JP4980349B2 - 閉鎖された超薄シリカ層を有する磁性粒子、その製造方法および使用 - Google Patents

Description

本発明は、シリカ（ＳｉＯ₂）で被覆された磁性粒子に関するものであり、ケイ酸塩層が閉鎖されており、数ナノメートル範囲内の極端に薄い厚さ−以下でシリカナノ層とも称する−を特徴としている。さらに本発明はこのケイ酸塩含有磁性粒子を製造するための改良された方法を述べるが、この方法は先行技術と比較して閉鎖ケイ酸塩層を有する製品をもたらし、またそのことに起因して著しく改善された純度をももたらす。さらにこの新規な方法は、磁鉄鉱表面でケイ酸塩が制御不能な態様で凝集体およびクラスタを生成するのを防止し、これにより、広く指摘された特性および生物学的応用が肯定的影響を受ける。この新規な方法はさらに、分別遠心分離に基づいてナノ粒子状固体粒子の減少を可能とする。本発明に係る磁性粒子は最適化された磁化挙動および懸濁挙動とプラスチック表面からのきわめて有利な遊離挙動とを示す。二酸化ケイ素で被覆されたこの高純度磁性粒子は好ましくは細胞試料または組織試料から核酸を単離するのに利用され、分離は試料基質から磁界によって行われる。これらの粒子は、大抵の場合生物学的身体試料からさまざまな増幅法でそれを検出する目的で核酸を自動精製するのに特別適している。

近年、分子診断法がますます重要となってきている。分子診断法は疾患の臨床診断に普及した。これに含まれるのは、病気の診断を向上させるための分子標識の測定、早期検知、治療中の疾患監視、疾患の予後、薬剤の作用もしくは副作用の予測（なかんずく感染病原体の検出、ゲノム突然変異の検出、所定のまたは疾患の過程で獲得された遺伝性パターンを基にした薬剤の作用もしくは副作用の予想、循環性腫瘍細胞の発見、そして疾患素質の危険因子の同定）である。しかし獣医学、環境分析および食品試験においても分子診断方法がその間に応用されるようになった。幅広い応用分野は病理学／細胞学研究所での検査または法医学的問題の枠内での検査である。しかし健康予防の枠内でも（例えば保存血液に感染病原体のないことの検査）、遺伝子診断がその間に利用されるようになり、立法機関は将来法律を介してそのような試験を指示する計画である。臨床分子診断でも利用される方法（例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＬＣＲ（リカーゼ連鎖反応）、ｂＤＮＡ（分枝ＤＮＡ）またはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）等のハイブリダイゼーション技術または増幅技術）は、化学的基礎研究においても日常的方法に属する。

分子診断において検定を実施するための前提条件は一般に被分析試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの単離である。確かに、核酸単離と検出反応を一緒に実施することを可能とする例えばｂＤＮＡに基づく試験等の分析法があるが、しかしＰＣＲは分子診断において最も広く普及した分子生物学的方法として、それが外因の影響を受け易いので殆ど常に、事前に浄化された核酸の使用を必要とする。

核酸の古典的調製法は液液抽出に依拠している。例としてここでは、身体試料からＤＮＡのフェノール−クロロホルム抽出を挙げておく。しかし高い労力消費と一部で高毒性物質を使用しなければならない必要性によって、この方法は、近年、著しく影を薄くし、固相に基づく方法が有利となっている。

固相に基づく核酸抽出法を使用する場合、本来の分析プロセスのための試料準備はその都度の問題提起に殆どかかわりなく４つの基本ステップに区分される：１．固相の状態調節；２．固相への被検成分の選択結合または特異結合と残りの試料基質の除去；３．もし、存在すれば、不純物の洗浄除去；４．富化され浄化された被検成分の溶出。

核酸の選択的および可逆的結合に関して、カオトロピックまたは別の高塩条件のもとで、すなわちカオトロピック塩または別の塩の高濃度において、ガラス粉末［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ７６（１９７９）６１５−６１９、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１（１９８２）３８２−３８７］、ディアマトーメエネルデ（ｄｉａｍａｔｏｍｅｅｎｅｒｄｅ）［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５（１９７９）１７６−１８２］または天然シリカ［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（１９９０）４９５−５０３、ＥＰ０３８９０６３Ｂ１］等のケイ酸塩含有吸収剤に特異的に結合するという核酸の久しく知られた特性が利用される。水溶性有機溶媒を含む緩衝剤は一般に低級脂肪族アルコールであるが、この緩衝液を用いて次に吸収剤から不純物が洗い落とされ、支持体が乾燥させられ、吸着された核酸は蒸留水またはいわゆる低塩緩衝剤、すなわちイオン強度の低い緩衝剤で溶出される。

