CN107532195A - 利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，包括如下步骤：(a)将相互不混合的第一物质和第二物质混合于体液或具有细胞外囊泡的水溶液中，从而制造双水相体系；(b)对所述双水相体系中浓缩于第二物质的细胞外囊泡进行分离。利用所述双水相体系的细胞外囊泡的分离方法与现有技术相比，具有非常高的效率，且具有分离方式简单、所需时间非常短的优点。本发明的利用双水相体系的细胞外囊泡的分离不需要超速离心分离机，在约10～20分钟的短时间内几乎以100％的效率实现细胞外囊泡的分离，因此，相比于现有的其他分离方法具有以下优点：实用、因花费少而经济的同时能够提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度，不仅可以通过分离的细胞外囊泡来诊断疾病，而且可以适用于利用细胞外囊泡的多种领域。

Description

利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法
技术领域
本发明涉及利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，更加详细地，提供一种利用所述方法能够在短时间内迅速地分离细胞外囊泡且还可以提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度的方法。
背景技术
在细胞外囊泡中有外泌体(exosomes)或微泡(microvesicles)等，大小为50～1000nm，具有原来的细胞所具有的特性，因此，作为诊断疾病的标志物(marker)受到关注。
作为现有的分离细胞外囊泡的技术有超速离心分离(ultracentrifugationisolation)、尺寸排阻法(size exclusion)、免疫亲和性分离(immunoaffinityisolation)、微流体芯片技术(microfluidics chip)及利用聚合物的方法(polymericmethod)等。其中，超速离心分离是分离细胞外囊泡时最为广泛使用的方法，是原理简单且最具可信性的分离方法。
但是，利用所述超速离心分离对细胞外囊泡进行分离时具有以下缺点：细胞外囊泡的收率低，分离时所需时间长，且需要昂贵的机器。
就尺寸排阻法而言，主要和超速离心分离法一起使用，虽然具有简单地提高细胞外囊泡的纯度的优点，但局限在于细胞外囊泡粘附于过滤器并分离后的收率低。
免疫亲和性分离法作为使得抗体粘附于细胞外囊泡而进行分离的方法，虽然可以通过非常高的筛选特性(specificity)进行分离，但制造抗体的过程需要很长时间且花费较多费用，因此不适合使用于实用性的诊断。
为了克服所述现有技术的问题，本发明的发明人在公开专利第2014-0050465号中提出了一种涉及分离细胞外囊泡的微流体芯片的技术。作为利用由记载于所述专利文献的抗体所涂敷的微流体芯片而使得细胞外囊泡从血清中分离出来的方法，虽然具有细胞外囊泡的分离所需的时间少且不需要单独准备研究室而在经济方面有利的优点，但是所述方法也是从收率较低这点来说，作为既实用又经济的诊断方法来使用仍然存在需要改进的问题。
另外，利用聚合物的方法作为通过降低体液(body fluid)的溶解度来使得细胞外囊泡沉淀的技术，需要较长的准备时间(incubation time)，且连蛋白质也一起沉淀，因而沉淀物的纯度不佳，不适宜用于诊断。
发明内容
本发明涉及一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，从体液中分离细胞外囊泡时，提出一种相比于现有技术以高纯度在短时间内迅速地进行分离的技术。
更为详细地进行说明，现有的细胞外囊泡分离技术具有收率低、诱发杂质污染(impurity contamination)的问题，为了通过与现有技术完全不同的方式对细胞外囊泡进行分离，本发明中提出一种利用双水相体系的方法。所述双水相体系可以在短时间内有效地对相互不同种类的粒子(particles)进行分离，因此，经常被使用于分离粒子，但是通过双水相体系来分离细胞外囊泡的研究尚未被报道。
在本发明中，利用双水相体系对细胞外囊泡进行分离，从而提供一种具有高收率和筛选特性(Selectivity)及短时间内迅速进行分离的方法。
但是，本发明想要实现的技术课题并非受限于以上所提及的课题，未提及的又另外的课题，对该技术领域具有通常知识的人员来说，可以明确地从后面的本发明的说明书的记载中得到理解。
