CN101818143A - 基于二氧化硅磁性复合微粒的超低量dna提取试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

一种超低量DNA提取试剂盒，它含有二氧化硅磁性复合微粒；还含有pH＝4.5-7.0吸附液，其组分为1-8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，5-50mmol/l的EDTA，0.5-5％w/v的Triton；洗涤液，其组分为0-2mol/l的乙酸钠，体积百分比40-80％的乙醇；洗脱液，其组分为8-12mmol/l的Tris-HCl，pH＝8.3。本发明利用表面具有小尺寸的纳米级突起的二氧化硅磁性复合微粒，高效地实现超低量DNA的提取；方法简单，提取快速，通常操作可在1个小时内完成；能够有效去除抑制剂和污染物，适用于药检、药厂、分子生物学实验室。

Description

基于二氧化硅磁性复合微粒的超低量DNA提取试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的方法及试剂盒。

背景技术

超低量DNA一般是指液体样本中DNA的浓度少于等于1ng/ml。能否从含有超低量DNA的样本中成功提取DNA是分子生物学实验中的难题，开发超低量DNA提取方法一直是分子生物学工作者的目标之一。超低量DNA提取方法有着广泛的用途，例如从生物制药的发酵液中提取微量宿主DNA进行药品质量控制和监测、从降解或稀释的生物样本中提取痕量DNA进行司法鉴定等。

超顺磁性材料在一定条件下可以在溶液中分散，而在外磁场作用下可以富集和定向运动。与常用的分离提取方法如沉淀法、离心法、离子交换法和各种层析方法相比，基于超顺磁性材料在外磁场作用下的富集而发展起来的磁分离技术具有方便快捷、所需设备简单、提取效率高、可自动化操作等特点。二氧化硅磁性复合粒子因易于吸附DNA，并兼具良好的化学稳定性和生物相容性，在DNA提取方面得到越来越广泛的关注和应用。对于纳米尺寸的二氧化硅磁性复合粒子，其比表面积大、吸附活性强、吸附容量大。但是由于粒子尺寸小，磁场响应能力弱，一般需要采用专门的磁分离柱并施加高强度外磁场才能实现粒子的有效富集。即使一些粒子的磁性物质含量较高，不使用磁分离柱也可富集，但其富集速度也较慢。这就限制了纳米尺寸的二氧化硅磁性复合粒子的应用，尤其是在一些要求过程快速的工作中的应用，比如现在越来越重要的高通量DNA分离或筛选工作。为此，现在用于DNA提取的商业化产品多采用尺寸较大的微米尺寸的二氧化硅磁性复合粒子。这类粒子具有较强的磁场响应能力，在外加磁场下无需磁分离柱即可实现快速高效富集。但是由于粒子的尺寸大，其比表面积较小，吸附活性和吸附容量都要明显低于纳米尺寸的粒子。因此现在二氧化硅磁性复合微米粒子主要用于中小量生物样本的DNA提取(大量生物样本的DNA提取多采用离心柱膜法)，其灵敏度低不能很好地用于超低量DNA的提取。

目前，尚没有利用二氧化硅磁性复合微米粒子提取超低量DNA的技术。市面上也缺乏专业用于超低量DNA提取的试剂盒，进行超低量DNA提取主要依赖于国外一些公司，如Promega公司、Qiagen公司等公司的通用DNA提取试剂盒，这些试剂盒不仅价格昂贵，而且用于超低量DNA提取的成功率低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA，解决超低量DNA提取的难题，实现简便、快速、高效地提取。

本发明人经过广泛而深入的研究，制备了一种二氧化硅磁性复合微粒，其专利申请号为2008100509410。这种二氧化硅磁性复合微粒是由两个或两个以上铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，微粒表面由纳米交联单元的表面组合而成，因而微粒表面具有小尺寸的纳米级突起。这样，微粒除了具有与其他微米级磁性粒子相同的强磁场响应能力外，还兼具二氧化硅磁性复合纳米粒子比表面积大的优点，与其他二氧化硅磁性复合微米粒子相比，具有更强的吸附活性。本发明人发现该二氧化硅磁性复合微粒与DNA分子具有高度的亲和力，可以作为提取超低量DNA的有效介质。并在此基础上开发了基于二氧化硅磁性复合微粒的超低量DNA提取方法及试剂盒。