核酸単離の完全で安価な自動化に関して、超常磁性吸着剤を使った方法がますます重要となっている。

最も単純な実施例（国際出願第０１／４６４０４号パンフレット）において例えばエレクトログラフィックトナー等の技術的応用のために製造される市販の磁性粒子が、何らの修飾もなしに核酸精製に直接利用される。

このような大規模に製造される製品は、一定の核酸吸着、磁化性等の最重要な前提条件の幾つかを確かに満たす。他方で、市場で入手可能なこれらの製品は、高感度かつ再現可能な結果に関して不可欠な重要な境界条件を満たすことができない。例えばまさにウイルス（例えばＨＣＶまたはＨＩＶ）診断分野では、血清または血漿からウイルス性核酸を定量的に−つまりほぼ１００％の収率で−抽出し、そこから血清／血漿中の精確なウイルス濃度を導き出し、こうして治療決断を講じることが決定的に重要である。光学評価を背景に磁性粒子の純度も決定的に重要である。しばしば微孔質であることがある磁性粒子では、まさに、粒子からの鉄原子の拡散によって、透過測定または反射測定を鋭敏に妨害することがある変色溶液を生じることがある。

それゆえに、特に手動および自動化核酸単離に関して生物学的応用のための磁性粒子の数多くの開発が述べられている。

その際、高密度のＳｉＯＨ基を表面に担持した磁性粒子がきわめて重要である。つまりＳｉＯＨ基は核酸と可逆的結合に入り込めることが知られている。シリカ変性磁性粒子も本発明の対象である。

高感度の定量的かつ再現可能な結果に関してこのような磁性粒子は、磁化性および核酸結合能力の他に、以下に詳しく述べる一連の他の境界条件を満たさねばならない。

粒径と粒径分布：
一次粒径が約０．１乃至１μｍの範囲内のエレクトログラフィックトナー用に例えばＬａｎｘｅｓｓ社からバイオキシデ（Ｂａｙｏｘｉｄｅ）Ｅの名で入手可能なＦｅ₃Ｏ₄（磁鉄鉱）からなる磁性粒子は粒径に関してほぼ理想的前提条件を満たすことが判明した。つまりこのような粒径でもって、生物学的応用にとって重要な「懸濁安定性」の主要な境界条件は達成することができる。これは一方で、数分、例えば１０乃至１５分内の振動（核酸の吸着段階）後にさしたる沈降を生じない一方、磁界印加後、核酸を含む磁性粒子は数分、例えば１乃至５分内の極力短い分析時間を考慮して完全に分離されるように安定でなければならない。

これに関連して、入手可能なＦｅ₃Ｏ₄（磁鉄鉱）磁性粒子は、残念ながら、ナノメートル範囲のごく微細な磁性粒子をも微量含む欠点を有する。

望ましくないこの副生成物は、表面積が大きいのでかなりの量の核酸を結合することができ、磁界内では残念ながら数分内に分離されることがなく、従ってこの核酸の情報内容は−まさに核酸の定量測定に関して−失われることがある。

この収率損失の他に、これは、商品化に否定的に影響するとともに溶出液の測光評価時に支障になる黄褐色の澄んでいない上澄みも生じる。

それゆえに、ここで述べる生物学的応用にとってこの「ナノ粒子状磁性粒子成分」を分離できると大きな利点であろう。

ケイ酸塩含有量：
上で述べたように、大規模に製造される磁性粒子、例えばＬａｎｘｅｓｓ社のバイオキシデＥシリーズは、特殊なシリカ再処理なしでも一定の核酸結合能力を有する。しかしながら、「バルク」生産に起因して、僅かな量の表面ＳｉＯＨ基しか有しない。僅かな核酸吸着能力のゆえに、このような製品では相応に比較的大量の磁性粒子が必要とされ、そのため小容積の試料の精製が困難となる。

さらに、このような製品は、核酸精製時に日常的に利用されるガラスまたはマイクロタイタープレートのプラスチック壁等の容器壁に対して、ここに述べる応用にとって不都合な湿潤挙動を有する。水性懸濁液中でかなりの量の未変性で比較的疎水性の磁性粒子がマイクロタイタープレート壁に吸着されたままとなり、こうしてピペット処理を不正確とし収率損失を生じる。

これに関連してごく好ましく挙動するのは高密度のＳｉＯＨ表面基を有する粒子であり、これらの粒子はその親水性のゆえに、特に例えば前記マイクロタイタープレート等のプラスチック壁から特別有利に滴下する。

