NO329549B1

NO329549B1 - Preparat inneholdende partikler som har en glassoverflate, fremgangsmate for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et gellag, fremgangsmate for a rense nukleinsyrer, fremgangsmate for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et glasslag, og anvendelse av sinkoksid i glasslag.

Info

Publication number: NO329549B1
Application number: NO20012620A
Authority: NO
Inventors: Herbert Harttig; Helmut Schmidt; Michael Riedling; Martin Mennig
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 2001-05-29
Publication date: 2010-11-08
Also published as: ES2205914T3; CA2352490A1; JP3561270B2; NO20012620D0; AU1652800A; US6545143B1; DE59906909D1; US20030125542A1; CA2352490C; EP1144620B1; JP3561235B2; AU762188B2; PT1144620E; EP1144620A1; DK1144620T3; JP2002531084A; JP2004135678A; WO2000032762A1; US6919444B2; ATE248911T1

Description

Søknaden angår el preparat inneholdende partikler som har en glassoverflate, fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et gellag, fremgangsmåte for å rense nukleinsyrer, fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et glasslag, og anvendelse av sinkoksid i glasslag.

I det siste har det blitt fokusert mer og mer på nukleinsyrer som interessante innenfor medisinsk diagnostikk. Tallrike deteksjonsmetoder har nå blitt utviklet hvor fravær eller nærvær av enkelte nukleinsyrer blir anvendt som en indikator for en sykdom. Disse inkluderer f.eks. tester for infeksiøse organismer for eksempel for virus eller bakterier i kroppsvæsker og også deteksjon av mutasjoner i genome nukleinsyrer, for eksempel i onkologi. Imidlertid er vanligvis nukleinsyrene til stede i svært lave konsentrasjoner i prøvematerialet. Det er derfor blitt utviklet ulike metoder for å isolere nukleinsyrer fra andre prøvekomponenter, slik som proteiner eller andre cellulære komponenter hvor noen av disse interfererer med den etterfølgende deteksjonsmetode. Noen av disse metoder utnytter erobringsprober bundet til faste faser som kan hybridisere med nukleinsyrene som skal separeres, og holde disse tilbake på en fast fase mens de andre prøvekomponenter fjernes. En slik metode er beskrevet for eksempel i EP-B-0 305 399. Imidlertid er det en ulempe ved disse metoder at hver enkelt av dem bare er egnet for rensing av nukleinsyrer som har en veldig spesiell nukleotidsekvens.

En prosess for å isolere nukleinsyrer ved hjelp av magnetiske partikler dannet av cellulose og jernoksid er beskrevet i WO 91/12079, og hvor partikkelstørrelsen er angitt å være mellom 1 og 10 u,m. Disse partikler inneholder ikke en glassoverflate og er kun egnet for en isolering hvor nukleinsyrene blir presipilert. Imidlertid fanger også aggregeringsprosessen mange prøvekomponenter som interfererer med etterfølgende fremgangsmåtetrinn.

EP-B-0389 063 beskriver en fremgangsmåte hvor prøven blandes med en blanding av et kaotropisk guanidiniumsalt og silikapartikler. Under disse betingelser er bindingen av nukleinsyrer til silikaoverflaten relativt uavhengig av sekvensen. De andre prøvekomponenter kan fjernes ved vasking og nukleinsyren kan deretter vaskes.

Magnetiske partikler med en vesentlig porefri glassoverflate for sekvensuavhengig rensing av nukleinsyrer er beskrevet i WO 96/41811. Partiklene som anvendes i dette tilfelle har en kjerne som foretrukket inneholder magnetitt som et magnetisk materiale og de har en foretrukken partikkelstørrelse mellom 10 og 60 u,m. Magnetitt viser harde magnetiske egenskaper i krystaller som er større enn ca. 30 til 50 nm. Permanent magnetisme induseres ved et eksternt magnetisk felt. Partikler som har en slik hard magnetisk kjerne har tilsvarende egenskaper som en liten permanent magnet etter at de først er blitt eksponert for et eksternt magnetisk felt. 1 suspensjoner vil slike partikler tiltrekke hverandre og danne større enheter. Under påvirkning av et eksternt gravitasjonsfelt vil disse større enheter sedimentere raskere enn de individuelle partikler. Dette er ugunstig siden lange inkubasjonsperioder krever jevnlig redispergering.

I WO 96/41840 er det beskrevet pigmenter med en glassoverflate som har en tykkelse på minst 0,8 u.m. Sinkforbindelser er også foreslått som en glassdannende komponent. Pigmentpartiklene som er dannet i denne fremgangsmåte har en partikkel-størrelse på foretrukket 2 til 20 um.