本发明的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法包括如下步骤：(a)将不相混合的第一物质和第二物质混合于体液或含有细胞外囊泡的水溶液中，从而制造双水相体系；(b)对所述双水相体系中浓缩于第一物质和第二物质之间的界面或所述第二物质的细胞外囊泡进行分离，在所述(a)步骤之后，还可以包括如下步骤：添加添加物，从而调节范德瓦耳斯相互作用(van der waals interactions)、氢键结合(hydrogen bonding)、水合作用(hydration)、疏水相互作用(hydrophobic interaction)或静电相互作用(electrostaticinteraction)等；以及以100～5,000X g-力对所述双水相体系进行离心分离。
此时，制造出双水相体系的第一物质/第二物质可以选自水/EOPO(ethyleneoxidepropylene oxide，环氧乙烷-环氧丙烷)、聚乙二醇(polyethylene glycol)/葡聚糖(dextran)、聚乙二醇/高浓度盐、聚乙二醇/果聚糖(levan)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)/葡聚糖、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)/葡聚糖、聚蔗糖(ficoll)/葡聚糖、聚乙二醇/聚(乙烯基甲基乙基醚)(Poly(vinyl methylethyl ether))、聚乙二醇/硫酸铵(ammonium sulfate)、聚乙二醇/硫酸钠(sodium sulfate)、聚乙二醇/硫酸镁(magnesium sulfate)、聚乙二醇/磷酸钾(potassium phosphate)或聚乙二醇/碳酸钠(sodium carbonate)。
另外，第一物质为聚乙二醇、第二物质为葡聚糖的情况，优选地，所述聚乙二醇的分子量为0.2～600kDa，浓度为1～20wt％，所述葡聚糖的分子量为15～2,000kDa，浓度为1～20wt％。
通过本发明中提出的所述方法能够提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度，优选地，所述细胞外囊泡选自由外泌体(exosome)、微泡(microvesicle)及微粒(microparticle)组成的群中的至少任意一个以上，使用通过所述方法分离出的囊泡能够进行ELISA、PCR、蛋白质印迹(western blot)、蛋白质组学(protepmics)、基因组学(genomics)等的试验。
利用本发明的双水相体系分离细胞外囊泡的装置包括：注入部10，其用于注入形成双水相体系的第一物质及第二物质；投入部20，其用于投入体液或含有细胞外囊泡的水溶液；本体30，其与所述注入部及投入部相连接，用于将第一物质及第二物质与体液或含有细胞外囊泡的水溶液进行混合及离心分离，从而分离出细胞外囊泡；以及回收部40，其用于对从本体30分离出的细胞外囊泡进行回收。
注入部10可以分离为第一注入部10a和第二注入部10b，以便能够分别注入第一物质和第二物质，在注入部10和投入部20之间还可以包括混合部50，混合部50用于将体液或含有细胞外囊泡的水溶液与第一物质及第二物质进行混合。此时，优选地，在所述混合部50安装有振动装置，更为优选地，本体30的形状为圆筒形或葫芦瓶形。
根据本发明的利用双水相体系的细胞外囊泡的分离方法相比于现有技术，具有非常高的效率，且具有分离方式简单、所需时间非常短的优点。更为详细地，利用双水相体系的细胞外囊泡的分离不需要超速离心分离机，在约10～20分钟的非常短的时间内以比现有的分离方法超速离心分离法高出约4倍以上的效率实现细胞外囊泡的分离。因此，本发明可以给利用细胞外囊泡的多种诊断方法提供很大帮助，且与现有的其他分离方法不同，实用且因花费少而经济，因而属于竞争力非常高的细胞外囊泡的分离方法。
另外，通过本发明可以提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度，被分离的细胞外囊泡不仅可以使用于疾病诊断，而且具有可以应用于其余的利用细胞外囊泡的大部分领域的优点。
附图说明
图1是图示出利用本发明的双水相体系分离细胞外囊泡的装置的图。
图2是针对图1中还包括混合部的装置的模式图。
图3是针对图2中注入部分离为两个的装置的模式图。
图4是针对利用本发明的双水相体系分离细胞外囊泡的装置中的本体的形状为葫芦瓶形的装置的模式图。
图5是示出通过三种双水相体系(system A、system B、system C)分离出的细胞外囊泡及蛋白质的回收效率(recovery efficiency)的图表，三种双水相体系由聚乙二醇(PEG,Polyethylene glycol)和葡聚糖(DEX,Ddextran)构成。
