JP2004135678A - 核酸を精製するための磁性粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は核酸の精製のために有効な新規ガラス表面粒子調製物の提供を課題とする。
【解決手段】 ガラス表面を有する粒子の調製物であって、これらの粒子の７５重量％超が０．５μｍ〜１５μｍの粒子サイズを有し、且つガラス表面が２〜６モル％の酸化SiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3及びZnOから構成される粒子を含む調製物が核酸の精製のための方法において極めて有利であることが証明された。これは特に核酸収率の上昇をもたらす。
【選択図】 なし
【解決手段】 ガラス表面を有する粒子の調製物であって、これらの粒子の７５重量％超が０．５μｍ〜１５μｍの粒子サイズを有し、且つガラス表面が２〜６モル％の酸化SiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3及びZnOから構成される粒子を含む調製物が核酸の精製のための方法において極めて有利であることが証明された。これは特に核酸収率の上昇をもたらす。
【選択図】 なし
Description
本願はガラス表面を有する粒子の調製物、かかる調製物を製造するための方法、及びこの調製物の助けを借りて核酸を精製する方法に関する。
核酸は最近になって医療診断の注目の的になりはじめている。所定の核酸の有無を疾患の指標として使う莫大な数の検査方法が現在開発されている。これらには、例えば体液中のウィルスや細菌の如き感染性生物の検査、そして更には例えば癌におけるゲノム核酸内の突然変異の検出が挙げられる。しかしながら、核酸は通常試料材料内でごく微量で存在する。従って、核酸をその他の成分、例えばタンパク質又はその他の細胞性成分であってその後の検出方法を妨害することのあるものから単離するための様々な方法が開発されている。これらの方法のいくつかは固相に結合した捕獲プローブを利用し、ここでこの捕獲プローブは分離すべき核酸とハイブリダイズしてそれらを固相上に保持し、しかもその他の試料成分を除去させることができる。かかる方法は例えばＥＰ−Ｂ−０，３０５，３９９号に記載されている。しかしながら、これらの方法の欠点はそれらが各々極めて特別なヌクレオチド配列を有する核酸を精製するためにだけ適当である点にある。
セルロース及び酸化鉄から成る磁性粒子の助けを借りて核酸を単離する方法はＷＯ９１／１２０７９号に記載され、それにおいては粒子サイズは１〜１０μｍである旨記載されている。これらの粒子はガラス表面は含まず、そして核酸を沈殿させるような単離のためにだけ適当である。しかしながら、この凝集プロセスはその後の工程段階を妨害する数多くの試料成分も捕捉してしまう。
ＥＰ−Ｂ−０，３８９，０６３号は試料をカオトロピックグアニジニウム塩及びシリカ粒子の混合物と混合する方法を提唱する。この条件下では、シリカ粒子への核酸の結合は比較的配列とは独立している。その他の試料成分は洗浄により除去でき、そして核酸はその後溶出されうる。
核酸の配列非依存性精製のための本質的にコアのないガラス表面を有する磁性粒子がＷＯ９６／４１８１１号に記載されている。この場合に利用される粒子は、好適には磁性材料として磁鉄鉱を含むコアを有し、そしてそれらは好ましくは１０〜６０μｍの粒子サイズを有する。磁鉄鉱は約３０〜５０nmより大きい結晶状で強い磁気特性を示す。永久磁力は外磁場により誘導される。このような強い磁性コアを有する粒子は、外部磁場へのその最初の曝露を経て小型の永久磁石の特性を有するようになる。懸濁物において、かかる粒子は互いを引き付け合い、そして大きめの単位を形成する。外重力場の影響下で、このような大きめの単位は個々の粒子よりもす早く沈降する。これは不利であり、なぜなら長時間のインキュベーションでは頻繁なる再分散を要するからである。
少なくとも０．８μｍの厚みを有するガラス表面を有する顔料がＷＯ９６／４１８４０号に記載されている。亜鉛化合物もガラス形成成分として提唱されている。この方法で形成される顔料粒子は好ましくは２〜２０μｍの粒子サイズを有する。
