DE19855259A1 - Magnetische Partikel zur Reinigung von Nukleinsäuren - Google Patents
Magnetische Partikel zur Reinigung von NukleinsäurenInfo
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Abstract
Zubereitungen von Partikeln mit einer Glasoberfläche, wobei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0,5 bis 15 mum haben sowie mit einer Glasoberfläche, welche einen Anteil von zwischen 2 und 6 Mol-% Zinkoxid enthält, haben sich als besonderes vorteilhaft in Nukleinsäureeinigungsverfahren erwiesen. Insbesondere wird eine erhöhte Nukleinsäureausbeute erreicht.
Description
Gegenstand der Anmeldung ist eine Zubereitung von Partikeln mit einer Glasoberfläche,
ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Zubereitung sowie ein Verfahren zur Reini
gung von Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Zubereitung.
Nukleinsäuren sind in jüngerer Zeit immer mehr in den Blickpunkt des Interesses der
medizinischen Diagnostik gerückt. So wurden mittlerweile eine Vielzahl von Nachweisver
fahren erarbeitet, bei denen die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuren
als Anzeichen für eine Erkrankung bewertet wird. Hierzu gehören z. B. Nachweise infek
tiöser Organismen, z. B. von Viren oder Bakterien in Körperflüssigkeiten, aber auch der
Nachweis von Mutationen in genomischen Nukleinsäuren, z. B. in der Onkologie. Nuklein
säuren liegen in dem üblicherweise verwendeten Probenmaterial jedoch in sehr geringen
Konzentrationen vor. Aus diesem Grund wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung der
Nukleinsäuren von anderen Probenbestandteilen, wie Proteinen oder anderen zellulären
Bestandteilen, die teilweise die anschließenden Nachweisverfahren stören, erarbeitet. Ein
Teil dieser Verfahren verwendet festphasengebundene Fangsonden, die mit den abzu
trennenden Nukleinsäuren hybridisieren können und diese an der Festphase zurückhalten,
während die übrigen Probenbestandteile entfernt werden. Ein solches Verfahren ist bei
spielsweise in EP-B-0 305 399 beschrieben. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil,
daß sie sich jeweils nur für die Reinigung von Nukleinsäuren mit einer ganz speziellen
Nukleotidsequenz eignen.
In WO 91/12079 ist ein Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren mit Hilfe von
Magnetpartikeln aus Zellulose und Eisenoxid beschrieben, wobei die Partikelgröße mit
zwischen 1 und 10 µm angegeben ist. Diese Partikel enthalten keine Glasoberfläche und
sind nur für eine Isolierung unter Präzipitation von Nukleinsäuren geeignet. Durch Aggre
gation werden jedoch eine Vielzahl von Probenbestandteilen eingeschlossen, die spätere
Verfahrensschritte stören.
In EP-B-0389 063 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem die Probe mit einem Ge
misch eines chaotropen Guanidiniumsalzes und Silicapartikeln gemischt wird. Unter diesen
Bedingungen binden Nukleinsäuren relativ sequenzunabhängig an die Silica-Oberfläche.
Die übrigen Probenbestandteile können abgewaschen und die Nukleinsäuren anschließend
eluiert werden.
In WO 96/41811 werden magnetische Partikel mit einer im wesentlichen porenfreien Glas
oberfläche zur sequenzunabhängigen Reinigung von Nukleinsäuren beschrieben. Die dort
verwendeten Partikel haben einen Kern, bevorzugt mit Magnetit als magnetischem Werk
stoff.
Magnetit in Kristallen größer ca. 30 bis 50 nm zeigt hartmagnetische Eigenschaften. Durch
ein externes Magnetfeld wird permanenter Magnetismus induziert. Partikel mit solchen
hartmagnetischen Kernen zeigen nach dem ersten Einwirken eines externen magnetischen
Feldes die Eigenschaften eines kleinen Permanentmagneten. In Suspension ziehen sich
solche Partikel gegenseitig an und bilden größere Einheiten. Diese größeren Einheiten
sedimentieren unter dem Einfluß eines äußeren Schwerefeldes schneller, als die Partikel als
Einzelne. Das ist nachteilig, da länger andauernde Inkubationen häufiges Redispergieren
erfordern.