Det har nå vist seg at det i de tidligere beskrevne fremgangsmåter for fremstilling av partikler ved anvendelse av en "sol-gel prosess" hvor kjernepartiklene som har en spesifisert størrelse blir dekket med en gel og deretter komprimert for å danne en glassoverflate, blir en større del av partiklene dannet som ikke inneholder kjernepartikler. Nukleinsyredeteksjonsmetoder som utføres ved å bruke slike preparater resulterer enten i et stort nukleinsyretap eller at småpartiklene må separeres laboratoriemessig for å kunne oppnå et større utbytte. Formålet med den foreliggende oppfinnelse var fullstendig eller delvis å forbedre den gjeldende teknikkens stand og spesielt å fremstille partikler som har en relativ lik partikkelstørrelsesfordeling og videre å øke utbyttet i nukleinsyrerensinger, og/eller å fremskaffe partikler for nukleinsyrerensing som kun har en svært lav tendens til å aggregere og sedimentere i et gravitasjonsfelt, akkurat like sakte som partikler som aldri er blitt eksponert for et magnetisk felt.

Oppfinnelsen angår et preparat inneholdende partikler som har en glassoverflate, kjennetegnet ved at mer enn 75 vekt% av disse partikler har en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 |im, hvor glassoverflaten er sammensatt av Si02, B203, K20, CaO, A1203 og ZnO.

En videre søknadsgjenstandsgjenstand av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et gellag inneholdende mindre enn 5 vekt% partikler uten en kjerne og hvor gellaget er sammensatt av Si02, B203, K20, CaO, A1203 og ZnO, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: - oppslemming av kjernepartikler i en sol ved anvendelse av et kjernepartikkelpreparat, og

- sprøytetørking av suspensjonen for dannelse av en gel,

og hvori kjernepartikkelpreparatet omfatter 75 vekt% partikler som har en partikkel-størrelse mellom 0,5 og 15 u.m.

En videre søknadsgjenstandsgjenstand av oppfinnelsen er en anvendelse av sinkoksid i glasslag dannet ved en sol-/gelprosess ifølge krav 14 for å øke glassoverflatens bindingskapasitet for nukleinsyrer.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et glasslag inneholdende mindre enn 5 vekt% partikler uten kjerne og hvor glasslaget er sammensatt av SiO?, B203. K20, CaO, AI2O3og ZnO, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene:

- oppslemming av kjernepartiklene i en sol ved å anvende et kjernepartikkelpreparat.

- sprøyletørking av suspensjonen for dannelse av cn gel, og

- komprimering av gelen for dannelse av et glass,

og hvori kjernepartikkelpreparatet omfatter 75 vekt% partikler med en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 um.

En videre søknadsgjenstandsgjenstand av oppfinnelsen er anvendelse av sinkoksid i glasslag dannet ved en sol-/gelprosess ifølge oppfinnelsen for å øke glassoverflatens bindingskapasitet for nukleinsyrer.

Faste materialer med liten diameter er av fagmannen på området referert til som partikler. Disse partikler har fordelaktig en vesentlig sfærisk overflate. Imidlertid skal platelet-formede og filamentære partikler med en dimensjon som angitt nedenfor også forstås som partikler. For å kunne anses som spesielt egnet for rensing av nukleinsyrer er det ønskelig at partiklene har en kjerne (pigmentdel) som foretrukket er magnetisk, og som er dekket med et lag av glass. Slike kjerner inneholdende fortrinnsvis metalloksider slik som aluminiumoksid, jernoksid, kromoksid, kopperoksid, manganoksid, blyoksid, tinnoksid, titaniumoksid, sinkoksid og zirkoniumoksid eller metaller slik som Fe, Cr, Ni eller magnetiske legeringer. Sammensetningen av denne kjernen er mindre viktig for funksjonen av partiklene ifølge oppfinnelsen, siden kjernen er dekket med en glassoverflate og siden kjernen ikke kommer i direkte kontakt med prøven som den er ment å isolere nukleinsyrer fra. Slike kjerner er kommersielt tilgjengelige. Hvis kjernene inneholder Fe03(magnetitt eller Fe203(maghemitt) eller Fe eller Cr eller Ni eller magnetiske legeringer er disse kjerner magnetiske.

