JP2005505305A - 固体支持体を使用してｒｎａを精製するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、以下の工程を含む、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡをＲＮＡを含む生物材料から精製するための方法を提供する：（ａ）生物材料を約７より大きいｐＨで緩衝化されたＲＮＡ結合溶液と混合し、ＲＮＡ結合溶液はＲＮＡ複合塩を含み、ＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ結合溶液中で生物材料の混合物を形成するための強カオトロピック物質を含まない工程；（ｂ）混合物を非シリカ固体支持体と接触させ、混合物中の実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸が、優先的に固体支持体と結合する工程；（ｃ）固体支持体をＲＮＡ洗浄溶液で洗浄し、結合した実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸以外の生物材料を除去する工程；および（ｄ）実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを得るために、ＲＮＡ溶出溶液を用いて固体支持体から結合した実質的に分解されていないＲＮＡを優先的に溶出する工程。
Description
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））は、研究および臨床的分析の分子生物学分野において広く使用されている。ＲＮＡは、天然に、各々それらの特定の機能に関連した、異なる特性を有する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを含む様々な形で見出され得る。ＲＮＡ発現レベルおよびパターンの分析は、例えば、発生遺伝学、薬物発見および臨床的診断といった分野において重要な情報を提供する。例えば、ＲＮＡ分析は、正常な遺伝子機能および異常な遺伝子機能の両方に関して重要な診断情報を提供する。さらに、一般的な白血病に関係する全体的なＤＮＡ再配列は、異常ハイブリッドＲＮＡの単離および同定により検出される。
【０００２】
ＲＮＡを分析する一般的な方法は、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護分析（ＲＰＡｓ）、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、クローニング、インビトロ翻訳およびマイクロアレイ分析のためのｃＤＮＡ調製が挙げられる。これらの分析から妥当なおよび一致した結果を得るため、ＲＮＡが、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質およびＤＮＡといった生物材料に共通する他の成分から精製されることが重要である。
【０００３】
ＲＮＡ精製法は、２つの一般的な区分（液相精製および固相精製）に分類される。液相精製において、ＲＮＡは液相内に残り、一方不純物は、例えば沈殿および／または遠心分離といったプロセスにより除去される。固相精製において、ＲＮＡは固体支持体に結合され、一方ＤＮＡ、タンパク質、およびリン脂質のような不純物は、選択的に溶出される。両方の精製方法は、多くの工程、およびしばしば危険な試薬を必要とする従来の方法、並びにより少ない工程および通常ほとんど危険ではない試薬を必要とする迅速な方法を利用する。出発生物材料が細胞を含む場合、両方の方法は、混入物（例えば、ＤＮＡ、脂質、炭水化物、タンパク質など）とＲＮＡとの混合物を生じる、細胞またはウイルス性共破壊あるいは溶解工程を必要とする。このような混合物はまた、ＲＮＡを容易に分解し、そして除去および／または不活化されるべきＲＮａｓｅを含む。
【０００４】
元々、液相ＲＮＡ単離法は、液体−液体抽出（すなわち、フェノール−クロロホルム）およびアルコール沈殿を使用する。おそらく、最も一般的に使用される液体−液体抽出法は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの「酸性グアニジウムフェノール」法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ，Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２：１５６〜９［１９８７］；米国特許第５，９４５，５１５号、同５，３４６，９９４号、および同４，８４３，１５５号）である。この方法は、以下の工程を含む：（１）グアニジウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）溶液でサンプルを抽出し、これに酸性媒体、フェノール、およびクロロホルムに連続して加える工程；（２）混合物を遠心分離し、フェノールにより変成したタンパク質が、中間層に見出され、核酸から除去され得るように、相を分離させる工程；（３）沈殿させるためにアルコールを加え、そしてそれにより、ＲＮＡを濃縮する工程；および（４）精製ＲＮＡを洗浄および再水和する工程。この方法は、ＲＮＡの精製を確実にするが、例えばクロロホルムおよびフェノールのような危険な試薬を使用する。カチオン界面活性剤による核酸の沈殿は、液相技術の別の例である（米国特許第５，９８５，５７２号、同５，７２８，８２２号、および同５，０１０，１８３号（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ））。例えば、米国特許第５，９８５，５７２号は、選択した第4級アミン界面活性剤を使用して生物学的サンプルからＲＮＡを単離する、新規な方法を開示する。危険ではない液相精製法は、低ｐＨ溶解および沈殿試薬を用いるＨｅａｔｈ（米国特許第５，９３７，１３７）により開示された。しかしながら、液相法は、単調な沈殿工程を含むという点で重大な不利点を有し、それ故に自動化は困難である。従って、高処理量ＲＮＡ精製の必要性は、固相法の開発をもたらした。液相精製と同様に、従来の固相法は高精製ＲＮＡを生成するために開発された。一般的に、これらの方法は、４つの一般的な工程を必要とする：ＲＮＡを放出するために細胞またはウイルス外被を溶解する工程；放出されたＲＮＡを固体支持体に結合する工程；不純物を洗浄する工程；次いで精製ＲＮＡを溶出する工程。最初の２つの工程（細胞またはウイルス外被を溶解する工程および放出ＲＮＡを結合する工程）は、元々危険な試薬を必要とする。
【０００５】
固相法は、例えば、そのような抽出に使用される固相の型に従って、シリカ樹脂またはイオン交換樹脂のいずれかに、大まかに分類され得る。固相核酸単離法に関して、膜フィルター、磁気ビーズ、金属酸化物、およびラテックス粒子を含む多くの固体支持体が使用されてきた。おそらく、最も広く使用される固体支持体は、シリカベース粒子（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号（Ｂｏｏｍら）；国際公開番号ＷＯ９５／０１３５９（Ｃｏｌｐａｎら）；米国特許第５，４０５，９５１号（Ｗｏｏｄａｒｄ）；国際公開番号ＷＯ９５／０２０４９（Ｊｏｎｅｓ）；同ＷＯ９２／０７８６３（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を参照のこと）である。核酸は、カオトロピック剤存在下でシリカに結合する。例えば、米国特許第５，２３４，８０９（Ｂｏｏｍら）に開示された方法は、ＤＮＡをシリカ粒子に結合するために、例えば、グアニジンチオシアネートのような高濃度カオトロピック溶液を使用し、そして全血からＤＮＡを精製するために、６つの遠心分離工程および５つの試薬を必要とする。
【０００６】
特に、Ｂｏｏｍは、以下を教示する；（１）生物材料をグアニジンチオシアネート、ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる溶液、シリカとを混合する工程；（２）核酸をシリカに結合させる工程；（３）グアニジンチオシアナート、エタノール、アセトンの連続した洗浄によりシリカを洗浄する工程；ならびに（４）溶出剤で核酸を溶出する工程。この方法の不利点は、特定の懸濁液の使用、多くの遠心分離工程の使用、および例えばグアニジンチオシアナートおよびアセトンのような危険試薬の使用である。しかしながら、この方法は、ＤＮＡ単離にうまく利用されてきたが、許容できないレベルのＤＮＡ混入により、ＲＮＡ単離には適さない。
【０００７】
先行技術もまた、核酸と低ｐＨで結合し、そしてその核酸が高いｐＨ（および／またはより高塩濃度）で溶出される、イオン交換樹脂の使用を教示する。米国特許第５，０５７，４２６号（Ｈｅｎｃｏら）を参照のこと。しかしながら、このような方法は、より小さな核酸および他の生物材料（例えば、タンパク質）から特有の電荷を有する長鎖核酸の選択的分離に、主に有利となる。このような方法では、長さおよび電荷に関わらず、生物材料の残部からのＲＮＡの単離に成功しない。
【０００８】
さらに、長鎖核酸は、使用するイオン交換法のための高塩濃度において、溶出されねばならない。一般的に使用される塩（例えば、ＮａＣｌおよびＫＣｌ）は、分子生物学において使用される多くの酵素を妨げ得る。従って、多くの適用にとって、核酸のイオン交換単離は、最終的な脱塩工程を必要とする。
【０００９】
ポリカチオン固体支持体はまた、混入物を含む溶液からの核酸の精製にも使用される。米国特許第５，５９９，６６７号（Ａｒｎｏｌｄら）参照のこと。ポリカチオン支持体は、大きさに基づいて選択的にヌクレオチド多量体を吸着し、より大きな多量体は、より小さな多量体よりポリカチオン支持体に対して高い親和力を有する。この方法は、正に帯電したカチオン固体支持体と負に帯電したヌクレオチドのリン酸骨格との間の親和力に、主に基づく。より大きなヌクレオチド多量体は、より高い電荷を有し、そして結果として、より小さなヌクレオチド多量体以上に優先的に結合する。従って、Ａｒｎｏｌｄの方法は、粗製生物材料からの全型のＲＮＡの単離よりむしろ、大きさに基づいたヌクレオチド多量体の単離に適している。さらに、Ａｒｎｏｌｄの方法は、その方法自体を例えばアンモニウムイオン、イミニウム（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）イオンおよびグアニジニウムイオンを含むポリカチオン支持体の使用に制限する。
【００１０】
最近の精製方法は、規定の緩衝液条件下のグアニジニウム塩の存在中においてＲＮＡが優先的に沈殿するという原則を利用する。米国特許第５，９７２，６１３（Ｓｏｍａｃｋら）参照のこと。この方法において、ＲＮＡは、低温で、グアニジニウム塩の存在下、沈殿されるが、一方ＤＮＡは溶液中に残る。さらに別の方法は、リチウム塩の存在も加えて、この原則を利用する。米国特許第５，９９０，３０２（Ｋｕｒｏｉｔａら）参照のこと。この方法では、生物材料は、リチウム塩およびカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ））を含む酸性溶液中で溶解され、その後、ＲＮＡは、核酸結合キャリア（例えば、シリカ）と接触される。ＲＮＡはその後、低イオン強度緩衝液中でシリカから溶出することにより精製される。しかしながら、この方法は、例えばカオトロピック塩であるグアニジンチオシアナートといった危険物質の使用において不利である。
【００１１】
シリカベースキャリアと併せた、カオトロピック物質の組み合わせ（例えば、４Ｍより大きいイオン強度で、グアニジンチオシアナート、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、および塩化リチウム／尿素の混合物）が、Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄにより教示された。ＷＯ９５／３４５６９を参照のこと。しかしながら、本発明は、前述のカオトロピック物質が添加されたシリカビーズのスラリーを含む一工程の方法に制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ＲＮＡ精製の分野を発展させるために、固相ＲＮＡ精製ストラテジーの必要性がある。また、単純かつ迅速なだけではなく、自動化を適応性最大限にする範囲において固相精製ストラテジーに適した、試薬および方法の必要性もある。室温（すなわち、２０〜２５℃）で安定であり、危険ではなく（すなわち、腐食性または有毒ではない）、混合の必要性を除く非粒子状である、およびＲＮＡの性質を保護する試薬の必要性がある。また、様々な生物出発材料を利用し、水和または乾燥に関わらず、臨床的実験室および研究室において見出されるように、特に慣用的単調試験に適用される場合に行われ得る、わずかな工程を有する方法の必要性がある。加えて、ＲＮＡ精製試薬は、粒子を混入または後続の分析（例えば、逆転写酵素反応、増幅反応、ヌクレアーゼ保護分析、ノーザンブロッティング、並びにマイクロアレイおよび他の標識反応）の緩衝化能力またはイオン状態を妨げることにより、その後のＲＮＡ分析手順を阻害するべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、液体の生物学的サンプルおよび乾燥した生物サンプルから、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを単離するための固体支持体を組み込む、試薬、方法、およびキットを提供する。精製ＲＮＡは、幅広く使用される分析法および診断法（例えば、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを必要とする、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ分析）における使用に適する。
【００１４】
本発明は、様々な生物物質から、危険物質（例えば、フェノール、およびクロロホルム）、または危険なカオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を使用せずに、ＲＮＡを精製するために使用され得る、独自の試薬の組み合わせを含む。さらに、本発明において教示される試薬および方法は、低塩試薬におけるＲＮＡの溶出を可能にし、従って、先行技術に見出される単調な脱塩工程を除去する。本発明により教示される試薬は、中性から高ｐＨの独自のＲＮＡ結合溶液、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液を含む。生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ溶解溶液にもなる界面活性剤を含む。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製するために、適した固体支持体との組み合わせにおいて使用された試薬は、実質的に純粋かつ混入を含まない。
【００１５】
本発明は、中性から高ｐＨの独自のＲＮＡ結合溶液の使用を教示する。このＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ複合塩、好ましくは緩衝液中にアルカリ金属塩が存在するので、核酸が優先的に最適な固体支持体と結合することを可能にする。一つの実施形態において、ＲＮＡ結合溶液は、例えば、界面活性剤のようなＲＮＡ結合溶液に細胞溶解能力を与える両親媒性試薬をさらに含む。このＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ溶解溶液としても言及され得る。ＲＮＡ溶解溶液は、核酸が他の混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）以上に最適な固体支持体に優先的に結合するように、溶解に続いて放出される核酸に独自の結合性質を与えながら、生物材料を溶解する。本発明のＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡ複合塩（例えば、緩衝液中のアルカリ金属塩）、および随意的な両親媒性試薬の存在により、危険なカオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を使用せずに、この優先的な結合を達成する。ＲＮＡ複合塩は、核酸（例えば、ＲＮＡ）の荷電したリン酸骨格と複合体化しているので、そのように呼ばれる。ＲＮＡ溶解溶液における、両親媒性試薬は、好ましくは生物材料の溶解を補助する界面活性剤である。すべての型の界面活性剤が、本発明を実行するために使用され得るが、非イオン性界面活性剤は、高濃度塩溶液により可溶性であるため、好ましい。
【００１６】
ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、緩衝化され、少なくとも約７（好ましくは、すくなくとも約８、より好ましくは、少なくとも約８．５、そして最も好ましくは、少なくとも約９）のｐＨを維持する。基本ｐＨまでの中和は、核酸、特にＲＮＡが固体支持体に結合する能力を高める。低ｐＨ試薬存在下の核酸の結合が著しく阻害されることも観察される。ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、所望のようにｐＨを調整する緩衝液を含む。緩衝液は、好ましくは、少なくとも約８のｐＫａを有する。好ましい緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）である。
【００１７】
適したＲＮＡ複合塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジウム塩）を含む。好ましいアルカリ金属塩は、リチウム塩である。本発明の実行に使用されるリチウム塩としては、塩化リチウム、および臭化リチウムが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡの固体支持体に対する優先的な結合は、高濃度のアルカリ金属塩により高められる。好ましくは、アルカリ金属塩は、４〜１０Ｍの間の濃度である。ＲＮＡ溶解溶液はさらに、両親媒性試薬を含む。一つの実施形態において、両親媒性試薬は、界面活性剤である。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、双性イオン性または非イオン性であり得るが、好ましくは非イオン性である。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ由来の界面活性剤およびＮｏｎｉｍｄｅｔ分類の界面活性剤が挙げられる。好ましくは、界面活性剤は約１０％の高濃度で存在する。アルカリ金属塩と界面活性剤の組み合わせはまた、各々中性から高ｐＨの緩衝液中において前述の高濃度で、一般に生物材料と結びつく酵素（例えばＲＮａｓｅ）の有害な影響を無効にするために役立つ。随意的に、ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液はまた、キレート剤を含み得る。
【００１８】
本発明はまた、不純物（例えば、タンパク質およびリン脂質）を固体支持体から除去すると同時に、一方で核酸が固体支持体に結合し続けることを可能にするＲＮＡ洗浄溶液の使用を組みこむ。ＲＮＡ洗浄溶液は、高濃度のアルコール、および６〜８Ｍの間の中性ｐＨで緩衝化された、適した塩を含み、混入物（例えば、タンパク質、脂質など）を除去する。
【００１９】
適した固体支持体と関連した、ＲＮＡ結合溶液（またはＲＮＡ溶解溶液）、およびＲＮＡ洗浄溶液の単純性および効率は、単純なＲＮＡ溶出溶液（例えば、ＲＮａｓｅフリー水、または代わりに固体支持体からＲＮＡを溶出する非イオン性界面活性剤を有するＲＮａｓｅフリー水）の使用という結果となる。従って、先行技術の高塩洗浄溶液において一般に直面するＲＮＡ脱塩問題は、回避される。
【００２０】
本発明はまた、生物学材料からのＲＮＡの単離の方法を教示する。生物材料としては、例えば、細胞またはウイルスの懸濁液、体液および老廃物、全血、骨髄、バフィーコート、血漿、培養細胞、全ての懸濁液（例えば、細菌、ホモジネートした組織）、粗製または部分精製した核酸の混合物、および環境サンプルが挙げられる。環境サンプルとしては、例えば、空気、水または土壌が挙げられる。
【００２１】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の万能性および有効性は、ＲＮＡ単離の２つの実行可能な代替法に役立つ。第１の方法において、生物材料を、固体支持体と接触させる前に、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液と接触させる。一つの実施形態において、生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液が優先的に使用される。この方法は、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを含む核酸を放出するために役立つ。第２の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に直接添加され、そして固体支持体に結合することを可能にし、それにより工程を削除し、そしてこの方法をさらに単純化する。この後者の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に直接適用され、そして次に生物材料と処理した固体支持体とを接触させる前に固体支持体上で乾燥させる。
【００２２】
適した固体支持体は、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。固体支持体は、容器に入れられ得、または固定され得、栓流（ｐｌｕｇ−ｆｌｏｗ）ＲＮＡ単離法または連続ＲＮＡ単離法を可能にする。代わりに、固体支持体の材料は、適した容器に固定され得るまたは入れられ得る遊離状態（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）の固体支持体（例えば、膜、ディスクまたはシリンダー）を作製するために、パックされ得る。一つの実施形態において、固体支持体は、繊維性または粒子であり、生物材料との最適な接触を可能にし得る。
【００２３】
本発明はまた、生物サンプルから実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを調製する指示手段および以下の１つまたは全てを含むＲＮＡ精製キットを提供する：ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液で処理していないかまたは処理した、いずれかの固体支持体、ＲＮＡ洗浄溶液、ＲＮＡ溶出溶液または、これらの任意の組み合わせ。加えて、キットは、固体支持体を収容するための容器、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを収容するための容器、およびそれらの組み合わせを含み得る。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、当業者に公知の後の分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロ翻訳、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析など）における使用に適したＲＮＡである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、生物サンプルからのＲＮＡ精製の試薬、方法、およびキットを提供する。そのような前記の生物サンプルとしては、代表的に水性混合物の状態にあるかまたは乾燥した状態にある生物材料が挙げられ、この生物材料は、原核細胞または真核細胞の複雑な生物混合物を含む、ＲＮＡを含有する。好ましくは、本発明の方法およびキットは、幅広い範囲のＲＮＡを単離する。候補ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡ、またはそれらの組み合せが挙げられるが、これらに限定されない。これら全ては、広い分子量範囲にわたって回収され得る。代表的に、生物材料はまた、ＤＮＡ、炭水化物、タンパク質。および脂質を含む。生物材料は、以下を含むが、これらに制限されない：体液（例えば、全血）、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液および脳脊髄液、口内塗抹標本、培養細胞、細菌の細胞懸濁液または組織ホモジネート、固形動物組織（例えば、心臓、肝臓および脳）、体内老廃物（例えば、糞および尿）、空気、水、堆積物または土から得られる環境サンプル、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原生動物、リケッチアおよび他の小さな微生物細胞。これらの生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分精製サンプルもまた、使用され得る。一つの実施形態において、生物材料は、核酸の粗製混合物または部分精製混合物を含む。
【００２５】