图6是示出通过三种双水相体系分离出的细胞外囊泡及蛋白质的回收效率的比(EV/protein recovery efficiency ratio)的图表。
图7是对利用本发明及现有的细胞外囊泡分离技术所分离的细胞外囊泡及蛋白质的回收效率进行比较的图表。
图8是对利用本发明及现有的细胞外囊泡分离技术所分离的细胞外囊泡及蛋白质的回收效率的比进行比较的图表。
图9是通过蛋白质印迹(Western blot)分析将利用超速离心分离机(Ultra)、Exoquick及双水相体系分离出的细胞外囊泡的量以细胞外囊泡的特别的标志物CD81进行成像的结果。(Ultra x 5指的是通过超速离心分离机分离出的细胞外囊泡量的5倍)。
图10是对在双水相体系中从双水相体系之间的界面提取细胞外囊泡的方法(protocol 1)和从一个相中提取的方法(protocol 2)进行比较的图表。
图11是示出在protocol 2中添加添加物时所发生的分离效率和纯度的变化的图表。
图12是对利用超速离心分离机及双水相体系所获得的细胞外囊泡的模样进行观察的透射电子显微镜(TEM,transmission electron microscopy)照片。
图13是对利用超速离心分离机及双水相体系所获得的细胞外囊泡里的RNA轮廓(RNA profiles)进行测量的结果。
图14是对利用双水相体系及超速离心分离机所获得的细胞外囊泡的作为mRNA的黑色素A(Melan A)实行PCR后使其图示化的结果。
具体实施方式
以下，为了具体考察本发明的技术特征，想参照实施例和附图进行说明。但是，这仅是本发明的最优选的一个实施例，并非全部代表本发明的技术思想，因此，应该理解，在申请本发明的当时可以有能够代替其的多种均等物和变形例。
本发明涉及如下一种技术：向体液或含有细胞外囊泡的水溶液中混合相互不混合的两种物质，从而制造出双水相体系，然后，分离出浓缩于所述双水相体系之间的界面或一个相的细胞外囊泡。
本发明中，细胞外囊泡作为从细胞中生成并向细胞外分泌的囊泡，包括外泌体(exosome)、微泡(microvesicle)及微粒(microparticle)等，但不限于此。
本发明中，优选地，形成双水相体系的第一物质/第二物质为水/EOPO、聚乙二醇/葡聚糖、聚乙二醇/高浓度盐、聚乙二醇/果聚糖、聚乙烯吡咯烷酮/葡聚糖、聚乙烯醇/葡聚糖、聚蔗糖/葡聚糖、聚乙二醇/聚(乙烯基甲基乙基醚)、聚乙二醇/硫酸铵、聚乙二醇/硫酸钠、聚乙二醇/硫酸镁、聚乙二醇/磷酸钾、聚乙二醇/碳酸钠，但并不特别限定于此。
另外，更加优选地，用于形成所述双水相体系的相互不混合的两种物质为聚乙二醇/葡聚糖，细胞外囊泡具有浓缩于葡聚糖上的特征，浓缩于所述葡聚糖上的细胞外囊泡可以利用吸移管等进行分离，但并不特别限定于此。
此时，特征在于，聚乙二醇的分子量为0.2～600kDa，浓度为1～20wt％，葡聚糖的分子量为15～2,000kDa，浓度为1～20wt％。若所述聚乙二醇及葡聚糖的浓度低于所述范围，则不形成双水相体系，若高于所述范围，则为了使得高分子溶解不仅需要很多时间，而且由于双相体系之间的表面张力较高，因而难以溶解如体液一样的第三溶质。
另外，通过添加盐来调节双水相体系的电位的情况，确认到在0.05mol K3P04中细胞外囊泡的回收效率(recovery efficiency)显示为85％的高数值。
就双水相体系而言，以100～5,000X g－力进行5～15分钟离心分离，从而可以更加促进分相(phase separation)现象，不足100X g－力的情况，分离时需要很多时间，因而没有进行离心分离的意义，从5,000X g－力开始升即使提高G值，分离时所需要的时间也不会有大的变化。
另外，本发明可以提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度，因此，具有可以应用于疾病的诊断、疫苗研究及治疗等多种领域的优点。更加详细地，从体液中分离出细胞外囊泡后，对存在于细胞外囊泡的基因表达量进行测量，从而可以诊断疾病。
此时，所述体液可以是选自由全血(whole blood)、血清、腹膜液、母乳或者小便组成的群中的任意一个以上，但并不特别限定于此。另外，所述疾病可以是选自由癌症、败血症、动脉硬化及类风湿性关节炎组成的群中的任意一个以上，但并不特别限定于此。
另外，可以使用利用本发明的双水相体系分离出的囊泡进行ELISA、PCR、蛋白质印迹、蛋白质组学、基因组学等的试验。
对存在于细胞外囊泡内的基因的表达量进行测量时，所述基因为针对刺激显示表达差异的mRNA，基因的分离过程与在细胞或组织中分离基因的现有的方法相同。更加详细地，所述基因利用多聚胸腺嘧啶(oligo(dT))合成为cDNA后，执行实时PCR(real timePCR)，但执行实时PCR时所使用的模板并非限定于cDNA。
此时，所述基因为选自由EDN1(Endothelin 1，内皮缩血管肽1)、VCAM1(Vascularcell adhesion molecule 1，血管细胞间黏附分子1)、ICAM1(lntercellular adhesionmolecule 1，细胞间黏附分子-1)、SELE(Selectin E，选择素E)、N0S3(Nitric oxidesynthase 3，一氧化氮合酶3)、BMP4(Bone morphogenetic protein 4，骨形态发生蛋白)、VWF(Von Willebrand factor，血管假性血友病因子)、MPZ(Myelin protein zero，髓鞘蛋白零)、IRF1(Interferon regulatory factor 1，干扰素调节因子)、TNF(Tumor necrosisfactor，肿瘤坏死因子)、IL32(Interleukin 32，白细胞介素-32)、CFLAR(CASP8and FADD-like apotosis regulator，CASP8和FADD样凋亡调节器)、CXCL10(Chemokine(C-X-Xmotif)ligand 10，趋化因子(c-x-x基序)配体10)、IL6(Interleukin 6，白细胞介素-6)、ICK(Intestinal cell(MAK-like)kinase，肠细胞(MAK-样)激酶)、TNFAIP2(Tumornecrosis factor,alpha-induced protein 2；肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白2)、ARHGAP8(RhoGTPase activating protein 8，Rho型GTPase激活蛋白8)及F3(Coagulation factorⅢ，凝血因子Ⅲ)组成的群中的一个以上，但并不限定于此。
本发明的利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，与图1一样，更加详细地，通过注入部10注入形成双水相体系的第一物质及第二物质，通过投入部20投入体液或包含细胞外囊泡的水溶液。所述第一物质、第二物质及体液或包含细胞外囊泡的水溶液流入与注入部10及投入部20相连接的本体30，从而得到混合及离心分离，进而分离出细胞外囊泡，通过回收部40获得所述分离出的细胞外囊泡。
如图2所示，在注入部10和投入部20之间还可以包括混合部50，以便体液或包含细胞外囊泡的水溶液与第一物质及第二物能够容易混合，优选地，在所述混合部50安装有振动装置，从而可以使得混合有效率地进行。
如图3所示，优选地，注入部10分离为第一注入部10a和第二注入部10b，以便能够分别注入第一物质和第二物质，制造双水相体系时，可以根据各个聚合物及体液的种类对第一物质及第二物质的浓度进行调节。
另外，本体30的形状既可以是圆筒形，也可以是如图4所示的葫芦瓶形。本体30是葫芦瓶形的情况，在凹陷进去的部位形成双水相体系的界面，由于这种情况下界面狭窄，因此分离出(trap)的细胞外囊泡的厚度厚厚地形成，从而具有易于分离的有点。
以下，希望以针对本发明的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法的具体实施例为中心进行说明。但是，这些实施例仅是本发明的优选的一个实施例，并非全部代表本发明的技术思想，因此，应该理解，在申请本发明的当时，可能存在能够代替它们的多种均等物和变形例。
[实施例1]
用于分离细胞外囊泡的双水相体系设计
为了寻找最能有效地对细胞外囊泡进行分离的双水相体系，制造如下表1所示的体系A、B、C(system A、B、C)，所述体系A、B、C由相互不同浓度的聚乙二醇/葡聚糖水溶液形成。
【表1】
双水相体系的种类 聚乙二醇[wt％] 葡聚糖[wt％]
体系A 3.5 1.5
体系B 7 3
体系C 10.5 4.5
[实施例2]
根据双水相体系的种类分离细胞外囊泡和蛋白质
根据实施例1，为了了解针对三种双水相体系的细胞外囊泡及蛋白质的分离效率，首先，向混合有细胞外囊泡和蛋白质的样本500μl中添加所述实施例1的体系A、B、C的双水相体系中想要的浓度，并在常温下溶解一小时左右后，以1,000Xg力使得所述双水相体系在常温下进行十分钟离心分离，从而诱导相分离。此时，所述样本的细胞外囊泡浓度为100μg/ml，蛋白质浓度为2000μg/ml。
之后，从各个聚乙二醇层及葡聚糖层之间的界面提取细胞外囊泡后对细胞外囊泡的浓度和蛋白质的浓度进行测量。
为了对各个双水相体系的细胞外囊泡的分离效率进行比较，对初始的全部细胞外囊泡或蛋白质的量进行比较，从而确认了分离出的量。为此，将相对全部量分离出的细胞外囊泡或蛋白质量的百分比(％)定义为回收效率(recovery efficiency,E)，根据下面的式(1)求出三种双水相体系的回收效率的结果如图5所示。此时细胞外囊泡的量是用RNA量来测定，蛋白质的量是利用Bradford法(bradford assay，考马斯亮蓝法)测定。
回收效率(E)＝(从葡聚糖上分离出的蛋白质或细胞外囊泡的量)/(全部溶液的蛋白质或细胞外囊泡的量)X 100(％) (1)
根据图5，就细胞外囊泡而言，聚合物的浓度最高的体系C中细胞外囊泡被分离出(trap)最多，被分离出的细胞外囊泡的量为全部量的52.2％。与此相反，蛋白质的情况，与聚合物的浓度无关，不到3％在界面被分离出。
这种结果可以通过在双水相体系中形成于界面的表面张力来进行说明。利用形成于双水相体系之间的界面的表面张力，双水相体系里的粒子被分离出，粒子的尺寸越大，被分离出的倾向越强。
图5中，由于细胞外囊泡大于蛋白质的尺寸，因此，较多受到界面的影响，越是由高浓度的聚合物组成的双水相体系，表面张力越强，因此，更多的细胞外囊泡在界面被分离出。
另外，与分离出的细胞外囊泡的纯度密切相关的细胞外囊泡和蛋白质的回收效率的比(EV/protein recovery efficiency ratio)如图6所示，可以得知，在分离细胞外囊泡时最佳的双水相体系为体系C，聚乙二醇/葡聚糖的浓度为10.5wt％/4.5wt％。
[实施例3]
与现有的细胞外囊泡分离方法的分离效率比较
根据所述实施例2，为了了解利用作为在分离细胞外囊泡时最佳的双水相体系的体系C来分离细胞外囊泡的方法的优越性，如下执行作为现有的细胞外囊泡分离方法的超速离心分离法及利用常用的产品exoquick的方法并进行比较，其结果如图7所示。
利用超速离心分离法的情况，将混合有细胞外囊泡和蛋白质的样本500μl在65μl的EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)以5mM溶解的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS,Phosphate buffered saline)中进行稀释后，以100,000x g-力处理两小时。之后，去除上层液，并对沉淀的细胞外囊泡的量和蛋白质的量进行测量。
利用Exoquick的情况，利用混合有细胞外囊泡和蛋白质的样本500μl，按照用于标记于产品的方案的现有的方法进行。
根据图7，与现有的两种代表性的分离方法—超速离心分离法及Exoquick相比，本发明的利用双水相体系的方法，其细胞外囊泡的效率更高，尤其，与超速离心分离法的情况相比，显示出高出约4倍的分离效率。
另外，为了确认通过各个方法所分离的细胞外囊泡的纯度，对细胞外囊泡和蛋白质的回收效率的比进行测量的结果如图8所示。显示出，利用双水相体系时，细胞外囊泡的纯度高于Exoquick，但是低于超速离心分离法。但是，如从所述图7的结果可以得知，由于超速离心分离法的细胞外囊泡的分离效率非常低，因此将分离效率及纯度均考虑在内时，可以得知，本发明的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法最有效率。
为了再次确认，利用细胞外囊泡的特别的标志物CD81进行了蛋白质印迹(westernblot)分析，其结果如图9所示。
根据图9，利用双水相体系及Exoquick所获得的细胞外囊泡在蛋白质印迹结果中显示出强烈的信号(signal)，尤其，通过双水相体系获得的细胞外囊泡显示出稍微更加强烈的信号。但是，超速离心分离的情况，没有出现信号。这是因为，虽然利用双水相体系及Exoquick所获得的细胞外囊泡的量有很多，以至于在蛋白质印迹结果中出现信号的程度，但是利用超速离心分离机所获得的细胞外囊泡的量较少，以至于在蛋白质印迹结果中没有出现信号。
[实施例4]
利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法的比较
本发明的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法大致分为两种。第一种为在双水相体系的界面捕捉细胞外囊泡从而进行分离的方法(方案1，Protocol 1)，第二种是使得细胞外囊泡浓缩于双水相体系的一个相从而进行分离的方法(方案2，Protocol 2)。
图10为对所述两种方法的分离效率进行比较的结果，方案1为在实施例1的体系C中对存在于界面的细胞外囊泡进行提取的方法，方案2为在体系A的一种相中对细胞外囊泡进行提取的方法。方案1显示为细胞外囊泡的分离效率低，而蛋白质的分离效率也低，方案2显示为细胞外囊泡的分离效率高，而蛋白质的分离效率也升高差不多水平，可以根据细胞外囊泡的分离目的而选择使用。
另外，向所述细胞外囊泡中放入额外的添加物时，能够对双水相体系内分子之间的引力或排斥力进行调节，因而可以使得分离效率更加提高。
图11显示出向方案2中放入作为添加物之一的0.05mol K3P04后分离效率的变化，随着添加0.05mol K3P04，细胞外囊泡的分离效率增加，与此相反，蛋白质的分离效率降低，所以，结果可以得知细胞外囊泡的纯度升高。
[实施例5]
分离出的细胞外囊泡的同一性比较
为了对利用双水相体系所获得的细胞外囊泡和利用现有技术超速离心分离机所获得的细胞外囊泡的同一性进行检查，对通过各个方法所分离出的细胞外囊泡的模样和RNA含量进行了确认。
首先，为了比较细胞外囊泡的模样，如图12所示，利用透射电子显微镜(TEM,transmission electron microscopy)确认的结果，可以得知，就利用超速离心分离机所获得的细胞外囊泡和利用双水相体系所获得的细胞外囊泡而言，其形态相同。
另外，为了对细胞外囊泡的RNA含量进行比较，在通过超速离心分离机及双水相体系所获得的各个细胞外囊泡中对RNA进行分离后，利用生物分析仪(bioanalyzer)进行RNA含量分析的结果如图13所示。这里，x轴为时间，与RNA的大小有关，y轴为荧光的强度，表示根据尺寸的RNA的相对量。
观察图13的结果可知，利用超速离心分离机时和利用双水相体系时存在于细胞外囊泡里的RNA的轮廓(profiles)几乎相同，这意味着双水相体系不会损害细胞外囊泡。
[实施例6]
用于诊断
通过以下方法确认了利用双水相体系的细胞外囊泡分离方法可以适用于各种疾病的诊断。
首先，向从黑素瘤(melanoma)中获得的细胞外囊泡中添加蛋白质，从而与生物流体相似地制造因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡样本。之后，利用双水相体系对所述细胞外囊泡样本进行分离，提取出称为黑色素A(Melan A)的mRNA，执行所述黑色素A的逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR)的结果如图14所示，利用其可以进行对黑色素瘤相关癌症的诊断。
从图14可知，利用双水相体系所获得的细胞外囊泡的PCR带与利用超速离心分离机所获得的PCR条带相比，显示为更强，所述结果也与图9的蛋白质印迹的结果相一致。
标号说明
10：注入部 10a：第一注入部
10b：第二注入部 20：投入部
30：本体 40：回收部
50：混合部
产业上利用可能性
本发明涉及一种利用双水相体系的细胞外囊泡的分离方法，提出如下一种技术：从体液中分离细胞外囊泡时，相比于现有技术，以高纯度在短时间内迅速地进行分离。尤其，现有的细胞外囊泡分离技术具有收率低且诱发杂质污染(impurity contamination)的问题，因而提出一种与现有技术完全不同方式的利用双水相体系的方法，由于所述双水相体系能够在短时间内有效地对不同种类的粒子(particles)进行分离，因此，通过分离细胞外囊泡而获得如下效果：收率高、具有筛选特性以及短时间内可以迅速地进行分离，因而具有产业上利用可能性。

Claims (21)

1.一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其包括如下步骤：
(a)将第一物质和第二物质混合于体液或具有细胞外囊泡的水溶液中，从而制造双水相体系；
(b)对所述双水相体系中浓缩于第一物质和第二物质之间的界面或所述第二物质的细胞外囊泡进行分离。
2.根据权利要求1所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述第一物质选自水、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚蔗糖，
所述第二物质选自EOPO、葡聚糖、高浓度盐、果聚糖、聚(乙烯基甲基乙基醚)、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钾或碳酸钠。
3.根据权利要求2所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述第一物质为水，所述第二物质为E0P0。
4.根据权利要求2所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述第一物质为聚乙二醇，所述第二物质选自葡聚糖、高浓度盐、果聚糖、聚(乙烯基甲基乙基醚)、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钾、碳酸钠。
5.根据权利要求2所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述第一物质选自聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚蔗糖，所述第二物质为葡聚糖。
6.根据权利要求2所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述第一物质为聚乙二醇，所述第二物质为葡聚糖。
7.根据权利要求6所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述聚乙二醇的分子量为0.2～600kDa。
8.根据权利要求6所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述聚乙二醇的浓度为1～20wt％。
9.根据权利要求6所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述葡聚糖的分子量为15～2,000kDa。
10.根据权利要求6所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述葡聚糖的浓度为1～20wt％。
11.根据权利要求1所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述(a)步骤之后还包括如下步骤：
向所述双水相体系中添加添加物，从而对双水相体系内分子之间的引力或排斥力进行调节。
12.根据权利要求1所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述(a)步骤之后还包括如下步骤：
以100～5,000X g-力对所述双水相体系进行前处理。
13.根据权利要求1所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法，其特征在于，
所述体液为选自由全血、血清、腹膜液、母乳及小便组成的群中的至少任意一个以上。
14.一种提高细胞外囊泡的纯度的方法，作为使用权利要求1至13中任意一项所记载的方法来提高因蛋白质而受到污染的细胞外囊泡的纯度的方法，其特征在于，
所述(a)步骤为将与蛋白质混合而受到污染的细胞外囊泡投入于双水相体系的步骤。
15.根据权利要求14所述的提高细胞外囊泡的纯度的方法，其特征在于，
所述细胞外囊泡为选自由外泌体、微泡及微粒组成的群中的至少任意一个以上。
16.一种利用通过使用权利要求1至13中任意一项所记载的方法而分离出的囊泡进行ELISA、PCR、蛋白质印迹、蛋白质组学、基因组学等的试验的方法。
17.一种利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，其包括:
注入部(10)，其用于注入形成双水相体系的第一物质及第二物质；
投入部(20)，其用于投入体液或包括细胞外囊泡的水溶液；
本体(30)，其与所述注入部及投入部相连接，用于将第一物质及第二物质与体液或包括细胞外囊泡的水溶液进行离心分离，从而分离出细胞外囊泡；以及
回收部(40)，其用于对从所述本体(30)分离出的细胞外囊泡进行回收。
18.根据权利要求17所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，其特征在于，在所述注入部(10)和投入部(20)之间还包括：
混合部(50)，其用于将体液或包括细胞外囊泡的水溶液与第一物质及第二物质进行混合。
19.根据权利要求18所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，其特征在于，
在所述混合部(50)包括有振动装置。
20.根据权利要求17所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，其特征在于，
所述注入部(10)分离为第一注入部(10a)和第二注入部(10b)，以便能够分别注入第一物质和第二物质。
21.根据权利要求17所述的利用双水相体系分离细胞外囊泡的装置，其特征在于，
所述本体(30)的形状为圆筒形或葫芦瓶形。
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