Ein Ziel der Erfindung war es daher, Partikel für die Nukleinsäurereinigung bereitzustellen,
die auch nach der Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes nur sehr geringe Tendenz zur
Zusammenlagerung zeigen und genauso langsam im Schwerefeld sedimentieren, wie
solche, die noch nie einem Magnetfeld ausgesetzt waren.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß in den in WO 96/41811
offengelegten Verfahren als magnetische Kerne auch solche eingesetzt werden können, die
wesentlich kleiner sind. Insbesondere zeigte es sich, daß es möglich ist, nanoscaligen
Magnetit mit einer Kristallgröße kleiner 50 nm, bevorzugt kleiner 30 nm, einzusetzen. Das
magnetische Verhalten der nanoscaligen Kerne wird als superparamagnetisch bezeichnet.
Die erhaltenen Partikel sedimentieren rasch unter Einwirkung eines externen Magnetfeldes.
Nach Redispersion unterscheidet sich die Sedimentationsgeschwindigkeit im Schwerefeld
nicht von der Sedimentationsgeschwindigkeit im Schwerefeld vor der Einwirkung des
externen Magnetfeldes. Vorteilhaft dabei ist, daß längere Inkubationszeiten in Suspension
möglich sind, ohne daß wieder aufgemischt und resuspendiert werden muß.
Andere Materialien, die als weichmagnetisch bezeichnet werden, sind Metalle auf Basis
der reinen Elemente Fe, Ni, Cr und Legierungen auf der Basis von bevorzugt Ni in Frage.
Solche Legierungen sind unter der Bezeichnung Permalloy bekannt. Sie bestehen zu 70 bis
80% aus Ni mit Zusätzen von Cr, Cu und Mo. Partikel aus magnetisch weichem Material
ziehen einander in Abwesenheit eines externen Magnetfeldes nicht oder nur vernachlässig
bar an.
Feinteilige Metallpulver sind sehr reaktiv. An Luft besteht die Gefahr der Selbstentzün
dung, sie gelten als pyrophor. Daher war es sehr überraschend, daß solch feinteilige
Metallpartikel nach dem Sol-Gelverfahren mit einer Glasschicht überzogen werden
konnten, ohne daß sich die magnetischen Eigenschaften wesentlich änderten. Besonders
bevorzugt werden als Metallpulver Carbonyleisenpulver eingesetzt, wobei in H2 reduzierte
Typen magnetisch besonders bevorzugte Eigenschaften aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung und eine Zubereitung von
Partikeln mit einem superparamagnetischen Kern.
In WO 96/41811 werden magnetische Partikel mit einer im wesentlichen porenfreien Glas
oberfläche zur sequenzunabhängigen Reinigung von Nukleinsäuren beschrieben. Die dort
verwendeten Partikel haben eine bevorzugte Korngröße von zwischen 10 und 60 µm.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung und eine Zubereitung von
Partikeln mit einem weichmagnetischen metallischen Kern.
In WO 96/41840 werden Pigmente beschrieben, die eine Glasoberfläche einer Dicke von
mindestens 0,8 µm aufweisen. Als eine glasbildende Komponente werden auch Verbindun
gen von Zink vorgeschlagen. Es entstehen dabei Pigmentpartikel mit einer Teilchengröße
von vorzugsweise 2 bis 20 µm.
Es hat sich nun herausgestellt, daß bei den bisher beschriebenen Verfahren zur Herstellung
von Partikeln nach dem Sol-Gel-Prozeß, bei dem Kernpartikel einer vorgegebenen Größe
mit einem Gel beschichtet werden und anschließend eine Verdichtung zu einer Glasober
fläche stattfindet, ein hoher Anteil von Partikeln gebildet wird, die kein Kernpartikel ent
halten. Dies führt entweder dazu, daß bei mit solchen Zubereitungen durchgeführten
Nukleinsäurenachweisverfahren große Verluste an Nukleinsäuren stattfinden oder die
Feinanteile zur Erhöhung der Ausbeute aufwendig abgetrennt werden müssen. Aufgabe der
vorliegenden Erfindung war es, den vorliegenden Stand der Technik ganz oder teilweise zu
verbessern, insbesondere Partikel mit einer relativ engen Korngrößenverteilung herzu
stellen und die Ausbeute bei Nukleinsäurereinigung weiter zu erhöhen.
Gegenstand der Erfindung ist eine Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasober
fläche, wobei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0.5 und
15 µm haben.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung
von Partikeln enthaltend einen Kern ummantelt mit einer Gelschicht oder einer Glasschicht
und ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zu
bereitung.
Als Partikel bezeichnet der Fachmann feste Materialien mit einem geringen Durchmesser.