本発明の試薬、方法およびキットは、ゲノムＤＮＡまたは他の不純物が比較的ほとんど混入していない実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを提供し、その結果このようなＲＮＡは、後続のプロセス（例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ分析）において使用され得る。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、ゲノムＤＮＡ、炭水化物、タンパク質、脂質不純物が実質的にないことを意味し、その結果、このようなＲＮＡは、当業者に公知の後の分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析）において使用され得る。本明細書で使用される場合、「実質的に分解されていない」とは、非消化ＲＮＡまたはインタクトなＲＮＡを意味し、これらのＲＮＡは、標準技術を用いて、当業者によって、容易に測定され得る。つまり、ＲＮＡは、本発明の精製法の間、酵素的手段、物理的手段でまたは化学的手段で損傷を受けない。
【００２６】
本発明の試薬、方法およびキットは、幅広い範囲の生物源および生活型を超えて、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡの精製に使用され得る。これら全てのＲＮＡは、広い分子量範囲にわたって回収され得る。本発明を行って得られた実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、純度、収量、大きさ、逆転写酵素または他のハイブリダイゼーションプロセス、増幅、ハイブリダイゼーション能などについて評価され得る。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、生物材料中に見出される総ＲＮＡの見本であり、そして代表的にｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡ組み合わせであるが、これらに制限されない。
【００２７】
生物サンプルとしては、例えば、細胞懸濁液またはウイルス懸濁液およびそれらのペレット、体液、および組織ホモジネートなどが挙げられる。生物サンプルが細胞またはウイルスからなる場合、細胞またはウイルスは、この工程の前に数えられ得る。計数は、標準的な細胞カウント方法（例えば、電子細胞カウンター（例えば、ＣＢＣ５ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）または視覚血球計算板（例えば、血球計、Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ））を用いて行われ得る。
【００２８】
（１．試薬：）本発明は、３つのカテゴリーの試薬を含む。これらは各々、ＲＮＡ結合溶液（加えて両親媒性の試薬を含む場合、代替的にＲＮＡ溶解溶液とも言われる）、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液である。
【００２９】
（（ｉ）ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液：）ＲＮＡ結合溶液は、核酸が優先的に最適な固体支持体に結合することを可能にする。ＲＮＡ溶解溶液は、生物サンプルの有効な溶解を可能にし、核酸を放出し、そして核酸が優先的に最適な固体支持体に結合することを可能にする。ＲＮＡ結合溶液は、以下の成分を含む：緩衝液；アルカリ金属塩；および随意的にキレート剤。ＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡ結合溶液と同じ成分を含むが、加えて両親溶媒試薬（例えば、界面活性剤）を含む。ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、添加される強カオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を必要としないという点で独特である。グアニジニウム塩および尿素は、強カオトロピック塩であり、水の構造を壊し、従って、他の溶質分子への強烈な効果を生じる疎水的相互作用の強度を減少させる傾向がある。例えば、尿素は、水に溶解した場合、タンパク質の２次構造、３次構造、および４次構造を破壊し、続いてＲＮＡからタンパク質の解離を引き起こす。グアニジニウム塩および尿素は、吸熱反応を介して水に溶解する。グアニジニウム塩および尿素の両方は、ホフマイスター順列により定義されたように強カオトロピック塩であると見なされる。ここでホフマイスター順列とは、相対的なカオトロピック強度に従ってカチオンおよびアニオンを並べる、広く使用されている系である（Ｆ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４（１８８８）２４７〜２６０）。
【００３０】
相対的に、リチウムカチオン（Ｌｉ＋）も塩化物アニオン（Ｃｌ−）も、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ順列において強カオトロピックではない。このスキーム下で、例えば、塩化物アニオンは、一般的にコスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）と見なされ、そしてリチウムカチオンは、ナトリウムカチオンと同様の溶媒効果を示す；従って、ＬｉＣｌは、強カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）ではなく、そしてコスモトロープと見なされる。高濃度リチウム塩（例えば、ＬｉＣｌ）は、グアニジニウム塩酸塩または尿素での、ＲＮａｓｅ Ａ中の３つのトリプトファニル基全てと比べると、ＲＮａｓｅ Ａ中の３つのトリプトファニル基のうち１つだけを露出する（Ａｈｍａｄ Ｆ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８３ Ｓｅｐ ２５；２５８（１８）：１１１４３〜６，Ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｒｅａ，ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ａｎｄ Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｓａｌｔ．）。これらの結果は、ＬｉＣｌが、２次構造、３次構造、または４次構造への全体的な影響なしに、タンパク質構造内の局所的撹乱のみを誘導することを示している。従って、ＬｉＣｌは、タンパク質変性についての広範囲の有用性を有するカオトロープではない。対照的に、グアニジニウム塩は、実質的に全てのタンパク質の変性において有効的である。その上、強カカオトロピック塩とは異なり、水中でのリチウム塩（例えば、塩化リチウム）の反応は、発熱反応である。例えば上記のような相違は、強カオトロピック物質（例えば、グアニジニウム）と本発明のアルカリ金属塩との間の相違を示し、そしてＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液の他の構成成分とこれらの相互作用に影響し、そして結果的に固体支持体に対するＲＮＡの結合に影響する。
【００３１】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の第１の構成成分は、前記の溶液のｐＨを少なくとも約７、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは約８．５、そして最も好ましくは約９に保つ緩衝液である。緩衝液は、好ましくは少なくとも約８のｐＨを有し、そして好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で使用される。好ましい緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液である。随意的に、塩基は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液のｐＨを調整するために使用され得る。好ましくは、この塩基は、前記の溶液のｐＨを少なくとも７まで上げ得る塩基である。塩基は、好ましくはアルカリ金属水酸化物である。そのようなアルカリ金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムが挙げられる。中性から高ｐＨのＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、核酸、特にＲＮＡの固体支持体に結合する能力を高める。
【００３２】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の第２の構成成分は、核酸（例えば、ＲＮＡ）に対する独自の結合特性を与えるＲＮＡ複合塩であり、その結果このような核酸は、他の混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）よりも固体支持体に優先的に結合し得る。好ましくは、このようなＲＮＡ複合塩は、アルカリ金属塩である。適した塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩が挙げられる。好ましくは、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化リチウムである。最も好ましくは、塩は塩化リチウムである。好ましくは、塩は４〜１０Ｍの間の高塩濃度で存在する。
【００３３】
ＲＮＡ溶解溶液は、加えて両親媒性試薬を含む。この試薬は、疎水性官能基（例えば、炭化水素鎖）に結合された親水基を有し、そして界面活性剤特性を有する化合物または分子から成る。一つの実施形態において、両親媒性試薬は、界面活性剤である。アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤が全て使用され得るが、ＲＮＡ単離は、非イオン性界面活性剤の使用により最適に達成される。非イオン性界面活性剤は、極性基を欠き、そして全ての界面活性剤のうち最も穏やかである。いくつかの非イオン性界面活性剤が使用され得るが、非イオン性界面活性剤は、好ましくはＴｗｅｅｎ分類（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−８０、など）、Ｔｒｉｔｏｎ分類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎ、など）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌｓ（ＸＤ、ＴＭＮ−６、など）およびＮｏｎｉｏｄｅｔｓ（ＮＰ−１０、ＮＰ−４０、など）由来のものである。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、２〜２０％の濃度で、より好ましくは約１０％で使用される。非イオン性界面活性剤の組み合わせもまた、使用され得る。例えば、ＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎは、様々な割合（例えば、１：１の割合）で使用され得る。
【００３４】
ＲＮＡの分解を妨げるため、ＲＮａｓｅを含まない水が、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液において使用される。随意的に、キレート剤もまたどちらかの溶液において使用され、混入ＤＮＡの分解を妨げる。キレート剤の使用は、さらなる混入問題を引き起こし得る、ＤＮＡポリメラーゼの小さい断片への分解を妨げる。好ましくは、キレート剤は１〜１００ｍＭの濃度で存在し；より好ましくは、キレート剤は１〜１０ｍＭの濃度で存在する。好ましくは、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである。
【００３５】
ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、先行技術に使用された試薬に対して重要な利点を有する。ＲＮＡ溶解溶液の場合、各々前述の高濃度で、中性から高ｐＨの緩衝液において、ＲＮＡ複合塩、および本発明により教示されるような界面活性剤の独自の組み合わせは、フェノール、クロロホルム、およびグアニジニウム塩のような試薬の使用なしに、ＲＮＡに有害な酵素（例えば、ＲＮａｓｅ）の不活化を促進する。加えて、ＲＮＡ結合溶液とＲＮＡ溶解溶液の両方は、核酸に、最適な固体支持体ときつく結合するように、高い結合特性を与える。
【００３６】
（（ｉｉ）ＲＮＡ洗浄溶液：）本発明はまた、低い塩濃度を有するＲＮＡ洗浄溶液を教示する。ＲＮＡ洗浄溶液は、非核酸混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）を除去するために、核酸が結合した固体支持体の洗浄に使用される。ＲＮＡ洗浄溶液は、好ましくは５０％を越える濃度のアルコール、緩衝液および低濃度の塩を含む。随意的に、ＲＮＡ洗浄溶液は、キレート剤を含む。本発明の目的において、低塩濃度は、後続の処理方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）の阻害を妨げるために後続の脱塩工程が不必要とされる塩濃度を意味する。好ましいＲＮＡ洗浄溶液は、Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）である。
【００３７】
（（ｉｉｉ）ＲＮＡ溶出溶液：）固体支持体に結合したＲＮＡがｎ ＲＮＡ溶出溶液を用いて優先的に溶出され得ると同時に、固体支持体に結合した混入ＤＮＡが残される。生物材料の溶解およびＲＮＡの固体支持体への結合において使用された試薬、および本発明で教示された固体支持体の洗浄において使用された試薬の単純性は、簡単なＲＮＡ溶出溶液に適する。一つの実施形態において、ＲＮａｓｅを含まない水、好ましくはＲＮａｓｅを不活化する物質（例えば、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ））で処理したＲＮａｓｅを含まない水が使用され得る。当業者に公知の他のＲＮＡ溶出溶液もまた使用され得る。好ましいＲＮＡ溶出溶液は、Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５ Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）である。
【００３８】
（２．固体支持体：）様々な固体支持体が、本発明において使用され得る。これらとしては、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびそれらの組み合わせから作製される固体支持体が挙げられる。本発明の試薬との使用に適した固体支持体の大きさは、生物材料の量に従って変化し得る。例えば、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ ９０３ペーパー（厚さ０．５ｍｍを有し、固体支持体に使用される）の場合、直径３ｍｍのディスクは、約３μｌの生物材料を保持するが、直径８ｍｍのディスクは、約２５μｌの生物材料を保持する。生物材料の量が増加するにつれて、固体支持体の厚みおよび／または直径が合わせて増加し得る。
【００３９】
好ましくは、固体支持体は、前述のＲＮＡ溶解溶液の存在下で、他の生物材料混入物よりも固体支持体に対する核酸の優先的な結合を可能にする材料である。好ましくは、そのような固体支持体は、接着ポリエステル繊維（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３）から成る。一つの実施形態において、ポリエステル繊維は、代替の容器構造中に収容される、または代替の構造中で形成されるために、断片化され、小さな粒子を作る。一つの構造は、非依存性遊離状態の固体支持体であり得る。
【００４０】
本発明の試薬との使用に適した固体支持体の形は、例えば、シート、プレカットディスク、円筒、単繊維、粒子から成る固体支持体であり得る。固体支持体の材料は、適した容器に固定化され得、または入れられ得る、遊離状態固体支持体（例えば、メンブレン、ディスク、またはシリンダー）を作るため、パックされ得る。必要な場合、固体支持体は、適切な容器（例えば、ペーパー型（例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ ｃａｒｄ）、ミクロ遠心チューブ、スピンチューブ、９６ウェルプレート、チャンバー、またはカートリッジ）に含まれる。固体支持体は、繊維を含む場合、繊維を適切にパックし、最適な核酸結合および混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）の洗浄を可能にするために、適切な容器に入れられ得る。
【００４１】
一つの実施形態において、固体支持体は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液で前処理され、ＲＮＡ単離の多くの工程を減らし得る。生物材料が細胞材料またはウイルス材料を含む場合、一つの工程で生物材料を溶解しそして核酸を結合するために、ＲＮＡ溶解溶液が使用される。好ましくは、固体支持体を処理するために使用される、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積の１０分の１である。さらに好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積の２分の１であり、そして最も好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積と一致する。固体支持体の総体積とは、固体支持体の外部境界により規定した量を言う。外部境界は、固体支持体を含む容器の形および／または内部境界により決定され得る。ＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体の間隙空間内に捕捉される、または固体支持体の材料（例えば、繊維、ビーズなど）上に沈着されることにより、共有結合的に、非共有結合的に結合され得る。好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体上で乾燥することを可能にされる。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体の作製に使用された材料（例えば、繊維など）に直接添加され得、そして好ましくは、最終使用者準備形態（ｆｉｎａｌ ｕｓｅｒ−ｒｅａｄｙ ｆｏｒｍ）（例えば、ペーパー、塗抹標本、ディスク、プラグ、カラムなど）にされる前に乾燥することを可能にされ得る。
【００４３】
本発明がより良く理解されるために、固体支持体を含む容器の特定の実施形態が今からより詳細に説明される。
【００４４】
本発明の一つの好ましい実施形態において、容器は、上端に１つ以上の注入ポートまたは貫通可能な隔壁を備えたカートリッジである。注入ポートは、サンプルまたは試薬を含む容器上方に、コネクター（例えば、メス型Ｌｕｅｒ−Ｌｏｃｋ）によって接続される。１つの注入ポート（サンプルポート）は、固体支持体に対する生物サンプルの適用のために使用される。サンプルポートに関する任意の特徴は、サンプルポートを通してサンプルが移された後にサンプルポートを密封する自己密封機構である。第２の注入ポートは、試薬ポートとして機能する。両方の注入ポートに関する任意の特徴は、保護性の簡単に壊れる封（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｂｒｅａｋａｗａｙ ｓｅａｌ）である。さらに、注入ポート、簡単に壊れる封、および分散器は、任意のねじふた中に内蔵され得る。固体支持体の底には、細胞破片、タンパク質、および脂質分子の分散および通過に適した孔径を有する任意の分散器がある。分散器は、カートリッジの断面を横切る生物材料の均一な横断を可能にし、そして固体支持体の上または下どこにおいても、生物材料の不均等な蓄積を妨げる。カートリッジの排出口は、テーパーバレル上にきちんと適合する保護蓋を備える。精製したＲＮＡは、容易かつ混入を含まない保存のため、スナップ蓋を有する円錐管から成る回収チューブ中に集められる。容器全体は、処理されるサンプルの大きさおよび次の分析に必要とされる産物量に応じた大きさに調整され得る。例えば、２５．２ｍｍの寸法周径）、３〜１０ｍｍの長さを有する、Ｆｉｌｔｒｏｎａｔ（商標登録）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３）フィルターによって作られた好ましい固体支持体は、適したチューブに入れられており、サイズにおいて調整されるか、およびより大きなサンプルを処理するためにより大きなチューブに入れられるのどちらかであり得る。代替的に、そのようなフィルターは、変化するサンプル量に適応し、および類似の結果を達成するために、チューブ内でお互いの上または下に積み重ねられ得る。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態において、容器は、挿入物を保持するために設計されたスピンチューブからなり、その挿入物の中に固体支持体がパックされる。固体支持体は、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびこれらの組み合わせであり得る。挿入物は、挿入物をスピンチューブに保持するフランジ（ｆｌａｎｇｅｄ）先端および液体を通すが、固体支持体を支持することを可能にする穿孔底から成る。スピンチューブにつながれた蓋は、挿入物を覆うために使用され得る。溶液（例えば、非核酸混入物を含むＲＮＡ溶出溶液、ＲＮＡ洗浄溶液、またはＲＮＡを含むＲＮＡ溶出溶液）は、穿孔底を通過し、そして前述の溶液を排出する遠心力によりスピンチューブの底に回収される。
【００４６】
さらに別の実施形態において、容器は複数ウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレート）であり得、そこで固体支持体は各ウェルにパックされる。各ウェルの底は、出口ポートを有し、そこを混入物または精製ＲＮＡを含む溶液が通過し得る。
【００４７】
最適な固体支持体と独自の試薬（ＲＮＡ結合溶液（またはＲＮＡ溶解溶液）、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液）の独自の組み合わせは、実質的に純粋かつ、分解されていないＲＮＡの単離を生じる。上記のようなＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の特性は、固体支持体に対する核酸の優先的な結合を可能にするが、一方ＲＮＡ溶出溶液は、固体支持体からのＤＮＡの溶出よりも、ＲＮＡの優先的な溶出を可能にする。
【００４８】
（３．方法：）本発明はまた、生物材料からＲＮＡを精製する方法を提供する。本発明で教示される試薬および固体支持体は、２つの代替の単離方法に役立つ。第１の方法において、生物材料は、固体支持体と接触させられる前に、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液と接触させられる。生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液は、生物材料を溶解するために使用され、そして固体支持体に添加する前にＲＮＡが放出される。加えて、ＲＮＡ溶解溶液は、有害な酵素（例えば、ＲＮａｓｅ）の有害な影響を妨げる。ＲＮＡ溶解溶液は、ペレットにおいて培養細胞または白血球細胞を溶解するために、または培養プレート（例えば、標準９６ウェルプレート）に接着している細胞、または培養プレート内で回収された細胞を溶解するために、うまく使用され得る。生物材料が組織塊または小さな粒子を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液は、その効果的な溶解能力のために、このような組織塊を粉砕してスラリーにするために効果的に使用され得る。ＲＮＡ溶解溶液量は、細胞の数または組織の大きさに応じてスケールアップまたはスケールダウンされ得る。一度生物材料が溶解されると、溶解液は直接固体支持体に添加され、少なくとも１分間インキュベートされ、固体支持体に対する核酸の結合を可能にし得る。好ましくは、溶解液は、５分間インキュベートすることを可能にされる。別の実施形態において、生物材料が核酸の粗製混合物または部分精製混合物からなる場合、本発明のＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡからタンパク質を解離するために使用され得る。
【００４９】
第２の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、直接固体支持体に添加され得、それにより工程を除去し得、そしてさらに方法を単純化し得る。この後者の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に適用され得、次いで処理した固体支持体と生物材料を接触させる前に、固体支持体上で乾燥され得る。例えば、一つの実施形態において、適切な量のＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、Ｓｐｉｎ−Ｘ ｂａｓｋｅｔに配置された固体支持体に直接添加される。ここで、Ｓｐｉｎ−Ｘ ｂａｓｋｅｔは、さらに２ｍｌスピンチューブに配置されている。いくらか過剰の結合していないＲＮＡ溶解溶液またはＲＮＡ結合溶液が除去された後、固体支持体は、乾燥まで少なくとも１２時間、４０〜８０℃の間で加熱され、そして次に乾燥（ｄｅｓｓｉｃａｔｉｏｎ）下で保存される。生物材料は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液を前処理した固体支持体に直接添加され得、そして生物材料がうまく溶解し、核酸が放出され、そして固体支持体に結合するまで、少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間インキュベートすることを可能にし得る。