特殊なサイズを有するコア粒子にゲルをコーティングし、次いで圧縮させてガラス表面を形成するゾル−ゲルプロセスを利用した粒子の製造について過去に発表された方法では、コア粒子を含まない大量の粒子が形成されてしまうことがこの度判明した。かかる調製物を使用して実施する核酸検出方法は核酸の大損失を招くか、又は収率を高めるために微粒子を労力をかけて分離させなければならないことを招く。本発明の目的は当業界の現状を完全にもしくは部分的に改善すること、そして特に比較的狭い粒度分布を有する粒子を製造し、且つ更には核酸精製の収率を高める及び／又は核酸粒子の精製用の粒子であって、外磁場に曝露した後でさえも、凝集する性質を極めてわずかにしかもたず、しかも重力場において磁場にまだ曝露されていない粒子とまさに同じぐらいにゆっくりと沈降する粒子の提供にある。
本発明はガラス表面を有する粒子を含む調製物に関連し、ここでこれらの粒子の７５重量％超は０．５〜１５μｍの粒子サイズを有する。
本発明の更なる課題はゲル層又はガラス層のコーティングされたコアを含む粒子の調製物の製造のための方法及び本発明に係る調製物の助けを借りて核酸を精製するための方法にある。
本発明の更なる課題は超常磁性コアを有する粒子の製造方法及びかかる粒子の調製物にある。
本発明は更に、磁性、そして好ましくは軟磁性金属コアを有する粒子の製造方法及びかかる粒子の調製物に関する。
小さな直径を有する固体材料は当業者により粒子と称されている。このような粒子は好ましくは本質的に球形の表面を有する。しかしながら、後述の寸法を有する血小板型及び繊維状粒子も粒子と解されている。核酸を精製するために特に好適となるには、粒子が好ましくは磁性のコア（顔料部分）を有し、且つガラスの層でコーティングされていることが所望される。かかるコアは好ましくは酸化金属、例えば酸化アルミニウム、酸化鉄、酸化クロム、酸化銅、酸化マンガン、酸化鉛、酸化錫、酸化チタン、酸化亜鉛及び酸化ジルコニア、又は金属、例えばＦｅ，Ｃｒ，Ｎｉもしくは磁性合金を含む。本発明に係る粒子の機能にとってこのコアの組成はさほど重要ではなく、なぜならこのコアはガラス表面でコーティングされ、従ってこのコアは核酸を単離するもととなる試料と直接接触するわけではないからである。かかるコアは商業的に入手できる。もしこのコアがＦｅ3 Ｏ4 （磁鉄鉱）もしくはＦｅ2 Ｏ3 （マグヘマイト）又はＦｅもしくはＣｒもしくはＮｉもしくは磁性合金を含むなら、これらのコアは磁性体である。
軟磁性体と称される適当な材料は純粋な元素、Ｆｅ，Ｎｉ，Ｃｒ及びそれらの合金を基礎とし、好ましくはＮｉを基礎とする。かかる合金の例はパーマロイの名で知られる。それらは７０〜８０％のＮｉと、Ｃｒ，Ｃｕ及びＭｏの添加物とから成る。磁性軟材料から成る粒子は磁場の不在下では互いを引き付けないか、又はごくわずかにしか引き付けない。
細く分散した金属粉末は極めて反応性である。それらは空気中で自己発火するおそれがあり、それらは自然性である。従って、かかる細く分散した金属粒子がゾル−ゲルプロセスにより、その磁性特性を有意に変えることなくガラス層でコーティングされうることは極めて驚くべきことである。カルボニル鉄粉が金属粉末として特に好適に利用され、そしてＨ2 内で還元されたそのタイプは特に好適な磁気特性を有する。カルボニル鉄ホイスカーは特に好適な特性を有する。
金属粉末は好ましくは１０nm〜１００μｍ、そして特に好ましくは２００nm〜８μｍの粒子サイズを有する。
本発明に係るガラス表面は珪素を含む非晶質材料から成る。酸化珪素の他に、このガラスは下記の成分を１又は複数種含むのが好ましい（モル％で）：
Ｂ2 Ｏ3 （０〜３０％）、Ａｌ2 Ｏ3 （０〜２０％）、ＣａＯ（０〜２０％）、ＢａＯ（０〜１０％）、Ｋ2 Ｏ（０〜２０％）、Ｎａ2 Ｏ（０〜２０％）、ＭｇＯ（０〜１８％）、Ｐｂ2 Ｏ3 （０〜１５％）、ＺｎＯ（０〜６％）。
Ｂ2 Ｏ3 （０〜３０％）、Ａｌ2 Ｏ3 （０〜２０％）、ＣａＯ（０〜２０％）、ＢａＯ（０〜１０％）、Ｋ2 Ｏ（０〜２０％）、Ｎａ2 Ｏ（０〜２０％）、ＭｇＯ（０〜１８％）、Ｐｂ2 Ｏ3 （０〜１５％）、ＺｎＯ（０〜６％）。