Bevorzugt haben diese Partikel eine im wesentlichen kugelige Oberfläche. Um für die
Reinigung von Nukleinsäuren besonders gut geeignet zu sein, ist es wünschenswert, daß
das Partikel einen Kern (Pigmentanteil) aufweist, der bevorzugt magnetisch ist und der mit
einer Glasschicht ummantelt ist. Solche Kerne enthalten bevorzugt Metalloxide, wie Alu
miniumoxid, Eisenoxid, Chromoxid, Kupferoxid, Manganoxid, Bleioxid, Zinnoxid, Titan
oxid, Zinkoxid und Zirkoniumoxid oder Metalle, wie Fe, Cr, Ni. Die Zusammensetzung
dieses Kerns ist für die Funktion der erfindungsgemäßen Partikel weniger wesentlich, da
der Kern mit einer Glasoberfläche ummantelt wird, so daß der Kern nicht direkt mit der
Probe, aus der die Nukleinsäure isoliert werden soll, in Berührung kommt. Solche Kerne
sind kommerziell erhältlich. Sofern der Kern Fe3O4 (Magnetit) oder Fe2O3 (Maghämit) oder
Fe oder Cr oder Ni oder magnetische Legierungen enthält, sind diese Kerne magnetisch.
Eine Glasoberfläche im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einem silizium
haltigen amorphen Material. Das Glas enthält bevorzugt neben Siliziumoxid einen oder
mehrere der folgenden Komponenten (in mol%):
B2O3 (0-30%), Al2O3 (0-20%), CaO (0-20%), BaO (0-10%), K2O (0-20%), Na2O (0-20%), MgO (0-18%), Pb2O3 (0-15%), ZnO (0-6%).
B2O3 (0-30%), Al2O3 (0-20%), CaO (0-20%), BaO (0-10%), K2O (0-20%), Na2O (0-20%), MgO (0-18%), Pb2O3 (0-15%), ZnO (0-6%).
In geringerem Umfang von 0-5% können auch eine Vielzahl anderer Oxide, wie z. B.
Na2O, Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO, ZrO2, CoO usw. enthalten sein. Als besonders
wirksam haben sich Oberflächen einer Zusammensetzung von SiO2, B2O3, Al2O3, CaO,
K2O, und ZnO erwiesen. Unter dem Gesichtspunkt der Ausbeute an Nukleinsäuren be
sonders bevorzugte Borsilikatgläser haben einen Zinkoxidgehalt von 2-6, bevorzugt von
ca. 4 mol%. Besonders bevorzugt besteht die Glasschicht aus 68-79 mol% SoO2, 15-5 mol%
B2O3, 6-2.5 mol% Gesamtmenge an K2O und NazO, 4-1 mol% CaO, 8-2 mol%
Al2O3, 6-2 mol% ZnO. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Gläser, die durch
den sogenannten Gel-Sol-Prozeß und anschließendes Trocknen und Verdichten der ge
bildeten Schicht gebildet werden. Dieser Prozeß ist in seinen Grundzügen bekannt und
wurde z. B. in C. J. Brinker, G. W. Scherer "Sol Gel science - The physics and chemistry of
Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990 und Sol-Gel Optics, Processing and
Applications Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, Seite 450 ff. sowie in
DE-A-19 41 191, DE-A-37 19 339, DE-A-41 17 041 und DE-A-42 17 432 beschrieben. Im Gel-
Sol-Prozeß werden Alkoxide von netzwerksbildenden Komponenten, z. B. SiO2, B2O3,
Al2O3, TiO2, ZrO2 und ZnO zusammen mit Oxiden und Salzen anderer Komponenten, z. B.
in alkoholischer Lösung, vorgelegt und hydrolysiert.
Durch die Zugabe von Wasser wird der Hydrolyseprozeß der Ausgangskomponenten in
Gang gesetzt. Die Reaktion verläuft relativ rasch, da die Alkaliionen katalytisch auf die
Hydrolysegeschwindigkeit des Kieselsäureesters einwirken. Nach Ablauf der Gelbildung
kann das entstehende Gel getrocknet und durch einen thermischen Prozeß zu einem Glas
verdichtet werden.
Das Mengenverhältnis Sol/Pigment hat einen erheblichen Einfluß auf die Ausbeute an er
findungsgemäßem, magnetischem Pigment. Grenzen sind dadurch gegeben, daß der
Pigmentanteil so gering ist, daß eine noch pump- und sprühfähige Masse entsteht. Bei zu
geringem Pigmentanteil wird der Feinanteil, z. B. von nicht-magnetischem Material zu
groß und stört. Als im Hinblick auf die Pigmentausbeute zweckmäßige Mengenverhält
nisse wurden 10 bis 45 g Pigment/100 ml Sol gefunden.