従って、核酸単離用の多くの磁性粒子開発においてシリカ成分が磁鉄鉱成分に比べて優勢である。例えば国際出願第０１／７１７３２号パンフレットに述べられているように、磁鉄鉱粒子の存在下に例えばテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）等の反応性シリカ化合物の加水分解によって、磁鉄鉱包摂によって磁化可能なシリカ粒子が得られる。表面の高密度ＳｉＯＨ基のゆえにこのような粒子は確かに高い核酸結合能力とマイクロタイタープレートに対する好ましい湿潤挙動とを示すが、しかし他方で磁鉄鉱含有量低減に相応して磁気特性が著しく低下している。こうして製造された磁性シリカ粒子はさらに、例えばごく不均質な粒径および粒径分布等の著しく不都合な形態学的性質を有する。付言するならば、球形ではない大粒の粒子は自動ピペット処理時に閉塞を生じることがある。

抽出可能な諸成分：
磁性粒子法に従って単離された核酸は一般に、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＬＣＲ（リカーゼ連鎖反応）またはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）等の他のプロセスを施される。ここで問題は、これが酵素によって制御される高感度の方法であり、例えば酵素毒として働く可能性がある数多くの不純物および鉄化合物によって妨害されることである。

それゆえに、核酸精製用に製造される磁性粒子は特別な純度要求を満たさねばならない。大規模に製造される例えばＬａｎｘｅｓｓ社のバイオキシデ等の酸化鉄が利用される場合、磁鉄鉱粒子が一定の多孔率と表面粗さとを有するので、この課題提起は決して些細なことではない。それゆえに、酸化鉄製造プロセスからも後続のシリカ処理時にも不純物が微細孔に包摂されることがあり、これらの不純物は後のプロセスにおいて酵素毒として妨害し、または変色不純物の場合、測光評価時に支障となることがある。

市場で入手可能な磁性粒子を前提に、高密度ＳｉＯＨ表面基と閉鎖された密なケイ酸塩表面層とを有するシリカ変性磁性粒子が製造されねばならない。出発製品の形態もきわめて良好な磁気特性もシリカ変性によって本質的影響を受けてはならない。同様に、プラスチック表面に対する湿潤挙動はシリカ被覆によって肯定的影響を受けねばならない。さらに、シリカ変性磁性粒子は、抽出可能な不純物に関して、磁性粒子からの不純物ないし鉄化合物の流出が妨げられかつ生物学的検出反応の妨害も測光評価の支障も起きないほどに、最適化されていなければならない。

最も近い先行技術：
Ｌａｎｘｅｓｓ社の磁性粒子バイオキシデＥから出発して、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットは、水ガラス溶液、例えばＣｏｇｎｉｓ社の水ガラスＨＫ３０を使って、粒子表面でシリカを分離するための洗練された方法を述べている。強アルカリ性（ｐＨ１１．５）から中性（ｐＨ７）への段階的なｐＨシフトと同じ意味であるバイオキシデＥ／水ガラス溶液中のｐＨ値の段階的希釈によって、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットで触れられたように磁性粒子表面にシリカが慎重に析出される。酸の添加によってｐＨ低下が行われると（国際出願第９８／３１８４０号パンフレット）、酸滴下個所で水ガラスからシリカ（ＳｉＯ₂）への制御不能な転換の起きることがあり、その構造体内に磁性粒子が沈積し、磁性粒子表面での上記制御下のシリカ析出はまったく達成されない。それにもかかわらず、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられた「バッチ法」は表面にごく小さなシリカ凝集体もしくはクラスタが生成するのを完全には防止できない。

つまり国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられたシリカ変性磁性粒子は表面構造体および核酸結合挙動に関して良好な特性を示す一方、相応する水性懸濁液の長期挙動において（保持時間数週間後）きわめて不利な黄褐色の上澄みが観察された。一般に界面活性剤も利用される生物学的検定においてこの作用は比較的短い保持時間後に既に観察することができる。この変色上澄み中には水ガラス成分の他に微量の鉄化合物とごく細かな磁鉄鉱粒子を分析で検出することができた。明らかにこれらの不純物はシリカ表面によって多孔質磁性粒子構造体内に包摂され、時間の経過とともにそこから外部に拡散したものである。それに加えてこの観察は、ケイ酸塩層が国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられたバッチ法では完全に閉鎖されずもしくは不規則に分布し、従って鉄化合物の流出を防止できないことを示唆している。

