CN114988456B - 氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用。制备方法包括以下步骤：S1、硅藻土的处理：依次用水和乙醇洗涤硅藻土，干燥，得到处理后的硅藻土；S2、氧化锌复合颗粒的合成：将锌盐、十六烷基三甲基溴化铵、处理后的硅藻土和水，加热搅拌反应，然后加入氨水溶液，冷却至0℃，停止反应，收集产生的白色沉淀物，洗涤，干燥，得到氧化锌复合颗粒。本发明制得的氧化锌复合颗粒作为病毒裂解材料，在没有大型仪器以及复杂多样的化学裂解试剂条件下，对病毒样本高效裂解，释放核酸。整个样品前处理过程简易高效，裂解完成后，不存在化学有机试剂抑制下游核酸检测的同时，为下游分子检测提供高质量核酸模板。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域中的核酸反应前处理技术，具体涉及一种氧化锌复合颗粒及制备方法及其在核酸检测中的病毒裂解应用。
背景技术
在过去的二十年里，不断发展的分子技术已被广泛应用于检测临床样本中病毒核酸。这些分子方法能够以高灵敏度识别含有有限数量病毒的临床样本。聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction，PCR)，一种基于病原微生物基因组核酸的分子检测技术，具有准确性高，耗时短，成本低，操作简便等特点。除了最佳引物和PCR反应条件外，下游分子检测步骤中使用高质量的核酸提取物是检测病毒含量低水平的样本最有效的方法。
高浓度的盐，如盐酸胍、异硫氰酸胍或非胍盐裂解盐，可以破坏核酸与蛋白质之间的次级键，使核蛋白解联，病毒核酸释放。另外，化学裂解试剂通常还含有去污剂SDS(十二烷基硫酸钠)，生物缓冲剂三羟甲基氨基甲烷Tris以及核酸降解抑制剂EDTA(乙二胺四乙酸)。传统的商业裂解剂存在一些局限性，如裂解后难以从样品中去除胍盐等蛋白强变性剂和醇类等有机试剂，导致下游PCR检测反应被抑制。除此之外，还存在提取过程耗时长，步骤繁琐，依赖大型仪器(如加热)以及核酸损失等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提出一种氧化锌复合颗粒及其制备方法和裂解病毒的应用，在没有大型仪器以及复杂多样的化学裂解试剂条件下，该材料对病毒样本高效裂解，释放核酸。整个样品前处理过程简易高效，裂解完成后，不存在化学有机试剂抑制下游核酸检测的同时，为下游分子检测提供高质量核酸模板。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种氧化锌复合颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：硅藻土的处理：依次用水和乙醇洗涤硅藻土，干燥，得到处理后的硅藻土；
步骤S2：氧化锌复合颗粒的合成：将锌盐、十六烷基三甲基溴化铵、步骤S1制得的处理后的硅藻土和水，加热搅拌反应，然后加入氨水溶液，冷却至0℃，停止反应，收集产生的白色沉淀物，洗涤，干燥，得到氧化锌复合颗粒。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤S1中所述水为蒸馏水，使用水洗涤1-2次，乙醇洗涤2-3次。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤S2中所述锌盐为Zn(NO3)2·6H2O；所述锌盐、十六烷基三甲基溴化铵的物质的量之比为(0.5-1.5)：(0.5-1.5)；所述十六烷基三甲基溴化铵与处理后的硅藻土的质量比为(300-400)：1；所述加热搅拌反应的温度为85-95℃，时间为30-60min；所述水为蒸馏水；所述洗涤为用蒸馏水洗涤2-3次。
具体地，包括以下步骤：
S1、硅藻土的处理：蒸馏水洗涤硅藻土一次，再用乙醇重复洗涤三次，以去除不均匀的硅藻土颗粒和自由的乙醇分子，然后，收集硅藻土沉淀物烘烤过夜。
S2、氧化锌复合颗粒的合成：使用水热法在碱性介质中合成了氧化锌纳米颗粒。为此，在烧瓶中加入0.1mol的Zn(NO3)2·6H2O，0.1mol的十六烷基三甲基溴化铵，0.1g的干净均一硅藻土和100mL的蒸馏水。搅拌混合物，90℃加热50min，并在这些条件下保持，同时加入2mL NH3·H2O溶液。随后，将烧瓶转移到冰盒中，停止反应。收集产生的白色沉淀物氧化锌复合颗粒，并用蒸馏水清洗三次，以去除残留的离子和单个ZnO颗粒。然后，收集白色沉淀物烘烤过夜。