Die Aufschlämmung wird zur Entstehung eines Pulvers bevorzugt durch eine Düse ver
sprüht und das Aerosol auf einer Fallstrecke getrocknet. Die Düse wird bevorzugt geheizt,
um die Trocknung der Aufschlämmung zu beschleunigen. Abhängig von der Geometrie
der Düse beträgt die Düsentemperatur bevorzugt ca. 120 bis 250°C. Ein Kompromiß wird
gefunden durch ausreichende Verdampfungsgeschwindigkeit, jedoch Vermeiden von Ver
spritzen.
Im Hinblick auf die Ausbeute ist die Verdichtungstemperatur möglichst hoch zu wählen.
Ist sie jedoch zu hoch, verkleben die Partikel untereinander und es bilden sich Agglome
rate, die herausgesiebt werden sollten. Ein Zusatz von Zink in der Schicht erhöht jedoch
überraschenderweise den Schmelzpunkt, so daß eine höhere Verdichtungstemperatur
(zwischen 710 und 800°C) möglich ist. Die Nachbehandlung unter Luft führt bei zu hohen
Temperaturen zu einem Verlust der magnetischen Eigenschaften, weshalb zu hohe
Temperaturen vermieden werden sollten. Auch hier sind bei Zusatz von Zink andere
Temperaturen möglich (bevorzugt zwischen 150 und 250°C).
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitung wird eine Zubereitung von Kern
partikeln, in der mehr als 75 Gew.-% der Kernpartikel eine Korngröße von zwischen etwas
weniger als 0.5 und etwas weniger als 15 µm haben, in den Sol/Gel-Prozeß eingesetzt. Die
Kernpartikel müssen um soviel kleiner sein als die glasummantelten Partikel, wie die
Dicke der Glasschicht ausmacht. Die Glasschicht wird nach dem erfindungsgemäßen Ver
fahren zwischen 5 nm und 1 µm groß sein, abhängig von den jeweils gewählten Umstän
den, wie Verhältnis Gel zu Kernpartikel. Im Durchschnitt dürfte die Glasschicht zwischen
0.2 und 0.3 µm dick sein.
Besonders bevorzugt ist eine Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasoberfläche wo
bei mehr als 75 Gew.-% dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 2 und 15 µm haben.
Besonders bevorzugt ist der Anteil der Partikel mit der bestimmten Korngröße größer als
90 Gew.-%.
Besonders bevorzugt werden magnetische Kernpartikel eingesetzt. Die erfindungsgemäße
Zubereitung hat den Vorteil, daß bevorzugt mehr als 95 Gew.-% der Partikel mit einer
Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm, bevorzugt zwischen 2 und 15 µm magnetisch
sind. Dies bedeutet, daß gegenüber den bekannten Verfahren der Anteil von nicht-kern
haltigen Partikeln drastisch reduziert ist. Dies kann man daran erkennen, nur wenig nicht-
magnetische Partikel enthalten sind. Dies führt dazu, daß es praktisch nicht mehr erforder
lich ist, die gebildeten nicht-magnetischen Partikel von den magnetischen Partikeln abzu
trennen, bevor die Zubereitung in Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren eingesetzt
wird. Dies bedeutet eine Vereinfachung im Herstellprozeß.
Außerdem kann die erfindungsgemäße Zubereitung dadurch charakterisiert werden, daß
bevorzugt weniger als 50% der Partikel eine Korngröße von weniger als 2 µm haben. Dies
hat zur Folge, daß der nicht-magnetische Feinanteil, der bei kleinen Korngrößen einen
hohen relativen Anteil ausmacht, stark reduziert ist. Besonders bevorzugt haben weniger
als 2% der Partikel eine Korngröße von weniger als 0.5 µm.
Bevorzugt sind nicht mehr als 10%, besonders bevorzugt zwischen 10 und 40% der
Partikel der Zubereitung Partikel mit einer Korngröße von mehr als 10 µm.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann neben den erfindungsgemäßen Partikeln noch
weitere nicht-glashaltige Bestandteile enthalten, wie z. B. Puffersubstanzen oder ein
Suspensionsmittel, z. B. Wasser oder alkoholische Lösungen von Wasser.
