor 2 Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Soft Magnetic Materials (AREA)
Abstract
本发明属于纳米材料技术领域，公开了一种DNA片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用，具体公开了一种羧基磁珠的制备方法。本发明提供制备方法可稳定、大批量地制备亚微米级别DNA分选及纯化用的羧基磁珠，该方法工艺简单、容易控制和操作，成本低，产率高，安全性和稳定性好，易实现工业化规模生产。其制备技术简单，无需复杂设备，过程绿色环保。该方法制备得到的羧基磁珠磁吸速度较快、可避免操作过程中磁珠丢失，提高操作精准性，可以配合半自动化及全自动化移液工作站，实现高通量建库的需求，其分选得到的DNA片段可直接用于构建基因库，回收率及纯度高。
Description
技术领域
本发明属纳米材料技术领域，具体涉及一种DNA片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用。
背景技术
四十多年来，测序技术经历了三次大飞跃，即以Sanger测序法/化学降解法为代表的第一代测序技术的自动化、以Roche 454/Illimina Solexa/ABI SOLiD为代表的第二代测序技术的高通量化以及以PacBio SMRT/Oxford Nanopore为主要代表的第三代单分子测序技术的长读长化，极大地推进了现代生命科学研究的进程。二代测序和三代测序统称为下一代测序(NGS)，而NGS的应用主要在DNA测序、RNA测序、宏基因组测序、表观遗传学等几大领域。在DNA测序中，从样品制备到文库制备及最终测序，大多步骤均要求精确高效化、易于自动化操作，并且许多高通量测序应用都要求核酸片段在特定范围内紧密分布，因此DNA片段筛选在基因测序领域是不可或缺的环节，高分辨率筛选可降低下游测序深度、节约测序成本。
传统的核酸片段分选方法有溶液沉淀法和切胶回收法，但这些方法操作步骤均十分复杂，难实现自动化，无法和下游的NGS测序技术串联形成流水线操作。基于磁珠法的固相可逆萃取技术解决了以上难题，将羧基磁珠引入到核酸体系中，通过调控体系结合液中的PEG和NaCl等盐浓度，即可以实现核酸片段的精确筛分。最后通过洗涤、洗脱步骤即可获得高纯度的特定尺寸DNA片段。
常见的文库制备方法有胶回收法、磁珠分选法等。胶回收法虽然成本低，但难以实现自动化、试剂对人体有害、实验操作耗时长。磁珠法利用磁珠自身的超顺磁性，可轻易实现自动化操作，仅需控制两轮分选磁珠的用量即可制备出所需尺寸的文库片段。
现有文献资料对磁珠分选DNA片段的机理已有较多研究，市面上亦出现较多的同类产品，尤以贝克曼AMPure XP Beads作为行业金标准。但整体上该类产品的售价依然较高，这是因为配套磁珠的相关液体组分已有较多文献研究，众多企业大多是从国外采购磁珠原料回来，自己开发液体组分配套进口磁珠组装成试剂盒再次出售。因进口磁珠原料的成本及货期不可控，导致企业利润较薄，产品降价的空间有限。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种羧基磁珠的制备方法。
本发明第二方面的目的，在于提供一种羧基磁珠。
本发明第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第二方面的羧基磁珠或本发明第三方面的试剂盒在DNA片段分选或DNA纯化中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用溶剂热法制备单分散的Fe3O4磁核，利用溶胶凝胶法在Fe3O4磁核表面进行二氧化硅涂层包覆，得到硅基磁珠；
(2)以氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂或烯丙基硅烷偶联剂对硅基磁珠进行改性衍生，得到氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠；
(3)通过接枝含有羧基的小分子化合物在步骤(3)得到的氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠上衍生羧基功能基团，即得到羧基磁珠。
在本发明一些实施方式中，所述溶剂热法包括以下步骤：将六水三氯化铁、乙二醇、一缩二乙二醇、醋酸钠和PEG混合，油浴条件下，搅拌1，反应1，磁铁吸附，洗涤，得到即得到单分散的Fe3O4磁核。
本发明首先采用改良的溶剂热法制备单分散的Fe3O4磁核，与常规的共沉淀法、热分解法、溶剂热法等相比，本发明提供制备的磁核具有磁分离速度快、粒径更为均一的特点。
在本发明一些实施方式中，所述油浴的温度为60～80℃；和/或，所述搅拌1的条件为200～400rpm搅拌50～70min。
在本发明一些优选实施方式中，所述油浴的温度为70～80℃；和/或，所述搅拌1的条件为200～300rpm搅拌6～70min。
在本发明一些实施方式中，所述反应1的条件为150～300℃100～200rpm密闭反应20～30h。
在本发明一些优选实施方式中，所述反应1的条件为150～200℃150～200rpm密闭反应24～30h。
在本发明一些实施方式中，所述六水三氯化铁、乙二醇、一缩二乙二醇、醋酸钠和PEG的质量比为1:(1～4):(0.5～1.5):(5～9):(0.1～0.5)。
在本发明一些优选实施方式中，所述六水三氯化铁、乙二醇、一缩二乙二醇、醋酸钠和PEG的质量比为1:(2～3):(0.5～0.9):(6～8):(0.1～0.3)。
在本发明一些实施方式中，所述溶胶凝胶法包括以下步骤：Fe3O4磁核与无水乙醇、氨水混合，搅拌2，加入正硅酸四乙酯，反应2，磁铁吸附，得到硅基磁珠。
在磁核表面以溶胶凝胶法进行二氧化硅涂层包覆，经过二氧化硅包覆的纳米复合微球抗酸碱腐蚀的性能得到提升，二氧化硅本身具有良好的生物相容性，对生物大分子基本不存在非特异性吸附。
在本发明一些实施方式中，所述搅拌2的条件为400～600rpm搅拌20～40min。
在本发明一些优选实施方式中，所述搅拌2的条件为500～600rpm搅拌30～40min.
