JP2002531084A - 核酸を精製するための磁性粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
、及びこの調製物の助けを借りて核酸を精製する方法に関する。
無を疾患の指標として使う莫大な数の検査方法が現在開発されている。これらに
は、例えば体液中のウィルスや細菌の如き感染性生物の検査、そして更には例え
ば癌におけるゲノム核酸内の突然変異の検出が挙げられる。しかしながら、核酸
は通常試料材料内でごく微量で存在する。従って、核酸をその他の成分、例えば
タンパク質又はその他の細胞性成分であってその後の検出方法を妨害することの
あるものから単離するための様々な方法が開発されている。これらの方法のいく
つかは固相に結合した捕獲プローブを利用し、ここでこの捕獲プローブは分離す
べき核酸とハイブリダイズしてそれらを固相上に保持し、しかもその他の試料成
分を除去させることができる。かかる方法は例えばEP−B−0,305,39
9号に記載されている。しかしながら、これらの方法の欠点はそれらが各々極め
て特別なヌクレオチド配列を有する核酸を精製するためにだけ適当である点にあ
る。
WO91/12079号に記載され、それにおいては粒子サイズは1〜10μm
である旨記載されている。これらの粒子はガラス表面は含まず、そして核酸を沈
殿させるような単離のためにだけ適当である。しかしながら、この凝集プロセス
はその後の工程段階を妨害する数多くの試料成分も捕捉してしまう。
びシリカ粒子の混合物と混合する方法を提唱する。この条件下では、シリカ粒子
への核酸の結合は比較的配列とは独立している。その他の試料成分は洗浄により
除去でき、そして核酸はその後溶出されうる。
粒子がWO96/41811号に記載されている。この場合に利用される粒子は
、好適には磁性材料として磁鉄鉱を含むコアを有し、そしてそれらは好ましくは
10〜60μmの粒子サイズを有する。磁鉄鉱は約30〜50nmより大きい結晶
状で強い磁気特性を示す。永久磁力は外磁場により誘導される。このような強い
磁性コアを有する粒子は、外部磁場へのその最初の曝露を経て小型の永久磁石の
特性を有するようになる。懸濁物において、かかる粒子は互いを引き付け合い、
そして大きめの単位を形成する。外重力場の影響下で、このような大きめの単位
は個々の粒子よりもす早く沈降する。これは不利であり、なぜなら長時間のイン
キュベーションでは頻繁なる再分散を要するからである。
1840号に記載されている。亜鉛化合物もガラス形成成分として提唱されてい
る。この方法で形成される顔料粒子は好ましくは2〜20μmの粒子サイズを有
する。
ラス表面を形成するゾル−ゲルプロセスを利用した粒子の製造について過去に発
表された方法では、コア粒子を含まない大量の粒子が形成されてしまうことがこ
の度判明した。かかる調製物を使用して実施する核酸検出方法は核酸の大損失を
招くか、又は収率を高めるために微粒子を労力をかけて分離させなければならな
いことを招く。本発明の目的は当業界の現状を完全にもしくは部分的に改善する
こと、そして特に比較的狭い粒度分布を有する粒子を製造し、且つ更には核酸精
製の収率を高める及び/又は核酸粒子の精製用の粒子であって、外磁場に曝露し
た後でさえも、凝集する性質を極めてわずかにしかもたず、しかも重力場におい
て磁場にまだ曝露されていない粒子とまさに同じぐらいにゆっくりと沈降する粒
子の提供にある。
の75重量%超は0.5〜15μmの粒子サイズを有する。
子の調製物の製造のための方法及び本発明に係る調製物の助けを借りて核酸を精
製するための方法にある。
調製物にある。
法及びかかる粒子の調製物に関する。
粒子は好ましくは本質的に球形の表面を有する。しかしながら、後述の寸法を有
する血小板型及び繊維状粒子も粒子と解されている。核酸を精製するために特に