上記抽出可能な障害成分の除去を考慮して、以下に述べるプロセス技術的最適化が実施された。改善は、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられた方法との比較によって証明される。しかしながらここに述べる実験では、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットの実施例とは異なり、もはや標準製品として入手可能でないバイオキシデＥ８７０７ではなく、ごく類似した型のバイオキシデＥ８７０６が利用された。両者とも製造に起因して僅かな割合のＳｉを含む磁鉄鉱Ｆｅ₃Ｏ₄であり、８７０７型ではＦｅ／Ｓｉ含有量が９９．１／０．９、バイオキシデＥ８７０６では９９．４／０．４である。本発明に係る方法を考慮すると、表面特性、とりわけ、磁鉄鉱Ｆｅ₃Ｏ₄のｐＨ値が重要である。ｐＨ６．５のバイオキシデＥ８７０７は弱酸性表面を有する一方、現在利用されるバイオキシデＥ８７０６型では中性ｐＨ値が確認され、チャージによっては弱アルカリ性の値（ｐＨ７．５）さえ確認された。意外なことに、弱アルカリ性のこの表面特性でさえ水ガラス−シリカの析出を誘発できることが発見された。ふつう、強アルカリ性水ガラス溶液からのシリカ析出は酸の添加によって行われる。

ところで比較実験において意外なことに、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられた段階的ｐＨ低下の代わりに例えば膜法等の連続法を利用するとき、抽出可能な成分に関して著しく向上した結果を達成できることが発見された。その際、実施例のなかで詳しく述べるように水性水ガラス／磁性粒子懸濁液は、１時間の反応時間後に「クロスフロー精密濾過」によって浄化された。僅かな超過圧で実施される「クロスフロー精密濾過」は、Ｍ．Ｍｕｌｄｅｒの"Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"に述べられているように公知の分離法もしくは浄化法である。その際、一定の容積で操作が行なわれる。すなわち、不純物を含む透過水体積流量が同じ体積流量の流入新鮮水に取り替えられる。生物学において知られている透析法とは異なり、精密濾過では孔径に相応して低分子塩だけでなく、粒子状不純物も分離することができる。この連続的浄化プロセスは、流出する透過水品質が流入新鮮水の純度に一致するまで実施された。回分の大きさに応じて一致するまでには約１２乃至１５時間かかる。

ところでＥＳＣＡによる表面分析キャラクタリゼーションにおいてまったく意外なことに、こうして製造されたシリカ変性磁性粒子はシリカ表面に目を向けると新規な、つまり超薄シリカ構造体を有し、場合によっては浄化向上もしくは純度上昇をそれと相関させることができることが確認された。このシリカナノ層は、粒子表面全体に均一に分布した５ｎｍまでのケイ酸塩層を特徴としている。しかし本発明に係る方法はさらに、２ｎｍの層厚についても記述し、まったく特別好ましくは０．５ｎｍ乃至０．２ｎｍの層厚についても記述する。こうして被覆された粒子が有する表面被覆は、例えば鉄イオンが周囲の溶液に流出するのを防止することを特徴としている。

シリカ層厚０．２ｎｍの磁性粒子の製造は実施例３で述べられる。

本発明に係る方法はさらに閉鎖された密なケイ酸塩層を特徴としており、これは純度向上もしくは上澄み中に観察される汚れ作用減少とも相関している。本発明に係るこの方法に従って製造されたシリカ被覆磁性粒子の純度は、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられた方法と比較して本質的に改善されている。それとともに製造および洗浄後に認められる上澄みの変色はもはや現れない（実施例２、３参照）。密で閉鎖されたシリカ層は特に、増幅法もしくは生物学的実験の光学評価を妨害することがある視認可能なまたは視認不可能な不純物、例えば鉄イオンの流出を妨げる（実施例４、５参照）。

意外なことに、さらに、磁鉄鉱表面におけるケイ酸塩の凝集体およびクラスタの生成は、前記膜濾過法において、ゆっくりと連続的に希釈してｐＨ値を中性値に低下させることによってほぼ完全に防止され、ないしは、国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットに述べられた「バッチ法」と比較して更に著しく低減されることが発見された。十分に規定されたこのケイ素ナノ層は以下に述べる特性と生物学的応用とに肯定的に影響する。

さらに、澄んだ上澄みに関する付加的製品最適化は、膜法に続いて、ゆっくりと沈降する酸化鉄粒子の分離を可能とする分別遠心分離を実施することによって達成することができることが明らかとなった。

こうして製造されて水性懸濁液として扱われる試料では、出発製品と絶対的に同一の磁化性、不変な形態、高い核酸結合能力、マイクロタイタープレートからの好ましい滴下、放置中にさしたる不純物なしに数分以内に磁界内で問題なく磁性粒子を分離する、優れた懸濁安定性等のあらゆる判定基準を達成できた。