Egnede materialer referert til som myke er metaller basert på de rene elementer Fe, N, Cr og legeringer derav, foretrukket basert på Ni. Eksempler på slike legeringer er kjent under navnet permalloy. De består av 70 til 80 % Ni med tilsetninger av Cr, Cu og Mo. Partikler bestående av magnetiske myke materialer tiltrekker ikke hverandre, eller bare i en neglisjerbar grad, i fravær av et eksternt magnetisk felt.

Finfordelte metallpulvere er veldig reaktive. Det er en risiko for selvantenning i luften, de er pyrofore. Det var derfor veldig overraskende at slike finfordelte metall-partikler kunne bli dekket med et glasslag ved en "sol-gel prosess" uten signifikant å endre de magnetiske egenskaper. Karbonyljernpulver er spesielt fordelaktig å anvende som et metallpulver, og typer derav som er blitt redusert i H2har spesielt fordelaktige magnetiske egenskaper. Karbonyljernbørster har spesielt fordelaktige egenskaper.

Metallpulvere har fortrinnsvis en partikkelstørrelse mellom 10 nm og 100 um, og spesielt foretrukket mellom 200 nm og 8 um.

En glassoverflate i følgende foreliggende oppfinnelse er sammensatt av et amorft materiale inneholdende silikon. I tillegg til silikonoksid inneholder glasset fortrinnsvis én eller flere av de følgende komponenter (i mol%): B303(0-30 %), A1203(0-20 %), CaO (0-20 %), BaO (0-10 %), K20 (0-20 %), Na20 (0-20 %), MgO (0-18 %), Pb203(0-15 %), ZnO (0-6 %).

Et antall av andre oksider kan også være til stede i små mengder av 0-5 % slik som f.eks. Na20, Mn203, Ti02, As203, Fe203, CuO, Zr02, CoO osv. Overflater som er sammensatt av SiO!2, B203, A1203, CaO, K20 og ZnO har vist seg å være spesielt effektive. Borsilikatglass som er spesielt fordelaktig med hensyn til utbyttet av nukleinsyrer har et sinkoksidinnhold på 2-6, fortrinnsvis ca. 4 mol%. Glasslaget er spesielt foretrukket sammensatt av 68-79 mol% Si02, 15-5 mol% B203, 6-2,5 mol % total mengde av K20 og Na20, 4-1 mol% CaO, 8-2 mol% A1203, 6-2 mol % ZnO. Det er spesielt foretrukket at glass ifølge den foreliggende oppfinnelse er dannet ved den såkalte "gel-sol prosessen" og deretter tørket, og laget formet ved kompresjon. Det vesentlige aspekt i denne prosess er kjent og har blitt beskrevet for eksempel i C. J. Brinker, G.W. Scherer "Sol Gel science - The physics and chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990 og Sol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C. Klein Red. Kluwer Academic Publishers 1994 side 450 ff og i DE-A-19941191, DE-A-3710339, DE-A-4117041 og DE-A-4217432.1 "gel-sol-prosessen" tilsettes alkoksider av nettverks-dannende komponenter, f.eks. Si02, B203, A1203, Ti02, Zr02og ZnO sammen med andre oksider og salter av andre komponenter, f.eks. i en alkoholisk løsning og hydrolyseres.

Tilsetningen av vann starter hydrolysen av utgangskomponentene. Reaksjonen går relativt raskt siden alkaliionene har en katalytisk effekt på hastigheten av hydrolysen av silisiumsyreesteren. Etter at geldannelsen er fullstendig kan gelen tørkes og komprimeres for dannelse av glass i en varméprosess.

Mengdeforholdet mellom kolloidal løsning og pigment har en betydelig inn-flytelse på utbyttet av det magnetiske pigmentet. Begrensningene er at mengden av pigment må være lav nok for å tillate dannelse av et materiale som fortsatt kan bli pumpet og sprøytet. Forholdet av fint materiale, f.eks. ikke-magnetisk materiale, vil bli for stort og interferere hvis mengden av pigment er for lav. Et mengdeforhold på 10 til 45 g pigment pr. 100 ml kolloidal løsning er blitt funnet å være hensiktsmessig med hensyn til pigmentutbyttet.

Blandingen blir fortrinnsvis sprøytet gjennom en dyse for å danne et pulver og aerosolen blir tørket på en nedfallsbane. Dysen blir fortrinnsvis varmet for å akselerere tørkingen av blandingen. Dysetemperaturen er foretrukket ca. 120 til 250 °C uavhengig av dysens geometri. Det må finnes et kompromiss mellom det å unngå sprut og en adekvat fordampningshastighet.