【００５０】
生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液との直接接触、またはＲＮＡ溶解溶液で前処理した固体支持体との接触は、細胞膜および核膜、またはウイルス外被を可溶化および／または破裂し、それにより核酸並びに他の混入物質（例えば、タンパク質、リン脂質など）を放出する。放出された核酸は、ＲＮＡ複合塩の存在下で、固体支持体と選択的に結合する。
【００５１】
このインキュベーション終了後、適した方法（例えば、遠心分離、ピペッティング、加圧、減圧）により、または核酸が固体支持体に結合したままにされるような、ＲＮＡ洗浄溶液と前述の方法の組み合わせにより、生物材料の残留物は、随意的に除去される。好ましくは、非核酸生物材料（タンパク質、リン脂質などが挙げられる）の残留物は、遠心分離によって、溶解液中の非結合混入物が固体支持体から分離されるように、最初に除去される。この後に、適量の適切なＲＮＡ洗浄溶液を使用する、１つ以上の洗浄工程が続く。各洗浄工程の後に、遠心分離工程が続く。好ましくは、洗浄工程の数は少なくとも２回、より好ましい洗浄工程の数は、少なくとも３回である。複数の洗浄工程は、固体支持体から実質的に全ての混合物を除去し、そして固体支持体に優先的に結合した核酸を残す。
【００５２】
その後、結合したＲＮＡは、適量の当業者に公知のＲＮＡ溶出溶液を使用して優先的に溶出し、固体支持体に結合した混入ＤＮＡは残される。好ましくは、次に固体支持体は遠心分離されるか、または加圧もしくは減圧に供され、固体支持体からＲＮＡを放出し、そしてＲＮＡは適切な容器に回収される。
【００５３】
本発明の別の局面の場合、特定のプロトコールを含むキットが提供され、このプロトコールは、本明細書中に記述されるような試薬および随意的に固体支持体と組み合わせることで、本発明の方法に従った、生物材料からのＲＮＡ精製に使用され得る。このキットは、説明手段も含む。
【００５４】
本発明は、以下の詳細な実施例への言及によりさらに説明される。これらの実施例は、様々な特定のかつ例示的な実施形態および技術をさらに説明するために提供される。しかしながら、本発明の範囲内でありながら、多くの変化および改変が成され得ると理解され得る。
【００５５】
以下に言及される全ての未加工の材料は、商業源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より容易に入手可能である。全ての割合は、特に規定されなければ、試薬の総量に基づいた容量／容量である。
【実施例】
【００５６】
（実施例１．ヒト培養細胞からのＲＮＡの単離）
培養Ｋ５６２細胞（ヒトリンパ芽球腫細胞株）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より得、ＡＴＣＣ推薦の培地を用いて培養した。細胞を、血球計を用いて数え、そして２００万個の細胞を含むサンプル量を１．７ｍｌミクロ遠心チューブに分配した。細胞をペレットにし、そして２０秒間、１２０００ｇで遠心分離し、上清を除去した。次いで、これらの細胞ペレットを、使用するまで−８０℃で凍結した。
【００５７】
培養細胞を、氷上で解凍し、そして２００μｌ ＲＮＡ溶解溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．８中の５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、７．２Ｍ 塩化リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、上下に穏やかにピペッティングして十分に細胞を溶解することにより、細胞からＲＮＡを精製した。次いで、生じた溶解液を、２ｍｌミクロ遠心チューブ（Ｓｐｉｎ−Ｘ，カタログＮｏ．９４２４，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の挿入部分中に配置された、８ｍｍ直径および５ｍｍ長に近い大きさの固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｒ−２０６５３，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加した。溶解液を固体支持体と共に５分間インキュベートし、溶解された細胞から放出された核酸が固体支持体に優先的に付着できるようにした。固体支持体および生物材料を含むミクロ遠心チューブを、１０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離し、混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）を含む過剰溶解溶液を回収し、固体支持体に付着した核酸を残した。続いて、容量２００μｌＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を固体支持体に添加し、１０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離した。次いで、固体支持体を含む挿入物を、２番目の２ｍｌ廃棄物収集チューブに移した。この洗浄工程は、全部で３回の連続した洗浄工程を繰り返した。しかしながら、３番目の洗浄の後に１０秒の代わりに２０秒間の遠心分離を行った。
【００５８】
次いで、固体支持体を含む挿入物を、きれいな２ｍｌ回収チューブに移した。固体支持体からＲＮＡを放出するため、容量１００μｌのＲＮＡ溶出溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を加え、そして室温で５分間インキュベートすることを可能にした。回収チューブを、６０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離し、２ｍｌ回収チューブに精製ＲＮＡを回収した。次いで、精製ＲＮＡを使用の準備ができるまで氷上に保存した。すぐに使用されないサンプルは、−７０℃〜−８０℃で適切に保存された。
【００５９】
（実施例２．ＲＮＡ精製の界面活性剤の評価）
異なる界面活性剤を、７．２Ｍ ＬｉＣＩを含む緩衝化溶液に添加し、ＲＮＡ産出量の最適化に必要とされる界面活性剤の最も良い型を決定する能力を評価した。以下の界面活性剤を試験した：１％アンモニウムラウリルスルフェート、１％ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００。界面活性剤を４５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．８を含む緩衝液に添加した。２００μｌ量の各混合物を固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ＃．Ｒ−２０６１９，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加し、そして１９時間、６０℃で乾燥した。２００万個のＫ−５６２細胞を、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、そして固体支持体上でピペッティングした。固体支持体を、２００μｌのＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））で３回洗浄することにより、ＲＮＡを精製し、そして１００μｌのＲＮＡ溶出溶液で溶出した。この場合、ＲＮａｓｅを含まない水をＲＮＡ溶出溶液として使用した。ＲＮＡの産出を測定するため、各サンプルの１：２０希釈を脱イオン水中で調製した。また、緩衝化溶液（例えば、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を希釈液として使用した。ＲＮＡ溶出溶液を含むブランクに対して標準化したＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、３２０ｎｍ（バックグラウンド）、２６０ｎｍ、および２８０ｎｍでの吸光度を読んだ。ＲＮＡ濃度を以下のように計算した：（Ａ２６０−Ａ３２０）×４０μｇ／ｍｌ（ＲＮＡ吸光係数）×５０（希釈係数）；産生したＲＮＡを、ＲＮＡ濃度と回収した溶出量を掛け合せることで計算した。推定ＲＮＡ純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度比率、Ａ２６０／Ａ２８０である。この比率の値が、１．８および２．１の間の場合、サンプルは比較的タンパク質および他の混入物を含まないと見なされる。この比率は、以下のように計算される：（Ａ２６０−Ａ３２０）／（Ａ２８０−Ａ３２０）。半定量的評価および定量的評価の両方を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて行った。ＲＮＡの量をエチジウムブロマイド染色の強度を調べることで、推定した。ＲＮＡの品質を、１８ｓバンドの強度の約２倍である２８ｓ断片を有するリボソームバンドの存在により、評価した。品質のさらなる指標は、ＲＮＡのバンドよりも非常に高い分子量として存在するゲノムＤＮＡの減少または欠如であった。
【００６０】
従って、各ＲＮＡサンプルの５μｌ量サンプルを１０×追跡用色素と混合し、そして２％アガロースゲルにロードした。ＲＮＡは、１００ボルトで３０分間、ゲルおよび泳動緩衝液の両方において、０．１２５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドとの電気泳動により大きさを分離して、可視化を可能にした。電気泳動の後、蛍光ＲＮＡバンドをＫｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＥＤＡＳ １２０ ＬＥ（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を有するトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）上で可視化した。
【００６１】
界面活性剤の３つ全ての型が、ＲＮＡ精製におけるＲＮＡ溶解溶液中の添加剤として有効であり、４．９μｇ〜６．２μｇの間のＲＮＡ収量をもたらす。これは、アガロースゲル電気泳動後のＲＮＡ染色の相対的な同等性により確かめられた。ＲＮＡの品質を、１．８より大きいＡ２６０／Ａ２８０比率およびアガロースゲル電気泳動後の２８ｓおよび１８ｓ ｒＲＮＡバンドの「２：１」比率の存在で、さらに評価した。各サンプルのわずかな高分子量バンドのみの存在は、ゲノムＤＮＡ混入の実質的な除去を示した。ＤＮＡ混入は、５μｌサンプル中、予想６００ｎｇＤＮＡのうち１０ｎｇ未満、または２％未満であると推定された。
【００６２】
いくつかの界面活性剤およびそれらの組み合わせが水溶液中で沈殿しないこともまた決定された。例えば、いくつかの非イオン性界面活性剤およびそれらの組み合わせは、安定した懸濁液を形成し、そしてより使用しやすい。
【００６３】
【表１−１】
【００６４】
【表１−２】
（実施例３．９６ウェルプレート形式におけるＲＮＡ精製の形式）
ＲＮＡ精製の再現性を、９６ウェルプレートを用いて試験した。ヒト細胞（Ｋ５６２、リンパ芽球腫細胞株）を細胞カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＣＢＣ−５，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて数え、そして５０ｍｌポリプロピレン遠心分離チューブに、２０００ｇで３分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットを、−８０℃で凍結し、実験のために解凍した。細胞を、実施例１に記載したＲＮＡ溶解溶液と、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で、ＲＮＡ溶解溶液を添加することにより混合し、次いで上下に５回穏やかにピペッティングし、溶解液を生成した。溶解液（０．１５ｍｌ／ウェル）を、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，カタログ番号２０００１７）の９６ウェルフロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）プレート（ここにプロセシングプレートとして言われる）の各ウェルに等分した。ここで、各ウェルには、１５．３９ｍｍ周径および１５ｍｍ長の大きさのポリエステル固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｒ−２２６０７，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）が取りつけられた。遠心分離後の各試薬の添加に続き、プロセシングプレートをきれいで標準粘着性のプレートシールで覆い、混入を妨いだ。プレートをＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｗａｓｔｅプレート（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．２０００２８，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）上に置いた。溶解液は固体支持体とインキュベートされ、そして核酸を固体支持体上に５分間室温で結合させ、その後に、プレートを２０００×ｇで３分間遠心分離した（Ｍ４ Ｓｗｉｎｇ−Ｏｕｔ Ｒｏｔｏｒを備えたＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｍｏｄｅｌ Ｃ４１２，カタログ番号１１１７５３３８；Ｊｏｕａｎｎ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）。容量１５０μｌのＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を各ウェルに添加し、そしてプレートを前記のようにさらに２回遠心分離した。３回目の洗浄後、廃棄プレートをＲＮａｓｅを含まない９６ウェル回収プレートに変えた。容量１００μｌのＲＮＡ溶出溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｐａｒｔ．Ｎｏ． Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をフィルターに添加し、そしてプレートを５分間室温でインキュベートした。次いで、ＲＮＡを２０００×ｇで５分間遠心分離により回収した。ＲＮＡ収量およびＲＮＡの品質を推定するため、吸光度（ＯＤ）を２６０ｎｍで９６ウェルＵＶプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ＵＶ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．１ソフトウェア，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって測定した。ＲＮＡ収量を実施例２に記載したように計算した。ＲＮＡ収量は、８．７９＋／−１．４９μｇ（１７％変動係数）であった。
【００６５】
本発明の試薬および方法を用いて精製したＲＮＡの、定量ＲＴ−ＰＣＲに対する適合性および９６反復単離からのＲＮＡ産出の再現性を判定するために、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を使用する５’ヌクレアーゼ（「Ｔａｑｍａｎ」）アッセイを用いて、ヒトβアクチンｍＲＮＡを増幅した。単一工程逆転写ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，カタログ番号Ｎ８０８−０２３６，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、２０μｌ反応液を使用して、３８４ウェルＯｐｔｉｃａｌ Ｐｌａｔｅｓ（カタログ番号．４３０９８４９，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において行った。容量１５μｌの試薬混合物をプレートの各ウェルに添加し、次いで５μｌの精製ＲＮＡ（ＲＮａｓｅを含まない水で１：１００に希釈した）を添加した。反応プレートを、反応準備の間氷上に維持した。反応液は、１×ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、３．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ、０．３ｍＭ ｄＧＴＰ、０．６ｍＭ ｄＵＴＰ、１×ヒトβ−アクチンプライマー／プローブミックス（ＶＩＣ）（カタログ番号４３１０８５５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．２単位のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、および２単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。プレートをＯｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ（カタログ番号４３１１９７１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で密封し、そして７９００ＨＴにおいて以下のように循環した：５０℃を２分間、６０℃を１５分間；９４℃を５秒間、そして６０℃を１分間を全部で５０サイクル。ヒトβアクチン配列を含むＲＮＡ転写物は、検量線として用いるために１回の反応につき１０１１から１０コピーへ希釈された。加熱サイクリングの間、７９００ＨＴ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔはＰＣＲのアニール／伸長期間の蛍光データ蓄積した。データ分析を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳバージョン２．０ａ２３，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。検量線は、１０００コピーと１０１０コピー（Ｒ２＞０．９９８）との間で線形であった。閾値サイクル（Ｃｔ）は、平均１８．８＋／−０．３９サイクル（変動係数＝２．１％、Ｎ＝９６）であった。サイクル閾値を、蛍光増幅産物が、バックグラウンドよりも有意に多くなるところでのサイクル数として定義した。計算されたコピー数は、１回の反応物につき平均４．６×１０８＋／−１．０×１０８コピー（変動係数＝２２％、Ｎ＝９６）であった。この実験は、９６ウェルプレート形式におけるβアクチン転写物検出の一貫性を証明した。
【００６６】
（実施例４．ＲＴ−ＰＣＲ分析における精製ＲＮＡの評価）
後続の分析における使用に対する精製ＲＮＡの適合性をさらに評価するため、ＲＴ−ＰＣＲ分析におけるＲＮＡの性能を評価した。実施例１の手順に従って精製した５μｌのＲＮＡ、１×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｎ８０８−００１０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｉ−３０２１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、９．３ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ−１０２８，Ｓｉｇｍａ）、１．２５ ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｔ，Ｐａｒｔ ｎｏ．７７１００，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、５ｍＭジチオスレイトール（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｄ−９７７９，Ｓｉｇｍａ）、２．５ｎｇランダムプライマー（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｃ１１８１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１６単位の組換えリボヌクレアーゼ阻害因子（ｒＲＮａｓｉｎ，ｐａｒｔ ｎｏ．Ｎ２５１５，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、および４０単位のＭＭＬＶ−ＲＴ（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ１７０５，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む１５μｌ反応溶液中で、ＲＮＡを逆転写した。反応液を２５℃で１０分間インキュベートし、ランダムプライマーのアニーリングを可能にし、４２℃で１５分間、次いで９９℃で５分間インキュベートし、逆転写酵素を不活化した。ＰＣＲミックスを添加し、そして９２℃を５秒間、６４℃を３０秒間、７２℃を１分間を５サイクルおよび９４℃を５秒間、６４℃を３０秒間、７２℃を１分間を２５サイクル、続いて７２℃を１５分間の最終伸長の増幅を行った。反応液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸塩、ｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ．によって合成された３００ｎＭ各プライマーＢＡ−Ｆ ５’−ＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ；ＢＡ−Ｒ：５’−ＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣおよび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含んだ。これらのＰＣＲプライマーは、βアクチンｍＲＮＡ由来の１３４塩基対のアンプリコンを生成する。反応産物を、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル（１００Ｖ １ｈ）上の電気泳動により分析した。バンドをＵＶトランスイルミネーターにより可視化した。予想された大きさの産物を観察した。
【００６７】
ＲＮＡの品質をさらに評価するため、より大きなアンプリコンを他のプライマーセットを用いて単離したＲＮＡから直ちに増幅した。ＲＮＡが実質的に分解された場合、より大きなアンプリコンは標準電気泳動法を用いて検出できない。例えば、トリプトファンｔＲＮＡ合成酵素ｍＲＮＡ由来のＰＣＲプライマーのセット（各々Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより合成されたＦ：５’−ＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣ；Ｒ：５’−ＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣ）は、本発明により単離された１０サンプルの総ＲＮＡ由来４９２塩基対断片の増幅にうまく利用された。
【００６８】
（実施例５．ＲＮＡ溶解溶液のカオトロープ剤減少効果の使用
グアニジウム塩は、最も強力であると知られるＲＮａｓｅの失活剤の一つである。従って、強力なカオトロープ剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）およびグアニジニウム塩酸塩）が、塩化リチウムの代わりになり得るか、または本発明の方法における試薬を用いてＲＮＡ収量が増加し得るかのいずれかの場合を発見することが目的である。
【００６９】
３セットの実験を行った。実験条件は、以下である：（１）ＧＩＴＣで前処理した固体支持体；（２）ＧＩＴＣ中で前溶解され、次いで固体支持体に添加される細胞；および（３）実施例１のＲＮＡ溶出溶液へのカオトロープの添加。全ての実験において、実施例１の固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｒ−２０６５３，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））を使用した。
【００７０】
第１の実験セットにおいて、ＲＮＡ溶解溶液またはＧＴＩＣ溶解溶液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、フィルター上でこの溶液の２００μｌをピペッティングし、次いで６８℃で１８時間乾燥することによって固体支持体をコーティングした。処理した固体支持体を、実施例２の方法に従って、Ｋ５６２細胞からＲＮＡを精製する能力を反復して試験した。精製したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動は、実施例２に記載されるように、ＧＩＴＣ溶解溶液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用するＲＮＡ収量は、フィルターに結合するために本発明のＲＮＡ溶解溶液を使用した場合に観察されたＲＮＡ収量の１０％に満たないことを示した。
【００７１】
第２の実験セットは、固体支持体へのＲＮＡの結合を促進するＧＩＴＣの能力を評価することを試みた。Ｋ５６２細胞を緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中に溶解し、次いで未処理のフィルターにかけた。緩衝液ＲＬＴの存在下での結合は、有意に低い収量（実施例１に記載されるようなＲＮＡ溶解溶液を使用したＲＮＡの５０％未満）を生じた。