Die Glasschicht der Partikel der erfindungsgemäßen Zubereitung enthält bevorzugt einen
Anteil von zwischen 2 und 6 mol%, besonders bevorzugt 4 mol% Zinkoxid. Dies kann
dadurch erreicht werden, daß der Anteil von Zinkoxid an der festen Masse des Sols, ver
glichen mit den Anteilen der übrigen festen Komponenten, in diesem Größenordnungs
bereich liegt. Der Anteil von Zinkoxid vergrößert sich mit Reduzierung des Anteils von
Boroxid, insbesondere bei längerem Erhitzen, da Boroxid unter den Herstellbedingungen
schon flüchtig ist.
Partikel, die eine Glasschicht aufweisen, in der der Anteil von Zinkoxid zwischen 2 und
6 mol% liegt, haben sich als besonders wirksam bei der Reinigung von Nukleinsäuren her
ausgestellt. Die Ausbeute an Nukleinsäuren konnte, verglichen mit derselben Glasschicht
ohne Zinkoxid, teilweise um 50% erhöht werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung
von Partikeln mit einem Kern ummantelt mit einer Gelschicht enthaltend weniger als
5 Gew.-% kernlose Partikel enthaltend die Schritte Suspendieren von Kernpartikeln in
einem Sol unter Verwendung einer Kernpartikelzubereitung und Sprühtrocknen der
Suspension unter Gelbildung, wobei die Kernpartikelzubereitung zu 75 Gew.-% aus
Partikeln mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm, bevorzugt zwischen 2 und
15 µm besteht.
Zur Durchführung des Gel/Sol-Prozesses, welchen das erfindungsgemäße Herstellungsver
fahren benutzt, wird auf die Beschreibung im Stand der Technik verwiesen. Der wesent
liche Unterschied der Erfindung zu dem Vorbeschriebenen, ist der Einsatz einer be
stimmten Kernpartikelzubereitung, durch welche eine Zubereitung mit weniger als
5 Gew.-% kernloser Partikel hergestellt werden kann. Als besonders vorteilhaft hat sich ein
Verfahren erwiesen, bei dem zunächst ein Sol aus Tetraalkylorthosilikaten, Alkylboraten,
Aluminiumalkoholaten und Alkalialkoholaten in Ethanol hergestellt wird und diese
Mischung mit Kalzium erhitzt wird. Anschließend wird die Mischung durch Zusatz von
Wasser hydrolysiert. In das so gebildete Sol werden die Kernpartikel in Festform zugege
ben und, bevorzugt mit Ultraschall, suspendiert. Anschließend wird die Suspension unter
Gelbildung in einem Sprüh-Trocknungsverfahren, bei dem die Düse geheizt wird, und bei
dem im wesentlichen Partikel entstehen, in denen 1 bis nur wenige Kernpartikel pro
Partikel enthalten sind (bevorzugt enthalten weniger als 1% der Partikel mehr als
10 Kernpartikel), versprüht. Das Sprühprodukt wird anschließend erhitzt, um das Gel zu
einem Glas zu verdichten. Auch hier hat der Zusatz von Zinkoxid zum Gel einen erheb
lichen Vorteil. Die Verdichtung kann bei höheren Temperaturen als bei solchen ohne Zink
zusatz durchgeführt werden, da der Erweichungspunkt des entstehenden Glases höher liegt.
Dadurch lassen sich organische Restbestandteile aus den eingesetzten Materialien leichter
austreiben.
Da nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Zubereitung mit einem sehr geringen
Anteil von kernlosen Partikeln entsteht, ist im allgemeinen keine anschließende Frak
tionierung nach kernlosen/kernhaltigen Partikeln mehr erforderlich.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren
durch nicht-kovalente Bindung der Nukleinsäuren aus einer Probe an Partikel mit einer
Glasoberfläche, Entfernen nicht-gebundener Probenbestandteile und Elution der gebun
denen Nukleinsäuren von der Glasoberfläche, wobei eine erfindungsgemäße Zubereitung
eingesetzt wird. Das Verfahren wird besonders einfach, wenn die Partikel magnetisch sind.
Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren mit Hilfe magnetischer Partikel mit einer
Glasoberfläche sind in WO 96/41811 beschrieben. Auf diese Offenbarung wird hier voll
inhaltlich Bezug genommen. Als Proben für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren
kommen insbesondere klinische Proben, wie Blut, Serum, Mundspülflüssigkeit, Urin,
Zerebralflüssigkeit, Sputum, Stuhl, Plasma, Punktate oder Knochenmarksproben in Frage.