在本发明一些实施方式中，所述反应2的条件为400～600rpm反应不少于12h
在本发明一些优选实施方式中，所述反应2的条件为500～600rpm反应不少于12h。
在本发明一些实施方式中，步骤(2)包括以下步骤：硅基磁珠分散至乙醇中，油浴条件下搅拌，加入氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂或双键的硅烷偶联剂和氨水，反应，洗涤，即得到氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠。
在本发明一些实施方式中，所述反应的条件为50～90℃反应至少12h。
在本发明一些优选实施方式中，所述反应的条件为60～80℃反应至少12h。
在本发明一些实施方式中，所述油浴的温度为50～90℃。
在本发明一些优选实施方式中，所述油浴的温度为60～80℃。
在本发明一些实施方式中，步骤(3)包括以下步骤：将氨基改性磁珠分散至N,N-二甲基甲酰胺，30～50℃油浴条件下搅拌，加入丁二酸酐，30～50℃反应不少于24h，即得到羧基磁珠；或
将环氧基改性磁珠分散至水中，30～50℃油浴条件下搅拌，加入氨基二乙酸，50～70℃反应不少于24h，即得到羧基磁珠；或
将双键改性磁珠分散至水中，65～80℃油浴条件下搅拌，加入十二烷基硫酸钠、丙烯酸、苯乙烯、二乙烯基苯，密闭排氧，加入过硫酸钾，65～80℃搅拌反应不少于24h，即得到羧基磁珠。
本发明四二方面，提供本发明第一方面的制备方法制备得到的羧基磁珠。
在本发明一些实施方式中，所述羧基磁珠的粒径为250～350nm。
在本发明一些优选实施方式中，所述羧基磁珠的粒径为290～320nm。
在本发明一些实施方式中，所述羧基磁珠含有300～400μmol/g的羧基。
在本发明一些优选实施方式中，所述羧基磁珠含有350～400μmol/g的羧基。
在本发明一些实施方式中，所述羧基磁珠分散在水中Zeta电位为-40～-35mV。
在本发明一些优选实施方式中，所述羧基磁珠分散在水中Zeta电位为-39～-37mV。
本发明第三方面，提供一种试剂盒，包括本发明第二方面的羧基磁珠、磁珠结合液、磁珠洗涤液和磁珠洗脱液。
在本发明一些实施方式中，所述磁珠结合液包括氯化钠、Tris、PEG、Proclin300。
在本发明一些实施方式中，所述磁珠洗涤液为60％～80％乙醇
在本发明一些实施方式中，所述磁珠洗脱液包括Tris和EDTA·2Na。
本发明第四方面，提供本发明第二方面的羧基磁珠或本发明第三方面的试剂盒在DNA片段分选或DNA纯化中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供制备方法可稳定、大批量地制备亚微米级别DNA分选及纯化用的羧基磁珠，该方法工艺简单、容易控制和操作，成本低，产率高，安全性和稳定性好，易实现工业化规模生产。其制备技术简单，无需复杂设备，过程绿色环保。该方法制备得到的羧基磁珠磁吸速度较快、可避免操作过程中磁珠丢失，提高操作精准性，可以配合半自动化及全自动化移液工作站，实现高通量建库的需求，其分选得到的DNA片段可直接用于构建基因库，回收率及纯度高。
本发明提供的用于DNA分选纯化的核心组分羧基磁珠，其尺寸介于亚微米级别(约300nm)，与现有文献报道较多的微米级大尺寸磁珠相比，本发明制备的磁珠粒径小、比表面积大、悬浮能力更强、有效捕获能力更强。实际操作时磁珠用量少、磁吸快、非特异性吸附低。
在实现相同功能的前提下，使用本发明提供的试剂盒性价比远高于市面上的其他同类产品。该试剂盒包含磁珠工作液、洗涤液、洗脱液、磁力架等组分。即可适用于科研领域的手工小试操作又可适配提取仪实现自动化操作；结合独特的洗涤缓冲液体系，该试剂盒可分离纯化小至150bp的DNA片段；DNA回收率高、分选精准稳定。可应用于酶切、连接、克隆、NGS建库等场景的DNA纯化，以及DNA建库所需的各种样本类型的片段分选。
从上至下核心原料均可实现自我把控，成本低、性价比高、可实现同类进口产品的原始替换。实现羧基磁珠核心原料的大批量自产，其性能与进口竞品磁珠不相上下。
附图说明
图1为本发明技术路线示意图。
图2为实施例1中制备得到的单分散的硅基磁珠(Fe3O4@SiO2磁珠)的SEM图，标尺为2μm。
图3为实施例1中制备得到的单分散的硅基磁珠(Fe3O4@SiO2磁珠)的TEM图，标尺为2μm。
图4为实施例1中单分散的硅基磁珠分散在水中的Zeta电位。
图5为实施例1中氨基修饰的磁珠分散在水中的Zeta电位。
图6为实施例2中环氧基修饰的磁珠分散在水中的Zeta电位。
图7为实施例3中双键修饰的磁珠分散在水中的Zeta电位。
图8为实施例1制备得到的羧基磁珠的电导滴定曲线。
图9为实施例1制备得到的羧基磁珠分散在水中的Zeta电位参数。
图10为实施例1制备得到的羧基磁珠的抗酸腐蚀测试结果。
图11为实施例1制备得到的羧基磁珠的吸速度测试结果。
图12为实施例1制备得到的羧基磁珠用于DNA片段纯化结果。
图13为实施例2制备得到的羧基磁珠用于DNA片段分选结果。
图14为实施例3制备得到的羧基磁珠和竞品磁珠同步分选小牛胸腺DNASmear的效果对比结果。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
磁珠结合液的配制：在2L塑料瓶中称取200g氯化钠母液(5M)、200g Tris母液(1M，pH8.1)、400g PEG8000、900g去离子水、0.5g Proclin300，密封塑料瓶，将其置于超声仪中，60℃超声加热溶解，使其形成均一透明的液体，即得到磁珠结合液。
磁珠洗涤液的配制：取700mL无水乙醇与300mL纯水混匀，即得到磁珠洗涤液。
磁珠洗脱液的配制：取10mL Tris母液(1M，pH8.0)，1mL EDTA·2Na母液(0.1M)于1L塑料瓶中，用水定容至1L刻度线，即得到磁珠洗脱液。
磁珠工作液的配制：用磁珠结合液将羧基磁珠复溶，制备成10mg/mL的磁珠溶液即为磁珠工作液。