本发明的一个目的是提供一种利用二氧化硅磁性复合微粒简便有效地提取超低量DNA的试剂盒。

本发明的另一目的是公开一种利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种超低量DNA提取试剂盒，它含有二氧化硅磁性复合微粒；还含有pH＝4.5-7.0吸附液，其组分为1-8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，5-50mmol/l的EDTA，0.5-5％w/v的Triton；洗涤液，其组分为0-2mol/l的乙酸钠，体积百分比40-80％的乙醇；洗脱液，其组分为8-12mmol/l的Tris-HCl，pH＝8.3。

在本发明的第二方面，提供了一种利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的方法，包括下列步骤：

(a)将吸附液与含超低量DNA的样本混合，得到含DNA的吸附液；

(b)将二氧化硅磁性复合微粒与含DNA的吸附液混合，形成固液均相分散悬浊液；

(c)用磁分离法将吸附了DNA的二氧化硅磁性复合微粒从固液均相分散悬浊液中分离，得到吸附有DNA的二氧化硅磁性复合微粒；

(d)用洗涤液多次洗涤吸附有DNA的二氧化硅磁性复合微粒，将微粒上的杂质洗去；

(e)用洗脱液将DNA从二氧化硅磁性复合微粒上解吸附，获得浓缩的纯DNA溶液。

本发明方法可简便高效地从含超低量DNA的样品中提取DNA。

在步骤(d)中，用洗涤液洗涤吸附有DNA的二氧化硅磁性复合微粒，洗涤次数为1-5次，较佳为2-3次。

所述的含超低量DNA的样本为生物制药的原液或腐败降解的生物样本或稀释后的生物样本。

用于本发明的吸附液、洗涤液、洗脱液没有特别限制，可以为本领域采用的各种吸附液、洗涤液、洗脱液。此外，试剂盒中的吸附液、洗涤液、洗脱液可以是浓缩液或稀释液。

本发明主要优点在于：

1、利用表面具有小尺寸的纳米级突起的二氧化硅磁性复合微粒，高效地实现超低量DNA的提取；

2、方法简单，提取快速，通常操作可在1个小时内完成；

3、能够有效去除抑制剂和污染物，适用于药检、药厂、分子生物学实验室。

附图说明

图1为对提取的DNA进行荧光定量的测试结果图。

图2为对提取的DNA的复合STR扩增谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

第一步：1μm Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒的制备

利用文献公开报道的方法合成50nm Co₃O₄-二氧化硅核壳纳米粒子。取300ml水和700ml甲醇混合后，加入15.0g硝酸镁和2.0g聚乙二胺，搅拌溶解后，加入12g 50nm Co₃O₄-二氧化硅核壳纳米粒子，在搅拌速度为80rpm的条件下反应30分钟。然后在溶液中加入40ml质量百分比浓度为25-28％的浓氨水，并在搅拌速度为300rpm下，滴加正硅酸乙酯0.35ml，反应8小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒，其平均尺寸为1μm。

第二步：超低量DNA提取试剂盒的制备

制备利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的提取试剂盒，其中包括：

0.5ml二氧化硅磁性复合微粒溶液，其组分为30mg/ml实施例1制备的Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒；

100ml pH＝6.7吸附液，其组分为8mol/L NaCl、0.5mol/L的Tris-HCl、25mmol/l的EDTA、2.0％(w/v)的Triton；

100ml洗涤液，其组分为1.5mol/l乙酸钠、70％体积百分比的乙醇；

10ml洗脱液，其组分为10mmol/L的Tris-HCl，pH＝8.3；

实施例2

制备利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的提取试剂盒，其中包括：

0.5ml二氧化硅磁性复合微粒溶液，其组分为25mg/ml实施例1制备的Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒；

100ml pH＝4.5吸附液，其组分为6mol/L NaClO₄溶液、0.5mol/L的Tris-HCl、35mmol/l的EDTA、4.0％(w/v)的Triton；

100ml洗涤液，其组分为1mol/l乙酸钠、75％体积百分比的乙醇；

10ml洗脱液，其组分为10mmol/l Tris-HCl，pH＝8.3

实施例3

制备利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的提取试剂盒，其中包括：

0.5ml二氧化硅磁性复合微粒溶液，其组分为25mg/ml实施例1制备的Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒；