Komprimeringstemperaturen bør velges så høy som mulig med hensyn til utbytte. Hvis den imidlertid er for høy vil partiklene agglutinere og det dannes agglomerater som bør fjernes ved sikting. Tilsetting av sink til laget vil imidlertid overraskende øke smeltepunktet, og det er derfor mulig å benytte en høyere komprimeringstcmpcratur (mellom 710 og 800 °C). Etterbehandlingen i luft medfører tap av magnetiske egenskaper hvis temperaturen er for høy, og derfor bør overdreven temperatur bør unngås. Når sink tilsettes er det også mulig å anvende andre temperaturer i dette tilfelle (foretrukket mellom 150 og 250 °C).

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse har det vist seg at magnetiske kjerner som er mye mindre kan anvendes i fremgangsmåten som beskrives i WO 96/41811. Spesielt har det vist seg at det er mulig å anvende kjerner med nanoskala for eksempel magnetitt med en krystallstørrelse på mindre enn 50 nm, fortrinnsvis mindre enn 30 nm. Den nedre grense for kjernestørrelsen er et resultat av håndteringsegen-skapene til kjernene, og spesielt deres tendens til å danne aggregater. Kjernene er fordelaktig større enn 5 nm, spesielt fordelaktig større enn 7 nm. De magnetiske egenskapene til nanoskalakjernene er referert til som superparamagnetiske. De oppnådde partikler sedimenterer raskt når de eksponeres for et eksterntmagnetisk felt. Etter finfordeling varierer ikke deres sedimenteringshastighet i et gravitasjonsfelt fra deres sedimenterings-sted i et gravitasjonsfelt før de ble eksponert for et eksternt magnetisk felt. Dette er fordelaktig siden det muliggjør en lengre inkubasjonstid i suspensjon uten å være nødt til å blande på nytt og resuspendere.

For å kunne fremstille et preparat ifølge oppfinnelsen må det anvendes et preparat av kjernepartikler hvor mer enn 75 vekt% av kjernepartiklene har en partikkel-størrelse mellom noe mindre enn 0,5 og noe mindre enn 15 u,m i "sol/gelprosessen". Kjernepartiklene må i tilstrekkelig grad være mindre enn de glassdekkede partikler med hensyn til tykkelsen av glasslaget. Etter den oppfinneriske fremgangsmåte vil glasslaget være mellom 5 nm og 1 um tykt avhengig av de valgte betingelser så som forholdene mellom gel og kjernepartikler. Gjennomsnittlig bør glasslaget være mellom 0,2 og 0,3 um tykt.

Det er spesielt foretrukket et preparat som inneholder partikler med en glassoverflate hvor mer enn 75 vekt% av disse partikler har en partikkelstørrelse mellom 2 og 25 um. Det er spesielt foretrukket at andelen med den definerte partikkelstørrelse er på mer enn 90 vekt%.

Det er spesielt foretrukket at magnetiske kjernepartikler anvendes. En fordel ved preparatet ifølge oppfinnelsen er at fortrinnsvis mer enn 95 vekt% av partiklene som har en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 u.m, fortrinnsvis mellom 2 og 15 um, er magnetiske. Dette betyr at andelen av partikler som ikke har kjerner blir dramatisk redusert sammenlignet med kjente fremgangsmåter. Delte kan erkjennes ved det faktum at kun et fåtall ikke-magnetiske partikler er til stede. Dette betyr at det praktisk talt ikke lenger er nødvendig å separere ikke-magnetiske partikler fra magnetiske partikler før anvendelse av preparatet i fremgangsmåter for rensing av nukleinsyrer. Dette forenkler produksjons-prosessen.

Preparatet ifølge oppfinnelsen kan ytterligere blikarakterisert vedat fortrinnsvis mindre enn 50 % av partiklene har en partikkelstørrelse på mindre enn 2 um. Følgelig er det en vesentlig reduksjon i den ikke-magnetiske finfraksjonen som har en relativt høy andel av partikler med liten størrelse. Spesielt foretrukket har mindre enn 2 % av partiklene en partikkelstørrelse på mindre 0,5 um.

Det er foretrukket at ikke mer enn 10 %, og spesielt foretrukket mellom 10 og 40 %, av partiklene i preparatet har en partikkelstørrelse som er større enn 10 um.

I tillegg til partiklene ifølge oppfinnelsen kan det oppfinneriske preparat også inneholde andre ikke-glassinneholdende komponenter slik som buffersubstanser eller løsningsmidler, f.eks. vann eller alkoholløsninger av vann.