实施例1
一种羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)单分散的硅基磁珠的制备：称4277.5g乙二醇、13184g一缩二乙二醇、1560g醋酸钠、1890g六水三氯化铁、550g PEG2000倒入50L洁净玻璃反应釜中；打开高低温循环油浴，温度设置70℃；开启搅拌电机，300rpm搅拌溶解60min，使釜内的溶液形成均一的黄色溶液；将反应液全部转入含有四氟内衬的50L不锈钢高压反应釜的内腔中；高压反应釜转速设置为150r/min、温度设置为200℃，密封加热反应24h；反应结束降温后将产物倒入30L塑料桶中，使用磁铁进行磁吸附，待所有磁核被吸附到桶底后，倒出上层溶液；向桶内加入大量去离子水反复超声搅拌洗涤，直至产物(磁核)无明显异味；将洗净的磁核全部转入20L玻璃釜中；向20L玻璃釜内加入12480g无水乙醇、1500g去离子水、350mL氨水；搅拌电机设置500rpm搅拌30min；用恒流泵向釜内滴加750mL正硅酸四乙酯，速度控制在5mL/min；硅源全部滴加完毕后，继续搅拌反应12h以上；反应完毕后将产物全部转入30L塑料桶中，静置磁吸4h；将30L桶内上清液全部转出，用大量去离子水对产物进行多次超声洗涤，直至上清pH呈中性；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的硅基磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到单分散的硅基磁珠(Fe3O4@SiO2磁珠)。
(2)氨基修饰的磁珠的制备：取100g步骤(1)中制备的硅基磁珠，将其超声分散于20L 95％乙醇中；将分散液全部转至20L玻璃反应釜中；开启300rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置70℃；向釜内加入150mL氨基硅烷偶联剂KH-550；70℃搅拌反应12h以上；产物用95％乙醇和去离子水反复洗涤，直至上清pH呈中性；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的氨基改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到氨基修饰的磁珠(即氨基改性磁珠)。
(3)羧基改性磁珠的制备：取50g步骤(2)中制备的氨基改性磁珠，将其超声分散于10L N,N-二甲基甲酰胺中；将分散液全部转至20L玻璃反应釜中；开启250rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置40℃；向釜内加入25g丁二酸酐；40℃搅拌反应24h以上；产物用乙醇和去离子水反复洗涤，直至上清无异味；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的羧基改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到羧基改性磁珠。
实施例2
一种羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)单分散的硅基磁珠的制备：称4277.5g乙二醇、13184g一缩二乙二醇、1560g醋酸钠、1890g六水三氯化铁、550g PEG2000倒入50L洁净玻璃反应釜中；打开高低温循环油浴，温度设置70℃；开启搅拌电机，300rpm搅拌溶解60min，使釜内的溶液形成均一的黄色溶液；将反应液全部转入含有四氟内衬的50L不锈钢高压反应釜的内腔中；高压反应釜转速设置为150r/min、温度设置为200℃，密封加热反应24h；反应结束降温后将产物倒入30L塑料桶中，使用磁铁进行磁吸附，待所有磁核被吸附到桶底后，倒出上层溶液；向桶内加入大量去离子水反复超声搅拌洗涤，直至产物(磁核)无明显异味；将洗净的磁核全部转入20L玻璃釜中；向20L玻璃釜内加入12480g无水乙醇、1500g去离子水、350mL氨水；搅拌电机设置500rpm搅拌30min；用恒流泵向釜内滴加750mL正硅酸四乙酯，速度控制在5mL/min；硅源全部滴加完毕后，继续搅拌反应12h以上；反应完毕后将产物全部转入30L塑料桶中，静置磁吸4h；将30L桶内上清液全部转出，用大量去离子水对产物进行多次超声洗涤，直至上清pH呈中性；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的硅基磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到单分散的硅基磁珠(Fe3O4@SiO2磁珠)。
(2)环氧基修饰的磁珠的制备：取80g步骤(1)中制备的硅基磁珠，将其超声分散于15L无水甲苯中；将分散液全部转至20L玻璃反应釜中；开启300rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置80℃；向釜内加入30mL环氧基硅烷偶联剂KH-560；80℃回流反应12h以上；产物用无水乙醇反复洗涤，直至无明显异味为止；磁分离去除桶内乙醇，将桶底的环氧基改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到环氧基修饰的磁珠(即环氧基改性磁珠)。
(3)羧基改性磁珠的制备：取77g步骤(2)中制备的环氧基改性磁珠，将其超声分散于15L去离子水中；将分散液全部转至20L玻璃反应釜中；开启400rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置60℃；向釜内加入50g氨基二乙酸；60℃搅拌反应24h以上；产物用去离子水反复洗涤，直至上清无异味；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的羧基改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到羧基改性磁珠。