数多くのその他の酸化物、例えばＮａ2 Ｏ，Ｍｎ2 Ｏ3 ，ＴｉＯ2 ，Ａｓ2 Ｏ3 ，Ｆｅ2 Ｏ3 ，ＣｕＯ，ＺｒＯ2 ，ＣａＯ等も０〜５％ほどの少量で存在していてよい。ＳｉＯ2 ，Ｂ2 Ｏ3 ，Ａｌ2 Ｏ3 ，ＣａＯ，Ｋ2 Ｏ及びＺｎＯの組成を有する表面が特に有効であると証明されている。核酸の収率との関係で特に有利な硼珪酸ガラスは２〜６、好ましくは約４モル％の酸化亜鉛含量を有する。このガラス層は特に好ましくは６８〜７９モル％のＳｉＯ2 、１５〜５モル％のＢ2 Ｏ3 、６〜２．５モル％のＫ2 ＯとＮａ2 Ｏとの総量、４〜１モル％のＣａＯ、８〜２モル％のＡｌ2 Ｏ3 、６〜２モル％のＺｎＯから成る。いわゆるゲル−ゾル法、しかる後の形成される層の乾燥及び圧縮によって形成されたガラスが本発明の観点で特に好ましい。この方法の本質的な観点は知られており、そして例えばC.J.Brinker, G.W.Scherer“Sol Gel science-The physics and chemistry of Sol Gel Processing”, Academic Press Inc.1990及びSol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C.Klein Ed.Kluwer Academic Publishers 1994頁 450以降、並びにDE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041及びDE-A-4217432に記載されている。このゲル−ゾル法では、ネットワーク形成成分のアルコキシド、例えばＳｉＯ2 ，Ｂ2 Ｏ3 ，Ａｌ2 Ｏ3 ，ＴｉＯ2 ，ＺｒＯ2 及びＺｎＯをその他の成分の酸化物及び塩と共に例えばアルコール性溶液に加え、そして加水分解する。
水の添加は出発成分の加水分解を開始させる。この反応は比較的速く進み、なぜならアルカリイオンは珪酸エステルの加速分解速度に対して触媒的効果を有するからである。ゲル形成の完了後、ゲルを乾かし、そして熱プロセスを介して圧縮してガラスを形成させることができる。
ゾル、対、顔料の量比は本発明に係る磁性顔料の収率に著しい影響を及ぼす。その制約は、顔料の量が、ポンピング及びスプレーイングが可能な材料が形成されるのに十分少ないものとする点にある。顔料の量が少なすぎると、微細材料、例えば非磁性材料の比率は大きくなりすぎてしまい、そして妨害を示す。１０〜４５ｇの顔料／１００mlのゾルの量比が顔料収率との関係で好都合であることが見い出された。
スラリーは好ましくはノズルを介してスプレーイングして粉末を形成させ、そしてそのエアロゾールを落下経路上で乾燥させる。このノズルは好ましくはスラリーの乾燥を促進させるために加熱しておく。ノズル温度はノズルの形状とは独立に好ましくは約１２０〜２５０℃とする。適切な蒸発速度と散乱の回避との間での妥協点を見つけなくてはならない。
圧縮温度は収率との関係でできるだけ高いものを選択すべきである。しかしながら、それが高すぎると、粒子は凝集し、そして凝集物はふるいにより除去せねばならない。しかしながら、層への亜鉛の添加が融点を驚くべきほどに高め、それ故高めの圧縮温度（７１０〜８００℃）の利用が可能となる。大気中での後処理は温度が高すぎると磁気特性の損失を招き、そのために過剰に高い温度は避けるべきである。亜鉛を加えると、この場合には他の温度（好ましくは１５０〜２５０℃）を利用することも可能となる。
本発明の範囲において、はるかに小さい磁性コアがＷＯ９６／４１８１１号に記載の方法に利用できうることが見い出された。特に、コアはナノスケールで、例えば５０nm未満、好ましくは３０nm未満の結晶サイズを有する磁鉄鉱が使用可能である。コアサイズの下限界はコアの取り扱い特性、そして特にその凝集物を形成する性質に由来する。このコアは好ましくは５nmより大きく、特に好ましくは、７nmより大きい。ナノスケールコアの磁気特性は超常磁性と称されている。得られる粒子は外磁場に曝露されるとすばやく沈降する。再分散の後、重力場でのその沈降速度は、外磁場への曝露前での重力場でのその沈降速度と相違しない。これは有利であり、なぜならそれは再混合及び再懸濁することなく懸濁物内でのより長いインキュベーション時間を可能にするからである。
本発明に係る調製物を製造するため、コア粒子の７５重量％超が０．５より若干小さい粒子サイズと１５μｍより若干小さい粒子サイズとの間の粒子サイズを有するコア粒子の調製物がゾル／ゲルプロセスにおいて利用される。このコア粒子はガラス層の厚みの程度にまで、ガラスコート化粒子よりも小さくなければならない。本発明の方法を経て、ガラス層はゲル、対、コア粒子の比の如き選定の条件に依存して、５nm〜１μｍの厚みとなるであろう。平均してガラス層は厚さ０．２〜０．３μｍであるべきである。