Bevorzugtes Probenmaterial ist Serum. Zur Reinigung der Nukleinsäuren wird die Probe,
erforderlichenfalls nach Lyse eventuell enthaltender zellulärer Strukturen und Verdau von
strörenden Probenbestandteilen, mit der erfindungsgemäßen Zubereitung versetzt, z. B. in
Form einer bestimmten Menge einer Suspension der Partikel. Nach einer Inkubationszeit,
während derer die Nukleinsäuren an die Glasoberfläche sequenzunspezifisch binden, wird
die Flüssigkeit zusammen mit den nicht-gebundenen Probenbestandteilen entfernt und die
Partikel gewünschtenfalls gewaschen, um Reste zu entfernen. Die noch daran gebundenen
Nukleinsäuren werden durch Elution mit einer Flüssigkeit, in der sich die Nukleinsäuren
gut lösen, von der Oberfläche entfernt. Die resultierende Flüssigkeit kann nun beliebig
weiter bearbeitet werden, insbesondere in Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, wie
z. B. die PCR, da während des Reinigungsverfahrens die meisten Enzyminhibitoren abge
trennt wurden.
Sofern die Partikel magnetisch sind, ist die Entfernung der Flüssigkeit von Partikeln mit
den Nukleinsäuren besonders einfach, da die Partikel mit Hilfe eines Magneten gesammelt
und festgehalten werden können, während die Flüssigkeit entfernt wird. Wenn die Partikel
nicht magnetisch sind, können sie von der Flüssigkeit durch Filtration mit einem geeigne
ten Filter abgetrennt werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
In einen 5-Liter-Rundkolben werden 1750 ml Tetraethylorthosilikat (Hersteller: Wacker,
Burghausen) vorgelegt und bei Raumtemperatur unter Rühren (500 U/min) zügig zuge
geben:
541 ml Triethylborat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
250 ml Kaliummethanolat (25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen))
261 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
292 ml Ethanol und
8,49 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
541 ml Triethylborat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
250 ml Kaliummethanolat (25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen))
261 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
292 ml Ethanol und
8,49 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
Die Mischung wird anschließend unter Rühren erhitzt bis zum starken Rückfluß. Über
30 Minuten wird eine Mischung von insgesamt 583 ml Ethanol und 233 ml Wasser zuge
tropft. Nach Abkühlen auf < 50°C wird das Sol umgefüllt in einen offenen Behälter und
1200 g Pigment IRIODIN 600 Black Mica (Hersteller: Merck, Darmstadt) dazugegeben.
Das Sol wird nach vollständiger Pigmentzugabe noch 1 Minute bei 500 U/min gerührt und
anschließend 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Nach der Ultraschallbehandlung wird
das Sol-Pigment-Gemisch mit einem Dissolverrührer bei ca. 500 U/min gerührt, bis die
gesamte Menge aufgebraucht ist.
Versprüht wird in einem Sprühturm der Fa. Nubilosa, Konstanz, mit einem Durchmesser
von 0,75 m, einer Höhe von 2,5 m und einer Verdunstungsleistung (bezogen auf Wasser)
von 1-3 Liter/Stunde. Die Lufteinlaßtemperatur beträgt 270°C, die Auslaßtemperatur ca.
130°C. Der Durchsatz der Luft ist 7,2 m3/min. Zum Sprühen wird eine Zweistoffdüse ver
wendet mit einem Sprühdruck von 2 bar. Die Förderleistung der verwendeten Kugelventil
membranpumpe beträgt 60 g Sol/min.
Das Sprühprodukt wird in einem Zyklon abgefangen, an Luft bei 250°C 1 Stunde vorver
dichtet und anschließend in einem Stickstoffofen mit einer Heizrate von 1 K/min auf eine
Temperatur von 675°C gebracht, 1 Stunde dort gehalten und abgekühlt auf 300°C. Bei
300°C wird Sauerstoff zudosiert, 1 Stunde gehalten, dann abgekühlt auf Raumtemperatur.
Nach dem Abkühlen erfolgt eine Siebung mit einem Sieb mit einer Maschenweite von
50 µm zur Entfernung von eventuell vorhandenen Aggregaten. Damit ist die Herstellung
abgeschlossen.