实施例3
一种羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)单分散的硅基磁珠的制备：称4277.5g乙二醇、13184g一缩二乙二醇、1560g醋酸钠、1890g六水三氯化铁、550g PEG2000倒入50L洁净玻璃反应釜中；打开高低温循环油浴，温度设置70℃；开启搅拌电机，300rpm搅拌溶解60min，使釜内的溶液形成均一的黄色溶液；将反应液全部转入含有四氟内衬的50L不锈钢高压反应釜的内腔中；高压反应釜转速设置为150r/min、温度设置为200℃，密封加热反应24h；反应结束降温后将产物倒入30L塑料桶中，使用磁铁进行磁吸附，待所有磁核被吸附到桶底后，倒出上层溶液；向桶内加入大量去离子水反复超声搅拌洗涤，直至产物(磁核)无明显异味；将洗净的磁核全部转入20L玻璃釜中；向20L玻璃釜内加入12480g无水乙醇、1500g去离子水、350mL氨水；搅拌电机设置500rpm搅拌30min；用恒流泵向釜内滴加750mL正硅酸四乙酯，速度控制在5mL/min；硅源全部滴加完毕后，继续搅拌反应12h以上；反应完毕后将产物全部转入30L塑料桶中，静置磁吸4h；将30L桶内上清液全部转出，用大量去离子水对产物进行多次超声洗涤，直至上清pH呈中性；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的硅基磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到单分散的硅基磁珠(Fe3O4@SiO2磁珠)。
(2)双键修饰的磁珠的制备：取200g步骤(1)中制备的硅基磁珠干粉，将其超声分散于20L 95乙醇中；将分散液全部转至50L玻璃反应釜中；开启300rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置60℃；向釜内加入10mL氨水、45mL含双键的硅烷偶联剂KH-570；60℃搅拌反应12h以上；产物用95％乙醇和去离子水反复洗涤，直至上清无异味；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的双键改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到双键修饰的磁珠(即双键改性磁珠)。
(3)羧基改性磁珠的制备：取45g步骤(2)中制备的双键改性磁珠，将其超声分散于40L去离子水中；将分散液全部转至50L玻璃反应釜中；开启300rpm机械搅拌，打开高低温循环油浴，温度设置75℃；向釜内加入10g十二烷基硫酸钠、15mL丙烯酸、10mL苯乙烯、2mL二乙烯基苯；密封反应釜，向釜内通氮气排氧30min；用注射器向釜内加入200mL过硫酸钾溶液(20mg/mL)75℃搅拌引发反应24h以上；产物用乙醇和去离子水反复洗涤，直至上清无异味；磁分离去除桶内去离子水，将桶底的羧基改性磁珠置于烘箱中60℃烘干24h，即得到羧基改性磁珠。
效果实施例
1.采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope，SEM)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)对实施例1步骤(1)中制备的单分散的硅基磁珠进行表征。
结果如图2和图3所示，由SEM图可知实施例1制备的单分散的硅基磁珠母体具有良好的单分散性，平均尺寸约300nm。由TEM图可知实施例1制备的单分散的硅基磁珠包覆了较为均一的二氧化硅壳层，厚度约为40nm。
2.采用布鲁克海文90Plus激光粒度分析仪分别检测实施例1～3中步骤(1)～(2)中制备的硅基磁珠、氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠和双键改性磁珠分散在水中的Zeta电位。
结果如图4～图5可以看出，硅基磁珠修饰KH550(氨基改性磁珠)后分散在水中Zeta电位反转证实微球表面氨基改性成功。硅基磁珠修饰KH560(环氧基改性磁珠)后分散在水中Zeta电位接近于0证实微球表面环氧改性成功(图6)；硅基磁珠修饰KH570后分散在水中Zeta电位接近于0证实微球表面双键改性成功(图7)。
3.采用电导滴定法测定实施例1制备得到的羧基磁珠表面的羧基含量，采用布鲁克海文90Plus激光粒度分析仪测定其分散在水中的Zeta电位。
通过电导滴定曲线可看出磁珠表表面的羧基密度，结果可以看出，实施例1制备得到的羧基磁珠表面具有极高的羧基密度，羧基含量达到350μmol/g(图8)，比市面上常规的免疫羧基磁珠高出一个数量级。如此高的羧基密度是因为磁珠粒径处于亚微米级别(约300nm)，磁珠的比表面积相对比微米级磁珠要高很多。Zeta电位结果显示，氨基磁珠经丁二酸酐改性(即羧基磁珠)后分散在水中Zeta电位由改性前的30.75mV变为-38.51mV，证实羧基改性成功(图9)。
4.抗酸腐蚀测试
分别取5mg实施例1的羧基磁珠与市面上购买的磁珠(后续简称竞品磁珠，购买自上海生工，货号为D110550-0500)，各自分散于1.5mL盐酸(6M)中，浸泡20min，测试磁珠的耐酸腐蚀效果。
结果显示，实施例1制备的羧基磁珠腐蚀20min后依然无铁离子泄露，而竞品磁珠已泄露出较多的铁离子，溶液呈黄色(图10)。对比说明实施例1制备得到的羧基磁珠包覆的壳层更加致密，抗复杂环境的能力更好。
5.吸速度测试
分别将实施例1的羧基磁珠与简称竞品磁珠，分散在纯水中制备成10mg/mL的磁流体，摇匀后放在磁铁旁磁吸，对比溶液完全澄清所需的时间。
由结果可知，竞品磁珠磁吸较慢，磁分离10min仍然未能被磁铁完全捕获。而实施例1制备得到的羧基磁珠在15s内即可被磁铁完全捕获，磁吸速度极快(图11)。