Det er foretrukket at glasslaget på partiklene i preparatet inneholder mellom 2 og 6 mol%, spesielt foretrukket 4 mol% sinkoksid. Dette kan oppnås ved å ha en mengde sinkoksid i den faste kolloidale (sol) masse på denne størrelsesorden sammenlignet med mengden av andre faste komponenter. Andelen av sinkoksid øker ettersom mengden av boroksid avtar, spesielt når preparatet varmes i en lengre periode siden boroksid allerede er flyktig under fremstillingsbetingelsene.

Partikler med et glasslag hvor andelene av sinkoksid er mellom 2 og 6 mol% har vist seg å være spesielt effektive ved rensing av nukleinsyrer. Utbytte av nukleinsyrer økte i enkelte tilfeller med 50 % sammenlignet med tilsvarende glasslag uten sinkoksid.

Et annet vesentlig trekk ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat hvor partiklene har en kjerne dekket med et gellag som inneholder mindre enn 5 vekt% partikler uten kjerne som omfatter trinnene å suspendere kjernepartiklene i en kolloidal løsning ved anvendelse av kjernepartikkelpreparatet og sprøytetørke suspensjonen slik at det dannes et gellag hvor kjernepartikkelpreparatet inneholder 75 vekt% partikler med en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 um, foretrukket mellom 2 og 15 um.

Det vises til beskrivelser i den kjente teknikk med hensyn til utførelse av "gel/solprosessen" som ble anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Hovedforskjellen mellom oppfinnelsen og den kjente teknikk er anvendelsen av et spesielt kjernepartikkelpreparat som tillater fremstilling av et preparat som inneholder mindre enn 5 vekt% partikler uten kjerner. En fremgangsmåte har vist seg å være spesielt fordelaktig hvor først en kolloidal løsning fremstilles fra tetraalkylortosilikater, alkyl-borater. aluminiumalkoholer og alkalialkoholer i etanol og denne blanding varmes med kalsium. Deretter hydrolyseres blandingen ved tilsetning av vann. Kjernepartiklene tilsettes i en fast form til den kolloidale løsning dannet på denne måte og suspenderes fortrinnsvis med ultralyd. Deretter atomiseres suspensjonen for å danne en gel i en sprøytetørket prosess hvor dysen varmes og hvor de partikler som dannes inneholder mellom én og noen få kjernepartikler pr. partikkel (fortrinnsvis mindre enn 1 % av partiklene inneholder mer enn 10 kjernepartikler). Del sprøytede produkt ble deretter varmet for å komprimere gelen slik at det dannes glass. Også i dette tilfelle er tilsetning av sinkoksid til gelen veldig fordelaktig. Komprimeringen kan utføres ved høyere temperaturer enn for preparater hvor sink ikke har blitt tilsatt, siden avherdingspunktet for glasset som er dannet er høyere. Dette gjør det lettere å fjerne organiske rester fra utgangsmaterialene.

Siden det dannes et preparat som inneholder lave andeler av partikler uten kjerner i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det vanligvis ikke lenger nødvendig å fraksjonere partikler med og uten kjerne etterpå.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for å rense nukleinsyrer ved en ikke-kovalent binding av nukleinsyrer i en prøve til partikler med en glassoverflate, fjerne ikke-bundne prøvekomponenter og eluere de bundne nukleinsyrer fra glassoverflaten hvori det anvendes et preparat ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåten er spesielt enkel når partiklene er magnetiske.

Fremgangsmåter for å rense nukleinsyrer ved hjelp av magnetiske partikler med en glassoverflate er beskrevet i WO 96/41811. Det henvises herved til hele innholdet i dette dokument. Egnede prøver for renseprosedyren ifølge oppfinnelsen er spesielt kliniske prøver slik som blod, serum, munnrensevann, urin, cerebral væske, slim fra lunger, feces, plasma, biopsiprøver eller benmargsprøver. Serum er et foretrukket prøve-materiale. For å rense nukleinsyrene blir prøven, hvis krevet etter lysis av cellulære strukturer som kan være til stede og fordøyelse av interfererende prøvekomponenter, blandet med det oppfinneriske preparat for eksempel i form av en viss mengde av partikkelsuspensjonen. Etter en inkubasjonsperiode hvor nukleinsyrene binder ikke-sekvens-spesifikt til glassoverflaten, blir væsken sammen med de ikke-bundne prøve-komponentene fjernet og partiklene vasket hvis ønskelig for å fjerne rester. Nukleinsyrene som fortsatt er bundet blir fjernet fra overflaten ved eluering med en væske som løser opp nukleinsyrene godt. Den resulterende væske kan nå bli bearbeidet på en hvilken som helst ønsket måte og spesielt bli anvendt i amplifikasjonsmetoder, f.eks. PCR siden de fleste enzyminhibitorer er blitt separert gjennom rensemetoden.