【００７２】
最後に、カオトロピック塩を本発明のＲＮＡ溶解溶液に添加し、本発明の方法におけるＲＮＡ収量を向上させるカオトロピック塩の能力を評価した。４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、６Ｍグアニジニウム塩酸塩、または８．３Ｍ尿素を添加した、実施例１に記載される本発明のＲＮＡ溶解溶液を、実施例１に記載される方法に従ってＲＮＡを精製するために使用した。前述の各溶液のｐＨは、それぞれ８．８、８．８、および８．６であったことを決定した。尿素−ＬｉＣｌ溶解溶液を用いて得たＲＮＡ収量は、実施例１のＲＮＡ溶解溶液を使用したＲＮＡ収量の約３５％であった。グアニジニウム塩酸塩を使用して、さらに少ないＲＮＡを回収し、そしてグアニジニウムチオシアン酸塩をＲＮＡ溶解溶液に添加した場合、ゲル上でＲＮＡを認めなかった。これらの結果は、グアニジニウム塩が、リチウム塩の代わりになり得ず、リチウム塩の存在下でＲＮＡ結合の効果を増強し得ないことを実証する。従って、これらの実験は、塩化リチウム存在下における本発明の固体支持体へのＲＮＡ結合が、カオトロピック塩存在下における類似の固相への核酸の結合と明確に異なる機構により生じることを示す。
【００７３】
（実施例６．固体支持体を用いるＲＮＡ精製における低ｐＨの影響）
ＲＮａｓｅは、低ｐＨで迅速にかつ効果的に不活化される。それ故、本方法が低ｐＨ ＲＮＡ溶解溶液の使用により増強され得るか否かを決定することを目的とした。
【００７４】
従って、４５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８緩衝液を４５ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．６と換えたことを除いて、本発明の実施例２に従って、２つ（一つは低ｐＨ（ｐＨ４．６）で、そして２番目は高ｐＨ（ｐＨ８．８））のＲＮＡ溶解溶液を調製した。３００μｌ容量の各ＲＮＡ溶解溶液を、固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｌｏｔ ＃Ｒ２０６５３， Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加し、そして実施例２に記載されるように乾燥した。実施例２によるＲＮＡ精製法の後に、回収したＲＮＡをＵＶ分光光度法により測定した。ｐＨ４．６ ＲＮＡ溶解溶液を用いて精製したＲＮＡの平均収量は、３．６０μｇ（４反復で、標準偏差は０．８６であった）である一方、ｐＨ８．８ ＲＮＡ溶解溶液を用いた平均収量は、１１．４０μｇ（４反復で、標準偏差は０．３２であった）であった。この結果は、溶解溶液のｐＨの低下が、生じるＲＮＡの収量および純度を有意に減少させたことを示した。
【００７５】
（実施例７．精製したＲＮＡサンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入の決定）
遺伝子発現および他の分析にとって、ＲＮＡ調製物は実質的にＤＮＡを含まず、一貫しかつ確実な結果を示すことが望ましい。ゲノムＤＮＡ混入は、多くの現在のＲＮＡ精製技術にともなう問題である。本発明の試薬および方法により精製された精製ＲＮＡのゲノムＤＮＡ含有量を評価することを目的とした。
【００７６】
２つの分析を用いて、ゲノムＤＮＡ含有量を評価した：リアルタイム定量ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動。第１の分析において、ＤＮＡ含有量は、実施例３に記載されるような９６ウェル形式で精製されたＲＮＡから推定した。精製ＲＮＡのゲノムＤＮＡ含有量を、Ｔａｑｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐアッセイを使用する定量アッセイにより推定した。Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐａｒｔ Ｎｏ．４３０４４３７，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＴａｑＭａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＦＡＭ）（ｐａｒｔ ｎｏ．４３１６８３１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、２０μｌ反応液中、以下のサイクル条件で、単一コピーのヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を増幅した：５０℃を２分間、９５℃を１０分間、９５℃を１５秒間、および６０℃を１分間を合計５０サイクル。５ｐｇから５０ｎｇまで（検量線に対するＲ２＞０．９９８）の、ヒトゲノムＤＮＡ（カタログ番号．４３１６８３１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより提供された）の段階希釈は、１反応あたりのＤＮＡ（ｎｇ）の算出を可能にした。総核酸収量を、２６０ｎｍの吸光度（主にＲＮＡ含量を仮定する）で算出した。精製ＲＮＡサンプルの平均ゲノムＤＮＡ含量は、０．２２％＋／−０．０３（Ｓ．Ｄ．）（変動係数＝１４．７％、Ｎ＝９６）と概算された。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲを使用するさらなる実験において、実施例１に記載されたカラム法を用いる１２サンプルからＲＮＡを精製し、そして市販のキット（ＲＮＡｅａｓｙ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号．７４１０３（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて１２サンプルからＲＮＡを精製した。どちらの場合においても、ＤＮＡ（ｎｇ）におけるＲＮａｓｅ Ｐの値を、総核酸の割合（大部分をＲＮＡと仮定して、換算として４０μｌ／ｍｌを使用し、Ａ２６０−Ａ３２０から計算した）として表した。市販のキットは、本発明（平均＝０．６４３％＋／−０．２１％）より有意に多くの混入ＤＮＡ（平均＝７．９１％＋／−２．６８（Ｓ．Ｄ．））を有するＲＮＡを生成した。従って、本発明は、現存の技術より有意な改善を示す。
【００７８】
第２のアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡを精製したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動より推定した。多くの市販のキット（例えば、前述のキット）により精製したＲＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡは、２８ｓ ｒＲＮＡのバンドより移動が遅いバンドとしてはっきりと見える。本発明により精製したＲＮＡを観察した結果、前述のキットより有意に少ないゲノムＤＮＡを含んでいた。本発明の試薬および方法を用いて得られたいくつかのＲＮＡ調整物において、ゲノムＤＮＡのバンドは見られなかった。このデータは、本発明の試薬および方法が、いくつかの現在の市販のキットより有意に高い純度のＲＮＡを産生することを示す。
【００７９】
（実施例８．マイクロアレイ分析のための精製ＲＮＡの使用）
より高濃度のＲＮＡを生成するために２０μｌのＲＮＡ溶出溶液量を用いる実施例１に記載された手順に従う本発明の方法を用いて、１０００万個のＫ５６２細胞から総ＲＮＡを精製した。各色素にＲＮＡ２０μｇ量を用いるＣｙＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，カタログ番号．ＲＰＮ ６２０２）を用いて、ＲＮＡをＣｙ３−ｄＣＴＰおよびＣｙ５−ｄＣＴＰで蛍光標識した。製造業者により記載された方法に従って、蛍光標識されたｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＭＡＰＴＭ Ｈｕｍａｎ ３８４ｘ５ Ｔｅｓｔ Ｃｈｉｐ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，カタログ番号．Ｓ９７００１０２）とハイブリダイズさせた。１６時間のハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイをＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００マイクロアレイ分析システム（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，カタログ番号．，９００−３０１１５２３００１）を用いてスキャンした。生じたマイクロアレイ画像は、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長の両方で、非常に低いバックグラウンド蛍光を有する強いシグナルを実証した。バックグラウンドを推定するため、ＧｅｎｅＰｉ×ＴＭ Ｐｒｏ ３．０分析ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し、ノイズに対するシグナルの割合を測定した。その割合を１グリッドあたり１６スポットを含む２４グリッドについて計算し、ここで、各スポットを、すぐ周りの周辺領域と比べた。ネガティブスポットは、分析に含めなかった。ポジティブハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドより３倍大きいシグナルであると、製造業者により定義されている。本実施例において、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長の両方の、ノイズに対するシグナルの平均割合は、そのレベルが非常に高く（それぞれ７．０１５および１０．６７８）、そのことは、高品質ＲＮＡから非常に低いバックグラウンド蛍光を示した。
【００８０】
（実施例９．ｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いるＲＮＡ品質の評価）
本発明の試薬および方法を用いて精製したＲＮＡの品質を評価するため、ＲＮＡサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて分析した。このシステムを使用して、電気泳動図を作成し、そして２８ｓピーク域および１８ｓピーク域の間の割合を計算する主要なリボソームＲＮＡの大きさおよび品質を評価し得る。一般的に、１．５より大きな割合を有する、２つの分解性ピークは、ＲＮＡサンプルが分解されないことを示す。
【００８１】
実施例１に記載されたプロトコールに従って（ＲＮＡ溶解溶液量がそれぞれ５００、７５０および１０００μｌ、およびＲＮＡ溶出溶液が２０、６０、および１００μｌであることを除く）、合計５０×１０６個のＫ５６２細胞由来のＲＮＡを精製した。精製に続き、１μｌの各ＲＮＡサンプルを、製造業者により提供された試薬中で、製造業者の指示書に従って調製されたＲＮＡ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のウェルにロードした。電気泳動に続き、生じた電気泳動図を調べた。全てのサンプルは、２つの明瞭な２８ｓピークおよび１８ｓピークを示した。１８ｓに対する２８ｓの平均割合は、２．４６であり、全てのサンプルについては１．８９から３．５３の範囲であった。従って、その割合は全て１．５より大きく、そのことは本発明の方法が、実質的に分解されていないＲＮＡを生成したことを示した。
【００８２】
（実施例１０．ヒト血漿からのウイルスＲＮＡの精製）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染したヒト血漿よりＲＮＡを精製した。処理したフィルターおよび未処理のフィルター両方を実施例１および２それぞれに記載されるように使用した。処理したフィルター（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３））を、Ｓｐｉｎ−Ｘキャリアチューブ中の各フィルター上で０．２ｍｌのＲＮＡ溶解溶液をピペッティングすることにより調製し、次いで、実験室用オーブン中で６８℃で１２〜１８時間加熱した。血漿（０．２〜０．４ｍｌ）を処理したフィルターにアプライし、そしてＲＮＡを室温で５分間結合させた。フィルターを実施例１に記載されるように洗浄した。ＲＮＡを、１５０μｌ量のＲＮＡ溶出溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液，Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中で溶出した。
【００８３】
未処理の固体支持体を使用し、２００μｌのヒト血漿サンプルからＲＮＡを精製した。ＲＮＡ溶解溶液をヒト血漿と２：６の間の割合で混合し、そして全サンプルを、外因性核酸（Ｋ５６２細胞から得られた単離物あたり１０〜３０μｇのヒト総細胞ＲＮＡ）と共に固体支持体にアプライした。次いで、実施例１に記載された方法に従い、固体支持体を洗浄および溶出した。外因性キャリアＲＮＡの添加は、キャリアＲＮＡを使用しない状態より少なくとも５０％多く、収率を有意に改善させることが見出された。
【００８４】
ＨＣＶ ＲＮＡが精製されたか否かを決定するため、ＨＣＶ特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨＣＶの５’非翻訳（５’−ＵＴＲ）領域内の２４１塩基標的に特異的なプライマーを使用した。１０μｌのＲＮＡ、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（カタログ番号Ｎ８０８−００１０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、各１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｔ，カタログ番号７７１００，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、５ｍＭジチオスレイトール（カタログ番号Ｄ−９７７９，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、２．５ｎｇランダムプライマー（カタログ番号Ｃ１１８１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２０単位の組換えＲＮａｓｅインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ，カタログ番号Ｎ２５１５，Ｐｒｏｍｅｇａ）、および４０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ１７０５，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む３０μｌの反応溶液において、逆転写を行った。反応物を２５℃で１０分間インキュベートし、４２℃で１５分間ｃＤＮＡ合成のためにランダムプライマーのアニーリングをし、次いで９９℃で５分間、逆転写酵素を不活化した。５μｌｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号．４３０４４３７，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、４００ｎＭの前方向プライマー（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより合成された５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ）４００ｎＭの逆方向のプライマー（５’−ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）、および２００ｎＭ ６ＦＡＭ−標識プローブ（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸにより合成された５’−ＴＡＭＲＡ−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ−６ＦＡＭ−３’）を含む５０μｌ反応液中で、ＰＣＲ増幅を行った。プレートをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で以下のとおりに加熱した：５０℃を２分間、９５℃を１０分間、９４℃を５秒間、および６０℃を１分間を５０サイクル。データをＰＣＲのアニール／伸長期間に収集し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）バージョン２．０を用いて分析した。増幅を、処理済みおよび未処理のフィルター両方を用いる血漿ＲＮＡから精製されたＲＮＡを用いて観察した。
【００８５】
（実施例１１．全血からのＲＮＡの精製）
全血サンプルを、３人のドナーから１０ｍｌ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（登録商標）Ｂｒａｎｄ血液回収チューブ（ＥＤＴＡ Ｋ３ Ｎｏ．１６８５２，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に回収し、そして使用まで４℃に保存した。白血球細胞数をＣＢＣ−７ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて校正したＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（登録商標）ＣＢＣ−５（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて測定した。２００μｌの容量を除去し、そして６００μｌ ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と、１．７ｍｌミクロ遠心チューブ中で混合した。混入赤血球細胞を溶解するため、３分間室温でインキュベーションした後、白血球細胞を１２，０００×ｇ、２０秒間の遠心分離によりペレットにした。溶解した赤血球を含む上清フラクションを除去し、そしてペレットを３００μｌＲＢＣ溶解溶液でリンスし、混入物をさらに除去した。白血球細胞をＲＮＡ溶解溶液に懸濁し、そしてＲＮＡを実施例１に従って精製した。βグロブリン転写を、製造業者の指示書に従って１工程逆転写ＰＣＲ増幅キット（ｒＴｔｈ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ カタログ番号ｎ８０８−００９８ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、増幅した。プライマー配列は、Ｆ５’ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＣＴ−３’およびＲ５’ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＡＡ ＣＣＴ ＣＡＡ−３’であった。精製したＲＮＡを、６０℃３０分間、９４℃３分間、続いて３０サイクルの９４℃１分間、７０℃１分間、７２℃１分間のサイクル条件を用いて増幅し、次いで７２℃で７分間インキュベートすることにより完了した。本発明を用いて単離されたＲＮＡが、十分に純粋で、ｃＤＮＡに逆転写され、次いで増幅されるか否かを決定するため、５０μｌ増幅反応溶液のうち５μｌを６０分間、８０ボルトでの２％アガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル画像は、各複製物に対して、そして各３つのＲＮＡドナーサンプルに対して予測された大きさの１９４塩基対で強いバンドを示し、このことは、実質的に純粋な出発ＲＮＡテンプレート物質を示した。さらに、混入ゲノムＤＮＡからの増幅は、約１０００塩基対の断片を生成する。この大きさの増幅産物がゲル上に認められなかったため、精製したＲＮＡ中に実質的なゲノムＤＮＡ混入はなかった。
【０００１】
（発明の背景）
核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ））は、研究および臨床的分析の分子生物学分野において広く使用されている。ＲＮＡは、天然に、各々それらの特定の機能に関連した、異なる特性を有する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡを含む様々な形で見出され得る。ＲＮＡ発現レベルおよびパターンの分析は、例えば、発生遺伝学、薬物発見および臨床的診断といった分野において重要な情報を提供する。例えば、ＲＮＡ分析は、正常な遺伝子機能および異常な遺伝子機能の両方に関して重要な診断情報を提供する。さらに、一般的な白血病に関係する全体的なＤＮＡ再配列は、異常ハイブリッドＲＮＡの単離および同定により検出される。
【０００２】
ＲＮＡを分析する一般的な方法は、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護分析（ＲＰＡｓ）、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、クローニング、インビトロ翻訳およびマイクロアレイ分析のためのｃＤＮＡ調製が挙げられる。これらの分析から妥当なおよび一致した結果を得るため、ＲＮＡが、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質およびＤＮＡといった生物材料に共通する他の成分から精製されることが重要である。
【０００３】
ＲＮＡ精製法は、２つの一般的な区分（液相精製および固相精製）に分類される。液相精製において、ＲＮＡは液相内に残り、一方不純物は、例えば沈殿および／または遠心分離といったプロセスにより除去される。固相精製において、ＲＮＡは固体支持体に結合され、一方ＤＮＡ、タンパク質、およびリン脂質のような不純物は、選択的に溶出される。両方の精製方法は、多くの工程、およびしばしば危険な試薬を必要とする従来の方法、並びにより少ない工程および通常ほとんど危険ではない試薬を必要とする迅速な方法を利用する。出発生物材料が細胞を含む場合、両方の方法は、混入物（例えば、ＤＮＡ、脂質、炭水化物、タンパク質など）とＲＮＡとの混合物を生じる、細胞またはウイルス性共破壊あるいは溶解工程を必要とする。このような混合物はまた、ＲＮＡを容易に分解し、そして除去および／または不活化されるべきＲＮａｓｅを含む。
【０００４】
元々、液相ＲＮＡ単離法は、液体−液体抽出（すなわち、フェノール−クロロホルム）およびアルコール沈殿を使用する。おそらく、最も一般的に使用される液体−液体抽出法は、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉの「酸性グアニジウムフェノール」法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ，Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６２：１５６〜９［１９８７］；米国特許第５，９４５，５１５号、同５，３４６，９９４号、および同４，８４３，１５５号）である。この方法は、以下の工程を含む：（１）グアニジウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）溶液でサンプルを抽出し、これに酸性媒体、フェノール、およびクロロホルムに連続して加える工程；（２）混合物を遠心分離し、フェノールにより変成したタンパク質が、中間層に見出され、核酸から除去され得るように、相を分離させる工程；（３）沈殿させるためにアルコールを加え、そしてそれにより、ＲＮＡを濃縮する工程；および（４）精製ＲＮＡを洗浄および再水和する工程。この方法は、ＲＮＡの精製を確実にするが、例えばクロロホルムおよびフェノールのような危険な試薬を使用する。カチオン界面活性剤による核酸の沈殿は、液相技術の別の例である（米国特許第５，９８５，５７２号、同５，７２８，８２２号、および同５，０１０，１８３号（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ））。例えば、米国特許第５，９８５，５７２号は、選択した第4級アミン界面活性剤を使用して生物学的サンプルからＲＮＡを単離する、新規な方法を開示する。危険ではない液相精製法は、低ｐＨ溶解および沈殿試薬を用いるＨｅａｔｈ（米国特許第５，９３７，１３７）により開示された。しかしながら、液相法は、単調な沈殿工程を含むという点で重大な不利点を有し、それ故に自動化は困難である。従って、高処理量ＲＮＡ精製の必要性は、固相法の開発をもたらした。液相精製と同様に、従来の固相法は高精製ＲＮＡを生成するために開発された。一般的に、これらの方法は、４つの一般的な工程を必要とする：ＲＮＡを放出するために細胞またはウイルス外被を溶解する工程；放出されたＲＮＡを固体支持体に結合する工程；不純物を洗浄する工程；次いで精製ＲＮＡを溶出する工程。最初の２つの工程（細胞またはウイルス外被を溶解する工程および放出ＲＮＡを結合する工程）は、元々危険な試薬を必要とする。
【０００５】