粒子の７５重量％超が２〜１５μｍの粒子サイズを有するガラス表面をもつ粒子を含む調製物が特に好ましい。この規定の粒子サイズを有する粒子の比率は特に好ましくは９０重量％超である。
磁性コア粒子が特に好適に利用される。本発明に係る調製物の長所は、０．５〜１５μｍ、好ましくは２〜１５μｍの粒子サイズを有する粒子の９５重量％超が好適には磁性体である点にある。このことは、コアを含まない粒子の比率が公知の方法と比較して激減していることを意味する。これは非磁性粒子がわずかにしか存在しない事実により認識されうる。このことは、核酸を精製する方法において当該調製物を使用する前に、磁性粒子から非磁性粒子を分離する必要性が事実上もはやなくなったことを意味する。これは製造工程を簡略化する。
本発明に係る調製物は粒子の５０％未満が２μｍ未満の粒子サイズを有するという点で更に特徴付けられうる。従って、サイズの小さい粒子内で比較的高い比率を有する非磁性微細画分において相当な減少がある。特に好ましくは、粒子の２％未満が０．５μｍ未満の粒子サイズを有する。
好ましくは、当該調製物の粒子の１０％以下、そして特に好ましくは１０〜４０％が１０μｍ超の粒子サイズを有する。
本発明に係る粒子の他に、本発明の調製物はその他の非ガラス含有成分、例えば緩衝物質又は懸濁剤、例えば水又は水のアルコール性溶液も含んでよい。
本発明の調製物の粒子のガラス層は好ましくは２〜６モル％、特に好ましくは４モル％の酸化亜鉛を含む。これはその他の固体成分の量と比較して、固体ゾル中にこの程度の質量の酸化亜鉛の量を有することにより達成される。酸化亜鉛の比率は、特にこの調製物を長時間加熱するときに酸化硼素の量が下がるほど上昇し、なぜなら酸化硼素はこの製造条件下では既に揮発性であるからである。
酸化亜鉛の比率が２〜６モル％であるガラス層を有する粒子が核酸の精製のために特に有効であることが証明された。状況によっては、核酸の収率は、酸化亜鉛のない同じガラス層と比べ５０％上昇した。
本発明の別の課題はコアのない粒子を５重量％未満含むゲル層でコーティングされたコアを有する粒子の製造方法であり、この方法はコア粒子調製物を用いてゾル中でコア粒子を懸濁し、そしてこの懸濁物をスプレードライしてゲルを形成する段階を含んで成り、ここでこのコア粒子調製物は０．５〜１５μｍ、好ましくは２〜１５μｍの粒子サイズを有する粒子７５重量％を含む。
本発明に係る製造方法により利用されるゲル／ゾルプロセスの実施については従来技術の記載を参照されたい。本発明と従来技術との主たる相違はコアのない粒子を５重量％未満含む調製物の製造を可能にする特定のコア粒子調製物の利用にある。まずゾルをエタノール中でテトラアルキルオルトシリケート、アルキルボレート、アルミニウムアルコラート及びアルカリアルコラートから調製し、そしてこの混合物をカルシウムと一緒に加熱する方法が特に好都合であると証明された。その後、この混合物は水の添加により加水分解させる。このようにして形成したゾルにコア粒子を固体状で加え、そして好適には超音波で懸濁する。その後、この懸濁物をスプレードライ工程で噴霧化してゲルを形成させる。この工程ではノズルを加熱しておき、そして粒子当り１から数個のコア粒子（好ましくは粒子の１％未満が１０個以下のコア粒子を含む）を含む粒子が主として形成される。スプレー生成物を次に加熱してゲルを圧縮し、ガラスを形成する。また、この場合にはゲルへの酸化亜鉛の添加が極めて有利である。この圧縮は亜鉛を添加しない調製物よりも高温で実施してよく、なぜなら形成されるガラスの軟化点は高くなるからである。このことは、出発材料からの有機残渣の排出を一層容易にする。
本発明に係る方法ではコアのない粒子をごくわずかな比率で含む調製物が形成されるため、コアを有するのと有さない粒子とのその後の分画は一般にもはや必要なくなる。
本発明は更に核酸を試料からガラス表面を有する粒子へと非共有式に結合させ、未結合の試料成分を除去し、そして結合した核酸をこのガラス表面から溶出させることにより核酸を精製するための方法にも関連し、この方法では本発明に係る調製物が利用される。この方法は粒子が磁性体であるときに極めて簡単である。