本发明进一步提供一种上述的制备方法制得的氧化锌复合颗粒，所述氧化锌复合颗粒为氧化锌纳米颗粒附着在硅藻土表面，所述氧化锌纳米颗粒的尺寸主要集中在70-180纳米范围。
本发明进一步提供一种上述的氧化锌纳米颗粒在裂解病毒中的应用。
本发明进一步提供一种裂解病毒的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：取待裂解样品与上述氧化锌复合颗粒以及蛋白酶K混合液混合均匀，混合反应；
步骤(2)：向步骤(1)体系中加入磁珠，混匀；
步骤(3)：利用磁力吸附步骤(2)体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤(4)：加入蛋白漂洗液，使磁珠重新悬浮，再次利用磁力吸附体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤：(5)：加入洗涤液，使磁珠重新悬浮，再次利用磁力吸附体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤：(6)：重复步骤(5)，然后使磁珠继续被吸附，干燥；
步骤：(7)：加入洗脱液，使磁珠重新悬浮，温浴反应使核酸洗脱；
步骤：(8)：利用磁力吸附步骤(7)体系中的磁珠，收集体系中的液体。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤(1)中所述混合反应温度为室温，时间为5-15min；所述氧化锌复合颗粒与待裂解样品的固液比为3-5g/mL；步骤(2)中所述混匀的温度为室温，时间为1-5min。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(8)中利用磁力吸附的方法为置于磁力架上0.5-2min。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤(6)中所述干燥为室温晾干1-5min；步骤(7)中所述温浴反应条件为50-90℃温浴2-5min。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤(8)中所述体系中的液体收集至无核酸酶离心管。
本发明具有如下有益效果：通过本发明的氧化锌复合颗粒的制备方法制得的氧化锌复合颗粒作为病毒裂解材料具有特殊的性质，其可通过物理、化学和生物途径破坏病毒的完整结构，具体包括：ZnO复合颗粒与病毒发生物理碰撞，破坏病毒完整结构释放核酸；溶液中的ZnO颗粒水解释放出Zn2+，使病毒生物膜(即病毒的蛋白外壳)内部和外部的离子化学浓度不同，产生渗透压，破坏完整的膜结构，实现裂解；此外，ZnO纳米颗粒受紫外线照射诱导产生具有极强的化学活性的氢氧自由基和活性氧(ROS：O2 -，-OH，H2O2)，以一种生物方式裂解破坏病毒蛋白外壳。根据本发明实施例的氧化锌复合颗粒应用在核酸检测中的病毒裂解步骤时，在没有大型仪器以及复杂多样的化学裂解试剂条件下，氧化锌复合颗粒可以对病毒样本进行高效裂解，释放核酸，使得整个核酸检测的样品前处理过程简易高效。裂解完成后，不存在化学有机试剂抑制下游核酸检测的同时，为下游分子检测提供高质量的核酸模板。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中硅藻土的SEM图；
图2为实施例1中附着在硅藻土上的氧化锌纳米颗粒的SEM图；
图3为实施例1氧化锌复合颗粒裂解产物扩增结果；
图4为实施例1对照组扩增结果；
图5为实施例2氧化锌复合颗粒裂解产物扩增结果；
图6为实施例2对照组扩增结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所应用的蛋白漂洗液为高盐溶液；洗涤液为低盐溶液；洗脱液为低盐溶液；磁珠为表面包被硅基的磁性颗粒，均购于杭州博日生物科技有限公司。
本发明实施例所应用的所有试剂盒为“MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒III”(BSC86S1B)。