「シリカで被覆された磁性粒子」との表現は、シリカナノ層で被覆された磁鉄鉱コアを含む。

「閉鎖された密なシリカ層」との表現は、５ｎｍ未満の範囲内、特別好ましくは層厚２ｎｍ、まったく特別好ましくは層厚０．５乃至０．２ｎｍの一様で均質な単層乃至多層の分子シリカ層を含む。閉鎖されたこのシリカ層は、特に、鉄化合物および鉄イオンがシリカ被覆磁性粒子の周囲に流出するのを妨げる。

「改良された製造方法」との表現は、精密濾過ユニットもしくは限外濾過ユニットを用いて容易に実施可能な、但しきわめて集中的な洗浄プロセスを含み、この洗浄プロセスはシリカ被覆磁性粒子の極端な純度をもたらす。この方法では、最初に粒子表面にケイ酸塩のナノ層が沈殿した後、ゆっくりとした制御下の連続的希釈に伴う反応溶液中で中性ｐＨ値へのｐＨ値低下が生じ、これにより均一で密な閉鎖されかつ均質なケイ酸塩層が磁鉄鉱表面に生じる。さらに、支障となるケイ酸塩の凝集体またはクラスタの生成が防止されもしくは十分に低減される。

「遠心分離法を用いたナノ粒子状成分の減少」との表現は、遠心分離法または単純な重力法の応用を含む。所望の留分が沈降する一方、望ましくないナノ粒子状成分は上澄みを取り除くことによって廃棄することができる。この効果は、超遠心分離によって粒径分布を判定することによって、減少した小部分の分画に基づいて確認することができる。遠心分離法では出発懸濁液が約３０００ｇにおいて１５分間遠心分離され、上澄みが取り除かれ、同量の水または緩衝液が添加され、再懸濁され、これらのステップが数回乃至１０回繰り返される。重力法では、遠心分離の代わりに、大部分の粒子が容器の底に沈積するまで単純に長時間放置され、引き続き水性上澄みが交換される。

「最適な磁化挙動」との表現は、極力大きな磁鉄鉱割合を有し、従って浄化中、反応容器への外部からの磁界印加時に、数分以内、例えば１分乃至５分以内に試料基質から完全に分離されるという本発明に係る粒子の特性を含む。これは特に、ピペットロボットを用いた自動処理における極力短い浄化時間、ハードウェアコンポーネントとしての磁界強度の限定された極力安価な磁石の使用において考慮することができる。

「懸濁挙動」との表現は、最適な粒径分布に基づいて、浄化段階の間、数分、例えば１０乃至１５分（核酸の吸着段階）以内の振動後にさしたる沈降を生じないように挙動する本発明に係る粒子の特性を含む。

「プラスチック表面からの最適な遊離挙動」との表現は、親水性表面性状に基づいて、生物学的浄化プロセスで使用されるプラスチック物品に対する親和力が低いという本発明に係る粒子の特性を含む。使用されるプラスチック物品は、なかんずく、ポリスチレン容器、ポリエチレン容器、ポリプロピレン容器、もしくは匹敵するプラスチックからなるあらゆる形状および寸法のいわゆるマイクロタイタープレートを含む。本発明に係る磁性粒子の特殊なシリカ層はこれらのプラスチック表面との反発的交互作用を可能とし、被覆された磁性粒子はその表面から滴下し、大きな相互作用を生じない。大きな相互作用は核酸の生物学的浄化法において結局、収率損失を生じることがある。

「単離」との表現は、上記シリカ被覆磁性粒子を使用して生物学的試料から核酸を浄化することを含み、実質的に以下の個別ステップに分かれる：
ａ）反応容器内で溶解緩衝剤で試料を溶解し、培養後、主にいわゆるカオトロピック塩、特別好ましくはグアニジン（グアニジニウム）イソチオシアネートを高いモル濃度で含む結合緩衝剤を添加する。
ｂ）ケイ酸塩被覆磁性粒子を添加する。
ｃ）核酸が磁性粒子に結合する温度において培養する。
ｄ）周辺の液体から磁性粒子を分離する磁界を印加して反応配合物から非結合成分を除去する。
ｅ）非特異的に結合した分子から核酸を浄化するために、粒子の磁化時のように、洗浄緩衝液を複数回添加し、引き続き、洗浄緩衝液を取り出す。
ｆ）核酸が磁性粒子から分離される条件下で溶出緩衝剤を添加する。
ｇ）磁界を再度印加後に溶出液を核酸と分離する。