实施例2～3制备的羧基磁珠与实施例1制备得到的羧基磁珠具有相同的性能(具有抗酸腐蚀性能以及较快的磁吸速度)。
6.磁珠纯化、分选性能验证
磁珠纯化DNA片段流程：取50μL 100bp DNALadder(赛默飞世尔科技公司，货号15628019)和不同体积的磁珠工作液混匀，室温静置孵育10min。转移到磁力架上，静置吸磁5min。待溶液澄清后，用移液器小心移弃全部上清。保持样本静置磁力架上，用500μL磁珠洗涤液漂洗磁珠两次。室温下空气干燥磁珠5min；待磁珠干燥至表面无光泽后，用20μL磁珠洗脱液将磁珠捕获的DNA片段洗脱下来。所述的DNA片段和磁珠体积比在1:(0.3～1.5)间调整。
磁珠分选DNA片段流程：取50μL 100bp DNALadder(赛默飞世尔科技公司，货号15628019)和不同体积的磁珠工作液混匀，室温静置孵育10min。转移到磁力架上，静置吸磁5min。待溶液澄清后，小心将上清移至干净无酶管中。向上清中加入适量二轮分选磁珠，混匀后室温静置孵育10min。转移到磁力架上，静置吸磁5min，小心移弃上清。用500μL磁珠洗涤液漂洗磁珠两次，室温下空气干燥磁珠5min；待磁珠干燥至表面无光泽后，用20μL磁珠洗脱液将磁珠上的DNA片段洗脱下来。一轮分选DNA片段和磁珠体积比在1:(0.3～1.5)间调整。二轮分选所述的上清DNA片段和加入的磁珠体积比在1:(0.15～0.2)间调整。
6.1DNA片段纯化
采用含有100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp的DNA溶液(ThermoFisher 100bp DNALadder)作为分选模板，分选不同区段的DNA片段。具体如下：取7个2mL离心管，分别加入50μL 100bp DNA Ladder(赛默飞世尔科技公司，货号15628019)后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠工作液(实施例1制备得到的羧基磁珠制备成10mg/mL的工作液)体积(见表1)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将离心管置于磁力架静置吸磁，待溶液澄清后，弃上清液；保持样本始终处于磁力架上，加入500μL 80％乙醇，室温放置30s，弃上清液，重复洗涤步骤一次；保持样本始终处于磁力架上，室温下开盖空气干燥磁珠至表面无明显光泽；向磁珠中加入20μLTE缓冲液，吸打混匀磁珠，室温孵育10min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的离心管。进行琼脂糖凝胶电泳分析。
表1不同体积的磁珠结合液对应分选DNA片段长度
结果如图12所示，由电泳图可看出，在一定范围内，随着磁珠工作液体积的增加，纯化得到的片段越来越小，可满足下游分选需求。
6.2DNA片段分选
DNA片段分选，包括以下步骤：
(1)采用含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp、2000bp的DNA溶液(ThermoFisher 100bp DNA Ladder)作为分选模板，分选不同区段的DNA片段。
(2)第一次结合(去除大片段)：取5个2mL离心管，分别加入50μL DNA溶液。然后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠工作液(实施例2制备得到的羧基磁珠制备成10mg/mL的工作液)体积(见表2)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将离心管置于磁力架静置吸磁，待溶液澄清后，上清液移取至新的无酶离心管备用。
(3)第二次结合(截留小片段)：根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠工作液体积(见表2)，加入到上清液中，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将离心管置于磁力架静置吸磁，待溶液澄清后，移弃上清。
(4)保持样本始终处于磁力架上，加入500μL 80％乙醇，室温放置30s，弃上清液，重复洗涤步骤一次。
(5)保持样本始终处于磁力架上，室温下开盖空气干燥磁珠至表面无明显光泽。
(6)向磁珠中加入20μLTE缓冲液，吸打混匀磁珠，室温孵育10min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的离心管。进行琼脂糖凝胶电泳分析。
表2不同体积的磁珠结合液对应分选DNA片段
结果如图13所示，从电泳图可以看出，不同二轮分选条件组合可得到不同区段的DNA片段，分选梯度良好。
6.3以碎片化的小牛胸腺DNA作为分选样本，对比实施例3制备的羧基磁珠与竞品磁珠(购自贝克曼库尔特，货号A63880)的分选效果
采用超声碎片化的小牛胸腺DNA(200ng/uL，实验室自制)作为分选模板用于分选不同区段的DNA。
(1)第一次结合(去除大片段)：取5个2mL离心管，分别加入50μL DNA溶液。然后根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠工作液(将实施例3制备得到的羧基磁珠制备成10mg/mL的工作液)体积(见表2)，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将离心管置于磁力架静置吸磁，待溶液澄清后，上清液移取至新的无酶离心管备用。
(2)第二次结合(截留小片段)：根据需分选目的片段大小选择特定的磁珠结合液体积(见表2)，加入到上清液中，旋涡混匀，室温放置10min，结束后将离心管置于磁力架静置吸磁，待溶液澄清后，移弃上清。
(3)保持样本始终处于磁力架上，加入500μL 80％乙醇，室温放置30s，弃上清液，重复洗涤步骤一次。
(4)保持样本始终处于磁力架上，室温下开盖空气干燥磁珠至表面无明显光泽。