固相法は、例えば、そのような抽出に使用される固相の型に従って、シリカ樹脂またはイオン交換樹脂のいずれかに、大まかに分類され得る。固相核酸単離法に関して、膜フィルター、磁気ビーズ、金属酸化物、およびラテックス粒子を含む多くの固体支持体が使用されてきた。おそらく、最も広く使用される固体支持体は、シリカベース粒子（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号（Ｂｏｏｍら）；国際公開番号ＷＯ９５／０１３５９（Ｃｏｌｐａｎら）；米国特許第５，４０５，９５１号（Ｗｏｏｄａｒｄ）；国際公開番号ＷＯ９５／０２０４９（Ｊｏｎｅｓ）；同ＷＯ９２／０７８６３（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）を参照のこと）である。核酸は、カオトロピック剤存在下でシリカに結合する。例えば、米国特許第５，２３４，８０９（Ｂｏｏｍら）に開示された方法は、ＤＮＡをシリカ粒子に結合するために、例えば、グアニジンチオシアネートのような高濃度カオトロピック溶液を使用し、そして全血からＤＮＡを精製するために、６つの遠心分離工程および５つの試薬を必要とする。
【０００６】
特に、Ｂｏｏｍは、以下を教示する；（１）生物材料をグアニジンチオシアネート、ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる溶液、シリカとを混合する工程；（２）核酸をシリカに結合させる工程；（３）グアニジンチオシアナート、エタノール、アセトンの連続した洗浄によりシリカを洗浄する工程；ならびに（４）溶出剤で核酸を溶出する工程。この方法の不利点は、特定の懸濁液の使用、多くの遠心分離工程の使用、および例えばグアニジンチオシアナートおよびアセトンのような危険試薬の使用である。しかしながら、この方法は、ＤＮＡ単離にうまく利用されてきたが、許容できないレベルのＤＮＡ混入により、ＲＮＡ単離には適さない。
【０００７】
先行技術もまた、核酸と低ｐＨで結合し、そしてその核酸が高いｐＨ（および／またはより高塩濃度）で溶出される、イオン交換樹脂の使用を教示する。米国特許第５，０５７，４２６号（Ｈｅｎｃｏら）を参照のこと。しかしながら、このような方法は、より小さな核酸および他の生物材料（例えば、タンパク質）から特有の電荷を有する長鎖核酸の選択的分離に、主に有利となる。このような方法では、長さおよび電荷に関わらず、生物材料の残部からのＲＮＡの単離に成功しない。
【０００８】
さらに、長鎖核酸は、使用するイオン交換法のための高塩濃度において、溶出されねばならない。一般的に使用される塩（例えば、ＮａＣｌおよびＫＣｌ）は、分子生物学において使用される多くの酵素を妨げ得る。従って、多くの適用にとって、核酸のイオン交換単離は、最終的な脱塩工程を必要とする。
【０００９】
ポリカチオン固体支持体はまた、混入物を含む溶液からの核酸の精製にも使用される。米国特許第５，５９９，６６７号（Ａｒｎｏｌｄら）参照のこと。ポリカチオン支持体は、大きさに基づいて選択的にヌクレオチド多量体を吸着し、より大きな多量体は、より小さな多量体よりポリカチオン支持体に対して高い親和力を有する。この方法は、正に帯電したカチオン固体支持体と負に帯電したヌクレオチドのリン酸骨格との間の親和力に、主に基づく。より大きなヌクレオチド多量体は、より高い電荷を有し、そして結果として、より小さなヌクレオチド多量体以上に優先的に結合する。従って、Ａｒｎｏｌｄの方法は、粗製生物材料からの全型のＲＮＡの単離よりむしろ、大きさに基づいたヌクレオチド多量体の単離に適している。さらに、Ａｒｎｏｌｄの方法は、その方法自体を例えばアンモニウムイオン、イミニウム（ｉｍｍｏｎｉｕｍ）イオンおよびグアニジニウムイオンを含むポリカチオン支持体の使用に制限する。
【００１０】
最近の精製方法は、規定の緩衝液条件下のグアニジニウム塩の存在中においてＲＮＡが優先的に沈殿するという原則を利用する。米国特許第５，９７２，６１３（Ｓｏｍａｃｋら）参照のこと。この方法において、ＲＮＡは、低温で、グアニジニウム塩の存在下、沈殿されるが、一方ＤＮＡは溶液中に残る。さらに別の方法は、リチウム塩の存在も加えて、この原則を利用する。米国特許第５，９９０，３０２（Ｋｕｒｏｉｔａら）参照のこと。この方法では、生物材料は、リチウム塩およびカオトロピック剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ））を含む酸性溶液中で溶解され、その後、ＲＮＡは、核酸結合キャリア（例えば、シリカ）と接触される。ＲＮＡはその後、低イオン強度緩衝液中でシリカから溶出することにより精製される。しかしながら、この方法は、例えばカオトロピック塩であるグアニジンチオシアナートといった危険物質の使用において不利である。
【００１１】
シリカベースキャリアと併せた、カオトロピック物質の組み合わせ（例えば、４Ｍより大きいイオン強度で、グアニジンチオシアナート、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、および塩化リチウム／尿素の混合物）が、Ｈｉｌｌｅｂｒａｎｄにより教示された。ＷＯ９５／３４５６９を参照のこと。しかしながら、本発明は、前述のカオトロピック物質が添加されたシリカビーズのスラリーを含む一工程の方法に制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ＲＮＡ精製の分野を発展させるために、固相ＲＮＡ精製ストラテジーの必要性がある。また、単純かつ迅速なだけではなく、自動化を適応性最大限にする範囲において固相精製ストラテジーに適した、試薬および方法の必要性もある。室温（すなわち、２０〜２５℃）で安定であり、危険ではなく（すなわち、腐食性または有毒ではない）、混合の必要性を除く非粒子状である、およびＲＮＡの性質を保護する試薬の必要性がある。また、様々な生物出発材料を利用し、水和または乾燥に関わらず、臨床的実験室および研究室において見出されるように、特に慣用的単調試験に適用される場合に行われ得る、わずかな工程を有する方法の必要性がある。加えて、ＲＮＡ精製試薬は、粒子を混入または後続の分析（例えば、逆転写酵素反応、増幅反応、ヌクレアーゼ保護分析、ノーザンブロッティング、並びにマイクロアレイおよび他の標識反応）の緩衝化能力またはイオン状態を妨げることにより、その後のＲＮＡ分析手順を阻害するべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、液体の生物学的サンプルおよび乾燥した生物サンプルから、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを単離するための固体支持体を組み込む、試薬、方法、およびキットを提供する。精製ＲＮＡは、幅広く使用される分析法および診断法（例えば、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを必要とする、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ分析）における使用に適する。
【００１４】
本発明は、様々な生物物質から、危険物質（例えば、フェノール、およびクロロホルム）、または危険なカオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を使用せずに、ＲＮＡを精製するために使用され得る、独自の試薬の組み合わせを含む。さらに、本発明において教示される試薬および方法は、低塩試薬におけるＲＮＡの溶出を可能にし、従って、先行技術に見出される単調な脱塩工程を除去する。本発明により教示される試薬は、中性から高ｐＨの独自のＲＮＡ結合溶液、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液を含む。生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ溶解溶液にもなる界面活性剤を含む。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製するために、適した固体支持体との組み合わせにおいて使用された試薬は、実質的に純粋かつ混入を含まない。
【００１５】
本発明は、中性から高ｐＨの独自のＲＮＡ結合溶液の使用を教示する。このＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ複合塩、好ましくは緩衝液中にアルカリ金属塩が存在するので、核酸が優先的に最適な固体支持体と結合することを可能にする。一つの実施形態において、ＲＮＡ結合溶液は、例えば、界面活性剤のようなＲＮＡ結合溶液に細胞溶解能力を与える両親媒性試薬をさらに含む。このＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ溶解溶液としても言及され得る。ＲＮＡ溶解溶液は、核酸が他の混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）以上に最適な固体支持体に優先的に結合するように、溶解に続いて放出される核酸に独自の結合性質を与えながら、生物材料を溶解する。本発明のＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡ複合塩（例えば、緩衝液中のアルカリ金属塩）、および随意的な両親媒性試薬の存在により、危険なカオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を使用せずに、この優先的な結合を達成する。ＲＮＡ複合塩は、核酸（例えば、ＲＮＡ）の荷電したリン酸骨格と複合体化しているので、そのように呼ばれる。ＲＮＡ溶解溶液における、両親媒性試薬は、好ましくは生物材料の溶解を補助する界面活性剤である。すべての型の界面活性剤が、本発明を実行するために使用され得るが、非イオン性界面活性剤は、高濃度塩溶液により可溶性であるため、好ましい。
【００１６】
ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、緩衝化され、少なくとも約７（好ましくは、すくなくとも約８、より好ましくは、少なくとも約８．５、そして最も好ましくは、少なくとも約９）のｐＨを維持する。基本ｐＨまでの中和は、核酸、特にＲＮＡが固体支持体に結合する能力を高める。低ｐＨ試薬存在下の核酸の結合が著しく阻害されることも観察される。ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、所望のようにｐＨを調整する緩衝液を含む。緩衝液は、好ましくは、少なくとも約８のｐＫａを有する。好ましい緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）である。
【００１７】
適したＲＮＡ複合塩は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジウム塩）を含む。好ましいアルカリ金属塩は、リチウム塩である。本発明の実行に使用されるリチウム塩としては、塩化リチウム、および臭化リチウムが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡの固体支持体に対する優先的な結合は、高濃度のアルカリ金属塩により高められる。好ましくは、アルカリ金属塩は、４〜１０Ｍの間の濃度である。ＲＮＡ溶解溶液はさらに、両親媒性試薬を含む。一つの実施形態において、両親媒性試薬は、界面活性剤である。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、双性イオン性または非イオン性であり得るが、好ましくは非イオン性である。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ由来の界面活性剤およびＮｏｎｉｍｄｅｔ分類の界面活性剤が挙げられる。好ましくは、界面活性剤は約１０％の高濃度で存在する。アルカリ金属塩と界面活性剤の組み合わせはまた、各々中性から高ｐＨの緩衝液中において前述の高濃度で、一般に生物材料と結びつく酵素（例えばＲＮａｓｅ）の有害な影響を無効にするために役立つ。随意的に、ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液はまた、キレート剤を含み得る。
【００１８】
本発明はまた、不純物（例えば、タンパク質およびリン脂質）を固体支持体から除去すると同時に、一方で核酸が固体支持体に結合し続けることを可能にするＲＮＡ洗浄溶液の使用を組みこむ。ＲＮＡ洗浄溶液は、高濃度のアルコール、および６〜８Ｍの間の中性ｐＨで緩衝化された、適した塩を含み、混入物（例えば、タンパク質、脂質など）を除去する。
【００１９】
適した固体支持体と関連した、ＲＮＡ結合溶液（またはＲＮＡ溶解溶液）、およびＲＮＡ洗浄溶液の単純性および効率は、単純なＲＮＡ溶出溶液（例えば、ＲＮａｓｅフリー水、または代わりに固体支持体からＲＮＡを溶出する非イオン性界面活性剤を有するＲＮａｓｅフリー水）の使用という結果となる。従って、先行技術の高塩洗浄溶液において一般に直面するＲＮＡ脱塩問題は、回避される。
【００２０】
本発明はまた、生物学材料からのＲＮＡの単離の方法を教示する。生物材料としては、例えば、細胞またはウイルスの懸濁液、体液および老廃物、全血、骨髄、バフィーコート、血漿、培養細胞、全ての懸濁液（例えば、細菌、ホモジネートした組織）、粗製または部分精製した核酸の混合物、および環境サンプルが挙げられる。環境サンプルとしては、例えば、空気、水または土壌が挙げられる。
【００２１】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の万能性および有効性は、ＲＮＡ単離の２つの実行可能な代替法に役立つ。第１の方法において、生物材料を、固体支持体と接触させる前に、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液と接触させる。一つの実施形態において、生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液が優先的に使用される。この方法は、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを含む核酸を放出するために役立つ。第２の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に直接添加され、そして固体支持体に結合することを可能にし、それにより工程を削除し、そしてこの方法をさらに単純化する。この後者の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に直接適用され、そして次に生物材料と処理した固体支持体とを接触させる前に固体支持体上で乾燥させる。
【００２２】
適した固体支持体は、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。固体支持体は、容器に入れられ得、または固定され得、栓流（ｐｌｕｇ−ｆｌｏｗ）ＲＮＡ単離法または連続ＲＮＡ単離法を可能にする。代わりに、固体支持体の材料は、適した容器に固定され得るまたは入れられ得る遊離状態（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）の固体支持体（例えば、膜、ディスクまたはシリンダー）を作製するために、パックされ得る。一つの実施形態において、固体支持体は、繊維性または粒子であり、生物材料との最適な接触を可能にし得る。
【００２３】
本発明はまた、生物サンプルから実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを調製する指示手段および以下の１つまたは全てを含むＲＮＡ精製キットを提供する：ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液で処理していないかまたは処理した、いずれかの固体支持体、ＲＮＡ洗浄溶液、ＲＮＡ溶出溶液または、これらの任意の組み合わせ。加えて、キットは、固体支持体を収容するための容器、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを収容するための容器、およびそれらの組み合わせを含み得る。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、当業者に公知の後の分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、インビトロ翻訳、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ分析など）における使用に適したＲＮＡである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、生物サンプルからのＲＮＡ精製の試薬、方法、およびキットを提供する。そのような前記の生物サンプルとしては、代表的に水性混合物の状態にあるかまたは乾燥した状態にある生物材料が挙げられ、この生物材料は、原核細胞または真核細胞の複雑な生物混合物を含む、ＲＮＡを含有する。好ましくは、本発明の方法およびキットは、幅広い範囲のＲＮＡを単離する。候補ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡ、またはそれらの組み合せが挙げられるが、これらに限定されない。これら全ては、広い分子量範囲にわたって回収され得る。代表的に、生物材料はまた、ＤＮＡ、炭水化物、タンパク質。および脂質を含む。生物材料は、以下を含むが、これらに制限されない：体液（例えば、全血）、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液および脳脊髄液、口内塗抹標本、培養細胞、細菌の細胞懸濁液または組織ホモジネート、固形動物組織（例えば、心臓、肝臓および脳）、体内老廃物（例えば、糞および尿）、空気、水、堆積物または土から得られる環境サンプル、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原生動物、リケッチアおよび他の小さな微生物細胞。これらの生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分精製サンプルもまた、使用され得る。一つの実施形態において、生物材料は、核酸の粗製混合物または部分精製混合物を含む。
【００２５】
本発明の試薬、方法およびキットは、ゲノムＤＮＡまたは他の不純物が比較的ほとんど混入していない実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを提供し、その結果このようなＲＮＡは、後続のプロセス（例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ分析）において使用され得る。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、ゲノムＤＮＡ、炭水化物、タンパク質、脂質不純物が実質的にないことを意味し、その結果、このようなＲＮＡは、当業者に公知の後の分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析）において使用され得る。本明細書で使用される場合、「実質的に分解されていない」とは、非消化ＲＮＡまたはインタクトなＲＮＡを意味し、これらのＲＮＡは、標準技術を用いて、当業者によって、容易に測定され得る。つまり、ＲＮＡは、本発明の精製法の間、酵素的手段、物理的手段でまたは化学的手段で損傷を受けない。
【００２６】
本発明の試薬、方法およびキットは、幅広い範囲の生物源および生活型を超えて、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡの精製に使用され得る。これら全てのＲＮＡは、広い分子量範囲にわたって回収され得る。本発明を行って得られた実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、純度、収量、大きさ、逆転写酵素または他のハイブリダイゼーションプロセス、増幅、ハイブリダイゼーション能などについて評価され得る。実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、生物材料中に見出される総ＲＮＡの見本であり、そして代表的にｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡ組み合わせであるが、これらに制限されない。
【００２７】
生物サンプルとしては、例えば、細胞懸濁液またはウイルス懸濁液およびそれらのペレット、体液、および組織ホモジネートなどが挙げられる。生物サンプルが細胞またはウイルスからなる場合、細胞またはウイルスは、この工程の前に数えられ得る。計数は、標準的な細胞カウント方法（例えば、電子細胞カウンター（例えば、ＣＢＣ５ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）または視覚血球計算板（例えば、血球計、Ｂｒｉｇｈｔ Ｌｉｎｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｐｔｉｃａｌ、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ））を用いて行われ得る。
【００２８】
（１．試薬：）本発明は、３つのカテゴリーの試薬を含む。これらは各々、ＲＮＡ結合溶液（加えて両親媒性の試薬を含む場合、代替的にＲＮＡ溶解溶液とも言われる）、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液である。
【００２９】
（（ｉ）ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液：）ＲＮＡ結合溶液は、核酸が優先的に最適な固体支持体に結合することを可能にする。ＲＮＡ溶解溶液は、生物サンプルの有効な溶解を可能にし、核酸を放出し、そして核酸が優先的に最適な固体支持体に結合することを可能にする。ＲＮＡ結合溶液は、以下の成分を含む：緩衝液；アルカリ金属塩；および随意的にキレート剤。ＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡ結合溶液と同じ成分を含むが、加えて両親溶媒試薬（例えば、界面活性剤）を含む。ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、添加される強カオトロピック物質（例えば、グアニジニウム塩、尿素など）を必要としないという点で独特である。グアニジニウム塩および尿素は、強カオトロピック塩であり、水の構造を壊し、従って、他の溶質分子への強烈な効果を生じる疎水的相互作用の強度を減少させる傾向がある。例えば、尿素は、水に溶解した場合、タンパク質の２次構造、３次構造、および４次構造を破壊し、続いてＲＮＡからタンパク質の解離を引き起こす。グアニジニウム塩および尿素は、吸熱反応を介して水に溶解する。グアニジニウム塩および尿素の両方は、ホフマイスター順列により定義されたように強カオトロピック塩であると見なされる。ここでホフマイスター順列とは、相対的なカオトロピック強度に従ってカチオンおよびアニオンを並べる、広く使用されている系である（Ｆ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｏｎ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｔｓ，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４（１８８８）２４７〜２６０）。
【００３０】
相対的に、リチウムカチオン（Ｌｉ＋）も塩化物アニオン（Ｃｌ−）も、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ順列において強カオトロピックではない。このスキーム下で、例えば、塩化物アニオンは、一般的にコスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）と見なされ、そしてリチウムカチオンは、ナトリウムカチオンと同様の溶媒効果を示す；従って、ＬｉＣｌは、強カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）ではなく、そしてコスモトロープと見なされる。高濃度リチウム塩（例えば、ＬｉＣｌ）は、グアニジニウム塩酸塩または尿素での、ＲＮａｓｅ Ａ中の３つのトリプトファニル基全てと比べると、ＲＮａｓｅ Ａ中の３つのトリプトファニル基のうち１つだけを露出する（Ａｈｍａｄ Ｆ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８３ Ｓｅｐ ２５；２５８（１８）：１１１４３〜６，Ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｒｅａ，ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ａｎｄ Ｌｉｔｈｉｕｍ Ｓａｌｔ．）。これらの結果は、ＬｉＣｌが、２次構造、３次構造、または４次構造への全体的な影響なしに、タンパク質構造内の局所的撹乱のみを誘導することを示している。従って、ＬｉＣｌは、タンパク質変性についての広範囲の有用性を有するカオトロープではない。対照的に、グアニジニウム塩は、実質的に全てのタンパク質の変性において有効的である。その上、強カカオトロピック塩とは異なり、水中でのリチウム塩（例えば、塩化リチウム）の反応は、発熱反応である。例えば上記のような相違は、強カオトロピック物質（例えば、グアニジニウム）と本発明のアルカリ金属塩との間の相違を示し、そしてＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液の他の構成成分とこれらの相互作用に影響し、そして結果的に固体支持体に対するＲＮＡの結合に影響する。