ガラス表面を有する磁性粒子の助けを借りて核酸を精製する方法はＷＯ９６／４１８１１に記載されている。その開示内容を全て参照されたい。本発明に係る精製方法のために適当な試料は特に臨床試料、例えば血液、血清、口をすすいだ後の液体、尿、大脳流体、痰、大便、血漿、生検又は骨髄試料である。血清が好適な試料材料である。核酸を精製するには、必要なら、存在しうる細胞構造物の溶解及び妨害試料成分の分解の後、例えば所定量の粒子懸濁物の形態の本発明の調製物と混合する。核酸が配列非特異的にガラス表面に結合するインキュベーション期間の後、液体を未結合の試料成分と一緒に除去し、そしてその粒子を所望するなら残留物の除去のために洗浄する。まだ結合し続けている核酸をその表面から、この核酸がよく溶解する液体による溶出により除去する。得られる液体はこのようにして任意の所望の態様で処理することができ、そして特に増幅方法、例えばＰＣＲに用いることができ、なぜなら酵素阻害剤のほとんどがこの精製工程の際に分離されるからである。
粒子が磁性体なら、核酸を有する粒子から液体を除去するのは極めて容易であり、なぜならこのような粒子は磁石の助けを借りて集め、保持でき、その間に液体を除去できるからである。この粒子が非磁性体なら、それらは適当なフィルターを利用する濾過により液体から分離されうる。
本発明を以下の実施例により一層詳しく説明する。
実施例１
亜鉛非含有層の調製のためのゾル（７４ＳｉＯ2 ・１５Ｂ2 Ｏ3 ・４Ｋ2 Ｏ・２ＣａＯ・５Ａｌ2 Ｏ3 ）
１７５０mlのテトラエチルオルトシリケート（製造者：Wacker Burghausen ）を５リットルの丸底フラスコに入れ、そして以下の化合物を室温にて撹拌しながらすばやく添加する（５００rpm ）：
５４１mlのトリエチルボレート（製造者：Aldrich, Steinheim）
２５０mlのメタノール酸カリウム（メタノール中２５％；製造者：Fluka, Deisenhofen）
２６１mgの第二ブチル酸アルミニウム（製造者：Aldrich, Steinheim）
２９２mlのエタノール及び
８．４９ｇのカルシウム（製造者：Fluka, Deisenhofen）
亜鉛非含有層の調製のためのゾル（７４ＳｉＯ2 ・１５Ｂ2 Ｏ3 ・４Ｋ2 Ｏ・２ＣａＯ・５Ａｌ2 Ｏ3 ）
１７５０mlのテトラエチルオルトシリケート（製造者：Wacker Burghausen ）を５リットルの丸底フラスコに入れ、そして以下の化合物を室温にて撹拌しながらすばやく添加する（５００rpm ）：
５４１mlのトリエチルボレート（製造者：Aldrich, Steinheim）
２５０mlのメタノール酸カリウム（メタノール中２５％；製造者：Fluka, Deisenhofen）
２６１mgの第二ブチル酸アルミニウム（製造者：Aldrich, Steinheim）
２９２mlのエタノール及び
８．４９ｇのカルシウム（製造者：Fluka, Deisenhofen）
この混合物を次に撹拌しながら加熱して強力に還流させる。５８３mlのエタノールと２３３mlの水とが一緒になって混合物を３０分かけて滴下する。＜５０℃にまで冷却後、ゾルを開放容器に移し、そして１２００ｇの顔料IRIODIN 600 Black Mica（製造者：Merck, Darmstadt）を加える。顔料の添加の完了後、このゾルを更に１分間５００rpm で撹拌し、しかる後超音波で５分処理する。超音波処理後、このゾル−顔料混合物を溶解撹拌器で約５００rpm 、全量が消費されるまで撹拌する。
実施例２
ガラスコート化顔料の調製物（ＭＧＰ）
直径０．７５ｍ、高さ２．５ｍ及び蒸発容量（水で換算）１〜３リットル／時間のNubilosa Company, Konstanz由来のスプレータワーでスプレーイングを実施する。空気入口温度は２７０℃、出口温度は約１３０℃とする。空気の流速は７．２ｍ3 ／min とする。２bar のスプレー圧を有する二流体ノズルをスプレーイングのために用いる。ボールバルブ膜ポンプの輸送能力は６０ｇのゾル／min とする。
ガラスコート化顔料の調製物（ＭＧＰ）
直径０．７５ｍ、高さ２．５ｍ及び蒸発容量（水で換算）１〜３リットル／時間のNubilosa Company, Konstanz由来のスプレータワーでスプレーイングを実施する。空気入口温度は２７０℃、出口温度は約１３０℃とする。空気の流速は７．２ｍ3 ／min とする。２bar のスプレー圧を有する二流体ノズルをスプレーイングのために用いる。ボールバルブ膜ポンプの輸送能力は６０ｇのゾル／min とする。