(5)向磁珠中加入20μL TE缓冲液，吸打混匀磁珠，室温孵育10min，再置于磁力架上，待磁珠完全分离，将上清液转移至新的离心管。进行琼脂糖凝胶电泳分析。
结果如图14所示，实施例3制备得到的羧基磁珠和竞品磁珠以小牛胸腺碎片化DNA作为样本进行同步分选时，性能和竞品磁珠基本一致。
7.磁珠价格对比
磁珠价格对比见表3。
表3磁珠价格对比
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种羧基磁珠的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用溶剂热法制备单分散的Fe3O4磁核，利用溶胶凝胶法在Fe3O4磁核表面进行二氧化硅涂层包覆，得到硅基磁珠；
(2)以氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂或烯丙基硅烷偶联剂对硅基磁珠进行改性衍生，得到氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠；
(3)通过接枝含有羧基的小分子化合物在步骤(3)得到的氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠上衍生羧基功能基团，即得到羧基磁珠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂热法包括以下步骤：将六水三氯化铁、乙二醇、一缩二乙二醇、醋酸钠和PEG混合，油浴条件下，搅拌1，反应1，磁铁吸附，洗涤，得到即得到单分散的Fe3O4磁核。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述油浴的温度为60～80℃；和/或，所述搅拌1的条件为200～400rpm搅拌50～70min；和/或，所述反应1的条件为150～300℃100～200rpm密闭反应20～30h；和/或，所述六水三氯化铁、乙二醇、一缩二乙二醇、醋酸钠和PEG的质量比为1:(1～4):(0.5～1.5):(5～9):(0.1～0.5)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶胶凝胶法包括以下步骤：Fe3O4磁核与无水乙醇、氨水混合，搅拌2，加入正硅酸四乙酯，反应2，磁铁吸附，得到硅基磁珠。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌2的条件为400～600rpm搅拌20～40min；和/或，所述反应2的条件为400～600rpm反应不少于12h。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：硅基磁珠分散至乙醇中，油浴条件下搅拌，加入氨基硅烷偶联剂、环氧基硅烷偶联剂或双键的硅烷偶联剂和氨水，反应，洗涤，即得到氨基改性磁珠、环氧基改性磁珠或双键改性磁珠。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括以下步骤：将氨基改性磁珠分散至N,N-二甲基甲酰胺，30～50℃油浴条件下搅拌，加入丁二酸酐，30～50℃反应不少于24h，即得到羧基磁珠；或
将环氧基改性磁珠分散至水中，30～50℃油浴条件下搅拌，加入氨基二乙酸，50～70℃反应不少于24h，即得到羧基磁珠；或
将双键改性磁珠分散至水中，65～80℃油浴条件下搅拌，加入十二烷基硫酸钠、丙烯酸、苯乙烯、二乙烯基苯，密闭排氧，加入过硫酸钾，65～80℃搅拌反应不少于24h，即得到羧基磁珠。
8.一种羧基磁珠，由权利要求1～7中任一项所述的制备方法制备得到。
9.一种试剂盒，包括权利要求8所述的羧基磁珠、磁珠结合液、磁珠洗涤液和磁珠洗脱液；优选的，所述磁珠结合液包括氯化钠、Tris、PEG、Proclin300。
10.权利要求8所述的羧基磁珠或权利要求9所述的试剂盒在DNA片段分选或DNA纯化中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311751683.XA CN117861624A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | 一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311751683.XA CN117861624A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | 一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117861624A true CN117861624A (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=90576354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311751683.XA Pending CN117861624A (zh) | 2023-12-18 | 2023-12-18 | 一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117861624A (zh) |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001071732A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-27 | Qiagen Gmbh | Porous ferro- or ferrimagnetic glass particles for isolating molecules |