【００３１】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の第１の構成成分は、前記の溶液のｐＨを少なくとも約７、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは約８．５、そして最も好ましくは約９に保つ緩衝液である。緩衝液は、好ましくは少なくとも約８のｐＨを有し、そして好ましくは１０〜１００ｍＭの濃度で使用される。好ましい緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液である。随意的に、塩基は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液のｐＨを調整するために使用され得る。好ましくは、この塩基は、前記の溶液のｐＨを少なくとも７まで上げ得る塩基である。塩基は、好ましくはアルカリ金属水酸化物である。そのようなアルカリ金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および水酸化リチウムが挙げられる。中性から高ｐＨのＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、核酸、特にＲＮＡの固体支持体に結合する能力を高める。
【００３２】
ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の第２の構成成分は、核酸（例えば、ＲＮＡ）に対する独自の結合特性を与えるＲＮＡ複合塩であり、その結果このような核酸は、他の混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）よりも固体支持体に優先的に結合し得る。好ましくは、このようなＲＮＡ複合塩は、アルカリ金属塩である。適した塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、およびリチウム塩が挙げられる。好ましくは、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化リチウムである。最も好ましくは、塩は塩化リチウムである。好ましくは、塩は４〜１０Ｍの間の高塩濃度で存在する。
【００３３】
ＲＮＡ溶解溶液は、加えて両親媒性試薬を含む。この試薬は、疎水性官能基（例えば、炭化水素鎖）に結合された親水基を有し、そして界面活性剤特性を有する化合物または分子から成る。一つの実施形態において、両親媒性試薬は、界面活性剤である。アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、および双性イオン性界面活性剤が全て使用され得るが、ＲＮＡ単離は、非イオン性界面活性剤の使用により最適に達成される。非イオン性界面活性剤は、極性基を欠き、そして全ての界面活性剤のうち最も穏やかである。いくつかの非イオン性界面活性剤が使用され得るが、非イオン性界面活性剤は、好ましくはＴｗｅｅｎ分類（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−８０、など）、Ｔｒｉｔｏｎ分類（Ｘ−１００、Ｘ−１１４、ＸＬ−８０Ｎ、など）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌｓ（ＸＤ、ＴＭＮ−６、など）およびＮｏｎｉｏｄｅｔｓ（ＮＰ−１０、ＮＰ−４０、など）由来のものである。好ましくは、非イオン性界面活性剤は、２〜２０％の濃度で、より好ましくは約１０％で使用される。非イオン性界面活性剤の組み合わせもまた、使用され得る。例えば、ＴｗｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎは、様々な割合（例えば、１：１の割合）で使用され得る。
【００３４】
ＲＮＡの分解を妨げるため、ＲＮａｓｅを含まない水が、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液において使用される。随意的に、キレート剤もまたどちらかの溶液において使用され、混入ＤＮＡの分解を妨げる。キレート剤の使用は、さらなる混入問題を引き起こし得る、ＤＮＡポリメラーゼの小さい断片への分解を妨げる。好ましくは、キレート剤は１〜１００ｍＭの濃度で存在し；より好ましくは、キレート剤は１〜１０ｍＭの濃度で存在する。好ましくは、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＣＤＴＡである。
【００３５】
ＲＮＡ結合溶液およびＲＮＡ溶解溶液は、先行技術に使用された試薬に対して重要な利点を有する。ＲＮＡ溶解溶液の場合、各々前述の高濃度で、中性から高ｐＨの緩衝液において、ＲＮＡ複合塩、および本発明により教示されるような界面活性剤の独自の組み合わせは、フェノール、クロロホルム、およびグアニジニウム塩のような試薬の使用なしに、ＲＮＡに有害な酵素（例えば、ＲＮａｓｅ）の不活化を促進する。加えて、ＲＮＡ結合溶液とＲＮＡ溶解溶液の両方は、核酸に、最適な固体支持体ときつく結合するように、高い結合特性を与える。
【００３６】
（（ｉｉ）ＲＮＡ洗浄溶液：）本発明はまた、低い塩濃度を有するＲＮＡ洗浄溶液を教示する。ＲＮＡ洗浄溶液は、非核酸混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）を除去するために、核酸が結合した固体支持体の洗浄に使用される。ＲＮＡ洗浄溶液は、好ましくは５０％を越える濃度のアルコール、緩衝液および低濃度の塩を含む。随意的に、ＲＮＡ洗浄溶液は、キレート剤を含む。本発明の目的において、低塩濃度は、後続の処理方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）の阻害を妨げるために後続の脱塩工程が不必要とされる塩濃度を意味する。好ましいＲＮＡ洗浄溶液は、Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）である。
【００３７】
（（ｉｉｉ）ＲＮＡ溶出溶液：）固体支持体に結合したＲＮＡがｎ ＲＮＡ溶出溶液を用いて優先的に溶出され得ると同時に、固体支持体に結合した混入ＤＮＡが残される。生物材料の溶解およびＲＮＡの固体支持体への結合において使用された試薬、および本発明で教示された固体支持体の洗浄において使用された試薬の単純性は、簡単なＲＮＡ溶出溶液に適する。一つの実施形態において、ＲＮａｓｅを含まない水、好ましくはＲＮａｓｅを不活化する物質（例えば、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ））で処理したＲＮａｓｅを含まない水が使用され得る。当業者に公知の他のＲＮＡ溶出溶液もまた使用され得る。好ましいＲＮＡ溶出溶液は、Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５ Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）である。
【００３８】
（２．固体支持体：）様々な固体支持体が、本発明において使用され得る。これらとしては、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびそれらの組み合わせから作製される固体支持体が挙げられる。本発明の試薬との使用に適した固体支持体の大きさは、生物材料の量に従って変化し得る。例えば、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ ９０３ペーパー（厚さ０．５ｍｍを有し、固体支持体に使用される）の場合、直径３ｍｍのディスクは、約３μｌの生物材料を保持するが、直径８ｍｍのディスクは、約２５μｌの生物材料を保持する。生物材料の量が増加するにつれて、固体支持体の厚みおよび／または直径が合わせて増加し得る。
【００３９】
好ましくは、固体支持体は、前述のＲＮＡ溶解溶液の存在下で、他の生物材料混入物よりも固体支持体に対する核酸の優先的な結合を可能にする材料である。好ましくは、そのような固体支持体は、接着ポリエステル繊維（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３）から成る。一つの実施形態において、ポリエステル繊維は、代替の容器構造中に収容される、または代替の構造中で形成されるために、断片化され、小さな粒子を作る。一つの構造は、非依存性遊離状態の固体支持体であり得る。
【００４０】
本発明の試薬との使用に適した固体支持体の形は、例えば、シート、プレカットディスク、円筒、単繊維、粒子から成る固体支持体であり得る。固体支持体の材料は、適した容器に固定化され得、または入れられ得る、遊離状態固体支持体（例えば、メンブレン、ディスク、またはシリンダー）を作るため、パックされ得る。必要な場合、固体支持体は、適切な容器（例えば、ペーパー型（例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ ｃａｒｄ）、ミクロ遠心チューブ、スピンチューブ、９６ウェルプレート、チャンバー、またはカートリッジ）に含まれる。固体支持体は、繊維を含む場合、繊維を適切にパックし、最適な核酸結合および混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）の洗浄を可能にするために、適切な容器に入れられ得る。
【００４１】
一つの実施形態において、固体支持体は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液で前処理され、ＲＮＡ単離の多くの工程を減らし得る。生物材料が細胞材料またはウイルス材料を含む場合、一つの工程で生物材料を溶解しそして核酸を結合するために、ＲＮＡ溶解溶液が使用される。好ましくは、固体支持体を処理するために使用される、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積の１０分の１である。さらに好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積の２分の１であり、そして最も好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の量は、少なくとも固体支持体の総体積と一致する。固体支持体の総体積とは、固体支持体の外部境界により規定した量を言う。外部境界は、固体支持体を含む容器の形および／または内部境界により決定され得る。ＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体の間隙空間内に捕捉される、または固体支持体の材料（例えば、繊維、ビーズなど）上に沈着されることにより、共有結合的に、非共有結合的に結合され得る。好ましくは、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体上で乾燥することを可能にされる。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体の作製に使用された材料（例えば、繊維など）に直接添加され得、そして好ましくは、最終使用者準備形態（ｆｉｎａｌ ｕｓｅｒ−ｒｅａｄｙ ｆｏｒｍ）（例えば、ペーパー、塗抹標本、ディスク、プラグ、カラムなど）にされる前に乾燥することを可能にされ得る。
【００４３】
本発明がより良く理解されるために、固体支持体を含む容器の特定の実施形態が今からより詳細に説明される。
【００４４】
本発明の一つの好ましい実施形態において、容器は、上端に１つ以上の注入ポートまたは貫通可能な隔壁を備えたカートリッジである。注入ポートは、サンプルまたは試薬を含む容器上方に、コネクター（例えば、メス型Ｌｕｅｒ−Ｌｏｃｋ）によって接続される。１つの注入ポート（サンプルポート）は、固体支持体に対する生物サンプルの適用のために使用される。サンプルポートに関する任意の特徴は、サンプルポートを通してサンプルが移された後にサンプルポートを密封する自己密封機構である。第２の注入ポートは、試薬ポートとして機能する。両方の注入ポートに関する任意の特徴は、保護性の簡単に壊れる封（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｂｒｅａｋａｗａｙ ｓｅａｌ）である。さらに、注入ポート、簡単に壊れる封、および分散器は、任意のねじふた中に内蔵され得る。固体支持体の底には、細胞破片、タンパク質、および脂質分子の分散および通過に適した孔径を有する任意の分散器がある。分散器は、カートリッジの断面を横切る生物材料の均一な横断を可能にし、そして固体支持体の上または下どこにおいても、生物材料の不均等な蓄積を妨げる。カートリッジの排出口は、テーパーバレル上にきちんと適合する保護蓋を備える。精製したＲＮＡは、容易かつ混入を含まない保存のため、スナップ蓋を有する円錐管から成る回収チューブ中に集められる。容器全体は、処理されるサンプルの大きさおよび次の分析に必要とされる産物量に応じた大きさに調整され得る。例えば、２５．２ｍｍの寸法周径）、３〜１０ｍｍの長さを有する、Ｆｉｌｔｒｏｎａｔ（商標登録）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３）フィルターによって作られた好ましい固体支持体は、適したチューブに入れられており、サイズにおいて調整されるか、およびより大きなサンプルを処理するためにより大きなチューブに入れられるのどちらかであり得る。代替的に、そのようなフィルターは、変化するサンプル量に適応し、および類似の結果を達成するために、チューブ内でお互いの上または下に積み重ねられ得る。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態において、容器は、挿入物を保持するために設計されたスピンチューブからなり、その挿入物の中に固体支持体がパックされる。固体支持体は、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびこれらの組み合わせであり得る。挿入物は、挿入物をスピンチューブに保持するフランジ（ｆｌａｎｇｅｄ）先端および液体を通すが、固体支持体を支持することを可能にする穿孔底から成る。スピンチューブにつながれた蓋は、挿入物を覆うために使用され得る。溶液（例えば、非核酸混入物を含むＲＮＡ溶出溶液、ＲＮＡ洗浄溶液、またはＲＮＡを含むＲＮＡ溶出溶液）は、穿孔底を通過し、そして前述の溶液を排出する遠心力によりスピンチューブの底に回収される。
【００４６】
さらに別の実施形態において、容器は複数ウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレート）であり得、そこで固体支持体は各ウェルにパックされる。各ウェルの底は、出口ポートを有し、そこを混入物または精製ＲＮＡを含む溶液が通過し得る。
【００４７】
最適な固体支持体と独自の試薬（ＲＮＡ結合溶液（またはＲＮＡ溶解溶液）、ＲＮＡ洗浄溶液、およびＲＮＡ溶出溶液）の独自の組み合わせは、実質的に純粋かつ、分解されていないＲＮＡの単離を生じる。上記のようなＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液の特性は、固体支持体に対する核酸の優先的な結合を可能にするが、一方ＲＮＡ溶出溶液は、固体支持体からのＤＮＡの溶出よりも、ＲＮＡの優先的な溶出を可能にする。
【００４８】
（３．方法：）本発明はまた、生物材料からＲＮＡを精製する方法を提供する。本発明で教示される試薬および固体支持体は、２つの代替の単離方法に役立つ。第１の方法において、生物材料は、固体支持体と接触させられる前に、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液と接触させられる。生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液は、生物材料を溶解するために使用され、そして固体支持体に添加する前にＲＮＡが放出される。加えて、ＲＮＡ溶解溶液は、有害な酵素（例えば、ＲＮａｓｅ）の有害な影響を妨げる。ＲＮＡ溶解溶液は、ペレットにおいて培養細胞または白血球細胞を溶解するために、または培養プレート（例えば、標準９６ウェルプレート）に接着している細胞、または培養プレート内で回収された細胞を溶解するために、うまく使用され得る。生物材料が組織塊または小さな粒子を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液は、その効果的な溶解能力のために、このような組織塊を粉砕してスラリーにするために効果的に使用され得る。ＲＮＡ溶解溶液量は、細胞の数または組織の大きさに応じてスケールアップまたはスケールダウンされ得る。一度生物材料が溶解されると、溶解液は直接固体支持体に添加され、少なくとも１分間インキュベートされ、固体支持体に対する核酸の結合を可能にし得る。好ましくは、溶解液は、５分間インキュベートすることを可能にされる。別の実施形態において、生物材料が核酸の粗製混合物または部分精製混合物からなる場合、本発明のＲＮＡ溶解溶液は、ＲＮＡからタンパク質を解離するために使用され得る。
【００４９】
第２の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、直接固体支持体に添加され得、それにより工程を除去し得、そしてさらに方法を単純化し得る。この後者の方法において、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、固体支持体に適用され得、次いで処理した固体支持体と生物材料を接触させる前に、固体支持体上で乾燥され得る。例えば、一つの実施形態において、適切な量のＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液は、Ｓｐｉｎ−Ｘ ｂａｓｋｅｔに配置された固体支持体に直接添加される。ここで、Ｓｐｉｎ−Ｘ ｂａｓｋｅｔは、さらに２ｍｌスピンチューブに配置されている。いくらか過剰の結合していないＲＮＡ溶解溶液またはＲＮＡ結合溶液が除去された後、固体支持体は、乾燥まで少なくとも１２時間、４０〜８０℃の間で加熱され、そして次に乾燥（ｄｅｓｓｉｃａｔｉｏｎ）下で保存される。生物材料は、ＲＮＡ結合溶液またはＲＮＡ溶解溶液を前処理した固体支持体に直接添加され得、そして生物材料がうまく溶解し、核酸が放出され、そして固体支持体に結合するまで、少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間インキュベートすることを可能にし得る。
【００５０】
生物材料が、細胞材料またはウイルス材料を含む場合、ＲＮＡ溶解溶液との直接接触、またはＲＮＡ溶解溶液で前処理した固体支持体との接触は、細胞膜および核膜、またはウイルス外被を可溶化および／または破裂し、それにより核酸並びに他の混入物質（例えば、タンパク質、リン脂質など）を放出する。放出された核酸は、ＲＮＡ複合塩の存在下で、固体支持体と選択的に結合する。
【００５１】
このインキュベーション終了後、適した方法（例えば、遠心分離、ピペッティング、加圧、減圧）により、または核酸が固体支持体に結合したままにされるような、ＲＮＡ洗浄溶液と前述の方法の組み合わせにより、生物材料の残留物は、随意的に除去される。好ましくは、非核酸生物材料（タンパク質、リン脂質などが挙げられる）の残留物は、遠心分離によって、溶解液中の非結合混入物が固体支持体から分離されるように、最初に除去される。この後に、適量の適切なＲＮＡ洗浄溶液を使用する、１つ以上の洗浄工程が続く。各洗浄工程の後に、遠心分離工程が続く。好ましくは、洗浄工程の数は少なくとも２回、より好ましい洗浄工程の数は、少なくとも３回である。複数の洗浄工程は、固体支持体から実質的に全ての混合物を除去し、そして固体支持体に優先的に結合した核酸を残す。
【００５２】
その後、結合したＲＮＡは、適量の当業者に公知のＲＮＡ溶出溶液を使用して優先的に溶出し、固体支持体に結合した混入ＤＮＡは残される。好ましくは、次に固体支持体は遠心分離されるか、または加圧もしくは減圧に供され、固体支持体からＲＮＡを放出し、そしてＲＮＡは適切な容器に回収される。
【００５３】
本発明の別の局面の場合、特定のプロトコールを含むキットが提供され、このプロトコールは、本明細書中に記述されるような試薬および随意的に固体支持体と組み合わせることで、本発明の方法に従った、生物材料からのＲＮＡ精製に使用され得る。このキットは、説明手段も含む。
【００５４】
本発明は、以下の詳細な実施例への言及によりさらに説明される。これらの実施例は、様々な特定のかつ例示的な実施形態および技術をさらに説明するために提供される。しかしながら、本発明の範囲内でありながら、多くの変化および改変が成され得ると理解され得る。
【００５５】
以下に言及される全ての未加工の材料は、商業源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より容易に入手可能である。全ての割合は、特に規定されなければ、試薬の総量に基づいた容量／容量である。
【実施例】
【００５６】
（実施例１．ヒト培養細胞からのＲＮＡの単離）
培養Ｋ５６２細胞（ヒトリンパ芽球腫細胞株）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より得、ＡＴＣＣ推薦の培地を用いて培養した。細胞を、血球計を用いて数え、そして２００万個の細胞を含むサンプル量を１．７ｍｌミクロ遠心チューブに分配した。細胞をペレットにし、そして２０秒間、１２０００ｇで遠心分離し、上清を除去した。次いで、これらの細胞ペレットを、使用するまで−８０℃で凍結した。
【００５７】
培養細胞を、氷上で解凍し、そして２００μｌ ＲＮＡ溶解溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．８中の５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、７．２Ｍ 塩化リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、上下に穏やかにピペッティングして十分に細胞を溶解することにより、細胞からＲＮＡを精製した。次いで、生じた溶解液を、２ｍｌミクロ遠心チューブ（Ｓｐｉｎ−Ｘ，カタログＮｏ．９４２４，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の挿入部分中に配置された、８ｍｍ直径および５ｍｍ長に近い大きさの固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｒ−２０６５３，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加した。溶解液を固体支持体と共に５分間インキュベートし、溶解された細胞から放出された核酸が固体支持体に優先的に付着できるようにした。固体支持体および生物材料を含むミクロ遠心チューブを、１０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離し、混入物（例えば、タンパク質、リン脂質など）を含む過剰溶解溶液を回収し、固体支持体に付着した核酸を残した。続いて、容量２００μｌＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を固体支持体に添加し、１０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離した。次いで、固体支持体を含む挿入物を、２番目の２ｍｌ廃棄物収集チューブに移した。この洗浄工程は、全部で３回の連続した洗浄工程を繰り返した。しかしながら、３番目の洗浄の後に１０秒の代わりに２０秒間の遠心分離を行った。
【００５８】
次いで、固体支持体を含む挿入物を、きれいな２ｍｌ回収チューブに移した。固体支持体からＲＮＡを放出するため、容量１００μｌのＲＮＡ溶出溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を加え、そして室温で５分間インキュベートすることを可能にした。回収チューブを、６０秒間、１２，０００×ｇで遠心分離し、２ｍｌ回収チューブに精製ＲＮＡを回収した。次いで、精製ＲＮＡを使用の準備ができるまで氷上に保存した。すぐに使用されないサンプルは、−７０℃〜−８０℃で適切に保存された。
【００５９】
（実施例２．ＲＮＡ精製の界面活性剤の評価）