Hvis partiklene er magnetiske er det spesielt enkelt å fjerne væsken fra partiklene med nukleinsyrene siden partiklene kan bli samlet og holdt ved hjelp av en magnet mens væsken fjernes. Hvis partiklene er ikke-magnetiske kan de separeres fra væsken ved filtrering ved anvendelse av et egnet filter.

Den foreliggende oppfinnelse tydeliggjøres i mer detalj i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Kolloidal (sol) løsning for fremstilling av sinkfritt lag (74 Si02 x 15 B203, x 4 K20 x 2 CaO x 5 A1203)

1750 ml tetraetylortosilikat (fabrikant: Wacker, Burghausen) ble plassert i en 5 liters rundkolbeflaske og følgende ble raskt tilsatt ved romtemperatur under omrøring (500 rpm):

541 ml trietylborat (fabrikant: Aldrich Steinheim)

250 ml kalsiummetanolat (25 % metanol)

(fabrikant: Fluka, Deisenhofen))

261 g aluminium sek. butylat (fabrikant: Aldrich, Steinheim)

292 ml etanol og

8,49 g kalsium (fabrikant: Fluka, Deisenhofen)

Blandingen ble deretter varmet til en sterk refluks under røring. En blanding på i alt 583 ml etanol og 233 ml vann ble tilsatt dråpevis i en periode på 30 minutter. Etter kjøling til < 50 °C ble den kolloidale løsning overført til en åpen beholder og 1200 g av pigmentet IRIODIN 600 ble tilsatt. Etter at pigmenttilsetningen var fullført ble den kolloidale løsning rørt i ytterligere 1 minutt ved 500 rpm, og deretter behandlet med ultralyd i 5 minutter. Etter den ultrasoniske behandling ble kolloidal-pigmentblandingen rørt med en oppløsningsrører ved ca. 500 rpm inntil hele mengden var brukt opp.

Eksempel 2

Fremstilling av glassdekte pigmenter (MGP)

Sprøytingen ble utført i et sprøytetårn fra Nubilosa Company, Konstanz med en diameter på 0,75 m, en høyde på 2,5 m og en fordampningskapasitet (med hensyn til vann) på 1 - 3 liter pr. time. Luftinntakstemperaturen var 270 °C, utløpstemperaturen var ca. 130 °C. Tilførselsmengden av luft var 7,2 m3 pr. minutt. For sprøyting ble det anvendt en tovæskedyse med et sprøytetrykk på 2 bar. Leveringskapasiteten til ballventilmembranpumpen var 60 g kolloidal løsning/min.

Sprøyteproduktet ble oppbevart i en syklon, prekomprimert i luft i 1 time ved 150 °C og deretter brakt til en temperatur på 675 °C i en nitrogenovn med en varme-mengde på 1 K/min, bibeholdt én time i denne ovnen og avkjølt til 300 °C. Oksygen ble tilsatt ved 300 °C, det ble bibeholdt i én time og deretter kjølt til romtemperatur. Etter avkjøling ble det siktet ved anvendelse av en sikt med en nettstørrelse på 50 um for å fjerne aggregater som kunne være til stede. Dette fullstendiggjør fremstillingen.

Eksempel 3

Kolloidal (sol) løsning for fremstilling av sinkinneholdende lag (70,67 Si02x 14,33 B203 x 4 K20 x 2 CaO x 5 A1203 x 4 ZnO)

En kolloidal løsning inneholdende sink ble fremstilt på samme måte som i eksempel 1. For dette ble de følgende vekter av stoffer tilsatt og behandlet på samme måte:

1258 ml tetraetylortosilikat (fabrikant: Wacker, Burghausen)

387 ml trietylborat (fabrikant: Aldrich, Steinheim)

188 ml kaliummetanolat 25 % i metanol (fabrikant: Fluka, Deisenhofen)

196 g aluminium sek. butylat (fabrikant: Aldrich, Steinheim)

1285 ml etanol

6,39 g kalsium (fabrikant: Fluka, Deisenhofen)

58,5 g sinkacetat dehydrert dihydrat (fabrikant: Fluka, Deisenhofen)

Etter koking med refluks ble 178 ml H20 sammen med 444 ml etanol tilsatt dråpevis innen 30 minutter. Etter kjøling ble det tilsatt 1200 g pigment. Ellers refereres til eksempel 1.