好適となるには、粒子が好ましくは磁性のコア(顔料部分)を有し、且つガラス
の層でコーティングされていることが所望される。かかるコアは好ましくは酸化
金属、例えば酸化アルミニウム、酸化鉄、酸化クロム、酸化銅、酸化マンガン、
酸化鉛、酸化錫、酸化チタン、酸化亜鉛及び酸化ジルコニア、又は金属、例えば
Fe,Cr,Niもしくは磁性合金を含む。本発明に係る粒子の機能にとってこ
のコアの組成はさほど重要ではなく、なぜならこのコアはガラス表面でコーティ
ングされ、従ってこのコアは核酸を単離するもととなる試料と直接接触するわけ
ではないからである。かかるコアは商業的に入手できる。もしこのコアがFe3
O4 (磁鉄鉱)もしくはFe2 O3 (マグヘマイト)又はFeもしくはCrもし
くはNiもしくは磁性合金を含むなら、これらのコアは磁性体である。
合金を基礎とし、好ましくはNiを基礎とする。かかる合金の例はパーマロイの
名で知られる。それらは70〜80%のNiと、Cr,Cu及びMoの添加物と
から成る。磁性軟材料から成る粒子は磁場の不在下では互いを引き付けないか、
又はごくわずかにしか引き付けない。
おそれがあり、それらは自然性である。従って、かかる細く分散した金属粒子が
ゾル−ゲルプロセスにより、その磁性特性を有意に変えることなくガラス層でコ
ーティングされうることは極めて驚くべきことである。カルボニル鉄粉が金属粉
末として特に好適に利用され、そしてH2 内で還元されたそのタイプは特に好適
な磁気特性を有する。カルボニル鉄ホイスカーは特に好適な特性を有する。
8μmの粒子サイズを有する。
このガラスは下記の成分を1又は複数種含むのが好ましい(モル%で): B2 O3 (0〜30%)、Al2 O3 (0〜20%)、CaO(0〜20%)
、BaO(0〜10%)、K2 O(0〜20%)、Na2 O(0〜20%)、M
gO(0〜18%)、Pb2 O3 (0〜15%)、ZnO(0〜6%)。
いてよい。SiO2 ,B2 O3 ,Al2 O3 ,CaO,K2 O及びZnOの組成
を有する表面が特に有効であると証明されている。核酸の収率との関係で特に有
利な硼珪酸ガラスは2〜6、好ましくは約4モル%の酸化亜鉛含量を有する。こ
のガラス層は特に好ましくは68〜79モル%のSiO2 、15〜5モル%のB 2 O3 、6〜2.5モル%のK2 OとNa2 Oとの総量、4〜1モル%のCaO
、8〜2モル%のAl2 O3 、6〜2モル%のZnOから成る。いわゆるゲル−
ゾル法、しかる後の形成される層の乾燥及び圧縮によって形成されたガラスが本
発明の観点で特に好ましい。この方法の本質的な観点は知られており、そして例
えばC.J.Brinker, G.W.Scherer“Sol Gel science-The physics and chemistry
of Sol Gel Processing”, Academic Press Inc.1990及びSol-Gel Optics, Proc
essing and Applications Lisa C.Klein Ed.Kluwer Academic Publishers 1994
頁 450以降、並びにDE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041及びDE-A-42174
32に記載されている。このゲル−ゾル法では、ネットワーク形成成分のアルコキ
シド、例えばSiO2 ,B2 O3 ,Al2 O3 ,TiO2 ,ZrO2 及びZnO
をその他の成分の酸化物及び塩と共に例えばアルコール性溶液に加え、そして加
水分解する。
ぜならアルカリイオンは珪酸エステルの加速分解速度に対して触媒的効果を有す
るからである。ゲル形成の完了後、ゲルを乾かし、そして熱プロセスを介して圧
縮してガラスを形成させることができる。