異なる界面活性剤を、７．２Ｍ ＬｉＣＩを含む緩衝化溶液に添加し、ＲＮＡ産出量の最適化に必要とされる界面活性剤の最も良い型を決定する能力を評価した。以下の界面活性剤を試験した：１％アンモニウムラウリルスルフェート、１％ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００。界面活性剤を４５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．８を含む緩衝液に添加した。２００μｌ量の各混合物を固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ＃．Ｒ−２０６１９，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加し、そして１９時間、６０℃で乾燥した。２００万個のＫ−５６２細胞を、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、そして固体支持体上でピペッティングした。固体支持体を、２００μｌのＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ洗浄溶液（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））で３回洗浄することにより、ＲＮＡを精製し、そして１００μｌのＲＮＡ溶出溶液で溶出した。この場合、ＲＮａｓｅを含まない水をＲＮＡ溶出溶液として使用した。ＲＮＡの産出を測定するため、各サンプルの１：２０希釈を脱イオン水中で調製した。また、緩衝化溶液（例えば、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を希釈液として使用した。ＲＮＡ溶出溶液を含むブランクに対して標準化したＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて、３２０ｎｍ（バックグラウンド）、２６０ｎｍ、および２８０ｎｍでの吸光度を読んだ。ＲＮＡ濃度を以下のように計算した：（Ａ２６０−Ａ３２０）×４０μｇ／ｍｌ（ＲＮＡ吸光係数）×５０（希釈係数）；産生したＲＮＡを、ＲＮＡ濃度と回収した溶出量を掛け合せることで計算した。推定ＲＮＡ純度は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度比率、Ａ２６０／Ａ２８０である。この比率の値が、１．８および２．１の間の場合、サンプルは比較的タンパク質および他の混入物を含まないと見なされる。この比率は、以下のように計算される：（Ａ２６０−Ａ３２０）／（Ａ２８０−Ａ３２０）。半定量的評価および定量的評価の両方を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて行った。ＲＮＡの量をエチジウムブロマイド染色の強度を調べることで、推定した。ＲＮＡの品質を、１８ｓバンドの強度の約２倍である２８ｓ断片を有するリボソームバンドの存在により、評価した。品質のさらなる指標は、ＲＮＡのバンドよりも非常に高い分子量として存在するゲノムＤＮＡの減少または欠如であった。
【００６０】
従って、各ＲＮＡサンプルの５μｌ量サンプルを１０×追跡用色素と混合し、そして２％アガロースゲルにロードした。ＲＮＡは、１００ボルトで３０分間、ゲルおよび泳動緩衝液の両方において、０．１２５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドとの電気泳動により大きさを分離して、可視化を可能にした。電気泳動の後、蛍光ＲＮＡバンドをＫｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＥＤＡＳ １２０ ＬＥ（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を有するトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）上で可視化した。
【００６１】
界面活性剤の３つ全ての型が、ＲＮＡ精製におけるＲＮＡ溶解溶液中の添加剤として有効であり、４．９μｇ〜６．２μｇの間のＲＮＡ収量をもたらす。これは、アガロースゲル電気泳動後のＲＮＡ染色の相対的な同等性により確かめられた。ＲＮＡの品質を、１．８より大きいＡ２６０／Ａ２８０比率およびアガロースゲル電気泳動後の２８ｓおよび１８ｓ ｒＲＮＡバンドの「２：１」比率の存在で、さらに評価した。各サンプルのわずかな高分子量バンドのみの存在は、ゲノムＤＮＡ混入の実質的な除去を示した。ＤＮＡ混入は、５μｌサンプル中、予想６００ｎｇＤＮＡのうち１０ｎｇ未満、または２％未満であると推定された。
【００６２】
いくつかの界面活性剤およびそれらの組み合わせが水溶液中で沈殿しないこともまた決定された。例えば、いくつかの非イオン性界面活性剤およびそれらの組み合わせは、安定した懸濁液を形成し、そしてより使用しやすい。
【００６３】
【表１−１】
【表１−２】
ＲＮＡ精製の再現性を、９６ウェルプレートを用いて試験した。ヒト細胞（Ｋ５６２、リンパ芽球腫細胞株）を細胞カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＣＢＣ−５，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて数え、そして５０ｍｌポリプロピレン遠心分離チューブに、２０００ｇで３分間の遠心分離によって回収された。細胞ペレットを、−８０℃で凍結し、実験のために解凍した。細胞を、実施例１に記載したＲＮＡ溶解溶液と、３×１０６細胞／ｍｌの濃度で、ＲＮＡ溶解溶液を添加することにより混合し、次いで上下に５回穏やかにピペッティングし、溶解液を生成した。溶解液（０．１５ｍｌ／ウェル）を、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，カタログ番号２０００１７）の９６ウェルフロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）プレート（ここにプロセシングプレートとして言われる）の各ウェルに等分した。ここで、各ウェルには、１５．３９ｍｍ周径および１５ｍｍ長の大きさのポリエステル固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｒ−２２６０７，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）が取りつけられた。遠心分離後の各試薬の添加に続き、プロセシングプレートをきれいで標準粘着性のプレートシールで覆い、混入を妨いだ。プレートをＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｗａｓｔｅプレート（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．２０００２８，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）上に置いた。溶解液は固体支持体とインキュベートされ、そして核酸を固体支持体上に５分間室温で結合させ、その後に、プレートを２０００×ｇで３分間遠心分離した（Ｍ４ Ｓｗｉｎｇ−Ｏｕｔ Ｒｏｔｏｒを備えたＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｍｏｄｅｌ Ｃ４１２，カタログ番号１１１７５３３８；Ｊｏｕａｎｎ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）。容量１５０μｌのＲＮＡ洗浄溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ２−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を各ウェルに添加し、そしてプレートを前記のようにさらに２回遠心分離した。３回目の洗浄後、廃棄プレートをＲＮａｓｅを含まない９６ウェル回収プレートに変えた。容量１００μｌのＲＮＡ溶出溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｐａｒｔ．Ｎｏ． Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をフィルターに添加し、そしてプレートを５分間室温でインキュベートした。次いで、ＲＮＡを２０００×ｇで５分間遠心分離により回収した。ＲＮＡ収量およびＲＮＡの品質を推定するため、吸光度（ＯＤ）を２６０ｎｍで９６ウェルＵＶプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ＵＶ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ，Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．１ソフトウェア，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって測定した。ＲＮＡ収量を実施例２に記載したように計算した。ＲＮＡ収量は、８．７９＋／−１．４９μｇ（１７％変動係数）であった。
【００６５】
本発明の試薬および方法を用いて精製したＲＮＡの、定量ＲＴ−ＰＣＲに対する適合性および９６反復単離からのＲＮＡ産出の再現性を判定するために、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を使用する５’ヌクレアーゼ（「Ｔａｑｍａｎ」）アッセイを用いて、ヒトβアクチンｍＲＮＡを増幅した。単一工程逆転写ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，カタログ番号Ｎ８０８−０２３６，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、２０μｌ反応液を使用して、３８４ウェルＯｐｔｉｃａｌ Ｐｌａｔｅｓ（カタログ番号．４３０９８４９，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）において行った。容量１５μｌの試薬混合物をプレートの各ウェルに添加し、次いで５μｌの精製ＲＮＡ（ＲＮａｓｅを含まない水で１：１００に希釈した）を添加した。反応プレートを、反応準備の間氷上に維持した。反応液は、１×ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、３．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、０．３ｍＭ ｄＣＴＰ、０．３ｍＭ ｄＧＴＰ、０．６ｍＭ ｄＵＴＰ、１×ヒトβ−アクチンプライマー／プローブミックス（ＶＩＣ）（カタログ番号４３１０８５５，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．２単位のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、および２単位のｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。プレートをＯｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｃｏｖｅｒ（カタログ番号４３１１９７１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で密封し、そして７９００ＨＴにおいて以下のように循環した：５０℃を２分間、６０℃を１５分間；９４℃を５秒間、そして６０℃を１分間を全部で５０サイクル。ヒトβアクチン配列を含むＲＮＡ転写物は、検量線として用いるために１回の反応につき１０１１から１０コピーへ希釈された。加熱サイクリングの間、７９００ＨＴ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔはＰＣＲのアニール／伸長期間の蛍光データ蓄積した。データ分析を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳバージョン２．０ａ２３，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。検量線は、１０００コピーと１０１０コピー（Ｒ２＞０．９９８）との間で線形であった。閾値サイクル（Ｃｔ）は、平均１８．８＋／−０．３９サイクル（変動係数＝２．１％、Ｎ＝９６）であった。サイクル閾値を、蛍光増幅産物が、バックグラウンドよりも有意に多くなるところでのサイクル数として定義した。計算されたコピー数は、１回の反応物につき平均４．６×１０８＋／−１．０×１０８コピー（変動係数＝２２％、Ｎ＝９６）であった。この実験は、９６ウェルプレート形式におけるβアクチン転写物検出の一貫性を証明した。
【００６６】
（実施例４．ＲＴ−ＰＣＲ分析における精製ＲＮＡの評価）
後続の分析における使用に対する精製ＲＮＡの適合性をさらに評価するため、ＲＴ−ＰＣＲ分析におけるＲＮＡの性能を評価した。実施例１の手順に従って精製した５μｌのＲＮＡ、１×ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｎ８０８−００１０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｉ−３０２１，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、９．３ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ−１０２８，Ｓｉｇｍａ）、１．２５ ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｔ，Ｐａｒｔ ｎｏ．７７１００，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、５ｍＭジチオスレイトール（Ｐａｒｔ ｎｏ．Ｄ−９７７９，Ｓｉｇｍａ）、２．５ｎｇランダムプライマー（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｃ１１８１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１６単位の組換えリボヌクレアーゼ阻害因子（ｒＲＮａｓｉｎ，ｐａｒｔ ｎｏ．Ｎ２５１５，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、および４０単位のＭＭＬＶ−ＲＴ（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ１７０５，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む１５μｌ反応溶液中で、ＲＮＡを逆転写した。反応液を２５℃で１０分間インキュベートし、ランダムプライマーのアニーリングを可能にし、４２℃で１５分間、次いで９９℃で５分間インキュベートし、逆転写酵素を不活化した。ＰＣＲミックスを添加し、そして９２℃を５秒間、６４℃を３０秒間、７２℃を１分間を５サイクルおよび９４℃を５秒間、６４℃を３０秒間、７２℃を１分間を２５サイクル、続いて７２℃を１５分間の最終伸長の増幅を行った。反応液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸塩、ｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ．によって合成された３００ｎＭ各プライマーＢＡ−Ｆ ５’−ＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣ；ＢＡ−Ｒ：５’−ＣＣＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣおよび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含んだ。これらのＰＣＲプライマーは、βアクチンｍＲＮＡ由来の１３４塩基対のアンプリコンを生成する。反応産物を、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル（１００Ｖ １ｈ）上の電気泳動により分析した。バンドをＵＶトランスイルミネーターにより可視化した。予想された大きさの産物を観察した。
【００６７】
ＲＮＡの品質をさらに評価するため、より大きなアンプリコンを他のプライマーセットを用いて単離したＲＮＡから直ちに増幅した。ＲＮＡが実質的に分解された場合、より大きなアンプリコンは標準電気泳動法を用いて検出できない。例えば、トリプトファンｔＲＮＡ合成酵素ｍＲＮＡ由来のＰＣＲプライマーのセット（各々Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより合成されたＦ：５’−ＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣ；Ｒ：５’−ＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣ）は、本発明により単離された１０サンプルの総ＲＮＡ由来４９２塩基対断片の増幅にうまく利用された。
【００６８】
（実施例５．ＲＮＡ溶解溶液のカオトロープ剤減少効果の使用
グアニジウム塩は、最も強力であると知られるＲＮａｓｅの失活剤の一つである。従って、強力なカオトロープ剤（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）およびグアニジニウム塩酸塩）が、塩化リチウムの代わりになり得るか、または本発明の方法における試薬を用いてＲＮＡ収量が増加し得るかのいずれかの場合を発見することが目的である。
【００６９】
３セットの実験を行った。実験条件は、以下である：（１）ＧＩＴＣで前処理した固体支持体；（２）ＧＩＴＣ中で前溶解され、次いで固体支持体に添加される細胞；および（３）実施例１のＲＮＡ溶出溶液へのカオトロープの添加。全ての実験において、実施例１の固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｒ−２０６５３，Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））を使用した。
【００７０】
第１の実験セットにおいて、ＲＮＡ溶解溶液またはＧＴＩＣ溶解溶液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、フィルター上でこの溶液の２００μｌをピペッティングし、次いで６８℃で１８時間乾燥することによって固体支持体をコーティングした。処理した固体支持体を、実施例２の方法に従って、Ｋ５６２細胞からＲＮＡを精製する能力を反復して試験した。精製したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動は、実施例２に記載されるように、ＧＩＴＣ溶解溶液（Ｂｕｆｆｅｒ ＲＬＴ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用するＲＮＡ収量は、フィルターに結合するために本発明のＲＮＡ溶解溶液を使用した場合に観察されたＲＮＡ収量の１０％に満たないことを示した。
【００７１】
第２の実験セットは、固体支持体へのＲＮＡの結合を促進するＧＩＴＣの能力を評価することを試みた。Ｋ５６２細胞を緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中に溶解し、次いで未処理のフィルターにかけた。緩衝液ＲＬＴの存在下での結合は、有意に低い収量（実施例１に記載されるようなＲＮＡ溶解溶液を使用したＲＮＡの５０％未満）を生じた。
【００７２】
最後に、カオトロピック塩を本発明のＲＮＡ溶解溶液に添加し、本発明の方法におけるＲＮＡ収量を向上させるカオトロピック塩の能力を評価した。４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、６Ｍグアニジニウム塩酸塩、または８．３Ｍ尿素を添加した、実施例１に記載される本発明のＲＮＡ溶解溶液を、実施例１に記載される方法に従ってＲＮＡを精製するために使用した。前述の各溶液のｐＨは、それぞれ８．８、８．８、および８．６であったことを決定した。尿素−ＬｉＣｌ溶解溶液を用いて得たＲＮＡ収量は、実施例１のＲＮＡ溶解溶液を使用したＲＮＡ収量の約３５％であった。グアニジニウム塩酸塩を使用して、さらに少ないＲＮＡを回収し、そしてグアニジニウムチオシアン酸塩をＲＮＡ溶解溶液に添加した場合、ゲル上でＲＮＡを認めなかった。これらの結果は、グアニジニウム塩が、リチウム塩の代わりになり得ず、リチウム塩の存在下でＲＮＡ結合の効果を増強し得ないことを実証する。従って、これらの実験は、塩化リチウム存在下における本発明の固体支持体へのＲＮＡ結合が、カオトロピック塩存在下における類似の固相への核酸の結合と明確に異なる機構により生じることを示す。
【００７３】
（実施例６．固体支持体を用いるＲＮＡ精製における低ｐＨの影響）
ＲＮａｓｅは、低ｐＨで迅速にかつ効果的に不活化される。それ故、本方法が低ｐＨ ＲＮＡ溶解溶液の使用により増強され得るか否かを決定することを目的とした。
【００７４】
従って、４５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８緩衝液を４５ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ４．６と換えたことを除いて、本発明の実施例２に従って、２つ（一つは低ｐＨ（ｐＨ４．６）で、そして２番目は高ｐＨ（ｐＨ８．８））のＲＮＡ溶解溶液を調製した。３００μｌ容量の各ＲＮＡ溶解溶液を、固体支持体（Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｌｏｔ ＃Ｒ２０６５３， Ｆｉｌｔｒｏｎａ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ））に添加し、そして実施例２に記載されるように乾燥した。実施例２によるＲＮＡ精製法の後に、回収したＲＮＡをＵＶ分光光度法により測定した。ｐＨ４．６ ＲＮＡ溶解溶液を用いて精製したＲＮＡの平均収量は、３．６０μｇ（４反復で、標準偏差は０．８６であった）である一方、ｐＨ８．８ ＲＮＡ溶解溶液を用いた平均収量は、１１．４０μｇ（４反復で、標準偏差は０．３２であった）であった。この結果は、溶解溶液のｐＨの低下が、生じるＲＮＡの収量および純度を有意に減少させたことを示した。
【００７５】
（実施例７．精製したＲＮＡサンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入の決定）
遺伝子発現および他の分析にとって、ＲＮＡ調製物は実質的にＤＮＡを含まず、一貫しかつ確実な結果を示すことが望ましい。ゲノムＤＮＡ混入は、多くの現在のＲＮＡ精製技術にともなう問題である。本発明の試薬および方法により精製された精製ＲＮＡのゲノムＤＮＡ含有量を評価することを目的とした。
【００７６】
２つの分析を用いて、ゲノムＤＮＡ含有量を評価した：リアルタイム定量ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動。第１の分析において、ＤＮＡ含有量は、実施例３に記載されるような９６ウェル形式で精製されたＲＮＡから推定した。精製ＲＮＡのゲノムＤＮＡ含有量を、Ｔａｑｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐアッセイを使用する定量アッセイにより推定した。Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐａｒｔ Ｎｏ．４３０４４３７，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＴａｑＭａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＦＡＭ）（ｐａｒｔ ｎｏ．４３１６８３１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、２０μｌ反応液中、以下のサイクル条件で、単一コピーのヒトＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を増幅した：５０℃を２分間、９５℃を１０分間、９５℃を１５秒間、および６０℃を１分間を合計５０サイクル。５ｐｇから５０ｎｇまで（検量線に対するＲ２＞０．９９８）の、ヒトゲノムＤＮＡ（カタログ番号．４３１６８３１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより提供された）の段階希釈は、１反応あたりのＤＮＡ（ｎｇ）の算出を可能にした。総核酸収量を、２６０ｎｍの吸光度（主にＲＮＡ含量を仮定する）で算出した。精製ＲＮＡサンプルの平均ゲノムＤＮＡ含量は、０．２２％＋／−０．０３（Ｓ．Ｄ．）（変動係数＝１４．７％、Ｎ＝９６）と概算された。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲを使用するさらなる実験において、実施例１に記載されたカラム法を用いる１２サンプルからＲＮＡを精製し、そして市販のキット（ＲＮＡｅａｓｙ，Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号．７４１０３（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて１２サンプルからＲＮＡを精製した。どちらの場合においても、ＤＮＡ（ｎｇ）におけるＲＮａｓｅ Ｐの値を、総核酸の割合（大部分をＲＮＡと仮定して、換算として４０μｌ／ｍｌを使用し、Ａ２６０−Ａ３２０から計算した）として表した。市販のキットは、本発明（平均＝０．６４３％＋／−０．２１％）より有意に多くの混入ＤＮＡ（平均＝７．９１％＋／−２．６８（Ｓ．Ｄ．））を有するＲＮＡを生成した。従って、本発明は、現存の技術より有意な改善を示す。
【００７８】
第２のアッセイにおいて、ゲノムＤＮＡを精製したＲＮＡのアガロースゲル電気泳動より推定した。多くの市販のキット（例えば、前述のキット）により精製したＲＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡは、２８ｓ ｒＲＮＡのバンドより移動が遅いバンドとしてはっきりと見える。本発明により精製したＲＮＡを観察した結果、前述のキットより有意に少ないゲノムＤＮＡを含んでいた。本発明の試薬および方法を用いて得られたいくつかのＲＮＡ調整物において、ゲノムＤＮＡのバンドは見られなかった。このデータは、本発明の試薬および方法が、いくつかの現在の市販のキットより有意に高い純度のＲＮＡを産生することを示す。
【００７９】
（実施例８．マイクロアレイ分析のための精製ＲＮＡの使用）