「自動浄化」との表現は、人間の手動作業力に完全にまたは部分ステップだけでも取り代わり、特に特殊な緩衝液で生物学的身体試料を分解するステップ、磁性粒子添加ステップ、特定温度における培養ステップ、吸収されなかった試料成分を取り除くステップ、洗浄ステップ、特定温度において粒子から結合された核酸を溶出するステップ、そして粒子懸濁液から溶出液を分離するステップにおいて応用される本方法の変更態様を含む。

「核酸」との表現は、鎖長が１０モノマー単位を超えるオリゴマーおよびポリマーリボヌクレオチドもしくは２'−デスオキシリボヌノレオチドを含む。核酸内のモノマー単位は隣接するモノマー単位の３'水酸基と５'水酸基との間でホスホジエステル化合物を介して結合されており、各炭水化物コンポーネントの１'原子に複素環式塩基がグリコシド結合されている。核酸は分子間水素結合を形成することによって二本鎖と三本鎖を結成することができる。

同様に、タンパク質／核酸錯体、モルポリノスまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）等の合成ヌクレオチドを有する核酸が意味されている。

「生物学的身体試料」との表現が含むのは、例えば全血、血清または血漿等の核酸含有生物学的材料、特にウイルス含有血清または血漿、その際まったく特別にはＨＩＶまたはＨＣＶ感染血清試料、「バフィーコート」（＝血液の白色血球留分）、便、腹水、塗抹、痰、器官穿刺標本、生検、組織切片、その際まったく特別にはさまざまに固定され、特にホルマリン含有固定液で固定されパラフィンに包埋された組織切片、分泌物、髄液、胆汁、リンパ液、尿、糞、精液、細胞、細胞培養である。同様に、生化学プロセスに由来しかつ引き続き浄化されねばならない核酸をも意味する。

「さまざまな増幅法で検出」との表現は、さまざまな分子生物学的技術、特にＰＣＲ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ＬＣＲまたはＮＡＳＢＡをも用いて浄化済み核酸の複製とそれに続くまたは同時並行的な増幅生成物の検出とを含む。同様に、例えばｂＤＮＡ等のシグナル増幅法での検出、つまり拡散増幅なしの検出が意味されている。特にＰＣＲの検出は、蛍光技術を用いて運動学的方法を応用することによって、「リアルタイム」条件のもとでも実施することができ、または古典的アガロースゲルで行うことができる。特に「リアルタイム」ＰＣＲは、相応するキャリブレータを使用して核酸のきわめて良好な定量を可能とする。臨床感度（間違った否定的結果の回避）にとって危険で限定的なのは、核酸の効率的浄化、すなわち、磁性粒子への効率的結合とＰＣＲ適合性条件のもとでの可逆的遊離である。

本発明の他の対象は本発明に係る方法を実施するためのキットであり、このキットは下記構成要素を含む：
（ａ）試料を分解するための試薬、
（ｂ）シリカ含有磁性粒子、またはシリカ含有磁性粒子の懸濁液、
（ｃ）洗浄緩衝剤、
（ｄ）溶出緩衝液。

キットの個々のコンポーネントには上記詳述と以下の実施例があてはまる。キットの個々のまたは複数のコンポーネントは変更した態様でも使用することができる。

本発明でもって、特別に製造されたシリカ被覆磁性粒子の使用に基づいて、特別効率的に生物学的身体試料から核酸を自動的に定量的に浄化し、相応する増幅技術で検出することが可能である。

従って、本発明は核酸診断にとって重要な貢献をなす。

以上に述べた本発明を実施するためのプロトコルを以下で例示する。これらの実施例においてその都度浄化されるべき核酸の厳密な反応条件が明示されるが、しかしながら、例えば磁性粒子量、培養温度、洗浄温度、培養時間、洗浄時間、溶解緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液の濃度等のさまざまなパラメータはその都度浄化されるべき核酸に依存して変更することができる。

（比較例）
（国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットの方法と同様に）バイオキシデＥ８７０６から水ガラス３７／４０によるｐＨ値を段階的に低下させることによるケイ酸塩被覆磁鉄鉱粒子の製造。
反応部：

ＫＰＧ攪拌器を備えた６ｌ三首フラスコ内に４０００ｇの水ガラス溶液３７／４０（Ｃｏｇｎｉｓ ＧｍｂＨ）がある。攪拌しながら２０００ｇのバイオキシデ８７０６（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）が１０分内に添加される。引き続き室温でなお１時間再攪拌される。
処理：

攪拌器の停止後、シリカ被覆磁鉄鉱ビーズが沈降する。このプロセスは、場合によっては磁界を印加することによって促進することができる。１時間の待ち時間後、上澄みが吸引される。処理のため４ｌの水が添加され、約１０分間攪拌される。上澄みが再び吸引される。この洗浄過程はなお少なくとも４回繰り返され、最終的に洗浄水は７．５乃至７．０のｐＨ値となる。
シリカ磁性粒子の特性：
ゼータ電位：−５０．２
ＥＳＣＡによるシリカ含有量：７．０原子％Ｓｉ
純度：室温で１０日間の放置後、上澄みは黄褐色に変色した。