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wird ein zinkhaltiges Sol bereitet. Dazu werden
folgende Ädukte eingewogen und analog behandelt:
1258 ml Tetraethylorthosilikat (Hersteller: Wacker, Burghausen)
387 ml Triethylborat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
188 ml Kaliummethanolat 25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
196 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
1285 ml Ethanol
6,39 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
58,5 g Zinkacetat dehydriertes Dihydrat (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
1258 ml Tetraethylorthosilikat (Hersteller: Wacker, Burghausen)
387 ml Triethylborat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
188 ml Kaliummethanolat 25%ig in Methanol (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
196 g Aluminium-sec.-Butylat (Hersteller: Aldrich, Steinheim)
1285 ml Ethanol
6,39 g Calcium (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
58,5 g Zinkacetat dehydriertes Dihydrat (Hersteller: Fluka, Deisenhofen)
Nach dem Kochen unter Rückfluß werden 178 ml H2O zusammen mit 444 ml Ethanol
binnen 30 Minuten zugetropft. Nach dem Abkühlen werden 1200 g Pigment zugesetzt.
Ansonsten siehe Beispiel 1.
Das pigmenthaltige Sol aus Beispiel 3 wird analog Beispiel 2 verarbeitet. Die Verdich
tungstemperatur beträgt jedoch 750°C.
Das pigmenthaltige Sol aus Beispiel 3 wird analog Beispiel 2 verarbeitet. Die Verdich
tungstemperatur beträgt jedoch 750°C und die Temperatur bei der Behandlung in Sauer
stoff beträgt 200°C.
Zum direkten Nachweis von gebundener bzw. nicht-gebundener DNA bzw. RNA werden
32P-markierter HIVgag RNA Standard mit 1,4 kb bzw. 32P-markierter Lambdaamplikons
mit 3 kb eingesetzt. Als Probe dient Negativplasma (human) enthaltend jeweils 109
Kopien.
In ein 2-ml-Eppendorf-Gefäß werden 500 µl Negativplasma mit 109 Kopien 32P gelabelte
Lambdaamplikons gegeben. Dazu werden 480 µl Bindepuffer/Proteinase-K-Lösung (5 : 1)
zupipettiert, gevortext und bei 70°C für 10 Minuten inkubiert. Nach Abkühlen auf Raum
temperatur werden 400 µl isopropanolische MGP-Suspension mit einem Gesamtinhalt von
3 mg MGP zupipettiert. Unmittelbar darauf wird durch Vortexen gemischt. Die Probe wird
dann für 15 Minuten auf einem Mischer, z. B. Thermomischer 5436 von Eppendorf, inku
biert.
Die MGP werden durch Überführung der Probe in einen Magnetseparator konzentriert.
Nach 1 Minute wird der Überstand vollständig abpipettiert.
0,5 ml Waschpuffer werden zu den MGPs pipettiert. Die Probe wird gevortext und dann in
den Magnetseparator überführt. Der Überstand wird nach 1 Minute abpipttiert. Die Wasch
prozedur wird noch 2 × wiederholt.
Zu den MGP werden 200 ml Elutionspuffer zugesetzt. Bei 80°C wird 10 Minuten auf
einem Thermomischer bei 1400 RPM inkubiert. Die Probe wird in den Magnetseparator
überführt und nach 1 Minute wird das gesamte Eluat abgenommen. Das Eluat wird dann in
ein neues Gefäß überführt und in einem Szintillationszähler vermessen.
Aus dem Verhältnis der Radioaktivität des Eluates zu der Radioaktivität der Probe vor der
Reinigungsprozedur kann die Ausbeute ermittelt werden.
Ergebnisse mit MGPs unterschiedlicher Beschichtung:
Gemäß Beispiel 1 wird eine Charge gefertigt, bei der das Pigment Black Mica (BM) ist.
Gemäß Beispiel 1 wird eine Charge gefertigt, bei der das Pigment MMB (Microna Matte
Black (Hersteller: Merck, Darmstadt)) ist.
MGP gemäß den Beispielen 7 und 8 wird bei einer Probenvorbereitung eingesetzt. Als
Probe dient Humanplasma mit 100 Kopien/ml HCV-Viren. Das Eluat der Probenvorberei
tung wird einer Amplifikation unterworfen und das Amplifikationsergebnis mit einem
Elektrolumineszenzverfahren detektiert. In einem weiteren Versuch war die Probe Human
plasma mit 600 Kopien/ml HBV-Viren.
Ein zinkhaltiges Sol wird in Analogie zu Beispiel 3 hergestellt, jedoch nur 240 g Sol.
Nach dem Abkühlen werden 71 g Carbonyleisenpulver HQ (BASF, Ludwigshafen) zuge
setzt, 1 Minute bei 500 U/min gerührt und anschließend 5 Minuten mit Ultraschall be
handelt. Das Sol wird in einem Sprühtrockner (Büche 190, Mini Spray Dryer) versprüht.