100ml pH＝7.0吸附液，其组分为1mol/L GuSCN溶液、0.5mol/L的Tris-HCl、5mmol/l的EDTA、0.5％(w/v)的Triton；

100ml洗涤液，其组分为80％体积百分比的乙醇；

10ml洗脱液，其组分为8mmol/l Tris-HCl，pH＝8.3

实施例4

制备利用二氧化硅磁性复合微粒提取超低量DNA的提取试剂盒，其中包括：

0.5ml二氧化硅磁性复合微粒溶液，其组分为25mg/ml实施例1制备的Co₃O₄-二氧化硅磁性复合微粒；

100ml pH＝6.7吸附液，其组分为8mol/L GuHCl溶液、0.5mol/L的Tris-HCl、50mmol/l的EDTA、5％(w/v)的Triton；

100ml洗涤液，其组分为2mol/l的乙酸钠、40％体积百分比的乙醇；

10ml洗脱液，其组分为12mmol/l Tris-HCl，pH＝8.3

实施例5

用超低量DNA提取试剂盒提取超低量DNA溶液中的DNA

1、在DNA溶液中加入DNA溶液的3倍体积吸附液，混匀；

2、加入20ul二氧化硅磁性复合微粒溶液，室温吸附20min；

3、旋涡振荡混匀放于磁架上，静止60s，吸弃液体；

4、加入适量洗涤液，旋涡振荡洗涤后，吸弃液体，重复本操作2次；

5、室温干燥10min后，加入洗脱液，65℃温浴15min；

6、将离心管放于磁架上，静止30s至二氧化硅磁性复合微粒吸附到管壁，吸出洗脱液至另一离心管中待用。

实施例6

用超低量DNA提取试剂盒提取降解生物样本中的DNA

1、取降解生物样本，加入1ml的吸附液或直至浸没样本，加入10ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K，56℃温浴2h；

2、10000rpm离心3min，吸取上清溶液至一新离心管；

3、其余步骤同实施例5步骤2～6。

试验例1 提取DNA的质量鉴定

对实施例5中提取的DNA采用AB公司的7500荧光实时定量PCR仪进行荧光定量测试。所用超低量DNA溶液中为分别含有0.1ng/ml、0.5ng/ml和1.0ng/ml标准DNA(9947A)的水溶液，对每种浓度的超低量DNA溶液均做3次平行实验。对提取的DNA进行荧光定量的测试结果表明，对所有超低量DNA溶液中的DNA均获得了高效的回收结果，回收效率均超过90％。(参见图1)

试验例2 提取DNA的质量鉴定

对实施例6中提取的DNA进行复合STR扩增。采用Powerplex 16试剂盒对提取的DNA进行复合STR扩增，应用AB公司的3130测序仪进行检测。结果表明所有16个STR位点都得到成功分型，扩增的均衡性好，表明本发明试剂盒能够用于降解生物样本中DNA的提取。(参见图2)

Claims (2)

1.一种基于二氧化硅磁性复合微粒的超低量DNA提取试剂盒，它含有二氧化硅磁性复合微粒；还含有pH＝4.5-7.0的吸附液，其组分为1-8mol/l的盐溶液，0.5mol/l的Tris-HCl，5-50mmol/l的EDTA，0.5-5％w/v的Triton；洗涤液，其组分为0-2mol/l的乙酸钠，体积百分比40-80％的乙醇；洗脱液，其组分为8-12mmol/l的Tris-HCl，pH＝8.3。

2.利用权利要求1所述的试剂盒提取超低量DNA的方法，其特征在于包括下列步骤：

(a)将吸附液与含超低量DNA的样本混合，得到含DNA的吸附液；

(b)将二氧化硅磁性复合微粒与含DNA的吸附液混合，形成固液均相分散悬浊液；

(c)用磁分离法将吸附了DNA的二氧化硅磁性复合微粒从固液均相分散悬浊液中分离，得到吸附有DNA的二氧化硅磁性复合微粒；

(d)用洗涤液多次洗涤吸附有DNA的二氧化硅磁性复合微粒，将微粒上的杂质洗去；

(e)用洗脱液将DNA从二氧化硅磁性复合微粒上解吸附，获得浓缩的纯DNA溶液。

Images