このスプレー生成物を大気中で２５０℃にて１時間予備圧縮したサイクロンの中に捕捉させ、しかる後１ｋ／min の加熱速度にて窒素オーブン内で６７５℃の温度にし、このオーブンの中で１時間保ち、そして３００℃に冷却する。酸素を３００℃にて加え、１時間保ち、次いで窒素にまで冷却する。冷却後、それを５０μｍのメッシュサイズを有するふるいを用いてふるいがけし、存在しうる凝集物を除去する。これは調製物を完成させる。
実施例３
亜鉛含有層を調製するためのゾル（７０．６７ＳｉＯ2 ・１４．３３Ｂ2 Ｏ3 ・４Ｋ2 Ｏ・２ＣａＯ・５Ａｌ2 Ｏ3 ・４ＺｎＯ）
亜鉛を含むゾルを実施例１と同様にして調製する。このために、以下の重量の抽出物を加え、そして同様にして処理する：
１２５８mlのテトラエチルオルトシリケート（製造者：Wacker Burghansen ）
３８７mlのトリエチルボレート（製造者：Aldrich, Steinheim）
１８８mlのメタノール酸カリウム（メタノール中２５％；製造者：Fluka, Deisenhofen）
１９６ｇの第二ブチル酸アルミニウム（製造者：Aldrich, Steinheim）
１２８５mlのエタノール
６．３９ｇのカルシウム（製造者：Fluka, Deisenhofen）
５８．５ｇの酢酸亜鉛脱水・二水和物（製造者：Fluka, Deisenhofen）
亜鉛含有層を調製するためのゾル（７０．６７ＳｉＯ2 ・１４．３３Ｂ2 Ｏ3 ・４Ｋ2 Ｏ・２ＣａＯ・５Ａｌ2 Ｏ3 ・４ＺｎＯ）
亜鉛を含むゾルを実施例１と同様にして調製する。このために、以下の重量の抽出物を加え、そして同様にして処理する：
１２５８mlのテトラエチルオルトシリケート（製造者：Wacker Burghansen ）
３８７mlのトリエチルボレート（製造者：Aldrich, Steinheim）
１８８mlのメタノール酸カリウム（メタノール中２５％；製造者：Fluka, Deisenhofen）
１９６ｇの第二ブチル酸アルミニウム（製造者：Aldrich, Steinheim）
１２８５mlのエタノール
６．３９ｇのカルシウム（製造者：Fluka, Deisenhofen）
５８．５ｇの酢酸亜鉛脱水・二水和物（製造者：Fluka, Deisenhofen）
還流しながら煮沸後、１７８mlのＨ2 Ｏを４４４mlのエタノールと一緒に３０分以内の時間をかけて滴下する。冷却後、１２００ｇの顔料を加える。その他は実施例１を参照されたい。
実施例４
亜鉛含有コート化顔料の調製物
実施例３由来の顔料含有ゾルを実施例３に類似して処理する。しかしながら、圧縮温度は７５０℃とする。
亜鉛含有コート化顔料の調製物
実施例３由来の顔料含有ゾルを実施例３に類似して処理する。しかしながら、圧縮温度は７５０℃とする。
実施例５
改良式後処理を利用した亜鉛含有ガラスコート化顔料の調製物（ＭＧＰ、磁性ガラス粒子）
実施例３由来の顔料含有ゾルを実施例２と似たようにして処理する。しかしながら、圧縮温度は７５０℃とし、そして酸素内での処理温度は２００℃とする。
改良式後処理を利用した亜鉛含有ガラスコート化顔料の調製物（ＭＧＰ、磁性ガラス粒子）
実施例３由来の顔料含有ゾルを実施例２と似たようにして処理する。しかしながら、圧縮温度は７５０℃とし、そして酸素内での処理温度は２００℃とする。
実施例６
放射性32Ｐを利用するＤＮＡ又はＲＮＡの収率の決定
１．４kbの32Ｐ−ラベル化ＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡ標準品又は３kbの32Ｐ−ラベル化ラムダアンプリコンを結合した又は未結合のＤＮＡ又はＲＮＡの直接検出のために用いる。各々１０9 コピーを含む陰性血漿（ヒト）を試料として用いる。
放射性32Ｐを利用するＤＮＡ又はＲＮＡの収率の決定
１．４kbの32Ｐ−ラベル化ＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡ標準品又は３kbの32Ｐ−ラベル化ラムダアンプリコンを結合した又は未結合のＤＮＡ又はＲＮＡの直接検出のために用いる。各々１０9 コピーを含む陰性血漿（ヒト）を試料として用いる。
試料調製のための手順