（実施例２）
バイオキシデＥ８７０６から水ガラス３７／４０による、「クロスフロー精密濾過」によってｐＨ値を連続的に低下させることによる高純度ケイ酸塩被覆磁鉄鉱粒子の製造。

比較例に述べられた反応部が繰り返され、但し処理は段階的もしくはバッチごとではなく、ＰＡＬＬ社の精密濾過ユニット"Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（登録商標）"を用いて０．２μｍＳｕｐｏｒ（登録商標）膜カセットで行われた。

このため磁性粒子懸濁液はポンプを用いてホースを介して吸引され、膜カセットに通された。透過水が廃棄される一方、濃縮水は反応容器に戻された。透過水に等しい量が粒子懸濁液に新たに供給された。

濾過時間１２時間後に透過水はｐＨおよび伝導率に関して供給水の品質に達し、浄化プロセスは終了した。
最終製品の性質：
ゼータ電位：−４１ｍＶ
Ｓｉ含有量：４．９原子％Ｓｉ。ＥＳＣＡにより判定。出発製品バイオキシデ８７０６のシリカ含有量：２．４原子％Ｓｉ。

従って、２．５原子％Ｓｉの差分が水ガラスでのシリカ処理によって粒子表面に析出された。これからシリカ層厚は０．４ｎｍと算出された。
純度：限外濾過によって浄化された粒子懸濁液は室温で数ヶ月の放置後も上澄みに変色を示さなかった。

（実施例３）
「クロスフロー精密濾過」によってｐＨ値を連続的に低下させ、引き続き分別遠心分離しながらバイオキシデＥ８７０６と水ガラス３７／４０とからの高純度ケイ酸塩被覆磁鉄鉱粒子の製造。

実施例２に述べた最終製品が遠心器（エッペンドルフ５８１０）を用いて３２２５ｇで７分間遠心分離された。製品の主要部分（＞９８％）が沈降する一方、黄褐色に変色した上澄みが残り、これが廃棄された。

残留物を再び水に収容し、遠心分離され、有色上澄みから分離された。この分別遠心分離は、上澄みが無色となるまでなお８回繰り返された。

最終製品の性質（第９遠心物）：
ゼータ電位：−３５ｍＶ
Ｓｉ含有量：３．０％Ｓｉ。従って、その差０．６原子％は水ガラスでのシリカ処理によって粒子表面に析出された。これからシリカ層厚は０．２ｎｍと算出された。
純度：こうして製造された磁性粒子懸濁液の上澄みは、数ヶ月保管した場合でもまったく無色のままである。

この製品品質は特に磁気分離に関して優れた値を示した。磁界印加後２０秒以内に既に絶対的に澄んだ上澄みを観察できた。

（実施例４）
シリカ被覆磁性粒子懸濁液の水性上澄みの光学測定
この実験では、ロット名称ＨＩＥ１３２６６（実施例２、３）の本発明に係る方法に由来）とロット名称ＨＩＥ１２１０６Ｒ２（国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットの方法に由来し、バイオキシデＥ８７０７に基づく）のシリカ被覆磁性粒子の２つの水性上澄みの吸収スペクトルは２２１乃至７５０ｎｍの範囲内でＮａｎｏｄｒｏｐ社の分光計で測定された（図１参照）。

このスペクトルから抽出された水スペクトルが参照とされた。対照として再度水スペクトルが試料として測定された（ゼロライン）。

スペクトルから明らかとなるように、シリカ被覆磁性粒子ＨＩＥ１３２６６の水性上澄みは水と類似の吸収挙動を示す。それに反して、ＨＩＥ１２１０６Ｒ２の上澄みの吸収線は約５００ｎｍの範囲内までの明確に変化する高い吸収挙動を示す。

このことから明らかとなるように、精密濾過ユニットにおいて従来の洗浄剤（粒子ＨＩＥ１３２６６）を使った本発明に係る製造法は、逐次数回洗浄しもしくは段階的にｐＨ値を低下（国際出願第０３／０５８６４９号パンフレットも参照）させた粒子ＨＩＥ１２１０６Ｒ２と比較して、上澄みの汚染もしくは鉄化合物流出の減少をもたらす。粒子ＨＩＥ１２１０６Ｒ２におけるこの汚染は、時間の経過に伴う上澄みの顕著な変色と吸収挙動の高まりとに現れる。さらに、上澄み内のこの汚染低下は本発明に係る方法による粒子上の閉鎖されたシリカ層を指し示す。