Eksempel 4

Fremstilling av et sinkinneholdende glassdekket pigment

Det kolloidalinneholdende pigment fra eksempel 3 ble behandlet analogt som i eksempel 2. Komprimeringstemperaturen var imidlertid 750 °C.

Eksempel 5

Fremstilling av sinkinneholdende glassdekte pigmenter ved anvendelse av en modifisert etterbehandling (MGP, magentiske glasspartikler)

Det kolloidalinneholdende pigment fra eksempel 3 ble behandlet analogt som i eksempel 2. Komprimeringstemperaturen var imidlertid 750 °C, og temperaturen for behandling i oksygen var 200 °C.

Eksempel 6

Bestemmelse av utbyttet av DNA eller RNA ved anvendelse av radioaktivt<32>P

En J P-merket HIV gag RNA-standard på 1,4 kb eller en P merket lambda amplikon på 3 kb ble anvendt for direkte å detektere bundet eller ikke bundet DNA eller RNA. Negativt plasma (humant) som hver inneholder IO<9>kopier ble anvendt som prøve.

Fremgangsmåte for prøvefremstilling

500 ul negativt plasma inneholdende IO<9>kopier av<j2>P-merket lambda amplikon ble plassert i et 2ml Eppendorft-rør. (480 fil bindingsbuffer/proteinase K-løsning (5:1) ble tilsatt med pipette, rotert og inkubert ved 70 °C i 10 minutter. Etter avkjøling til romtemperatur ble en 400 u.1 isopropanolisk MGP-suspensjon inneholdende totalt 3 mg MGP tilsatt med pipette. Straks etter ble den blandet ved rotasjon. Prøven ble så inkubert i 15 minutter på en blander f.eks. termomikser 5436 fra Eppendorf.

MGP'ene ble konsentrert ved å overføre prøven til en magnetisk separator. Etter ett minutt ble supernatanten fullstendig fjernet med pipette.

0,5 ml vaskebuffer ble tilsatt med pipette til MGP'ene. Prøven ble rotert og så overført til en magnetseparator. Supernatanten ble fjernet med pipette etter 1 minutt. Vaske fremgangsmåten ble gjentatt ytterligere to ganger.

200 ml elueringsbuffer ble tilsatt til MGP'ene. De ble inkubert i 10 minutter ved 80 °C på en termomikser ved 1400 rpm. Prøven ble overført til en magnetseparator og etter 1 minutt ble hele eluatet fjernet. Eluatet ble så overført til et nytt rør og målt i en scintillasjonsteller.

Utbyttet kan bestemmes fra forholdet mellom radioaktivitet i eluatet og radio-aktiviteten i prøven før rensefremgangsmåten.

Resultater med MGP'er med forskjellige tellinger:

Eksempel 7

Biotitt (BM) som pigmentbase (referanseeksempel)

En serie ble fremstilt i henhold til eksempel 1 hvor pigmentet er biotitt (BM).

Eksempel 8

Mikrona mattsvart (MMB) som pigmentbase

En serie ble fremstilt i henhold til eksempel 1 hvor pigmentet er MMB (mikrona mattsvart (fabrikant: Merck, Darmstadt).

Eksempel 9

Signalnivå etter amplifikasjon hvor prøvene er blitt fremstilt ved anvendelse av MGP'er som inneholder forskjellige pigmenter

MGP'er i henhold til eksempler 7 og 8 ble anvendt ved fremstilling av prøver. Humant plasma inneholdende 100 kopier pr. ml HCV-virus ble anvendt som prøve. Eluatet fra prøvefremstillingen ble underkastet amplifikasjon og amplifikasjonsresultatet ble detektert ved en elektrokjemiluminescensmetode. I et ytterligere eksperiment inneholdt prøven av humant plasma 600 kopier pr. ml HBV-virus.

Eksempel 10

Karbonyljernpulver HQ som pigment

En sinkinneholdende kolloidal løsning ble fremstilt ifølge eksempel 3, men med bare 240 g kolloidal løsning.

Etter kjøling ble 71 g karbonyljernpulver HQ (BASF, Ludwigshafen) med en partikkelstørrelsesfordeling på 10 % < 0,5 um, 50 % < 1,1 um, 90 % < 2,2 um tilsatt, rørt i 1 minutt ved 500 rpm og deretter behandlet med ultralyd i 5 minutter. Den kolloidale løsning ble sprøytet i en forstøver (Buchc 190, Mini Spray Dryer). Dysetemperaturen på forstøveren er 140 °C.