１０9 コピーの32Ｐ−ラベル化ラムダアンプリコンを含む５００μｌの陰性血漿を２mlのEppendorf 容器に入れる。４８０μｌの結合バッファー／プロテイナーゼ・Ｋ溶液（５：１）をピペクトにより加え、ボルテックスにかけ、そして７０℃で１０分インキュベーションする。室温にまで冷却後、全部で３mgのＭＧＰを含む４００μｌのイソプロパノールＭＧＰ懸濁物をピペクトにより加える。その直後にそれをボルテックスにより混合する。次にそのサンプルをミキサー、例えばEppendorf 由来のサーモミキサー５４３６で１５分インキュベーションする。
１０9 コピーの32Ｐ−ラベル化ラムダアンプリコンを含む５００μｌの陰性血漿を２mlのEppendorf 容器に入れる。４８０μｌの結合バッファー／プロテイナーゼ・Ｋ溶液（５：１）をピペクトにより加え、ボルテックスにかけ、そして７０℃で１０分インキュベーションする。室温にまで冷却後、全部で３mgのＭＧＰを含む４００μｌのイソプロパノールＭＧＰ懸濁物をピペクトにより加える。その直後にそれをボルテックスにより混合する。次にそのサンプルをミキサー、例えばEppendorf 由来のサーモミキサー５４３６で１５分インキュベーションする。
試料を磁気分離器に移すことによりＭＧＰを濃縮する。１分後、その上清液をピペクトにより完全に除去する。
０．５mlの洗浄バッファーをピペクトによりＭＧＰに加える。このサンプルをボルテックスにかけ、次いで磁気分離器に移す。この上清液を１分後にピペクトにより除去する。この洗浄工程を更に２分間繰り返す。
２００mlの溶出バッファーをＭＧＰに加える。それらをサーモミキサー上で８０℃にて１０分、１４００rpm でインキュベーションする。そのサンプルを磁気分離器に移し、そして１分後に全溶出液を除去する。その溶出液を次に新たな容器に移し、そしてシンチレーションカウンターで測定する。
収率は溶出液の放射能と、精製手順前の試料の放射能との比から決定できる。
様々なコーティングを有するＭＧＰによる結果
ＤＮＡ収率 ＲＮＡ収率
実施例２のＭＧＰ（亜鉛なし） ４４％ ４４％
実施例４のＭＧＰ（亜鉛入り） ６２％ ５９％
実施例６のＭＧＰ ６６％ ７０％
（亜鉛入り、改良式後処理）
ＤＮＡ収率 ＲＮＡ収率
実施例２のＭＧＰ（亜鉛なし） ４４％ ４４％
実施例４のＭＧＰ（亜鉛入り） ６２％ ５９％
実施例６のＭＧＰ ６６％ ７０％
（亜鉛入り、改良式後処理）
実施例７
顔料ベースとしての黒雲母（対照例）
顔料を黒雲母（ＢＭ）とするバッチを実施例１に従って製造する。
顔料ベースとしての黒雲母（対照例）
顔料を黒雲母（ＢＭ）とするバッチを実施例１に従って製造する。
実施例８
顔料ベースとしてのマイクロマットブラック（ＭＭ１３）
顔料をＭＭＢ（マイクロマットブラック（製造者：Merck, Darmstadt））とするバッチを実施例１に従って製造する。
顔料ベースとしてのマイクロマットブラック（ＭＭ１３）
顔料をＭＭＢ（マイクロマットブラック（製造者：Merck, Darmstadt））とするバッチを実施例１に従って製造する。
実施例９
試料を様々な顔料を含むＭＧＰを用いて調整する、増幅後のシグナルレベル
実施例７及び８に記載のＭＧＰを試料の調製のために利用する。１００コピー／mlのＨＣＶウィルスを含むヒト血漿を試料として用いる。この試料調製物の溶出液を増幅にかけ、そして増幅結果を電気化学発光法により検出する。追加の実験において、試料は６００コピー／mlのＨＢＶウィルスを含むヒト血漿とした。
試料を様々な顔料を含むＭＧＰを用いて調整する、増幅後のシグナルレベル
実施例７及び８に記載のＭＧＰを試料の調製のために利用する。１００コピー／mlのＨＣＶウィルスを含むヒト血漿を試料として用いる。この試料調製物の溶出液を増幅にかけ、そして増幅結果を電気化学発光法により検出する。追加の実験において、試料は６００コピー／mlのＨＢＶウィルスを含むヒト血漿とした。
ＨＣＶ ＥＣＬ ＨＢＶ ＥＣＬ
カウント数 カウント数
実施例７に従うＭＧＰ（ＢＭ） ９７０００ ２５０００
実施例８に従うＭＧＰ（ＭＭＢ） １２７０００ ４３０００
カウント数 カウント数
実施例７に従うＭＧＰ（ＢＭ） ９７０００ ２５０００
実施例８に従うＭＧＰ（ＭＭＢ） １２７０００ ４３０００
実施例１０
顔料としてのカルボニル鉄粉末ＨＱ
亜鉛含有ゾルを実施例３に従って調製するが、但し２４０ｇのゾルだけとする。
顔料としてのカルボニル鉄粉末ＨＱ
亜鉛含有ゾルを実施例３に従って調製するが、但し２４０ｇのゾルだけとする。