（実施例５）
ＲＴ‐ＰＣＲにおけるシリカ被覆磁性粒子の水性上澄みの挙動
２つの異なるシリカ被覆磁性粒子（ロット名称ＨＩＥ１３２６６、ＨＩＥ１２１０６Ｒ２）の水性上澄みが磁界のもとで取り出された。粒子ロットＨＩＥ１３２６６は本発明に係る製造法で従来の洗浄剤を使って精密濾過ユニットにおいて製造された（実施例２、３参照）。粒子ロットＨＩＥ１２１０６Ｒ２は逐次数回洗浄することによって製造された（国際出願第０３／０５８６４９号パンフレット参照。バイオキシデＥ８７０７をベース）。両方の上澄みは次に定量的単段ＲＴ‐ＰＣＲに供された。

いわゆる定量的ワンステップＲＴ（逆転写）ＰＣＲがＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭＸ４０００で実施された。両方の個々の粒子上澄みの上澄み５μｌもしくは水５μｌが対照として２０μｌのマスター混合物に与えられた。マスター混合物は下記成分を含む：４００ｎＭプライマーＡ、４００ｎＭプライマーＢ、１０ｎｇ ＭＣＦ‐７ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｔａｑｍａｎプライマー２００ｎＭ、１ｘ緩衝液Ａ、５ｎＭ ＭｇＣｌ₂、１．２ｎＭ ｄＮＴＰｓ、８Ｕリボヌクレアーゼ阻害剤、２０Ｕ ＭｕＬＶ逆転写酵素、１．２５Ｕ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。ＰＣＲプログラムは、４５℃で３０分、９５℃で１０分、９６℃で１５秒、６３℃で６０秒、７２℃で３０秒の４５サイクルである。

配合物は９６穴のマイクロタイタープレート（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に供され、閉鎖後に分析器内に置かれた。作動後、機器ソフトウェアを用いて、選択された基本値（蛍光強度）において、シグナル曲線の指数関数的増幅範囲内で各試料に個々のＣｔ値（選択された基本値が増幅曲線と交差するサイクル数）が割り当てられる。

図２から粒子ＨＩＥ１３２６６の上澄みを有する増幅曲線が明らかとなるが、これは水を試料とした増幅曲線に匹敵する。それに反してＨＩＥ１２１０６Ｒ２の上澄みでは増幅曲線が右側に約３Ｃｔ値だけシフトしているのが分かり、これはＲＴ‐ＰＣＲ効率への干渉もしくは否定的影響を示唆している。

ケイ酸塩被覆磁性粒子ＨＩＥ１３２６６（実施例２の本発明に係る方法）、ＨＩＥ１２１０６Ｒ２（国際公開第０３／０５８６４９号パンフレットの方法）の水性上澄みの吸収スペクトル（Ｎａｎｏｄｒｏｐ社の分光計）。対照は水。 ケイ酸塩被覆磁性粒子ＨＩＥ１３２６６（実施例２の本発明に係る方法）、ＨＩＥ１２１０６Ｒ２（国際公開第０３／０５８６４９号パンフレットの方法）の水性上澄みを使ったＭＸ４０００上での定量ＲＴ‐ＰＣＲの増幅曲線。対照は水。

Claims (9)

1. ケイ酸塩を含む最大層厚０．５ｎｍの閉鎖表面被覆を有することを特徴とするシリカ被覆磁性粒子。
2. 磁性材料が酸化鉄もしくは磁鉄鉱である請求項１記載のシリカ被覆磁性粒子。
3. 粒径分布が０．１乃至１μｍである請求項２記載のシリカ被覆磁性粒子。
4. 請求項１乃至３記載の粒子を製造するための方法において、水ガラスまたはケイ酸ゾルから磁鉄鉱粒子上へのケイ酸塩初析出が鉄粒子の表面特性によって引き起こされ、引き続き表面がゆっくりとした連続的希釈とｐＨ値の中性ｐＨ値への低下とによって平滑にされ密封されることを特徴とする方法。
5. ｐＨ値の低下をクロスフロー精密濾過によって行なう請求項４に記載の方法。
6. 請求項１乃至３記載の磁性粒子を使用して生物学的身体試料から核酸を精製するための方法。
7. 核酸がＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 核酸がＨＣＶまたはＨＩＶのＲＮＡであることを特徴とする請求項６記載の方法。
9. 核酸が固定された身体試料からのＲＮＡまたはＤＮＡであることを特徴とする請求項６記載の方法。

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