| CN101684138A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒 |
| CN102091575A (zh) * | 2009-12-14 | 2011-06-15 | 深圳先进技术研究院 | 四氧化三铁磁性纳米颗粒及其制备方法 |
| CN104212793A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-17 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
| CN105037664A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-11 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 一种采用溶胀共聚法制备的超顺磁性高级功能聚合物单分散微球 |
| US20160010081A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Exact Sciences Corporation | Systems, methods and kits for extracting nucleic acid from digestive fluid |
| CN105642239A (zh) * | 2016-03-17 | 2016-06-08 | 黑龙江省科学院高技术研究院 | 核酸提取用磁性微珠的制备方法 |
| CN106215821A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法 |
| CN113083177A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-07-09 | 苏州为度生物技术有限公司 | 核壳结构磁性荧光微球及其制备方法 |
| US20220372196A1 (en) * | 2019-06-21 | 2022-11-24 | Kangma-Healthcode (Shanghai) Biotech Co., Ltd. | Biomagnetic microsphere and preparation method and use method therefor |
| CN116099519A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-05-12 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用 |
| CN116994846A (zh) * | 2023-07-04 | 2023-11-03 | 广州奕昕生物科技有限公司 | 一种夹心结构的核酸提取用硅基磁珠及其制备方法 |
| CN117143299A (zh) * | 2023-08-31 | 2023-12-01 | 厦门为正生物科技股份有限公司 | 一种功能化磁性微球的制备方法及其应用 |
-
2023
- 2023-12-18 CN CN202311751683.XA patent/CN117861624A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001071732A2 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-27 | Qiagen Gmbh | Porous ferro- or ferrimagnetic glass particles for isolating molecules |
| CN101684138A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒 |
| CN102091575A (zh) * | 2009-12-14 | 2011-06-15 | 深圳先进技术研究院 | 四氧化三铁磁性纳米颗粒及其制备方法 |
| US20160010081A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Exact Sciences Corporation | Systems, methods and kits for extracting nucleic acid from digestive fluid |
| CN104212793A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-12-17 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法 |
| CN105037664A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-11-11 | 苏州英芮诚生化科技有限公司 | 一种采用溶胀共聚法制备的超顺磁性高级功能聚合物单分散微球 |
| CN105642239A (zh) * | 2016-03-17 | 2016-06-08 | 黑龙江省科学院高技术研究院 | 核酸提取用磁性微珠的制备方法 |
| CN106215821A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种磁微粒化学发光免疫分析试剂用羧基磁珠的制备方法 |
| US20220372196A1 (en) * | 2019-06-21 | 2022-11-24 | Kangma-Healthcode (Shanghai) Biotech Co., Ltd. | Biomagnetic microsphere and preparation method and use method therefor |