冷却後、１０％＜０．５μｍ、５０％＜１．１μｍ、９０％＜２．２μｍの粒度分布を有する７１ｇのカルボニル鉄粉末ＨＱ（ＢＡＳＦ，Ludwigs-hafen ）を加え、５００rpm で１分撹拌し、次いで超音波で５分処理する。このゾルをスプレードライヤー（Buche 190, Mini Spray Dryer ）でスプレーイングする。このスプレードライヤーのノズル温度は１４０℃とする。
得られる粉末を大気中で１５０℃にて加熱する。加熱速度は１ｋ／min とし、そして保持時間は１時間とする。次に、オーブン内の空気をＮ2 と交換し、数回フラッシングを行い、そして１ｋ／min で７００℃にまで加熱し、１時間保持し、２００℃へと１ｋ／min で冷却する。次いでそれを室温にまで冷却する。形成されうる凝集物は５０μｍのふるいによりふるいにかける。
収量は６２．４ｇである。ふるい損失は無視できる。凝集物は認められない。
実施例１１
ＲＮＡの結合の決定
１．４kbの32Ｐ−ラベル化ＨＩＶ ｇａｇ標準品を実施例６に従って実施例１０の粒子に結合させる。放射能測定は＞８０％の結合を示す。
ＲＮＡの結合の決定
１．４kbの32Ｐ−ラベル化ＨＩＶ ｇａｇ標準品を実施例６に従って実施例１０の粒子に結合させる。放射能測定は＞８０％の結合を示す。
実施例１２
沈降速度の比較
実施例１０の粒子３mgを２mlの容量を有する２本のEppendorf 容器に移し、そして各々１．５mlのＨ2 Ｏに懸濁する。
沈降速度の比較
実施例１０の粒子３mgを２mlの容量を有する２本のEppendorf 容器に移し、そして各々１．５mlのＨ2 Ｏに懸濁する。
容器１内の粒子を磁石により容器壁に引き付け、次いで振とうにより再懸濁させる。容器２内の粒子は同時に振とうさせる。
重力場での沈降が目視観察される。有意差は認められない。
Claims (11)
- ガラス表面を有する粒子を含む調製物であって、当該粒子の７５重量％超が０．５〜１５μｍの粒子サイズを有し、ここで当該ガラス表面がSiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3及びZnOから構成される、調製物。
- 前記０．５〜１５μｍの粒子サイズを有する粒子の９５重量％超が磁性粒子である、請求項１記載の調製物。
- 前記粒子の半分未満が２μｍ未満の粒子サイズを有する、請求項１又は２記載の調製物。
- 前記粒子の２％未満が０．５μｍ未満の粒子サイズを有する、請求項１，２及び３のいずれか１項記載の調製物。
- 前記磁性粒子がガラスでコーティングされた磁性コアを有する、請求項２記載の調製物。
- 前記粒子が２〜６モル％の酸化亜鉛を含むガラスコートを有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の調製物。
- コアのない粒子５重量％未満を含むゲル層でコーティングされたコアを有し、当該ゲル層がSiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3及びZnOから構成される粒子の調製物の製造方法であって、
・コア粒子調製物を利用してゾル中でコア粒子を懸濁し、
・この懸濁物をスプレードライしてゲルを形成する、
工程を含んで成り、ここで当該粒子調製物は７５重量％の０．５〜１５μｍの粒子サイズを有する粒子を含んで成る、方法。 - 核酸を精製する方法であって、核酸を試料からZnOを含有するガラス表面を有する粒子へと非共有式に結合させ、未結合の試料成分を除去し、そして結合した核酸を当該ガラス表面から溶出させることによる方法。
- 前記試料を請求項１〜６のいずれか１項記載の調製物と接触させるものとする、請求項８記載の方法。
- コアのない粒子５重量％未満を含むガラス層でコーティングされたコアを有し、当該ガラス層がSiO2, B2O3, K2O, CaO, Al2O3及びZnOから構成される粒子の調製物の製造のための方法であって、
コア粒子調製物を利用してゾル中にコア粒子を懸濁し、
当該懸濁物をスプレードライしてゲルを形成し、
当該ゲルを圧縮してガラスを形成する、
工程を含んで成り、ここで当該コア粒子調製物を０．５〜１５μｍの粒子サイズを有する粒子７５重量％を含んで成る、方法。 - 核酸のためのガラス表面の結合能力を増大させるため、ゾル／ゲル法により作製されるガラス層内で酸化亜鉛ガラス表面を利用する方法。
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