Det oppnådde pulver ble varmet i luft ved 150 °C. Varmemengden er 1 K/min og avholdelsestiden var 1 time. Deretter ble luften i ovnen erstattet med N2, spylt flere ganger og varmet ved 1 K/min til 700 °C, bibeholdt i 1 time, avkjølt til 200 °C ved 1 K/min. Nitrogen ble erstattet med luft ved 200 °C og bibeholdt i 1 time. Det ble så avkjølt til romtemperatur. Aggregater som kan ha blitt dannet ble fjernet ved sikting med en 50 u.m sikt.

Utbyttet var 62,4 g. Sikttapet var neglisjerbart. Aggregater forekom ikke.

Eksempel 11

Bestemmelse av bindingen av RNA

En<32>P-merket HIV gag standard på 1,4 kg ble bundet i henhold til eksempel 6 til partikler fra eksempel 10. Radioaktivitetsmålinger ga en blanding på > 80 %.

Eksempel 12

Sammenligning av sedimenteringshastigheter

3 mg partikler fra eksempel 10 ble overført til to Eppendorf-rør med et volum på

2 ml og ble suspendert med 1,5 ml H20 i hver tilfelle.

Partiklene i rør 1 ble tiltrukket rørveggen med en magnet og deretter resuspendert ved risting. Partiklene i rør 2 ble ristet opp samtidig.

Sedimentering i et gravitasjonsfelt ble observert visuelt. Det forekom ingen forskjeller.

Claims

1. Preparat inneholdende partikler som har en glassoverflate,karakterisert vedat mer enn 75 vekt% av disse partikler har en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 um, hvor glassoverflaten er sammensatt av Si02, B203, K20, CaO, A1203og ZnO.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat mer enn 95 vekt% av partiklene som har en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 um er magnetiske.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat mindre enn halvparten av partiklene har en partikkelstørrelse på mindre 2 \ xm.

4. Preparat ifølge ett av kravene 1, 2 og 3, karakterisert vedat mindre enn 2 % av partiklene har en partikkelstørrelse på mindre enn 0,5 u,m.

5. Preparat ifølge krav 2, karakterisert vedat de magnetiske partikler har en magnetisk kjerne som er dekket med glass.

6. Preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat ikke mer enn 10 % av disse partikler er partikler med en partikkelstørrelse på mer enn 10fim.

7. Preparat ifølge ett av de foregående krav, karakterisert vedat partiklene har et glassdekke som inneholder mellom 2 og 6 mol% sinkoksid.

8. Preparat ifølge ett av de foregående krav, karakterisert vedat det inneholder minst én kjerne av et magnetisk metall.

9. Preparat ifølge krav 8, karakterisert vedat kjernen eller kjernene har en partikkelstørrelse på mellom 0,01 um og 100 u.m, spesielt foretrukket mellom 0,2fim og 8fim.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et gellag inneholdende mindre enn 5 vekt% partikler uten en kjerne og hvor gellaget er sammensatt av Si02, B203, K20, CaO, A1203 og ZnO, karakterisert vedat den omfatter trinnene: - oppslemming av kjernepartikler i en sol ved anvendelse av et kjernepartikkelpreparat, og - sprøytetørking av suspensjonen for dannelse av en gel, og hvori kjernepartikkelpreparatet omfatter 75 vekt% partikler som har en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15fim.

11. Fremgangsmåte for å rense nukleinsyrer, karakterisert vedikke-kovalent binding av nukleinsyrer fra en prøve til partikler som har en glassoverflate som innholder ZnO, fjerning av ikke-bundne prøvekomponenter og eluering av de bundne nukleinsyrer fra glassoverflaten.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert vedat prøven bringes i kontakt med et preparat ifølge ett av kravene 1 til 9.

13. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 11 eller 12, karakterisert vedat partiklene er magnetiske og holdes med en magnet mens prøvekomponentene fjernes.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat av partikler som har en kjerne dekket med et glasslag inneholdende mindre enn 5 vekt% partikler uten kjerne og hvor glasslaget er sammensatt av Si02, B203, K20, CaO, A1203 og ZnO,karakterisert vedat den omfatter trinnene: - oppslemming av kjernepartiklene i en sol ved å anvende et kjernepartikkelpreparat, - sprøytetørking av suspensjonen for dannelse av en gel, og - komprimering av gelen for dannelse av et glass, og hvori kjernepartikkelpreparatet omfatter 75 vekt% partikler med en partikkelstørrelse mellom 0,5 og 15 um.

15. Anvendelse av sinkoksid i glasslag dannet ved en sol-/gelprosess ifølge krav 14 for å øke glassoverflatens bindingskapasitet for nukleinsyrer.