实施例1含有HBV血清样本的测试
一种氧化锌复合颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、硅藻土的处理：
将硅藻土与蒸馏水搅拌，离心，收集沉淀物。这个洗涤步骤重复三次，以去除不均匀的硅藻土颗粒和杂质。图1为硅藻土的SEM(扫描电子显微镜)图。
S2、氧化锌复合颗粒的合成：
使用水热法在碱性介质中合成了氧化锌复合颗粒。将0.1mol的Zn(NO3)2·6H2O和0.1mol的十六烷基三甲基溴化铵混合在100mL的蒸馏水中，其中含有硅藻土，放在烧瓶中。混合物在连续搅拌下，在90℃条件下保持50分钟，然后加入2mL NH3·H2O溶液。随后，将烧瓶转移到冰盒中，停止反应。收集沉淀物(ZnO-DE，即氧化锌-硅藻土复合颗粒)，并用蒸馏水清洗，以去除残留的离子和单个ZnO颗粒。然后，烘烤过夜。图2为附着在硅藻土上的纳米氧化锌颗粒的SEM图，由此可知，该硅藻土上面明显附着有氧化锌纳米颗粒,且氧化锌纳米颗粒的粒径主要集中在70-180nm范围，平均粒径为120nm。
利用上述氧化锌-硅藻土复合颗粒裂解病毒的方法，按以下步骤进行：
S1、取300μL充分混匀的HBV血清样本加入到含有氧化锌复合颗粒的1.5ml离心管，待测样本和氧化锌复合颗粒以及蛋白酶K混合液(30ul)充分混匀，室温混合10min。
S2、使用MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒III进行磁珠法提取核酸，在离心管中加入25μL的磁珠(使用之前磁珠应充分混匀)，室温下颠倒混匀3min。
S3、将离心管置于磁力架上1min，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S4、加入500μL去蛋白漂洗液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S5、加入500μL洗涤液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S6、再加入500μL洗涤液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附，室温晾干2min。
S7、从磁力架上取下离心管，加入70μL洗脱液，使磁珠重新悬浮，70℃温浴3min，其间轻轻晃动两次使核酸充分洗脱。
S8、将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶离心管。
对比例1含有HBV的血清样本采用商业化的磁珠法核酸提取试剂盒中的裂解液进行裂解提取。
HBV核酸检测用的PCR反应液现配现用：将5μL纯化好的核酸溶液加到20μL PCR反应液中，进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应液配方：12.5μL Taq DNA聚合酶混合液Taq DNA faster mix 12.5，2μL引物和5.5μL去离子水。
PCR扩增程序：热变性反应：95℃，5min；扩增反应：95℃，10秒；60℃，45秒；45个循环；在60℃进行荧光采集。
实施例1和对比例1的扩增曲线如图3和4所示：采用本发明实施例的氧化锌复合颗粒裂解方法获得的PCR反应Ct(Cycle threshold循环阈值)值为32.06，采用商业化的磁珠法核酸提取试剂盒及新鲜配制的PCR反应液的PCR反应Ct值为32.15。二者结果对比，最终效果基本相同。但在提取过程中，磁珠法试剂盒与本发明实施例的氧化锌复合微粒存在兼容问题，即该氧化锌复合材料的裂解液环境不利于试剂盒中磁珠的吸附，例如氧化锌复合颗粒的裂解液不具备DNA吸附所需要的盐浓度和PH值等条件。尽管本发明实施例的基于氧化锌复合颗粒的裂解液存在这种不利条件，但却能取得与商业试剂盒相同的最终效果，由此可知：本发明实施例的无化学裂解试剂，仅使用氧化锌复合颗粒和蛋白酶K的裂解方案的效率高于商业试剂盒中含化学试剂和其他复杂成分的裂解效率。本发明实施例提供的裂解方法无需特殊温度或者其他复杂化学试剂参与DNA病毒的裂解，简化实验操作并避免了化学试剂对下游PCR扩增反应的抑制作用。