より高濃度のＲＮＡを生成するために２０μｌのＲＮＡ溶出溶液量を用いる実施例１に記載された手順に従う本発明の方法を用いて、１０００万個のＫ５６２細胞から総ＲＮＡを精製した。各色素にＲＮＡ２０μｇ量を用いるＣｙＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，カタログ番号．ＲＰＮ ６２０２）を用いて、ＲＮＡをＣｙ３−ｄＣＴＰおよびＣｙ５−ｄＣＴＰで蛍光標識した。製造業者により記載された方法に従って、蛍光標識されたｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＭＡＰＴＭ Ｈｕｍａｎ ３８４ｘ５ Ｔｅｓｔ Ｃｈｉｐ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，カタログ番号．Ｓ９７００１０２）とハイブリダイズさせた。１６時間のハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイをＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００マイクロアレイ分析システム（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，カタログ番号．，９００−３０１１５２３００１）を用いてスキャンした。生じたマイクロアレイ画像は、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長の両方で、非常に低いバックグラウンド蛍光を有する強いシグナルを実証した。バックグラウンドを推定するため、ＧｅｎｅＰｉ×ＴＭ Ｐｒｏ ３．０分析ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し、ノイズに対するシグナルの割合を測定した。その割合を１グリッドあたり１６スポットを含む２４グリッドについて計算し、ここで、各スポットを、すぐ周りの周辺領域と比べた。ネガティブスポットは、分析に含めなかった。ポジティブハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドより３倍大きいシグナルであると、製造業者により定義されている。本実施例において、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長の両方の、ノイズに対するシグナルの平均割合は、そのレベルが非常に高く（それぞれ７．０１５および１０．６７８）、そのことは、高品質ＲＮＡから非常に低いバックグラウンド蛍光を示した。
【００８０】
（実施例９．ｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いるＲＮＡ品質の評価）
本発明の試薬および方法を用いて精製したＲＮＡの品質を評価するため、ＲＮＡサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて分析した。このシステムを使用して、電気泳動図を作成し、そして２８ｓピーク域および１８ｓピーク域の間の割合を計算する主要なリボソームＲＮＡの大きさおよび品質を評価し得る。一般的に、１．５より大きな割合を有する、２つの分解性ピークは、ＲＮＡサンプルが分解されないことを示す。
【００８１】
実施例１に記載されたプロトコールに従って（ＲＮＡ溶解溶液量がそれぞれ５００、７５０および１０００μｌ、およびＲＮＡ溶出溶液が２０、６０、および１００μｌであることを除く）、合計５０×１０６個のＫ５６２細胞由来のＲＮＡを精製した。精製に続き、１μｌの各ＲＮＡサンプルを、製造業者により提供された試薬中で、製造業者の指示書に従って調製されたＲＮＡ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のウェルにロードした。電気泳動に続き、生じた電気泳動図を調べた。全てのサンプルは、２つの明瞭な２８ｓピークおよび１８ｓピークを示した。１８ｓに対する２８ｓの平均割合は、２．４６であり、全てのサンプルについては１．８９から３．５３の範囲であった。従って、その割合は全て１．５より大きく、そのことは本発明の方法が、実質的に分解されていないＲＮＡを生成したことを示した。
【００８２】
（実施例１０．ヒト血漿からのウイルスＲＮＡの精製）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染したヒト血漿よりＲＮＡを精製した。処理したフィルターおよび未処理のフィルター両方を実施例１および２それぞれに記載されるように使用した。処理したフィルター（Ｆｉｌｔｒｏｎａ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｒ−２０６５３））を、Ｓｐｉｎ−Ｘキャリアチューブ中の各フィルター上で０．２ｍｌのＲＮＡ溶解溶液をピペッティングすることにより調製し、次いで、実験室用オーブン中で６８℃で１２〜１８時間加熱した。血漿（０．２〜０．４ｍｌ）を処理したフィルターにアプライし、そしてＲＮＡを室温で５分間結合させた。フィルターを実施例１に記載されるように洗浄した。ＲＮＡを、１５０μｌ量のＲＮＡ溶出溶液（Ｇｅｎｔｒａ ＲＮＡ溶出溶液，Ｐａｒｔ．Ｎｏ．Ｓ３−００２５，Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）中で溶出した。
【００８３】
未処理の固体支持体を使用し、２００μｌのヒト血漿サンプルからＲＮＡを精製した。ＲＮＡ溶解溶液をヒト血漿と２：６の間の割合で混合し、そして全サンプルを、外因性核酸（Ｋ５６２細胞から得られた単離物あたり１０〜３０μｇのヒト総細胞ＲＮＡ）と共に固体支持体にアプライした。次いで、実施例１に記載された方法に従い、固体支持体を洗浄および溶出した。外因性キャリアＲＮＡの添加は、キャリアＲＮＡを使用しない状態より少なくとも５０％多く、収率を有意に改善させることが見出された。
【００８４】
ＨＣＶ ＲＮＡが精製されたか否かを決定するため、ＨＣＶ特異的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨＣＶの５’非翻訳（５’−ＵＴＲ）領域内の２４１塩基標的に特異的なプライマーを使用した。１０μｌのＲＮＡ、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（カタログ番号Ｎ８０８−００１０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、各１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｔ，カタログ番号７７１００，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、５ｍＭジチオスレイトール（カタログ番号Ｄ−９７７９，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、２．５ｎｇランダムプライマー（カタログ番号Ｃ１１８１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２０単位の組換えＲＮａｓｅインヒビター（ｒＲＮａｓｉｎ，カタログ番号Ｎ２５１５，Ｐｒｏｍｅｇａ）、および４０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ｐａｒｔ ｎｏ．Ｍ１７０５，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む３０μｌの反応溶液において、逆転写を行った。反応物を２５℃で１０分間インキュベートし、４２℃で１５分間ｃＤＮＡ合成のためにランダムプライマーのアニーリングをし、次いで９９℃で５分間、逆転写酵素を不活化した。５μｌｃＤＮＡ、１×Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号．４３０４４３７，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、４００ｎＭの前方向プライマー（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡにより合成された５’−ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡ）４００ｎＭの逆方向のプライマー（５’−ＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）、および２００ｎＭ ６ＦＡＭ−標識プローブ（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸにより合成された５’−ＴＡＭＲＡ−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ−６ＦＡＭ−３’）を含む５０μｌ反応液中で、ＰＣＲ増幅を行った。プレートをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で以下のとおりに加熱した：５０℃を２分間、９５℃を１０分間、９４℃を５秒間、および６０℃を１分間を５０サイクル。データをＰＣＲのアニール／伸長期間に収集し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＤＳ）バージョン２．０を用いて分析した。増幅を、処理済みおよび未処理のフィルター両方を用いる血漿ＲＮＡから精製されたＲＮＡを用いて観察した。
【００８５】
（実施例１１．全血からのＲＮＡの精製）
全血サンプルを、３人のドナーから１０ｍｌ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（登録商標）Ｂｒａｎｄ血液回収チューブ（ＥＤＴＡ Ｋ３ Ｎｏ．１６８５２，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中に回収し、そして使用まで４℃に保存した。白血球細胞数をＣＢＣ−７ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて校正したＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（登録商標）ＣＢＣ−５（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて測定した。２００μｌの容量を除去し、そして６００μｌ ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と、１．７ｍｌミクロ遠心チューブ中で混合した。混入赤血球細胞を溶解するため、３分間室温でインキュベーションした後、白血球細胞を１２，０００×ｇ、２０秒間の遠心分離によりペレットにした。溶解した赤血球を含む上清フラクションを除去し、そしてペレットを３００μｌＲＢＣ溶解溶液でリンスし、混入物をさらに除去した。白血球細胞をＲＮＡ溶解溶液に懸濁し、そしてＲＮＡを実施例１に従って精製した。βグロブリン転写を、製造業者の指示書に従って１工程逆転写ＰＣＲ増幅キット（ｒＴｔｈ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ カタログ番号ｎ８０８−００９８ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、増幅した。プライマー配列は、Ｆ５’ＴＡＧ ＣＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＣＴ−３’およびＲ５’ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＡＡ ＣＣＴ ＣＡＡ−３’であった。精製したＲＮＡを、６０℃３０分間、９４℃３分間、続いて３０サイクルの９４℃１分間、７０℃１分間、７２℃１分間のサイクル条件を用いて増幅し、次いで７２℃で７分間インキュベートすることにより完了した。本発明を用いて単離されたＲＮＡが、十分に純粋で、ｃＤＮＡに逆転写され、次いで増幅されるか否かを決定するため、５０μｌ増幅反応溶液のうち５μｌを６０分間、８０ボルトでの２％アガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル画像は、各複製物に対して、そして各３つのＲＮＡドナーサンプルに対して予測された大きさの１９４塩基対で強いバンドを示し、このことは、実質的に純粋な出発ＲＮＡテンプレート物質を示した。さらに、混入ゲノムＤＮＡからの増幅は、約１０００塩基対の断片を生成する。この大きさの増幅産物がゲル上に認められなかったため、精製したＲＮＡ中に実質的なゲノムＤＮＡ混入はなかった。
Claims (45)
- ＲＮＡを含む生物材料より、実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ） 該生物材料を約７より大きいｐＨで緩衝化されたＲＮＡ結合溶液と混合し、該ＲＮＡ結合溶液はＲＮＡ複合塩を含み、ここで該ＲＮＡ結合溶液は、該ＲＮＡ結合溶液中で該生物材料の混合物を形成するための強カオトロピック物質を含まない、工程；
（ｂ） 該混合物を非シリカ固体支持体と接触させる工程であって、その結果、該混合物中の実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸が、優先的に該固体支持体と結合する、工程；
（ｃ） 該固体支持体をＲＮＡ洗浄溶液で洗浄し、結合した、実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸以外の生物材料を除去する、工程；および
（ｄ） 実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを得るために、ＲＮＡ溶出溶液を用いて、該固体支持体から、結合した実質的に分解されていないＲＮＡを優先的に溶出する工程、
を含む、方法。 - 前記生物材料が、核酸の粗製混合物および部分精製された混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物材料が、真核細胞、原核細胞、微生物細胞、細菌細胞、植物細胞、マイコプラズマ、原生動物、細菌、真菌、ウイルス、酵母、リケッチアおよびそれらのホモジネートからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物材料が、全血、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液、脳脊髄液、および固形動物組織からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物材料が、糞、尿、涙、および汗からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記生物材料が、空気、水、堆積物および土壌から得られる環境サンプルからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体が、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体が、ポリエステルを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体が、ポリエステルの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体が、容器中に含まれ、該容器は、遠心チューブ、スピンチューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、複数ウェルプレート、試験管、およびそれらの組み合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記強カオトロピック物質が、グアニジニウム塩および尿素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡおよびウイルスＲＮＡ、並びにそれらの組み合せからなる群より選択される総ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ複合塩が、アルカリ金属塩である、前記請求項１に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジウム塩からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩が、リチウム塩である、請求項１３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩が、塩化リチウムである、請求項１３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩が、約４Ｍより高い濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩が、４〜１０Ｍの間の濃度で存在する、請求項１３に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ結合溶液は、必要に応じてキレート剤を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記キレート剤は、ＥＤＴＡおよびＣＤＴＡからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
- ＲＮＡを含む生物材料から実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ） 該生物材料を約７より大きいｐＨで緩衝化されたＲＮＡ溶解溶液と混合し、該ＲＮＡ溶解溶液は両親媒性試薬、およびＲＮＡ複合塩を含み、ここで該ＲＮＡ溶解溶液は、強カオトロピック物質を含まない、工程；
（ｂ） 該生物材料を該ＲＮＡ溶解溶液で溶解し、実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸および非核酸生物物質を含む溶解液を形成する、工程；
（ｃ） 該溶解液を固定化した非シリカ固体支持体に接触させる工程であって、その結果、該溶解液中の実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸が、該固体支持体と優先的に結合する、工程；
（ｄ） ＲＮＡ洗浄溶液で該固体支持体を洗浄し、非核酸生物物質を除去する、工程；および
（ｅ） 実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを得るために、ＲＮＡ溶出溶液を用いて、該固体支持体から、結合した実質的に分解されていないＲＮＡを優先的に溶出する工程、
を含む、方法。 - 前記生物材料は、核酸の粗製混合物および部分精製された混合物をからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記生物材料は、真核細胞、原核細胞、微生物細胞、細菌細胞、植物細胞、マイコプラズマ、原生動物、細菌、真菌、ウイルス、酵母、リケッチアおよびそれらのホモジネートからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記生物材料が、全血、骨髄、血斑、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液、脳脊髄液、および固形動物組織からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記生物材料が、糞、尿、涙、および汗からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記生物材料が、空気、水、堆積物および土壌から得られる環境サンプルからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体は、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、フッ化ポリビニリデン、およびそれらの組み合せからなる群から選択される成分を含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記非シリカ固体支持体は、ポリエステルを含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記固定化非シリカ固体支持体は、ポリエステルの組み合せを含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記固体支持体は、容器中に含まれ、該容器は、遠心チューブ、スピンチューブ、シリンジ、カートリッジ、チャンバー、複数ウェルプレート、試験管、およびそれらの組み合せからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記強カオトロピック物質は、グアニジニウム塩および尿素からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
- 前記実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡおよびウイルスＲＮＡ、並びにそれらの組み合せからなる群より選択される総ＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ複合塩は、アルカリ金属塩である、請求項２１に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、セシウム塩、およびルビジウム塩からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、リチウム塩である、請求項３３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、塩化リチウムである、請求項３３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、約４Ｍより高い濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
- 前記アルカリ金属塩は、４〜１０Ｍの間の濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。
- 前記両親媒性試薬は、界面活性剤である、請求項２０に記載の方法。
- 前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である、請求項３９に記載の方法。
- 前記非イオン性界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、ｎｏｎｉｏｄｅｔ、およびｔｅｒｇｉｔｏｌからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ結合溶液は、必要に応じてキレート剤を含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびＣＤＴＡからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
- 生物材料から実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ） ＲＮＡを含む生物材料を、約７より大きいｐＨで緩衝化されたＲＮＡ結合溶液で前処理した固体支持体と接触させる工程であって、その結果、該ＲＮＡ結合溶液が固体支持体に結合し、該ＲＮＡ結合溶液は、ＲＮＡ複合塩を含み、ここで該ＲＮＡ結合溶液は、強カオトロピック物質を含まない、工程；
（ｂ）該生物材料を、該固体支持体と接触させる工程であって、その結果、実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸が優先的に該固体支持体と結合する、工程；
（ｃ） 該固体支持体をＲＮＡ洗浄溶液で洗浄し、結合した、実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸以外の生物材料を除去する、工程；および
（ｄ） 実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを得るために、ＲＮＡ溶出溶液を用いて、該固体支持体から、結合した実質的に分解されていないＲＮＡを優先的に溶出する工程、
を含む、方法。 - 生物材料から実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを精製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ） ＲＮＡを含む生物材料を、約７より大きいｐＨで緩衝化されたＲＮＡ溶解溶液で前処理した固体支持体と接触させる工程であって、その結果、該ＲＮＡ溶解溶液は固体支持体に結合し、該ＲＮＡ溶解溶液は、両親媒性試薬およびＲＮＡ複合塩を含み、該ＲＮＡ溶解溶液は、強カオトロピック物質を含まない、工程；
（ｂ） 実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸および非核酸生物材料を放出し、実質的に分解されていないＲＮＡを含む核酸を優先的に該固体支持体に結合させるため、該生物材料を、該固体支持体と接触させる、工程；
（ｃ） 該固体支持体をＲＮＡ洗浄溶液で洗浄し、結合した、分解されていないＲＮＡを含む核酸以外の生物材料を除去する工程；および
（ｄ） 実質的に純粋かつ分解されていないＲＮＡを得るため、ＲＮＡ溶出溶液を用いて、結合した分解されていないＲＮＡを、該固体支持体から優先的に溶出する、工程、
を含む、方法。
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