その制約は、顔料の量が、ポンピング及びスプレーイングが可能な材料が形成さ
れるのに十分少ないものとする点にある。顔料の量が少なすぎると、微細材料、
例えば非磁性材料の比率は大きくなりすぎてしまい、そして妨害を示す。10〜
45gの顔料/100mlのゾルの量比が顔料収率との関係で好都合であることが
見い出された。
してそのエアロゾールを落下経路上で乾燥させる。このノズルは好ましくはスラ
リーの乾燥を促進させるために加熱しておく。ノズル温度はノズルの形状とは独
立に好ましくは約120〜250℃とする。適切な蒸発速度と散乱の回避との間
での妥協点を見つけなくてはならない。
がら、それが高すぎると、粒子は凝集し、そして凝集物はふるいにより除去せね
ばならない。しかしながら、層への亜鉛の添加が融点を驚くべきほどに高め、そ
れ故高めの圧縮温度(710〜800℃)の利用が可能となる。大気中での後処
理は温度が高すぎると磁気特性の損失を招き、そのために過剰に高い温度は避け
るべきである。亜鉛を加えると、この場合には他の温度(好ましくは150〜2
50℃)を利用することも可能となる。
記載の方法に利用できうることが見い出された。特に、コアはナノスケールで、
例えば50nm未満、好ましくは30nm未満の結晶サイズを有する磁鉄鉱が使用可
能である。コアサイズの下限界はコアの取り扱い特性、そして特にその凝集物を
形成する性質に由来する。このコアは好ましくは5nmより大きく、特に好ましく
は、7nmより大きい。ナノスケールコアの磁気特性は超常磁性と称されている。
得られる粒子は外磁場に曝露されるとすばやく沈降する。再分散の後、重力場で
のその沈降速度は、外磁場への曝露前での重力場でのその沈降速度と相違しない
。これは有利であり、なぜならそれは再混合及び再懸濁することなく懸濁物内で
のより長いインキュベーション時間を可能にするからである。
干小さい粒子サイズと15μmより若干小さい粒子サイズとの間の粒子サイズを
有するコア粒子の調製物がゾル/ゲルプロセスにおいて利用される。このコア粒
子はガラス層の厚みの程度にまで、ガラスコート化粒子よりも小さくなければな
らない。本発明の方法を経て、ガラス層はゲル、対、コア粒子の比の如き選定の
条件に依存して、5nm〜1μmの厚みとなるであろう。平均してガラス層は厚さ
0.2〜0.3μmであるべきである。
子を含む調製物が特に好ましい。この規定の粒子サイズを有する粒子の比率は特
に好ましくは90重量%超である。
〜15μm、好ましくは2〜15μmの粒子サイズを有する粒子の95重量%超
が好適には磁性体である点にある。このことは、コアを含まない粒子の比率が公
知の方法と比較して激減していることを意味する。これは非磁性粒子がわずかに
しか存在しない事実により認識されうる。このことは、核酸を精製する方法にお
いて当該調製物を使用する前に、磁性粒子から非磁性粒子を分離する必要性が事
実上もはやなくなったことを意味する。これは製造工程を簡略化する。
いう点で更に特徴付けられうる。従って、サイズの小さい粒子内で比較的高い比
率を有する非磁性微細画分において相当な減少がある。特に好ましくは、粒子の
2%未満が0.5μm未満の粒子サイズを有する。
0%が10μm超の粒子サイズを有する。
ば緩衝物質又は懸濁剤、例えば水又は水のアルコール性溶液も含んでよい。
4モル%の酸化亜鉛を含む。これはその他の固体成分の量と比較して、固体ゾル
中にこの程度の質量の酸化亜鉛の量を有することにより達成される。酸化亜鉛の
比率は、特にこの調製物を長時間加熱するときに酸化硼素の量が下がるほど上昇
し、なぜなら酸化硼素はこの製造条件下では既に揮発性であるからである。
めに特に有効であることが証明された。状況によっては、核酸の収率は、酸化亜
鉛のない同じガラス層と比べ50%上昇した。
されたコアを有する粒子の製造方法であり、この方法はコア粒子調製物を用いて