实施例2含有SARS-CoV-2假病毒样本(已灭活)的测试
一种氧化锌复合颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、硅藻土的处理：将硅藻土与蒸馏水搅拌10min。在混合物重力沉降1min后，将上清液收集在试管中，离心。去除上清液，用乙醇洗涤。混合物经过沉降后，将上清液收集，离心。沉淀物用蒸馏水清洗，离心后，再次收集沉淀物。这个洗涤步骤重复三次，以去除不均匀的硅藻土颗粒和自由的乙醇分子。最后，收集硅藻土沉淀物，并烘烤过夜。
S2、氧化锌复合颗粒的合成：使用水热法在碱性介质中合成了氧化锌复合颗粒。为此，将0.1mol的Zn(NO3)2·6H2O和0.1mol的十六烷基三甲基溴化铵混合在100mL的蒸馏水中，其中含有均匀的硅藻土，放在烧瓶中。混合物在连续搅拌下，在90℃条件下保持50分钟，然后加入2mL NH3·H2O溶液。随后，将烧瓶转移到冰盒中，停止反应。收集沉淀物硅藻土-氧化锌复合颗粒，并用蒸馏水清洗三次，以去除残留的离子和单个ZnO颗粒。然后，烘烤过夜。
利用上述氧化锌-硅藻土复合颗粒裂解病毒的方法，按以下步骤进行：
S1、取300μL含有SARS-CoV-2假病毒样本(现取唾液与假病毒混合)充分混匀的加入到含有氧化锌复合颗粒以及蛋白酶K混合液的1.5ml离心管，待测样本和氧化锌复合材料充分混匀，室温混合10min。
S2、使用MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒III进行磁珠法提取核酸，在离心管中加入25μL的磁珠(使用之前磁珠应充分混匀)，室温下颠倒混匀3min。
S3、将离心管置于磁力架上1min，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S4、加入500μL去蛋白漂洗液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S5、加入500μL洗涤液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，取下离心管。
S6、再加入500μL洗涤液，使磁珠重新悬浮，将离心管置于磁力架上1min，用移液器移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附，室温晾干2min。
S7、从磁力架上取下离心管，加入70μL洗脱液，使磁珠重新悬浮，70℃温浴3min，其间轻轻晃动两次使核酸充分洗脱。
S8、将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶离心管。
对比例2含有SARS-CoV-2假病毒样本采用商业化的磁珠法核酸提取MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒III中的裂解液进行裂解提取。
新冠病毒检测用的PCR反应液现配现用，将5μL纯化好的核酸溶液加到20μL PCR反应液中，进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应液配方：PCR buffer master mix 16μL(pH8.09，内含dNTPs,Mg2+和其它扩增所需组分)；引物2μL(内含ORFlab、N和GAPDH的引物探针)，逆转录酶2μL,模板5μL。
PCR扩增程序：热变性反应：95℃，5min；扩增反应：95℃，10秒；60℃，45秒；45个循环；在60℃进行荧光采集。
实施例2和对比例2的扩增曲线如图5和图6所示：氧化锌复合颗粒裂解方法获得的RT-PCR反应Ct值为31.11，采用商业化的磁珠法核酸提取试剂盒对应的Ct值为31.33。二者结果对比，最终效果基本相同。但在提取过程中，磁珠法核酸提取试剂盒与本发明实施例的氧化锌复合微粒存在兼容问题，即该氧化锌复合材料的裂解液环境不利于试剂盒中磁珠的吸附，例如氧化锌复合颗粒的裂解液不具备DNA吸附所需要的盐浓度和PH值等条件。尽管本发明实施例的基于氧化锌复合颗粒的裂解液存在这种不利条件，但却能取得与商业试剂盒相同的最终效果，由此可知：本发明实施例的无化学裂解试剂，仅使用氧化锌复合颗粒和蛋白酶K的裂解方案的效率高于商业试剂盒中含化学试剂和其他复杂成分的裂解液。本发明实施例提供的裂解方法无需特殊温度或者其他复杂化学试剂参与RNA病毒的裂解，简化实验操作并避免了化学试剂对下游PCR扩增反应的抑制作用。