Die Düsentemperatur des Sprühtrockners beträgt 140°C.
Das erhaltene Pulver wird bei 150°C an Luft ausgeheizt. Die Aufheizgeschwindigkeit
beträgt 1 K/min, die Haltezeit 1 Stunde. Anschließend wird die Luft im Ofen durch N2
ersetzt, mehrfach gespült und mit 1 K/min auf 700°C erhitzt, 1 Stunde gehalten, auf
200°C abgekühlt mit 1 K/min. Bei 200°C wird N2 durch Luft ersetzt und 1 Stunde gehal
ten. Danach wird abgekühlt auf Raumtemperatur. Eventuell entstandene Aggregate werden
mit einem 50-µm-Sieb ausgesiebt.
Die Ausbeute beträgt 62,4 g. Siebverluste sind vernachlässigbar; Aggregate treten nicht
auf.
Gemäß Beispiel 6 wird 32P-markierter HIVgag Standard mit 1,4 Kb an die Partikel gemäß
Beispiel 11 gebunden. Die radioaktive Messung ergibt eine Bindung < 80%.
Je 3 mg Partikel gemäß Beispiel 10 werden in ein Eppendorf-Gefäß 2 ml überführt und mit
je 1,5 ml H2O suspendiert.
Die Partikel in Gefäß 1 werden mit einem Magneten an die Gefäßwand gezogen und an
schließend durch Schütteln resuspendiert. Gleichzeitig werden die Partikel in Gefäß 2 auf
geschüttelt.
Die Sedimentation im Schwerefeld wird visuell beobachtet. Es ergeben sich keine Unter
schiede.
Claims (13)
1. Zubereitung enthaltend Partikel mit einer Glasoberfläche, wobei mehr als 75 Gew.-%
dieser Partikel eine Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm haben.
2. Zubereitung gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 95 Gew.-% der
Partikel mit einer Korngröße von zwischen 0.5 und 15 µm magnetisch sind.
3. Zubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß weniger als die
Hälfte der Partikel eine Korngröße von weniger als 2 µm haben.
4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß
weniger als 2% der Partikel eine Korngröße von weniger als 0.5 µm haben.
5. Zubereitung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen
Partikel einen magnetischen Kern aufweisen, der mit Glas ummantelt ist.
6. Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht mehr als 10%
dieser Partikel Partikel mit einer Korngröße von mehr als 10 µm sind.
7. Zubereitung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Partikel einen Glasmantel aufweisen, der einen Anteil von zwischen 2 und
6 mol% Zinkoxid enthält.
8. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln mit einem Kern um
mantelt mit einer Gelschicht enthaltend weniger als 5 Gew.-% kernlose Partikel, ent
haltend die Schritte
- - Suspendieren von Kernpartikeln in einem Sol unter Verwendung einer Kern partikelzubereitung
- - Sprühtrocknen der Suspension unter Gelbildung
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Sol Zink enthält.
10. Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren durch nicht-kovalente Bindung der
Nukleinsäuren aus einer Probe an Partikel mit einer Glasoberfläche, Entfernen nicht-
gebundener Probenbestandteile und Elution der gebundenen Nukleinsäuren von der
Glasoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einer Zubereitung gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt gebracht wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel magnetisch
sind und bei Entfernung der Probenbestandteile durch einen Magneten festgehalten
werden.
12. Verwendung von Zinkoxid in nach dem Sol/Gel-Prozeß erzeugten Glasschichten zur
Erhöhung der Bindefähigkeit der Glasoberfläche für Nukleinsäuren.
13. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Partikeln mit einem Kern um
mantelt mit einer Glasschicht enthaltend weniger als 5 Gew.-% kernlose Partikel, ent
haltend die Schritte
- - Suspendieren von Kernpartikeln in einem Sol unter Verwendung einer Kern partikelzubereitung
- - Sprühtrocknen der Suspension unter Gelbildung
- - Verdichtung des Gels zum Glas
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---|---|---|---|
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE102004058828A1 (de) * | 2004-10-28 | 2006-06-14 | Directif Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren |
WO2021198289A1 (en) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Université de Liège | Preparation of magnetic core-shell particles |
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-
1998
- 1998-11-30 DE DE19855259A patent/DE19855259A1/de not_active Ceased
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE102004058828A1 (de) * | 2004-10-28 | 2006-06-14 | Directif Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren |
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