ゾル中でコア粒子を懸濁し、そしてこの懸濁物をスプレードライしてゲルを形成
する段階を含んで成り、ここでこのコア粒子調製物は0.5〜15μm、好まし
くは2〜15μmの粒子サイズを有する粒子75重量%を含む。
従来技術の記載を参照されたい。本発明と従来技術との主たる相違はコアのない
粒子を5重量%未満含む調製物の製造を可能にする特定のコア粒子調製物の利用
にある。まずゾルをエタノール中でテトラアルキルオルトシリケート、アルキル
ボレート、アルミニウムアルコラート及びアルカリアルコラートから調製し、そ
してこの混合物をカルシウムと一緒に加熱する方法が特に好都合であると証明さ
れた。その後、この混合物は水の添加により加水分解させる。このようにして形
成したゾルにコア粒子を固体状で加え、そして好適には超音波で懸濁する。その
後、この懸濁物をスプレードライ工程で噴霧化してゲルを形成させる。この工程
ではノズルを加熱しておき、そして粒子当り1から数個のコア粒子(好ましくは
粒子の1%未満が10個以下のコア粒子を含む)を含む粒子が主として形成され
る。スプレー生成物を次に加熱してゲルを圧縮し、ガラスを形成する。また、こ
の場合にはゲルへの酸化亜鉛の添加が極めて有利である。この圧縮は亜鉛を添加
しない調製物よりも高温で実施してよく、なぜなら形成されるガラスの軟化点は
高くなるからである。このことは、出発材料からの有機残渣の排出を一層容易に
する。
されるため、コアを有するのと有さない粒子とのその後の分画は一般にもはや必
要なくなる。
、未結合の試料成分を除去し、そして結合した核酸をこのガラス表面から溶出さ
せることにより核酸を精製するための方法にも関連し、この方法では本発明に係
る調製物が利用される。この方法は粒子が磁性体であるときに極めて簡単である
。
41811に記載されている。その開示内容を全て参照されたい。本発明に係る
精製方法のために適当な試料は特に臨床試料、例えば血液、血清、口をすすいだ
後の液体、尿、大脳流体、痰、大便、血漿、生検又は骨髄試料である。血清が好
適な試料材料である。核酸を精製するには、必要なら、存在しうる細胞構造物の
溶解及び妨害試料成分の分解の後、例えば所定量の粒子懸濁物の形態の本発明の
調製物と混合する。核酸が配列非特異的にガラス表面に結合するインキュベーシ
ョン期間の後、液体を未結合の試料成分と一緒に除去し、そしてその粒子を所望
するなら残留物の除去のために洗浄する。まだ結合し続けている核酸をその表面
から、この核酸がよく溶解する液体による溶出により除去する。得られる液体は
このようにして任意の所望の態様で処理することができ、そして特に増幅方法、
例えばPCRに用いることができ、なぜなら酵素阻害剤のほとんどがこの精製工
程の際に分離されるからである。
り、なぜならこのような粒子は磁石の助けを借りて集め、保持でき、その間に液
体を除去できるからである。この粒子が非磁性体なら、それらは適当なフィルタ
ーを利用する濾過により液体から分離されうる。
CaO・5Al2 O3 ) 1750mlのテトラエチルオルトシリケート(製造者:Wacker Burghausen )
を5リットルの丸底フラスコに入れ、そして以下の化合物を室温にて撹拌しなが
らすばやく添加する(500rpm ): 541mlのトリエチルボレート(製造者:Aldrich, Steinheim) 250mlのメタノール酸カリウム(メタノール中25%;製造者:Fluka, Deise
nhofen) 261mgの第二ブチル酸アルミニウム(製造者:Aldrich, Steinheim) 292mlのエタノール及び 8.49gのカルシウム(製造者:Fluka, Deisenhofen)
ールと233mlの水とが一緒になって混合物を30分かけて滴下する。<50℃
にまで冷却後、ゾルを開放容器に移し、そして1200gの顔料IRIODIN 600 Bl
