CN117802203A - 一种基于crispr技术降低福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸占比的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR技术降低福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸占比的方法及其试剂盒,所述方法特异性高、不受样本细胞状态的影响且不具有微生物偏好性,可减少微生物核酸的损失,进而提高样本微生物检出能力,能够更加真实准确地鉴定宏基因组中的微生物,适用于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体地,涉及一种基于CRISPR技术降低福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸占比的方法及其试剂盒。
背景技术
目前对组织中微生物组检测技术通常使用的是新鲜组织样本。而当新鲜标本难以得到,或者对已有病例进行回顾性研究时,医院或科研机构中保存的石蜡包埋组织则可成为微生物组学研究的重要材料来源。福尔马林固定石蜡包埋组织样本(Formalin-Fixedand Parrffin Embedded,FFPE)是医学领域常见的一类生物材料,最开始应用于免疫组化进行疾病诊断和病理分型,目前已广泛应用到各种组学研究中。
FFPE样本的制作过程包括福尔马林固定、脱水、浸蜡和包埋的环节,FFPE组织样本提取的核酸往往存在高度片段化、核酸分子损伤、核酸与蛋白质分子交联、脱蜡试剂残留等质量问题,并且严重影响后续建库的成功率以及后续测序数据的表现。针对FFPE样本的提取相比新鲜组织样本提取需要增加二甲苯脱蜡和高温解交联的步骤,并且物理振荡破壁强度应比新鲜组织样本的提取要温和,否则会加剧FFPE样本核酸的片段化。
FFPE组织样本中绝大部分为宿主细胞,其中微生物占比极少。宿主细胞中含有大量的宿主核酸,这些宿主核酸在测序过程中不仅占了绝大多数的测序数据量导致浪费,还会降低微生物的检测灵敏度,因此,去除宏基因组样本中的宿主DNA成为提高宏基因组检测灵敏度、降低测序成本的一项关键技术。目前常用的去宿主方法为差异裂解法,利用较温和的裂解缓冲液可以实现对人源细胞裂解的同时保留大多数微生物细胞完整性,对裂解释放的人基因组DNA用DNase进行消化后,从而实现去除宿主DNA的目的,该方法的优点是操作简单,缺点是对难裂解的微生物回收率较高,而对易裂解和细胞完整性差的微生物损失较大。
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-associated protein 9(Cas9)系统是细菌对抗噬菌体感染的一种防御机制,其作用原理是在向导RNA(guide RNA,gRNA)的介导下,Cas9与靶DNA结合并对靶DNA进行双链切割。Cas9与靶DNA的结合只有在PAM(protospacer adjacent motif)序列存在且紧邻PAM的互补链上的17-20个碱基与gRNA互补时才会发生。针对不需要DNA切割的应用,人们将Cas9的核酸内切酶活性位点进行了突变得到dCas9(dead Cas9),dCas9仍具有与DNA结合的能力。CRISPR-dCas9系统已被广泛应用于转录调控、基因组成像和DNA捕获等研究。
本发明提出了一种基于CRISPR技术对FFPE样本提取后去除宿主核酸的方法,即对提取后的组织核酸样本用CRISPR-dCas9特异性捕获人源DNA,与微生物DNA的分离,达到去除人源DNA的效果,可以有效避免微生物DNA的损失,该方法操作简单、特异性高且不具有微生物偏好性。
发明内容
为了解决目前本领域面临的差异裂解法去宿主具有一定的偏好性、且会造成易裂解微生物核酸的损失这一技术问题,本发明的目的在于提供一种基于CRISPR技术降低福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸占比的方法及其试剂盒。
本发明提供的上述方法主要对提取后的组织核酸样本用CRISPR-dCas9特异性捕获人源DNA,与微生物DNA的分离,达到去除人源DNA的效果,可以有效避免微生物DNA的损失,该方法操作简单、特异性高且不具有微生物偏好性,能够显著提高FFPE组织样本中微生物的检出率。
本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现:
本发明的第一方面提供了一种基于CRISPR技术特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的方法。
进一步,所述方法包括如下步骤:
(1)从福尔马林固定石蜡包埋样本中提取宏基因组总核酸,得到包含宿主基因组DNA的宏基因组核酸样品;
(2)配制sgRNA-dCas9复合物,所述sgRNA-dCas9复合物包括复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA;
(3)配制反应体系,所述反应体系包含步骤(1)中所述的核酸样品、步骤(2)中所述的sgRNA-dCas9复合物,在缓冲液中反应;
(4)用包被有链霉亲和素的磁珠捕获sgRNA-dCas9复合物和其结合的宿主DNA,形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物;
(5)磁力分离去除磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物,回收上清,达到去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的目的;
优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA包含靶向Alu的Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8、dCas9;
优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA包含靶向L1的L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8、dCas9;
更优选地,所述Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8的序列如SEQ ID NO:1~8所示;
更优选地,所述L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8的序列如SEQ ID NO:9~16所示。
进一步,步骤(2)中所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA还包含10X NEB buffer、RNaseinhibitor。
进一步,步骤(2)中所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA中Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为(0.1~1.0)μg、(0.1~1.0)μg、(0.5~1.5)μL、(0.1~1.0)μL;
优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA中Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为0.5μg、0.5μg、1μL、0.5μL;
更优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA由Nuclease-free Water补加至10μL。
进一步,步骤(2)中所述复合物二dCas9-L1_sgRNA还包含10X NEB buffer、RNaseinhibitor。
进一步,步骤(2)中所述复合物二dCas9-L1_sgRNA中L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为(0.1~1.0)μg、(0.1~1.0)μg、(0.5~1.5)μL、(0.1~1.0)μL;
优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA中L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为0.5μg、0.5μg、1μL、0.5μL;
更优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA由Nuclease-free Water补加至10μL。
进一步,步骤(3)中所述反应体系的组成如下:福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer;
优选地,所述福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer的使用量分别为(5~15)ng、(0.5~5.0)μL、(0.1-3.0)μL、(0.5~5.0)μL;
更优选地,所述福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer的使用量分别为10ng、2μL、1μL、2μL;
最优选地,所述反应体系由Nuclease-free Water补加至20μL;
最优选地,所述反应体系的反应条件为37℃孵育40min。
进一步,步骤(4)中所述包被有链霉亲和素的磁珠为M-270链霉亲和素磁珠。
进一步,步骤(1)中所述从福尔马林固定石蜡包埋样本中提取宏基因组总核酸包括如下步骤:福尔马林固定石蜡包埋样本脱蜡、细胞解离、裂解及解交联、磁珠纯化、核酸洗脱。
进一步,所述解交联是指解除在FFPE组织样本的制作过程中由甲醛诱导的DNA-DNA交联,或DNA-蛋白交联的过程。
在本发明中,所述福尔马林固定石蜡包埋样本(Formalin-Fixed and ParrffinEmbedded,FFPE)是病理实验室保存临床组织样本的标准方法,这种方法首先通过将组织样本固定在甲醛(也称为福尔马林)中,以保存组织内的蛋白质和重要结构。接下来,将其嵌入石蜡块中,使得切割所需尺寸的切片更容易安装在显微镜载玻片上进行检查。FFPE样本可以在常温下储存数十年不会降解或腐烂,常被用于活检标本的保存和制备,有助于检查、实验研究和诊断/药物开发。
在本发明中,所述Alu和L1是在人基因组上广泛分布且占比较高的两种重复序列,分别占人基因组11%和17%。L1元件的长度约为6~7kb且富含AT,多分布于基因组中基因较少的异染色质区域,而Alu元件的长度约为300bp且富含GC,多分布于基因组中基因富集的常染色质区域,即L1和Alu在碱基组成和人基因组上的分布具有互补性。Alu是灵长类基因组所特有的一种转座元件,而L1家族中也有一部分(L1PA)是灵长类基因组所特有的,虽然不同家族的Alu和L1(L1PA)序列不完全相同,但两种元件具有各自特异的保守序列,可以用于区分人与微生物基因组。
在本发明的具体实施方案中,为了实现对FFPE核酸样本中人基因组的有效去除,本发明针对Alu和L1(L1PA)的保守序列设计sgRNA,将Alu-sgRNA和L1-sgRNA分别合成后,与dCas9组装为Alu-sgRNA-dCas9和L1-sgRNA-dCas9两种复合物。用两种复合物的混合物进行去宿主实验后,通过高通量测序检测去宿主效率,实验结果显示CRISPR去宿主可以有效降低测序数据中人源reads占比并提高微生物reads占比,并提高微生物指标的检出率。本发明提供的方法特异性高、不受样本细胞状态的影响且不具有微生物偏好性,可减少微生物核酸的损失,进而提高样本微生物检出能力。
在本发明的前期实验中,本发明针对Alu设计了长度为18nt和20nt的crRNA,并通过体外转录合成了长度为98nt的trusgRNA(Alu_trusgRNA和L1_trusgRNA,若sgRNA 5’端第一个碱基不是G,则需要在5’端加一个G,此类sgRNA长度为99nt)和100nt的sgRNA(Alu_sgRNA和L1_sgRNA,若sgRNA 5’端第一个碱基不是G,则需要在5’端加一个G,此类sgRNA长度为101nt),将两种长度的sgRNA分别与dCas9蛋白组装成RNP复合物,再用两种复合物进行去宿主实验后,通过qPCR检测两种复合物的去宿主效率,结果显示与100nt sgRNA相比,98ntsgRNA(即为本发明提供的Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8、L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8)去宿主基本不会有微生物损失,表明本发明所采用的sgRNA取得了预料不到的技术效果。
在本发明中,所述去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸包括:降低福尔马林固定石蜡包埋样本中的宿主核酸占比、完全去除福尔马林固定石蜡包埋样本中的宿主核酸。
在本发明中,所述核酸占比是指某类核酸(例如微生物核酸或宿主核酸)在样品中总核酸中所占的比例。
在一些实施方案中,本发明所述的样本可以选自有需要的受试者来源的FFPE组织样本、肺泡灌洗液、痰液、尿液、脓液、拭子、脑脊液、胸腔积液、腹水、新鲜组织样本、粪便等多种样本。在优选的实施方案中,所述样本为有需要的受试者来源的FFPE组织样本。
在一些实施方案中,本发明所述的受试者可以为哺乳动物,所述哺乳动物包括但不限于:人、小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、马、牛或非人灵长类动物。在优选的实施方案中,所述受试者为人。
本发明的第二方面提供了一种特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的试剂盒。
进一步,所述试剂盒采用本发明第一方面所述的方法去除福尔马林固定石蜡包埋样本中的宿主核酸。
本发明的第三方面提供了如下任一方面应用:
(1)本发明第一方面中所述的sgRNA-dCas9复合物在特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本提取后核酸中宿主核酸中的应用;
(2)本发明第一方面所述的方法在特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本提取后核酸中宿主核酸中的应用。
在本发明中,所述去宿主是指从样本中去除属于宿主的生物材料的过程,其中就组织样本而言,宿主或受试者可以通用,均指所述组织所属的生物体。去宿主处理的目的是去除属于宿主的,而尽可能地保留样本中的非宿主来源的生物材料,例如从肿瘤样本中去除宿主DNA,保留微生物DNA。
在本发明中,所述reads是指高通量测序过程中由每个反应产生的序列,通过对这些序列的读取形成测序的原始数据。通过对相互重叠的reads的拼接能够获得重叠群,这一过程通常由测序拼接软件来完成。通过对重叠群的分析可以进一步匹配其中的重叠部分,并确定重叠群在基因组中的顺序,由顺序已知的重叠群组成的更长的scaffold。因此,reads数越高,测序往往越准确。
在本发明中,在进行裂解之前,FFPE组织样品需要进行脱蜡,以暴露样品。脱蜡的过程可以按照常规手段进行。例如,可以采用本领域常用的脱蜡剂,如Histo-Clear、Histo-ClearII,甲基异丁基酮、甲基乙基酮、丙烷、苯-丙酮等。
相对于现有技术,本发明具有的优点和有益效果如下:
本发明提供了一种全新的基于CRISPR技术特异性去除FFPE组织样本提取后核酸中宿主核酸的方法,该方法特异性高、不受样本细胞状态的影响且不具有微生物偏好性,可减少微生物核酸的损失,进而提高样本微生物检出能力。
附图说明
图1:未去宿主和去宿主样本测序数据中人源reads占比和微生物reads占比对应的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,具体实施例仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1不同组织来源的FFPE样本中核酸提取
1、实验材料
样本:阑尾组织FFPE切片3~5张,右半结肠肿瘤组织FFPE切片3~5张;
提取试剂盒:VAMNE Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit;
脱蜡剂:无毒脱蜡剂;
1×PBS缓冲液,生工,B540626-0500;
无水乙醇(优级纯),西陇,1280340501600;
异丙醇,西陇,CAS 67-63-0;
1×dsDNA HS Assay Kit,Thermo,Q33231;
三维样品研磨仪,上海净信,JXFSTPRP-4D。
2、实验方法
(1)FFPE组织样本脱蜡、细胞解离
1)取3~5片组织切片,用解剖刀将组织从切片上刮下,将刮下的组织置于1.5mL离心管中;蜡卷样本则用吸头将蜡卷组织装入1.5mL离心管中。
2)向离心管内加入1mL脱蜡剂,涡旋10s混匀后,室温下12000rpm离心2min。小心吸取并丢弃上清液,注意不要碰到沉淀。
3)向离心管内加入1mL无水乙醇,涡旋10s使沉淀重悬,室温下12000rpm离心2min。小心尽可能吸净所有上清液并丢弃,注意不要碰到沉淀。
4)开盖置于室温至37℃下孵育至样品中乙醇全部蒸干。
5)离心管中加入20μL的Proteinase K,补充无核酸酶水至总体积200μL;最大转速涡旋震荡15s后,置于金属浴中56℃,1000rpm振荡孵育10min。
6)将样本中加入200μL PBS,涡旋振荡重悬组织,转到Lysis Tube管中。
(2)裂解及解交联
1)向Lysis Tube离心管加入40μL Proteinase K、200μL Lysis Buffer 2、200μLBinding Buffer 2,涡旋混匀。
2)将Lysis Tube管置于破壁仪并配平,用破壁条件21m/s,90s,cycle 1,间隔20s,进行破壁。
3)破壁后12,000rpm(13,800×g)离心3min以消除泡沫,转移600μL上清至新的2mLNuclease-free Tube中。
4)置于金属浴中56℃振荡孵育1h。孵育结束后,瞬时离心以收集管盖内壁上的液体。
5)置于金属浴90℃并孵育1h解交联。孵育结束后,瞬时离心以收集管盖内壁上的液体。注意:此步不建议振荡,以免加剧DNA片段化;如只有一个加热模块,应在56℃孵育结束时将样本取出置于室温,待模块升温至90℃再放入。
6)向管中加入350μL异丙醇,涡旋混匀,瞬时离心1-3s以收集管盖内壁上的液体。
(3)磁珠纯化、核酸洗脱
1)向上一步离心管中加入20μL Magnetic Beads,涡旋混匀,上下颠倒混匀3min,静置1min。
2)瞬时离心1-3s,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清。
3)从磁力架上取下离心管,沿管壁加入900μL Wash Buffer A,涡旋混匀,上下颠倒混匀1min,静置1min,瞬时离心1-3s,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清。
4)重复上一步步骤操作一次。
5)从磁力架上取下离心管,沿管壁加入900μL Wash Buffer B,涡旋混匀,上下颠倒混匀1min,静置1min,瞬时离心1-3s,将离心管置于磁力架上,静置1min,弃上清。
6)重复上一步步骤操作一次。
7)瞬时离心1-3s,将离心管置于磁力架上,使用小枪头尽可能弃尽上清,开盖晾干。
8)加入60μL提前预热至56℃的Nuclease-free ddH2O,涡旋混匀1min,瞬时离心1-3s,将离心管置于磁力架上,静置3min。
9)吸取55μL洗脱产物至新的1.5mL Nuclease-free Tube,取1μL用于Qubit检测DNA浓度。
3、实验结果
提取后FFPE样本核酸浓度及产量如下表1所示。
表1提取后FFPE样本核酸浓度及产量
样本 | 浓度(ng/μL) | 提取总量(ng) |
阑尾样本 | 4.23 | 232.65 |
右半结肠组织样本 | 1.87 | 102.85 |
实施例2利用CRISPR技术去除人源核酸DNA
1、实验材料
High-Fidelity 2X PCR Master Mix,NEB;
HiScribeTMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit,NEB;
dCas9-3xFLAG-Biotin Protein,Sigma-Aldrich;
DynabeadsTMM-270链霉亲和素,ThermoFisher;
RNA Clean&Concentrator-5,ZYMO RESEARCH;
RNase Inhibitor,NEB;
NEBuffer,NEB;
Probe qPCR Mix,Takara。
2、实验方法
(1)通过体外转录合成Alu_sgRNA混合物(包括Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8,见表2)、L1_sgRNA混合物(包括L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8,见表2)。
表2 sgRNA序列
(2)配制两种sgRNA-dCas9复合物
1)复合物一(dCas9-Alu_sgRNA)的组成如表3所示。
表3复合物一
2)复合物二(dCas9-L1_sgRNA)的组成如表4所示。
表4复合物二
(3)配制如下4个反应体系
两个实验组用的sgRNA-dCas9复合物为上面组装好的两个复合物,对照组1和实验组1的DNA来源为阑尾FFPE样本,对照组2和实验组2的DNA来源为右半结肠FFPE样本,每个处理组各进行3次重复。各组反应体系如表5所示。
表5各组反应体系
(4)对应每个实验组取10μL M-270链霉亲和素磁珠,用50μL 1×NEB buffer 3.1清洗磁珠两次。
(5)用步骤(3)的20μL产物重悬磁珠,室温旋转结合5-10min,回收上清。
(6)将回收产物和对照组样本进行纯化后建库测序。
3、实验结果
测序结果如图1所示,结果显示,CRISPR去宿主可以降低测序数据中人源reads占比并提高微生物reads占比。
与未去宿主的样本相比,CRISPR去宿主可以提高FFPE样本中微生物的检出效率,其中来源组织中关键微生物指标RPM值及去宿主RPM/未去宿主RPM的fold change如表6所示。以上结果表明了本发明提供的基于CRISPR技术特异性去除FFPE组织样本提取后核酸中宿主核酸的方法能够实际FFPE组织样本中,所述方法特异性高、不受样本细胞状态的影响且不具有微生物偏好性,可减少微生物核酸的损失,进而提高样本微生物检出能力。
表6微生物指标RPM及fold change
Claims (10)
1.一种基于CRISPR技术特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)从福尔马林固定石蜡包埋样本中提取宏基因组总核酸,得到包含宿主基因组DNA的宏基因组核酸样品;
(2)配制sgRNA-dCas9复合物,所述sgRNA-dCas9复合物包括复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA;
(3)配制反应体系,所述反应体系包含步骤(1)中所述的核酸样品、步骤(2)中所述的sgRNA-dCas9复合物,在缓冲液中反应;
(4)用包被有链霉亲和素的磁珠捕获sgRNA-dCas9复合物和其结合的宿主DNA,形成磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物;
(5)磁力分离去除磁珠-蛋白-RNA-DNA复合物,回收上清,达到去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的目的;
优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA包含靶向Alu的Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8、dCas9;
优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA包含靶向L1的L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8、dCas9;
更优选地,所述Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8的序列如SEQ ID NO:1~8所示;
更优选地,所述L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8的序列如SEQ ID NO:9~16所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA还包含10X NEB buffer、RNase inhibitor。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA中Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为(0.1~1.0)μg、(0.1~1.0)μg、(0.5~1.5)μL、(0.1~1.0)μL;
优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA中Alu_sgRNA_1~Alu_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为0.5μg、0.5μg、1μL、0.5μL;
更优选地,所述复合物一dCas9-Alu_sgRNA由Nuclease-free Water补加至10μL。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述复合物二dCas9-L1_sgRNA还包含10X NEB buffer、RNase inhibitor。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述复合物二dCas9-L1_sgRNA中L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8混合物、dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为(0.1~1.0)μg、(0.1~1.0)μg、(0.5~1.5)μL、(0.1~1.0)μL;
优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA中L1_sgRNA_1~L1_sgRNA_8混合物、dCas9、10XNEB buffer、RNase inhibitor的使用量分别为0.5μg、0.5μg、1μL、0.5μL;
更优选地,所述复合物二dCas9-L1_sgRNA由Nuclease-free Water补加至10μL。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述反应体系的组成如下:福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer;
优选地,所述福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer的使用量分别为(5~15)ng、(0.5~5.0)μL、(0.1-3.0)μL、(0.5~5.0)μL;
更优选地,所述福尔马林固定石蜡包埋样本来源的核酸样品、复合物一dCas9-Alu_sgRNA、复合物二dCas9-L1_sgRNA、10X NEB buffer的使用量分别为10ng、2μL、1μL、2μL;
最优选地,所述反应体系由Nuclease-free Water补加至20μL;
最优选地,所述反应体系的反应条件为37℃孵育40min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中所述包被有链霉亲和素的磁珠为M-270链霉亲和素磁珠。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述从福尔马林固定石蜡包埋样本中提取宏基因组总核酸包括如下步骤:福尔马林固定石蜡包埋样本脱蜡、细胞解离、裂解及解交联、磁珠纯化、核酸洗脱。
9.一种特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本中宿主核酸的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用权利要求1-8中任一项所述的方法去除福尔马林固定石蜡包埋样本中的宿主核酸。
10.如下任一方面应用,其特征在于,所述应用包括:
(1)权利要求1中所述的sgRNA-dCas9复合物在特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本提取后核酸中宿主核酸中的应用;
(2)权利要求1-8中任一项所述的方法在特异性去除福尔马林固定石蜡包埋样本提取后核酸中宿主核酸中的应用。
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CN113564227A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-10-29 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 基于CRISPR/dcas9的宿主与病原微生物DNA快速分离方法 |
CN115125288A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-09-30 | 杭州瑞普基因科技有限公司 | 在福尔马林固定石蜡包埋组织中降低宿主核酸比例的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
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SUK YEE LAM ET AL.: "Technical challenges regarding the use of formalin‑fixed paraffin embedded (FFPE) tissue specimens for the detection of bacterial alterations in colorectal cancer", BMC MICROBIOL, 31 December 2021 (2021-12-31) * |
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