实施例3不同粒径的氧化锌颗粒对含有HBV血清样本的测试对比
在本实施例中，对含有不同粒径的氧化锌纳米颗粒的氧化锌-硅藻土复合物进行HBV病毒裂解测试对比，测试结果如表1所示。
| 序号 | 裂解材料 | FAM荧光曲线对应阈值(Ct值) |
| 1 | 氧化锌-硅藻土复合物(含70nm氧化锌颗粒) | 33.08 |
| 2 | 氧化锌-硅藻土复合物(含120nm氧化锌颗粒) | 32.46 |
| 3 | 氧化锌-硅藻土复合物(含300nm氧化锌颗粒) | 33.47 |
| 4 | 氧化锌-硅藻土复合物(含1000nm氧化锌颗粒) | 33.37 |
| 5 | 120nm纯氧化锌颗粒 | 33.34 |
表1：含有不同粒径的氧化锌纳米颗粒的氧化锌-硅藻土复合物的PCR反应Ct值
从表1可知，由第1-4组Ct值结果可知，对于HBV病毒裂解，含120nm氧化锌纳米颗粒的复合物裂解效率最高。120nm的微粒尺寸与病毒发生物理碰撞的效率更高。由第2组和第5组的Ct值结果对比可知，对于粒径一定的氧化锌颗粒，硅藻土的存在提高了裂解效率。因为硅藻土可起到聚集有效裂解材料氧化锌的作用，从而提升对生物膜的破坏强度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种氧化锌复合颗粒在核酸检测中的病毒裂解应用，其特征在于，所述氧化锌复合颗粒的制备包括以下步骤：
步骤S1：硅藻土的处理：依次用水和乙醇洗涤硅藻土，干燥，得到处理后的硅藻土；
步骤S2：氧化锌复合颗粒的合成：将锌盐、十六烷基三甲基溴化铵、步骤S1制得的处理后的硅藻土和水，加热搅拌反应，然后加入氨水溶液，冷却至0℃，停止反应，收集产生的白色沉淀物，洗涤，干燥，得到氧化锌复合颗粒；其中，
所述锌盐、十六烷基三甲基溴化铵的物质的量之比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）；
所述十六烷基三甲基溴化铵与处理后的硅藻土的质量比为（300-400）：1；
所述加热搅拌反应的温度为85-95℃，时间为30-60分钟。
2.根据权利要求1所述的病毒裂解应用，其特征在于， 步骤S2中所述锌盐为Zn(NO3)2·6H2O。
3.根据权利要求1所述的病毒裂解应用，其特征在于，所述氧化锌复合颗粒为氧化锌纳米颗粒附着在硅藻土表面，所述氧化锌纳米颗粒的尺寸为70-180纳米。
4.一种用于核酸检测的裂解病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：取待裂解样品与根据权利要求1所述的氧化锌复合颗粒以及蛋白酶K混合液混合均匀，混合反应，所述混合反应温度为室温，时间为5-15min；所述氧化锌复合颗粒与待裂解样品的固液比为3-5g/mL；
步骤（2）：向步骤（1）中体系中加入磁珠，混匀；
步骤（3）：利用磁力吸附步骤（2）体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤（4）：加入蛋白漂洗液，使磁珠重新悬浮，再次利用磁力吸附体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤（5）：加入洗涤液，使磁珠重新悬浮，再次利用磁力吸附体系中的磁珠，并移去体系中的液体；
步骤（6）：重复步骤（5），然后使磁珠继续被吸附，干燥；
步骤（7）：加入洗脱液，使磁珠重新悬浮，温浴反应使核酸洗脱，所述温浴反应条件为50-90℃温浴2-5min；
步骤（8）：利用磁力吸附步骤（7）体系中的磁珠，收集体系中的液体。
5.根据权利要求4所述的裂解病毒的方法，其特征在于，步骤（2）中所述混匀的温度为室温，时间为1-5min。
6.根据权利要求4所述的裂解病毒的方法，其特征在于，步骤（3）、步骤（4）、步骤（5）、步骤（8）中利用磁力吸附的方法为置于磁力架上0.5-2min。
7.根据权利要求4所述的裂解病毒的方法，其特征在于，步骤（6）中所述干燥为室温晾干1-5min。
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