ack Mica(製造者:Merck, Darmstadt)を加える。顔料の添加の完了後、このゾ
ルを更に1分間500rpm で撹拌し、しかる後超音波で5分処理する。超音波処
理後、このゾル−顔料混合物を溶解撹拌器で約500rpm 、全量が消費されるま
で撹拌する。
間のNubilosa Company, Konstanz由来のスプレータワーでスプレーイングを実施
する。空気入口温度は270℃、出口温度は約130℃とする。空気の流速は7
.2m3 /min とする。2bar のスプレー圧を有する二流体ノズルをスプレーイ
ングのために用いる。ボールバルブ膜ポンプの輸送能力は60gのゾル/min と
する。
中に捕捉させ、しかる後1k/min の加熱速度にて窒素オーブン内で675℃の
温度にし、このオーブンの中で1時間保ち、そして300℃に冷却する。酸素を
300℃にて加え、1時間保ち、次いで窒素にまで冷却する。冷却後、それを5
0μmのメッシュサイズを有するふるいを用いてふるいがけし、存在しうる凝集
物を除去する。これは調製物を完成させる。
4K2 O・2CaO・5Al2 O3 ・4ZnO) 亜鉛を含むゾルを実施例1と同様にして調製する。このために、以下の重量の
抽出物を加え、そして同様にして処理する: 1258mlのテトラエチルオルトシリケート(製造者:Wacker Burghansen ) 387mlのトリエチルボレート(製造者:Aldrich, Steinheim) 188mlのメタノール酸カリウム(メタノール中25%;製造者:Fluka, Deise
nhofen) 196gの第二ブチル酸アルミニウム(製造者:Aldrich, Steinheim) 1285mlのエタノール 6.39gのカルシウム(製造者:Fluka, Deisenhofen) 58.5gの酢酸亜鉛脱水・二水和物(製造者:Fluka, Deisenhofen)
分以内の時間をかけて滴下する。冷却後、1200gの顔料を加える。その他は
実施例1を参照されたい。
圧縮温度は750℃とする。
ラス粒子) 実施例3由来の顔料含有ゾルを実施例2と似たようにして処理する。しかしな
がら、圧縮温度は750℃とし、そして酸素内での処理温度は200℃とする。
ベル化ラムダアンプリコンを結合した又は未結合のDNA又はRNAの直接検出
のために用いる。各々109 コピーを含む陰性血漿(ヒト)を試料として用いる
。
漿を2mlのEppendorf 容器に入れる。480μlの結合バッファー/プロテイナ
ーゼ・K溶液(5:1)をピペクトにより加え、ボルテックスにかけ、そして7
0℃で10分インキュベーションする。室温にまで冷却後、全部で3mgのMGP
を含む400μlのイソプロパノールMGP懸濁物をピペクトにより加える。そ
の直後にそれをボルテックスにより混合する。次にそのサンプルをミキサー、例
えばEppendorf 由来のサーモミキサー5436で15分インキュベーションする
。
ピペクトにより完全に除去する。
ボルテックスにかけ、次いで磁気分離器に移す。この上清液を1分後にピペクト
により除去する。この洗浄工程を更に2分間繰り返す。
0℃にて10分、1400rpm でインキュベーションする。そのサンプルを磁気
分離器に移し、そして1分後に全溶出液を除去する。その溶出液を次に新たな容
器に移し、そしてシンチレーションカウンターで測定する。
るバッチを実施例1に従って製造する。
/mlのHCVウィルスを含むヒト血漿を試料として用いる。この試料調製物の溶
出液を増幅にかけ、そして増幅結果を電気化学発光法により検出する。追加の実
験において、試料は600コピー/mlのHBVウィルスを含むヒト血漿とした。
。
度分布を有する71gのカルボニル鉄粉末HQ(BASF,Ludwigs-hafen )を
加え、500rpm で1分撹拌し、次いで超音波で5分処理する。このゾルをスプ
レードライヤー(Buche 190, Mini Spray Dryer )でスプレーイングする。この
スプレードライヤーのノズル温度は140℃とする。
そして保持時間は1時間とする。次に、オーブン内の空気をN2 と交換し、数回
フラッシングを行い、そして1k/min で700℃にまで加熱し、1時間保持し
、200℃へと1k/min で冷却する。次いでそれを室温にまで冷却する。形成
されうる凝集物は50μmのふるいによりふるいにかける。
0の粒子に結合させる。放射能測定は>80%の結合を示す。
して各々1.5mlのH2 Oに懸濁する。
せる。容器2内の粒子は同時に振とうさせる。
Claims (16)
- 【請求項1】 ガラス表面を有する粒子を含む調製物であって、当該粒子の
75重量%超が0.5〜15μmの粒子サイズを有する、調製物。 - 【請求項2】 前記0.5〜15μmの粒子サイズを有する粒子の95重量
%超が磁性粒子である、請求項1記載の調製物。 - 【請求項3】 前記粒子の半分未満が2μm未満の粒子サイズを有する、請
求項1又は2記載の調製物。 - 【請求項4】 前記粒子の2%未満が0.5μm未満の粒子サイズを有する
、請求項1,2及び3のいずれか1項記載の調製物。 - 【請求項5】 前記磁性粒子がガラスでコーティングされた磁性コアを有す
る、請求項2記載の調製物。 - 【請求項6】 前記粒子の10%以下が10μm以下の粒子サイズを有する
粒子である、請求項1記載の調製物。 - 【請求項7】 前記粒子が2〜6モル%の酸化亜鉛を含むガラスコートを有
する、請求項1〜6のいずれか1項記載の調製物。 - 【請求項8】 少なくとも一種類の磁性金属コアを含む、請求項1〜7のい
ずれか1項記載の調製物。 - 【請求項9】 コアのない粒子5重量%未満を含むゲル層でコーティングさ
れたコアを有する粒子の調製物の製造方法であって、 ・コア粒子調製物を利用してゾル中でコア粒子を懸濁し、 ・この懸濁物をスプレードライしてゲルを形成する、 工程を含んで成り、ここで当該粒子調製物は75重量%の0.5〜15μmの
粒子サイズを有する粒子を含んで成る、方法。 - 【請求項10】 前記ゾルが亜鉛を含む、請求項9記載の方法。
- 【請求項11】 核酸を精製する方法であって、核酸を試料からガラス表面
を有する粒子へと非共有式に結合させ、未結合の試料成分を除去し、そして結合
した核酸を当該ガラス表面から溶出させることによる方法であって、ここで当該
試料を請求項1〜8又は15〜16のいずれか1項記載の調製物と接触させるも
のとする、方法。 - 【請求項12】 前記粒子が磁性粒子であり、そして前記試料成分を除去す
る際に磁石により保持される、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 核酸のためのガラス表面の結合能力を増大させるための、
ゾル/ゲル法により作製されるガラス層内での酸化亜鉛の利用。 - 【請求項14】 コアのない粒子5重量%未満を含むゲル層でコーティング
されたコアを有する粒子の調製物の製造のための方法であって、 コア粒子調製物を利用してゾル中にコア粒子を懸濁し、 当該懸濁物をスプレードライしてゲルを形成し、 当該ゲルを圧縮してガラスを形成する、 工程を含んで成り、ここで当該コア粒子調製物を0.5〜15μmの粒子サイ
ズを有する粒子75重量%を含んで成る、方法。 - 【請求項15】 ガラス表面を有する粒子を含む調製物であって、当該粒子
は磁性金属から成る少なくとも一のコアを有する、調製物。 - 【請求項16】 前記コアが0.01〜100μmの粒子サイズ、特に好ま
しくは0.2μm〜8μmの粒子サイズを有する、請求項15記載の調製物。
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