| CN113083177A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-07-09 | 苏州为度生物技术有限公司 | 核壳结构磁性荧光微球及其制备方法 |
| CN116099519A (zh) * | 2023-03-09 | 2023-05-12 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 一种磁性固相萃取材料、其制备方法及应用 |
| CN116994846A (zh) * | 2023-07-04 | 2023-11-03 | 广州奕昕生物科技有限公司 | 一种夹心结构的核酸提取用硅基磁珠及其制备方法 |
| CN117143299A (zh) * | 2023-08-31 | 2023-12-01 | 厦门为正生物科技股份有限公司 | 一种功能化磁性微球的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| WANG GZ ET AL.: "Magnetic composite microspheres with patterned surface structures:preparation in situ and characterization", 《ACTA CHIMICA SINICA》, vol. 65, 28 September 2007 (2007-09-28), pages 2051 - 2056 * |
| 徐鹏: "Fe3O4@SiO2@PAA 多层核-壳结构复合微球的制备及吸附染料研究", 《林业工程学报》, vol. 3, 18 May 2018 (2018-05-18), pages 2 - 1 * |
| 李志利: "磁性复合微球的制备、表征及在DNA纯化中的应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》, no. 4, 15 April 2011 (2011-04-15), pages 27 - 28 * |
| 杨淏文: "基于纳米磁珠与化学发光技术检测广西巴马小型猪PERV的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》, no. 2, 15 February 2015 (2015-02-15), pages 15 - 16 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Simultaneous extraction of DNA and RNA from Escherichia coli BL 21 based on silica-coated magnetic nanoparticles | |
| CN103820431B (zh) | 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒 | |
| CN104212793B (zh) | 磁珠法提取细菌基因组dna的试剂盒及其提取方法 | |
| CN107257857B (zh) | 用于ivt后rna纯化的方法和试剂盒 | |
| CN101747478B (zh) | 有机-无机杂化多孔整体材料的“一锅法”制备 | |
| CN102586225B (zh) | 一种操纵磁珠分离目标分子的方法 | |
| CN104801262A (zh) | 一种磁性复合铀吸附剂的制备方法及其应用 | |
| WO2016023431A1 (zh) | 杂交富集捕获dna测序文库洗涤溶液及洗涤方法 | |
| CN113893826A (zh) | 一种高性能悬浮磁珠的制备方法及应用 | |
| CN113388610B (zh) | 一种磁珠法快速提取细菌质粒dna的试剂盒及提取方法 | |
| CN109055363A (zh) | 一种适用于筛选超长片段核酸的磁珠试剂及筛选方法 | |
| CN106434630B (zh) | 牛副流感病毒3型hn蛋白核酸适配体及其筛选方法 | |
| JP6431522B2 (ja) | 核酸の精製のための１工程法 | |
| CN110846382A (zh) | 胎儿游离dna的富集方法 | |
| EP1608752A2 (en) | Method for isolating nucleic acids | |
| CN114177893B (zh) | 磁性微球、制备方法及应用 | |
| CN117861624A (zh) | 一种dna片段分选纯化磁珠的制备方法及其及应用 | |
| EP1205548A1 (en) | Methods and apparatus for successively ligating double-stranded DNA molecules on a solid phase | |
| CN104209087B (zh) | 一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法 | |
| CN111560369A (zh) | 一种用于纯化游离dna的微米级生物磁珠的制备方法 | |
| Davies et al. | Improved manufacture and application of an agarose magnetizable solid-phase support | |
| CN114395553A (zh) | 磁珠法质粒提取试剂盒、制备方法及质粒提取方法 | |
| CN116555248B (zh) | 一种细菌中高分子量dna提取试剂盒及提取方法 | |
| CN117373771A (zh) | 一种离子型磁珠及其制备方法 | |
| CN116272903A (zh) | 用于提取纯化dna的离子型磁珠及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |