CN112136044A - 通过两相流体系统的外来体分离方法 - Google Patents
通过两相流体系统的外来体分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112136044A CN112136044A CN201980026098.9A CN201980026098A CN112136044A CN 112136044 A CN112136044 A CN 112136044A CN 201980026098 A CN201980026098 A CN 201980026098A CN 112136044 A CN112136044 A CN 112136044A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- separation
- exosomes
- phase
- exosome
- fluid system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title claims description 49
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 128
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 49
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 11
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 10
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 claims description 2
- -1 saliva Substances 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005201 scrubbing Methods 0.000 claims description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 13
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 13
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 3
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 3
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000710 polymer precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000941893 Felis catus Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N carbon tetrachloride Substances ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000457 cardiotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001451 cardiotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108091091360 miR-125b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D11/00—Solvent extraction
- B01D11/04—Solvent extraction of solutions which are liquid
- B01D11/0492—Applications, solvents used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/20—Milk; Whey; Colostrum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/52—Sperm; Prostate; Seminal fluid; Leydig cells of testes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D9/00—Crystallisation
- B01D9/005—Selection of auxiliary, e.g. for control of crystallisation nuclei, of crystal growth, of adherence to walls; Arrangements for introduction thereof
- B01D9/0054—Use of anti-solvent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
本发明为外来体分离方法，其能够从大量和少量样品和以前不能从其中获得外来体的样品类型中廉价地获得高纯度外来体。
Description
发明领域
本发明为外来体分离方法，其能够从大量和少量样品和以前不能从其中获得外来体的样品类型中廉价地获得高纯度外来体。
发明背景
囊泡是参与物质在细胞内的运输和储存的小囊，并且通过至少一个脂质双层与细胞质流体分离。外来体是由许多生物体（从原核生物到高等真核生物和植物）释放的囊泡，并且其含有不同尺寸的脂质双层囊泡[1]。这些囊泡的重要性在于将信息传递至其它细胞以影响细胞功能的能力。通过外来体的信号传递通过由蛋白质、脂质、核酸和糖组成的许多不同类别的生物分子进行[2]。
在1982年，通过实验确定从精浆分离的囊泡增加精子运动性，首次发现了细胞外囊泡与细胞的功能相互作用[3]。从这一点开始，直到今天，已经在许多不同组织中进行了关于囊泡分子机制的开发的研究，并将留在黑暗中的问题暴露出来。
从骨髓组织获得的间充质干细胞的外来体已显示在作为心脏毒素肌损伤模型的C2C12成肌细胞系和C57BL/6小鼠中促进肌原性分化和血管生成，并从而诱导再生为骨骼肌[4]。从子宫内膜组织获得的间充质干细胞的外来体已显示在作为CCl4诱导的肝损伤模型的TAMH和THLE-2肝细胞细胞系和C57BL/6小鼠中降低血清中的ALT和AST值，并增加能够使肝中细胞更新的基因的活性[5]。从经历细胞分化的PC-12细胞系分离的外来体已显示增加间充质干细胞(特别是miR-125b)的神经元蛋白和基因的表达，并且诱导间充质干细胞的神经原性分化[6]。从柠檬汁分离的外来体已显示在A549、SW480和LAMA84细胞系和NOD/SCID小鼠中在TRAIL途径上导致细胞凋亡，并且以高速率增加凋亡基因的激活。此外，使用超速离心，以600微克的极低产率从240 ml样品分离植物来源的外来体[7]。基于免疫磁性分离，使用包覆有HLA、DP、DQ、DR特异性单克隆抗体的磁珠，从抗原呈递细胞(APC)分离的外来体作为高纯度外来体获得[8]。使用聚合物沉淀作为分离尿外来体的新方法。发现它是比先前使用的方法更容易的方法，但是确定除了外来体之外还存在过量的污染物[9]。
现有技术中的应用可以用3个基本方法标题来陈述：基于超速离心的方法、基于过滤的方法、基于溶解度-沉淀的方法。
基于超速离心的方法：以100,000 g和更高的速度离心是当今最常用的外来体分离方法。除了是非常昂贵、费力和耗时的方法之外，它还以低效率分离外来体。这是因为基于超速离心的方法不具有任何选择性。由于它们沉淀出超过一定粒径的所有颗粒，它们还分离许多不需要的物质，例如蛋白质和脂蛋白，以及外来体。它在诊断病例(例如血液)中不是有效的，因为超速离心不能应用于低于50 ml的样品；而且也不能满足需要大规模生产时的要求。即使是指数增加处理时间的方法，例如梯度超速离心，也以比本申请的发明低得多的效率进行外来体分离。在专利文献号US6899863B1中公开的发明是该方法的一个实例。
基于过滤的方法：可以用根据外来体的尺寸制备的过滤器分离外来体。尽管用这些方法，可以更快地获得外来体，并且用比超速离心更便宜的装置，但是该方法不是优选的，因为施加在外来体上以穿过这些小的过滤器的力导致它们的结构劣化和分解。同时，外来体的尺寸是异质的(例如，植物外来体大于动物外来体)的事实使得难以将该方法应用于不同的外来体，并且还导致过滤器的频繁堵塞，从而降低过滤器的寿命，延长过程并减少获得的产物的量。研究人员优选过滤而不是超速离心的原因是速度和价格的优势。实例公布；(doi: 10.1152/ajprenal.00434.2006)。
基于溶解度-沉淀的方法：外来体可以在其溶解度低的溶液中沉淀而不需要超速离心。在这些方法中使用的聚合物(如聚乙二醇(PEG))保留水分子，并能够使具有较低溶解度的分子(包括外来体)沉淀。为了成功沉淀，必须将待分离的材料在PEG (或类似的聚合物)中于4℃下保持长达12小时。此外，除了外来体之外沉淀的其它材料降低终产物的纯度，并且当外来体从液相沉淀到固相时，与其它方法相比，外来体损失要多得多。
与现有技术应用有关的问题可以列出如下：
●超速离心方法所需的初始体积太高，
●超速离心装置是昂贵的设备，并且其必须长时间操作用于分离。
●为了能够通过超速离心方法获得纯样品，应包括另外的耗时过程，如洗涤和密度差离心，
●相对于初始量，以极低效率获得通过超速离心和免疫磁珠获得的产物，
●从外来体中分离用于分离的单克隆抗体是困难的，并且该过程导致囊泡膜结构上的表面蛋白丧失其功能，
●通过聚合物沉淀分离的外来体需要长时间的孵育，
●在聚合沉淀方法中外来体不能与溶液中的其它污染物颗粒分离，并从而产生异质产物。
发明概述
本发明的目的是提供外来体分离方法，其能够以纯形式和以廉价且容易的方式从大量和少量的不同材料获得外来体。此外，本发明能够从通过当前的技术不能从其中分离外来体的样品(例如植物裂解物)获得外来体。
发明详述
为实现本发明的目的而开发的“用两相流体系统的外来体分离方法”在附图中说明，其中：
图1显示在本发明的范围内从植物裂解物分离的外来体的表征的代表。(通过SEM图像， 从不同材料获得的外来体的形态和尺寸(a)；通过流式细胞术装置，通过CD9、CD63和HSP70 抗体(其为外来体表征标志物)测量的流式细胞术图(b)；和外来体直径测量图(c))。
图2显示在本发明的范围内从血浆分离的外来体的表征的代表。(通过SEM图像，从 不同材料获得的外来体的形态和尺寸(a)；通过流式细胞术装置，通过CD9、CD63和HSP70抗 体(其为外来体表征标志物)测量的流式细胞术图(b)；和外来体直径测量图(c))。
图3显示在本发明的范围内从细胞培养基分离的外来体的表征的代表。(通过SEM 图像，从不同材料获得的外来体的形态和尺寸(a)；通过流式细胞术装置，通过CD9、CD63和 HSP70抗体(其为外来体表征标志物)测量的流式细胞术图(b)；和外来体直径测量图(c))。
图4为在外来体分离具有已知量的不同浓度的蛋白质之前和之后测量的蛋白质的量的图示，以显示在本发明的外来体分离方法中已经去除了蛋白质污染物。(分离后去除98%的蛋白质)。
图5为在分离具有已知量的不同浓度的外来体之前和之后外来体的量的测量的图示，以显示已经高效地分离外来体。(分离后以80%的效率获得外来体)。
本发明的通过两相流体系统的外来体分离方法能够从细胞质内和外的流体获得外来体，并且包括以下步骤：
a. 制备含有外来体的流体样品，
b. 去除所述流体样品中的污染物(术语污染物是指除外来体之外的所有物质。这些物 质包括材料如脂肪酸、蛋白质、核酸、盐、细胞组分)，
c. 将所述流体样品与含有PEG和葡聚糖的分离溶液混合，
d. 通过所述两相流体提取系统将形成的用于分离的所述混合物分离成两相，
e. 丢弃分离成两相的所述样品的上清液，以去除其中的蛋白质和其它不需要的物质，
f. 将所述收集的相与洗涤溶液混合，
g. 通过所述两相流体提取系统将形成的用于洗涤的所述混合物分离成两相，
h. 丢弃形成的所述两相的上清液，并收集含有所述外来体的下面的相。
在本发明的一个实施方案中，所述含有外来体的流体样品为极性流体。所述流体样品选自细胞培养基、血液、血清、血浆、胎盘液、唾液、尿素、精液、母乳、植物提取物及其混合物。过滤或离心方法用于从所述流体样品中去除所述大的污染物。
在本发明的一个实施方案中，所述分离溶液中PEG的分子量在25,000-45,000之间，而葡聚糖的分子量在450,000-650,000之间。用于所述分离溶液中的PEG的质量浓度在2%-4%之间，而葡聚糖的质量浓度在0.75%-2.80%之间。
在本发明的一个实施方案中，在用于获得外来体的所述两相分离中使用离心方法。该离心方法在1000 g-5000 g之间进行。
在本发明的一个实施方案中，在水中的PEG用作所述洗涤溶液，并且PEG含量在2质量%-4质量%之间。PEG的分子量在25,000-45,000之间。所述离心方法用于将所述洗涤溶液分离成两个单独的相，并且过滤用于去除用所述洗涤溶液洗涤的所述样品中的微泡。
在本发明的一个实施方案中，在“丢弃形成的所述两相的上清液，并收集含有所述外来体的下面的相”的步骤之后，进行包括以下子步骤的葡聚糖去除方法，用于从所述获得的外来体溶液中去除葡聚糖：
a. 加入含有一元醇或丙酮的纯化溶液，以从所述收集的下面的相中去除葡聚糖，
b. 通过过滤从所述收集的下面的相中去除葡聚糖，
c. 从所述外来体中去除通过所述纯化溶液沉淀的葡聚糖，
d. 从所述外来体中去除所述纯化溶液，从而获得纯外来体(在该步骤中，通过离心沉 淀葡聚糖，收集在上清液中含有外来体的液相，并因此去除葡聚糖)。
在葡聚糖去除方法中，乙醇或甲醇可以用作用于沉淀所述葡聚糖的所述纯化溶液中的一元醇。所述加入的醇与所述样品的混合比保持在以体积计1:1至3:1范围内。离心方法用于从所述外来体中去除葡聚糖。在用于去除葡聚糖的所述过滤过程中使用的过滤器的孔径小于所述外来体的直径并且大于葡聚糖的分子直径；以及在所述过滤过程中使用的过滤器的孔径可以在40千道尔顿至500千道尔顿范围内。
本发明的外来体分离方法涉及开发以纯的形式和以廉价且容易的方式从大量和少量的不同材料分离外来体的方法。在本发明的外来体分离方法中，待分离外来体的材料可以不同。这些材料可以是来自微生物培养物的所有种类的生物材料，例如细菌、真菌、酵母、霉菌；和哺乳动物细胞组织，例如脂肪、脑、软骨、骨髓、结缔组织、皮肤。用于制备用于分离过程的不同材料的方法步骤可以描述如下：
在两相分离过程之前，通过在7,500 g-20,000 g之间进行5-20分钟的离心，用于从细胞培养基、血浆和植物裂解物中分离外来体，获得更纯且更均质的溶液。结果是，避免了在两相系统中在葡聚糖相中可能的杂质。
通过在2,000 g-10,000 g之间进行5-20分钟的离心，用于从植物裂解物中外来体分离而由植物分解产生的大尺寸颗粒旨在不在沉淀时由于在两相分离过程期间施加的离心和它们的重量而在葡聚糖相中引起任何杂质。此外，确保了在进行过滤过程用于去除尺寸为220纳米及以上的颗粒期间使用的过滤器不被堵塞。
两相流体系统用于分离由于制备步骤获得的均质外来体-蛋白质混合物。这些系统是用于通过利用它们所含的聚合物的化学和物理性质形成一个相来分离分子的系统。在两相流体系统中，通过利用PEG相对蛋白质和DEX相对磷脂结构化膜的化学倾向，外来体清除非外来体(nonexosomal)蛋白质和其它杂质。由于溶液中所用聚合物的浓度，确定最大量的蛋白质保留在PEG相中(图4)，而DEX相含有大量的外来体(图5)。
在两相分离过程的第一步之后，PEG相达到蛋白质饱和，因此进行洗涤过程以去除剩余在DEX相中的污染物蛋白质。在分离过程中取出上清液之后，通过使用具有相同物理化学性质的上清液进行洗涤过程，以不改变系统的工作浓度。结果是，由于在新加入的PEG相中没有蛋白质，在DEX相中的非外来体蛋白质可以迁移到上清液中。
通常在分离和洗涤过程中获得的外来体分子在DEX相中。因此，观察到在功能应用和囊泡表征和分析两者中，其中存在囊泡的DEX相影响实验条件。通过甲醇沉淀过程去除溶液中的葡聚糖分子，以获得纯形式的外来体，其与DEX相分离。通过利用葡聚糖分子在一元醇中的不溶性，通过增加溶液中的醇浓度使葡聚糖分子沉淀，并使用离心从溶液中分离。此外，由于在溶液中剩余的甲醇对基于生物学的测定具有负面作用的事实，可以通过利用其低沸点将其去除。
本发明为用于分离外来体分离方法。通过将所述获得的材料(裂解物)与如上所述的分离溶液混合，开始外来体分离过程。将从植物、血浆或细胞培养基获得的裂解物与分离溶液混合，所述分离溶液的含量在表1中指示。该混合过程通过颠倒约20次进行。然后使混合物经受离心。在+4℃下，以1,000 g进行离心10分钟。将经受离心的混合物分成两相，即包含85-95%的含有蛋白质和其它细胞残余物的混合物的上清液和包含约5%的其中收集外来体的混合物的下面的相。小心地去除并丢弃上清液。含有外来体的下面的相构成总混合物的约10%。为了获得超纯外来体，用洗涤溶液重复离心，所述洗涤溶液的含量在表1中给出。根据将要进行的实验的内容，可以去除含有外来体的下面的相中的葡聚糖。葡聚糖去除过程可以通过1000-500千道尔顿过滤器过滤并收集上清液或通过加入甲醇从而沉淀葡聚糖来进行。通过颠倒10-15次将通过加入甲醇获得的混合物混合，然后在+2℃至+8℃下，在12000-14000 g下离心10-20分钟。收集上清液并且通过蒸发器蒸发外来体溶液中的甲醇。外来体可以被等分并在-80℃下储存长达12个月，或冻干并以粉末形式在+4℃下储存长达36个月。
样品的制备
细胞培养基
—通过0.22 μm过滤器过滤从细胞培养物收集的培养基，用于去除微泡和细胞部分。
—收集的培养基可以在4℃下储存长达24小时，在-20℃下储存长达一周，并且对于长期储存，在-80℃下储存长达一年。
血浆
—通过0.22 μm过滤器过滤收集的血浆，用于去除微泡和细胞部分。
—所获得的提取物可在4℃下储存24小时，在-20℃下储存一周，和在-80℃下长期储存。
植物裂解物
—过滤借助于均质机或共混机均质化的植物裂解物(优选通过孔径为150-400 μm的过滤器)。
—将其在+4℃下在12000 g下离心10分钟。
—收集上清液并通过0.22 μm过滤器过滤。
—所获得的提取物可在4℃下储存24小时，在-20℃下储存一周，和在-80℃下长期储存。
表1：在本发明的范围内使用的溶液的含量信息。
表2：在本发明的范围内使用的溶液的储存条件。
| 产品名称 | 储存条件 |
| 分离溶液 | + 4℃ |
| 洗涤溶液 | + 4℃ |
表3：从1毫升起始材料获得的外来体的量。(*待获得的外来体的量可以根据细胞/培养基-植物裂解物/溶液-血细胞/血浆比而改变)。
| 起始材料 | 初始量 | 外来体量 |
| 细胞培养基 | 1 mL | 50-250* μg |
| 血浆 | 1 mL | 50-300* μg |
| 植物裂解物 | 1 mL | 10-250* μg |
表4：从1微克外来体获得的RNA的量。
| 起始材料 | 外来体 | RNA |
| 细胞培养基 | 1 μg | 10-150 ng |
| 血浆 | 1 μg | 10-250 ng |
| Bitki裂解物 | 1 μg | 10-250 ng |
本发明的外来体分离方法的优点可以列出如下：
—它是廉价的，
—它适合于以非常少量或大量分离，
—获得高纯度的产物而没有蛋白质污染，
—从不同材料(血液、细胞培养基、植物、哺乳动物组织和所有生物材料)分离是可能的，
—分离过程容易，
—可能获得大量的纯RNA，
—它不需要高速离心(如100,000g)，
—它不需要长的孵育周期，
—聚合物染色溶液用于促进相之间的分离。
参考文献
Claims (22)
1.通过两相流体系统的外来体分离方法，其能够从细胞质内和外的流体获得外来体，所述方法包括以下步骤：
a. 制备含有外来体的流体样品，
b. 去除所述流体样品中的污染物，
c. 将所述流体样品与含有PEG和葡聚糖的分离溶液混合，
d. 通过所述两相流体提取系统将形成的用于分离的所述混合物分离成两相，
e. 丢弃分离成两相的所述样品的上清液，以去除其中的蛋白质和其它不需要的物质，
f. 将所述收集的相与洗涤溶液混合，
g. 通过所述两相流体提取系统将形成的用于洗涤的所述混合物分离成两相，
h. 丢弃形成的所述两相的上清液，并收集含有所述外来体的下面的相。
2.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述含有外来体的流体样品为极性流体。
3.根据权利要求2所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述含有外来体的流体样品为选自以下的流体：细胞培养基、血液、血清、血浆、胎盘液、唾液、尿素、精液、母乳、植物提取物及其混合物。
4.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中过滤方法用于从所述流体样品中去除大的污染物。
5.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中离心方法用于从所述流体样品中去除大的污染物。
6.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述分离溶液中PEG的分子量在25,000-45,000之间。
7.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述分离溶液中葡聚糖的分子量在450,000-650,000之间。
8.根据权利要求6所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中用于所述分离溶液中的PEG的质量浓度在2%-4%之间。
9.根据权利要求7所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中用于所述分离溶液中的葡聚糖的质量浓度在0.75%-2.80%之间。
10.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中在用于获得外来体的所述两相分离中使用离心方法。
11.根据权利要求10所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中在用于获得外来体的所述两相分离中，所述离心方法在1000 g和5000 g进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在水中的PEG用作所述洗涤溶液。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述洗涤溶液含有2质量%至4质量%的PEG。
14.根据权利要求12所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述洗涤溶液中PEG的分子量在25,000-45,000之间。
15.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中离心方法用于将所述洗涤溶液分离成两个单独的相。
16.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中过滤用于去除用所述洗涤溶液洗涤的所述样品中的微泡。
17.葡聚糖去除方法，其在“丢弃形成的所述两相的上清液，并收集含有所述外来体的下面的相”的步骤之后进行，用于从所述获得的外来体溶液中去除葡聚糖，所述方法包括以下子步骤：
a. 加入含有一元醇或丙酮的纯化溶液，以从所述收集的下面的相中去除葡聚糖，
b. 通过过滤从所述收集的下面的相中去除葡聚糖，
c. 从所述外来体中去除通过所述纯化溶液沉淀的葡聚糖，
d. 从所述外来体中去除所述纯化溶液，从而获得纯形式的外来体。
18.根据权利要求17所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中用于沉淀所述葡聚糖的所述纯化溶液中的所述一元醇为乙醇或甲醇。
19.根据权利要求1所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中所述加入的醇与所述样品的混合比在以体积计1:1至3:1范围内。
20.根据权利要求17所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中离心方法用于从所述外来体中去除葡聚糖。
21.根据权利要求17所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中在用于去除葡聚糖的所述过滤过程中使用的过滤器的孔径小于所述外来体的直径并且大于葡聚糖的分子直径。
22.根据权利要求17所述的通过两相流体系统的外来体分离方法，其中在所述过滤过程中使用的过滤器的孔径在40千道尔顿至500千道尔顿范围内。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TR2018/02164 | 2018-02-15 | ||
| TR201802164 | 2018-02-15 | ||
| PCT/TR2019/050103 WO2019160519A2 (en) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | Exosome isolation method by two phase fluid system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112136044A true CN112136044A (zh) | 2020-12-25 |
| CN112136044B CN112136044B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=67619611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980026098.9A Active CN112136044B (zh) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | 通过两相流体系统的外来体分离方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11911713B2 (zh) |
| EP (1) | EP3752833A4 (zh) |
| CN (1) | CN112136044B (zh) |
| WO (1) | WO2019160519A2 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR201913215A2 (tr) * | 2019-09-02 | 2021-03-22 | Univ Yeditepe | Deri̇ hücreleri̇ni̇n canliliğini ve saç çikartma kapasi̇teleri̇ni̇ arttirmasi i̇çi̇n bi̇tki̇sel eksozomlarin kullanimi |
| US20230227916A1 (en) * | 2020-04-15 | 2023-07-20 | H.U. Group Research Institute G.K. | Method for recovering extracellular vesicle |
| TR202007334A2 (tr) * | 2020-05-11 | 2021-11-22 | Univ Yeditepe | Bi̇tki̇sel eksozom üreti̇m yöntemi̇ |
| CN112048471A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-08 | 淄博市中心医院 | 一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法 |
| CN117586955B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-19 | 吉林大学 | 一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2867571A (en) * | 1953-09-30 | 1959-01-06 | Gen Electric | Depolymerization of high molecular weight dextran |
| US5104736A (en) * | 1988-03-03 | 1992-04-14 | Micro-Pak, Inc. | Reinforced paucilamellar lipid vesicles |
| CN101993459A (zh) * | 2009-08-24 | 2011-03-30 | 湖南省洪江华光生物有限责任公司 | 双水相萃取分离竹叶黄酮工艺 |
| CN102257158A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-11-23 | 生命科技公司 | 用于dna提取的方法和试剂盒 |
| CN104125826A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-29 | 努沃研究有限责任公司 | 亚氯酸盐或氯酸盐脂质体组合物 |
| CN105384836A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-03-09 | 黑龙江众生生物工程有限公司 | 一种提高食药用真菌β-葡聚糖的提取溶出率方法 |
| US20160333338A1 (en) * | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Norgen Biotek Corp. | Methods for extracellular vesicle isolation and selective removal |
| CN107532195A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-01-02 | 浦项工科大学校产学协力团 | 利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2788780B1 (fr) | 1999-01-27 | 2001-03-30 | Ap Cells Inc | Procede de preparation de vesicules membranaires |
-
2019
- 2019-02-15 EP EP19754801.9A patent/EP3752833A4/en active Pending
- 2019-02-15 US US16/969,997 patent/US11911713B2/en active Active
- 2019-02-15 CN CN201980026098.9A patent/CN112136044B/zh active Active
- 2019-02-15 WO PCT/TR2019/050103 patent/WO2019160519A2/en unknown
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2867571A (en) * | 1953-09-30 | 1959-01-06 | Gen Electric | Depolymerization of high molecular weight dextran |
| US5104736A (en) * | 1988-03-03 | 1992-04-14 | Micro-Pak, Inc. | Reinforced paucilamellar lipid vesicles |
| CN102257158A (zh) * | 2008-02-15 | 2011-11-23 | 生命科技公司 | 用于dna提取的方法和试剂盒 |
| CN101993459A (zh) * | 2009-08-24 | 2011-03-30 | 湖南省洪江华光生物有限责任公司 | 双水相萃取分离竹叶黄酮工艺 |
| CN104125826A (zh) * | 2011-12-22 | 2014-10-29 | 努沃研究有限责任公司 | 亚氯酸盐或氯酸盐脂质体组合物 |
| CN107532195A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-01-02 | 浦项工科大学校产学协力团 | 利用双水相体系分离细胞外囊泡的方法 |
| EP3279332A1 (en) * | 2015-03-31 | 2018-02-07 | Postech Academy-Industry Foundation | Method for isolating extracellular vesicles using aqueous two-phase system |
| US20160333338A1 (en) * | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Norgen Biotek Corp. | Methods for extracellular vesicle isolation and selective removal |
| CN105384836A (zh) * | 2015-12-16 | 2016-03-09 | 黑龙江众生生物工程有限公司 | 一种提高食药用真菌β-葡聚糖的提取溶出率方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JONGMIN KIM等: ""Isolation of High-Purity Extracellular Vesicles by Extracting Proteins Using Aqueous Two-Phase System", 《PLOS ONE》, vol. 10, no. 6, pages 1 - 16, XP055504906, DOI: 10.1371/journal.pone.0129760 * |
| 彭胜;彭密军;黄美娥;卜晓英;伍钢;: "双水相体系萃取分离杜仲黄酮", 中药材, no. 11, pages 1754 - 1757 * |
| 潘卫三: "《工业药剂学 第2版》", 中国医药科技出版社, pages: 476 * |
| 王启迪;罗坚;全灿;周俊波;李增兰;: "蛋白质纯化技术研究进展", 现代生物医学进展, no. 32, pages 6389 - 6392 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210101093A1 (en) | 2021-04-08 |
| CN112136044B (zh) | 2024-05-28 |
| WO2019160519A3 (en) | 2020-02-13 |
| US11911713B2 (en) | 2024-02-27 |
| EP3752833A4 (en) | 2021-11-24 |
| WO2019160519A2 (en) | 2019-08-22 |
| WO2019160519A8 (en) | 2020-09-10 |
| EP3752833A2 (en) | 2020-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112136044B (zh) | 通过两相流体系统的外来体分离方法 | |
| Konoshenko et al. | Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends | |
| US20220364051A1 (en) | Method for mass-producing plant exosomes | |
| EP2839278B1 (en) | Methods for exosome isolation | |
| Mirsky et al. | Chromosin, a desoxyribose nucleoprotein complex of the cell nucleus | |
| Zeringer et al. | Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes | |
| Stanly et al. | Isolation of exosome-like vesicles from plants by ultracentrifugation on sucrose/deuterium oxide (D 2 O) density cushions | |
| EP3674704B1 (en) | Method for isolating exosome and exosome isolation kit | |
| Nordin et al. | Tangential flow filtration with or without subsequent bind-elute size exclusion chromatography for purification of extracellular vesicles | |
| US20220380751A1 (en) | Method for enriching microvesicles | |
| Mukhopadhya et al. | Extracellular vesicle separation from milk and infant milk formula using acid precipitation and ultracentrifugation | |
| EP3727630A1 (en) | Method and stationary phase for isolating extracellular vesicles from biological material | |
| CN113215079B (zh) | 一种从牛奶中提取细胞外囊泡的方法 | |
| CN108546671A (zh) | 一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法 | |
| KR102148298B1 (ko) | 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지의 제조 방법 | |
| EP4353815A1 (en) | Method for isolating extracellular vesicle using salt fractional precipitation | |
| Dias et al. | Stress-Inducible Protein 1 (STI1): Extracellular Vesicle Analysis and Quantification | |
| CN109265577A (zh) | 一种泥鳅多糖的制备方法 | |
| BRPI0905833A2 (pt) | mÉtodo de preparaÇço de amostra coproparasitolàgina fecal e composiÇço clarificante | |
| Dismuke et al. | Current methods to purify and characterize exosomes | |
| RU2803918C1 (ru) | Способ получения очищенных сывороток культуральных, обеднённых факторами роста | |
| US20230374106A1 (en) | Methods and Devices For Complexing Target Entities | |
| CN108272822A (zh) | 一种乳极性脂质的提取方法及其应用 | |
| AU2018387258B2 (en) | Method and stationary phase for isolating extracellular vesicles from biological material | |
| CN114480257A (zh) | 一种识别和富集外泌体的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |