CN104125826A - 亚氯酸盐或氯酸盐脂质体组合物 - Google Patents

亚氯酸盐或氯酸盐脂质体组合物 Download PDF

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Abstract

本申请包括包含包封在脂质体核心内部的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体和脂质体组合物、其制备方法和使用方法,特别是作为药物的使用方法。

Description

亚氯酸盐或氯酸盐脂质体组合物
本申请要求2011年12月22日提交的第61/57,326号共同待审(copending)美国临时专利申请的优先权,其内容以其整体援引加入本文。
申请领域
本申请涉及含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体组合物,其制备方法及其使用方法,例如作为药物的使用方法。
申请背景
脂质体
对于将脂质体作为用于药物递送的载体已进行了广泛的研究。已有将脂质体有效用于药物和疫苗的递送的报道(Gregoriadis,G.TIBITECH,1995,13:527-537及其中所引用的参考文献)。例如,基于脂质体的药物递送系统广泛用于给药如盐酸多比柔星(以Doxil和Myocet的形式上市)的药物的静脉内抗癌化疗(Abraham等人,Methods Enzymol.2005,391:71-91)。脂质体还可以用于递送吸入型气雾剂药物,例如:1)胰岛素(Huang等人,J ControlRelease,2006,113:9-14);2)抗生素,特别是靶向肺泡巨噬细胞结核感染的抗生素(Vyas等人,Int J Pharm.2005,296:12-25);3)抗癌化疗药物(Verschraegen等人Clin Cancer Res.2004,10:2319-2326);以及4)其它(参见第5,049,388号美国专利)。
将特定大小的有机分子包含于脂质体中更常见。已知较小的分子(如乙醇、葡萄糖、氨和乙酸酯)会渗透穿过脂质体的脂双层。将该行为称作渗漏。
虽然有将脂质体成功用作药物递送系统的实例,对于许多应用仍有未满足的挑战。化学稳定性和物理稳定性、清除率、包封率和靶向性是其中一些最大的挑战,特别是当要包封较小的分子时。
亚氯酸盐、氯酸盐及其混合物
在本文中称为亚氯酸盐的亚氯酸根离子(ClO2 -)已用于多种场景中。亚氯酸钠是强氧化剂,其已用于水净化、消毒以及漂白和除臭。在酸性条件下,亚氯酸钠产生高毒性的二氧化氯气体,因此使用的水性溶液通常以强碱性(大约pH 13)溶液的形式提供,使用如氢氧化钠的碱性物质调节pH。
氯酸盐也已用于多种场景中。在本文中称为氯酸盐的氯酸根离子(ClO3 -)是强氧化剂,并以用于烟花、消毒和杀虫药中。此外,氯酸盐被用作用于治疗皮肤疾病的抗真菌剂(第5,427,801号美国专利),并已发现其可逆性抑制沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)感染的细胞中蛋白聚糖的硫酸化(JMed Microbiol,2004年2月第53卷第2期:93-95)。
包含亚氯酸盐和氯酸盐的混合物的组合物也已用于多种场景中,例如用于治疗多种疾病和病况。稳定化的亚氯酸盐是此类组合物的非限制性例例。例如,第4,725,437、4,507,285和4,851,222号美国专利公开了稳定化的亚氯酸盐用于治疗伤口和感染以及使骨髓再生的用途。在第2011/0076344号美国专利申请公开中描述了稳定化的亚氯酸盐用于抑制抗原特异性免疫应答的用途。第2001/017030号PCT专利申请公开中公开了通过给药氧化剂(如稳定化的亚氯酸盐)对于多种巨噬细胞相关的病症的治疗。第7,105,183号美国专利描述了稳定化的亚氯酸盐用于治疗巨噬细胞相关的神经变性(neurogenerative)疾病的用途。第5,877,222号美国专利描述了稳定化的亚氯酸盐在治疗AIDS相关的痴呆中的用途。第2008/145376号PCT专利申请公开报道了稳定化的亚氯酸盐在治疗变应性哮喘、变应性鼻炎和遗传特应性皮炎中的用途。第2007/009245号PCT专利申请公开中公开了与氟嘧啶组合的稳定化的亚氯酸盐在癌症治疗中的用途。第2001/012205号PCT专利申请公开中公开了稳定化的亚氯酸盐用于治疗癌症和其它受调节巨噬细胞功能影响的病况的用途。第255145号EP专利申请公开了稳定化的亚氯酸盐在眼科学中的用途。已报道了评估稳定化的亚氯酸盐在对患有晚期出血性放射性膀胱炎和直肠炎的患者的治疗中的用途的二期研究(Veerasarn,V.等人,Gynecologic Oncology,2006,100:179-184)。已证明稳定化的亚氯酸盐在啮齿动物心脏模型(Hansen,A.等人,Pharmacology&Toxicology,2001,89:92-95)和其它研究(Kemp,E.等人,Transplantation Proceedings,2000,32:1018-1019)中延长异种移植物的存活。也已报道稳定化的亚氯酸盐的抗菌作用(Stoll,P.等人,Zeitschrift fuerAntimikrobielle und Antineoplastische Chemotherapie,1993,11:15-20;Stoll,P.等人,Chemotherapy,1993,39:40-47;Hollfelder,K.等人,Reakt.Sauerstoffspezies Med,1987,253-262;Adamczyk,R.等人,Reakt.Sauerstoffspezies Med,1987,247-252;Gillissen,G.等人,Arzneimittel-Forschung,1986,36:1778-1782;Ullmann,U.等人,Infection,1985,13:S236-S240;Ullmann,U.等人,Infection,1984,12:225-229)。近期研究表明稳定化的亚氯酸盐能够刺激自然杀伤(NK)细胞对恶性细胞的细胞毒性,这与稳定化的亚氯酸盐增强对肿瘤细胞免疫的能力有关(Kuhne,L.等人,Biomedicine and Biotechnology,2011,p.436587)。
在上述出版物中,所述亚氯酸盐是稳定化的亚氯酸盐的可商购剂型的形式,其称为OxovasinTM(局部剂型)或者WF10(用于静脉内给药的药物产品)。OxovasinTM和WF10为OXO-K993的稀释液,OXO-K993本身是水性溶液。最初认为OXO-K993是含有叫作四氯十氧(tetrachlorodecaoxygen,TCDO)的化合物作为活性成分的溶液,并且在过去的文献中经常使用术语四氯十氧、十氧化四氯(tetrachlorodecaoxide)和TCDO指代WF10和Oxoferin中的活性剂。但是,随后的分析测试测定OXO-K993不包含TCDO,而是亚氯酸根离子、氯离子、氯酸根离子和硫酸根离子及钠阳离子的水性溶液。因此,向患者静脉内给药WF10或者局部施用OxoferinTM时必然(entail)递送离子的混合物。OXO-K993可得自NUVO Manufacturing GmbH(Wanzleben,Germany)。在第4,507,285号美国专利中描述OXO-K993及其制备。已发表描述OXO-K993和WF10的综述文章,其描述了该物质在当时已知的多种用途(Drugs in R&D,2004,5:242-244;McGrath等人,Current Opinion inInvestigational Drugs,2002,3:365-373)。
包封方法:
第5,269,979号美国专利公开了形成用于包封过客(passenger)分子的叫作溶剂稀释微载体(SDMC)的载体的方法。使用多步方法形成包封载体:首先涉及“形成(formed)溶液”的制备,然后通过构建(organization)步骤导致从所述“形成溶液”中生成所述SDMC。所述“形成溶液”通过以下步骤制备:将两亲性(amphiphatic)物质和过客分子在有机溶剂中溶解,然后加入水得到浑浊的溶液,然后加入更多的有机溶剂以得到澄清的“形成溶液”。可将形成溶液立即使用或储存。使用构建步骤制备SDMC,所述构建步骤可包括:将所述“形成溶液”稀释入水性体系中,原位雾化或者再水合。在SDMC中,过客分子包封于双分子层自身中,或者与双分子层的组分结合,而不是在由球形的双分子层所生成的空间内部。包封在SDMC中的载体分子有十氧化四氯(TCDO)。注意到在该申请中描述的方法不包括“纯化”步骤,使得在SDMC制备中使用的所有物质保留在测试使用的最终溶液中。
第2,636,812号加拿大专利申请公开了用于在水性介质中排出包封的物质的包膜(enveloping membrane)。在一个实例中,所述包封的物质为氧化性的氯氧化合物,特别是TCDO。所述包膜在中性水性介质中为不溶的并且水可渗透,其通常由阳离子或者阴离子的水不溶性聚合物构成。该申请中所制备的组合物可用于液体和基质表面的消毒和纯化,以及用于水的消毒。
第KR2003/072766号韩国专利申请公开中公开了口服卫生组合物,其包含亚氯酸盐(具体为亚氯酸钠),以及包封在脂质体中的锌离子。此组合物可另外含有载体或者赋形剂,其可具有双相或者单相结构,并且pH为7-8.5。在一实例中,所述脂质体由卵磷脂制备。
第WO 00/19981号的PCT专利申请公开中公开了抗菌制剂,其包含与过氧化合物(例如过氧化氢)组合的亚氯酸盐,以及使用这些制剂来对物品或表面进行消毒的方法。所述制剂可被配制为脂质体的形式,其pH可为6.8-7.8。亚氯酸盐和过氧化合物都是对于微生物活性所需要的。在该申请中显然未制备真正的脂质体制剂。
第2007/0145328号美国专利申请公开中公开了用于肠胃外、全身或静脉内给药的亚氯酸盐(如亚氯酸钠)制剂,其含有亚氯酸盐和pH调节剂。所述pH调节剂调节所述制剂的pH,使其处于约7至约11.5的范围。该申请教导所述制剂的毒性低于WF10。
Panasenko等人(Member Cell Biol,1997;11(2):253-8)公开了次氯酸钠(NaClO)、亚氯酸钠(NaClO2)、氯酸钠(NaClO3)和高氯酸钠(NaClO4)引发脂质过氧化反应的能力。所述脂质体由pH为7.4的卵磷脂酰胆碱在单一的氯化钠和缓冲液中制备。含氧氯酸盐仅加入外相中。没有进行用亚氯酸盐或者氯酸盐负载囊泡或者将含氧氯酸盐从外相移除的步骤。
第2011/0052655号美国专利申请公开描述了为了控制水性体系中原生动物营养子和孢囊,将抗微生物剂包封入微囊剂或者纳米囊(包括脂质体)中。
第2011/0177147号美国专利申请公开描述了为了移除含工业用水的系统中的生物污着,将抗菌组合物与至少一种稳定剂联合包封。所述抗菌组合物可以为非氧化性杀生物(biocidal)的化合物,如异噻唑林,并且所述稳定剂可以为含氯酸盐的缓冲液。
申请概述
本申请涉及含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体组合物,其制备方法以及使用方法。
因此,本申请包括脂质体组合物,其包含具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。通常所述组合物中具有多个分离的脂质体(亦称为囊泡)。通常所述囊泡分散于水相中并包封一种或多种水性组合物。因此,根据一个实施方案,亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物被包封于多个囊泡中,所述囊泡的壁含有一个或多个脂双层。本申请还包括包含至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。
本申请还包括脂质体组合物,其包含包封和未包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物,其中所述包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物在组合物的内相中,并且未包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物在组合物的外相中。或者,外相可含有除了亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的物质,例如其它的治疗剂或者氯化钠。在一个实施方案中,内相和外相的pH相同。在另一实施方案中,内相和外相的pH不同,例如,内相中的pH可为约5至约14、约6至约13、约8至约12.5或者约10至约12的pH,并且外相的pH可为大约中性,例如约6至8。在本发明的一个实施方案中,内相和外相的pH通过缓冲液(例如碳酸盐缓冲液)来进行调节。
在另一实施方案中,脂质体包含适合用于包封亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质,所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的pH为约5至约14、约8至约13、约9至约12.5或者约10至约12。在一实施方案中,所述脂质选自形成脂质体的那些,所述脂质体在约5℃或高于约5℃下不渗透渗漏亚氯酸根离子和/或氯酸根离子。这样的脂质包括例如磷脂,如具有足够长的饱和和/或不饱和脂肪酸链的磷酯酰胆碱,和/或鞘脂,如鞘磷脂,或者显示期望的性质的这样的脂质的合适的混合物。
在另一实施方案中,所述亚氯酸盐为稳定化的亚氯酸盐组合物,例如OXO-K993或者含有1-10%、10-20%、20-30%、30-50%或者50-90%(w/v)OXO-K993的组合物。在另一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐含有10%(w/v)的OXO-K993(以这种方式稀释的OXO-K993称作WF10)。
在一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐含有约2%(w/v)的OXO-K993;在另一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐含有约2%(w/v)的OXO-K993、约2%(w/v)的甘油和约96%(w/v)的水。这样的组合物以OxovasinTM或OxoferinTM(Nuvo Manufacturing GmbH,Wanzleben,Germany)的形式商业出售。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物包含以所述组合物中的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封亚氯酸盐。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物包含以所述组合物中的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封氯酸盐。
在又一实施方案中,所述脂质体组合物包含以所述组合物中的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封氯酸根离子和亚氯酸根离子的混合物。含有亚氯酸根离子和/或氯酸根离子的物质的任意组合物也可含有至少一种反荷离子以保持电中性。因此,根据本申请中的一个实施方案,所述脂质体组合物含有一种或多种阳离子。可能的阳离子的非限制性实例包括碱金属阳离子(例如钠或Na+)和碱土金属阳离子。在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有亚氯酸根离子、氯酸根离子或其混合物,其还含有钠和/或钾反荷离子。在另一实施方案中,所述脂质体组合物就个体体液而言是等渗的。在此方面测定等渗性是技术人员熟知的。
本申请还包括制备具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体的方法,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质,所述脂质可得自天然的、半合成的或者合成的来源。在一个实施方案中,所述方法包括:
(a)向内表面至少部分具有所述一种或多种脂质的薄膜的容器中加入亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的水性溶液;
(b)在足以全部或者部分移除所述内表面的所述薄膜的条件下搅拌所述容器,以得到含有包封有亚氯酸盐和/或氯酸盐的脂质体的浑浊溶液;
(c)对所述浑浊溶液进行处理,以将所述脂质体的平均直径减小至所需的量;以及
(d)任选地对所述脂质体进行处理,以从所述脂质体的外部溶液中移除亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。
按照本申请的方法,在一实施方案中,本发明的脂质体中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的包合率为约0.1%至约50%、约0.5%至约25%、约1%至约15%、约1%至约10%或者约1%至约5%。
在另一实施方案中,本申请的脂质体使用乙醇注入法制备。在另一实施方案中,所述脂质体使用包括交叉流技术的乙醇注入法制备。
该申请还包括包含脂质体和至少一种生理学上可接受的载体或者赋形剂的药物组合物。
本申请还包括本申请的组合物作为药物的用途。取决于它们的预期用途,本申请的组合物可以为无菌的或者非无菌的。本发明的组合物也可以是无热源的。
本申请还包括用于治疗受益于给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的疾病、病症或病况的方法,其包括向需要其的个体给药有效量的本申请的组合物。
本申请还包括本申请的组合物用于治疗受益于给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的疾病、病症或病况的用途。
在一个实施方案中,使用所述组合物的方法包括告知使用者特定的安全性或临床效果。例如,可告知使用者所述脂质体组合物比提供或预计会提供类似治疗效果的非脂质体组合物更稳定、更具靶向特异性或更具治疗有效性。也可告知使用者所述组合物比提供或预计会提供类似治疗效果的非脂质体制剂在一个或多个方面上更安全。例如,用所述脂质体组合物进行治疗,可以产生更低的副作用(如减少的静脉刺激(静脉炎)),从而提高患者的耐受性和顺从性。还可告知使用者与提供或预计会提供类似治疗效果的非脂质体制剂相比,脂质体组合物可以更快的速率(例如静脉内推注相对于稀释输注)或者以降低的体积给药。还可告知使用者所述脂质体组合物可使活性成分延长释放、控制释放或延迟释放。此外,可告知使用者这种延长释放或延迟释放可根据脂质体中脂质的特性和使用者治疗处理所需时机进行定制或调整。可以通过公开的材料(如标签或者产品说明书)的方式告知使用者。
从以下详细说明会明确本申请的其它特征和优点。但是应当理解,尽管详细说明和具体的实施例说明本申请的实施方案,但其仅作为说明给出,因为从该详细的说明,本领域技术人员会明确本申请的精神和范围内的多种变化和修饰。
附图简要说明
现将参照所附附图对本申请的实施方案进行更详细的描述,其中:
图1显示WF10的稀释曲线,其用于将测量的亚氯酸盐/氯酸盐的吸光度与实施例7的邻联甲苯胺方法B(用于检测样品中的亚氯酸盐/氯酸盐)中的特定反稀释因子相联系。反稀释因子相对于在447nm处测量的吸光度作图。左手边的图表显示整个数据集,而右手边的图表仅呈现非线性域。顶部和底物的线分别代表数据集的线性和非线性部分的拟合。二者的第一个交叉点标志着两个域的转换。
图2为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由1-棕榈酰-2-油酰-sn-3-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)制备,并将其在5℃、23℃和37℃下储存。
图3为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由鞘磷脂(SM)制备,并将其在5℃、23℃和37℃下储存。图的末尾(大约522h)处的数据点的聚集是有目的地将温度升高至37℃后的测量。
图4为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由3:1比率的POPC:POPG(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1’-消旋-甘油))制备,并将其在5℃、23℃和37℃下储存。
图5为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由2:1比率的POPC:POPG制备,并将其在5℃、23℃和37℃下储存。
图6为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由1:1比率的POPC:POPG制备,并将其在5℃、23℃和37℃下储存。
图7为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)制备,并将其在5℃和23℃下储存持续1、5和7天。
图8为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由鞘磷脂SM制备。在5℃(蓝)和23℃(红)下储存,然后将温度升高至37℃(这立即导致渗漏)。
图9为显示脂质体中亚氯酸盐和氯酸盐的渗漏的图,所述脂质体由DPPC和DPPC/DMPC制备,并将其在22℃和38℃下储存。
图10呈现对DPPC和DPPC/DMPC脂质体的长期稳定性研究的概况。每条代表样品在室温(约22℃)和冰箱中(约6℃)的温度下的渗漏实验的结果。X轴代表时间(以天计)。中度灰色标志发现外部介质中的WF10含量小于LOD的脂质体。更浅的灰色标志外部介质中的WF10含量小于LOQ的时期。深灰色表明WF10的含量高于LOQ。
图11显示实施例12中描述的2011年12月12日用SX122进行的高分辨率渗漏(HRL)实验的结果。可看见两个样品的图。温度曲线参考右手边的y轴。渗漏的物质的量以总样品体积的分数的形式提供。所述实验用于测定渗漏在数小时内开始的温度。
图12显示实施例12中描述的2012年1月6日用SX122进行的HRL实验的结果。可看见两个样品的图。温度曲线参考右手边的y轴。渗漏的物质的量以总样品体积的分数的形式提供。所述实验检查38℃下的渗漏特性。所述实验进行数天,表明在该温度下非常慢的渗漏。
图13显示实施例12中描述的2012年1月26日用SX126进行的HRL实验的结果。可看见两个样品的图。温度曲线参考右手边的y轴。渗漏的物质的量以总样品体积的分数的形式提供。从该图中可见部分渗漏。
图14显示实施例12中描述的2012年2月22日用SX126进行的HRL实验的结果。可看见两个样品的图。温度曲线参考右手边的y轴。渗漏的物质的量以总样品体积的分数的形式提供。
图15显示实施例12中描述的2012年1月25日用SX126进行的HRL实验的结果。可看见两个样品的图。温度曲线参考右手边的y轴。渗漏的物质的量以总样品体积的分数的形式提供。
图16为显示实施例14中报道的释放的物质的量占总样品体积的分数相对于实验的时间作图的图。大图显示整个实验,以及渗漏上限(其中所包封的WF10被完全释放)。这为整个样品体积的大约7.5%,因此这也表明脂质体的包封容量。较小的图更详细地报告发生一些渗漏的时期。
图17显示在本申请的一个实施方案中使用乙醇注入法制备脂质体的图示。出钢室的脂质体包封WF10并分散于含有WF10的外相中。
图18为显示在使用乙醇注入法制备包含WF10的脂质体的渗滤过程期间滤液中收集的亚氯酸盐的量的图。
图19为显示在使用乙醇注入法制备包含WF10的脂质体的渗滤过程期间滤液中收集的亚氯酸盐的量的图(重复图18中报道的实验)。
图20为显示在使用乙醇注入法制备包含WF10的脂质体的渗滤过程期间滤液中收集的亚氯酸盐的量的图。所述脂质体使用与图18和图19中报道的实验相比两倍浓度的WF10来制备。
图21为显示小鼠的胶原诱导性关节炎(CIA)的得分的图,所述小鼠在诱导CIA后接受WF10、脂质体形式的WF10或者NaCl(i.p.)。
图22为显示接受WF10、脂质体形式的WF10或者NaCl(i.p.)的小鼠第16天的CIA得分的棒图。
申请详述
I.定义
除非另外说明,如本领域技术人员会理解,在本部分和其它部分中所描述的定义和实施方案意图可应用于它们适合的本文中所描述的本申请的所有实施方案及方面。
本文中所使用的术语“a”、“an”和“the”不仅包括具有一员(member)的方面,也包括具有多于一员的方面。例如,一包括“磷脂”的实施方案应理解为提供具有一种磷脂或者两种或更多种额外的磷脂的方面。
在含有“额外的/附加(additional)”或者“第二”组分的组合物中,如本文中使用的第二组分与其它组分或者第一组分化学上不同。“第三”组分与其它组分、第一组分和第二组分不同,并且进一步列举的或“额外的/附加”组分类似地不同。
如本文中所使用的术语“剂/物质(agent)”指化合物或者化合物的混合物,当将其加入至组合物中时,会对组合物的性质产生特定作用。
如本文中所使用的术语“亚氯酸盐”指阴离子“ClO2 -”。阴离子物质通常以离解的形式存在于水性溶液中,但阴离子经常源自含有阴离子和阳离子的母体盐。
如本文中所使用的术语“氯酸盐”指阴离子“ClO3 -”。阴离子物质通常以离解的形式存在于水性溶液中,但阴离子经常源自含有阴离子和阳离子的母体盐。
如本文中所使用的术语“稳定化的亚氯酸盐”指组合物或者物质,其含有亚氯酸根离子(ClO2 -),并且其中亚氯酸根离子的浓度、pH和/或活性在使用前保持稳定,持续可接受的时期。在稳定化的亚氯酸盐中,在使用前亚氯酸根离子基本上不降解,并且亚氯酸根离子的活性基本上保持。稳定化的亚氯酸盐可含有缓冲剂,例如碳酸钠/氢氧化钠缓冲系统,其维持制剂的碱性pH。可监测亚氯酸根离子的浓度,例如通过高效液相色谱法(HPLC)进行。
本文中所使用的“WF10”指药物物质OXO-K993的10%(w/v)水性稀释液,分析上表征为包含亚氯酸根离子(4.25%)、氯酸根离子(1.5%)、氯离子(2.0%)、硫酸根离子(0.7%)和钠离子(4.0%)的溶液。
如本文中所使用的术语“可接受的时期”意指至少约1天、至少约1周、至少约30天、至少约6个月、至少约1年、至少约2年或者至少约制备和使用之间的时间。
如本文中所使用的术语“脂质体”指含有至少一个环绕内部核心的脂双层的人工制备的囊泡。内相(inner phase或internal phase)或者内部核心(在本文中可交换地使用)含有如亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的物质。所述囊泡可用于递送物质,例如局部地或在体内递送。有三种类型的脂质体:MLV(多层囊泡)、SUV(小单层囊泡,直径25-300nm)和LUV(大单层囊泡,直径大于300nm)。囊泡外的物质体积称为外相(external phase或outer phase)或者连续相。这些术语在本文中可交换地使用。脂质体组合物会含有多个独立的、分离的脂质体,并且内相和外相通常含有水。
鞘脂为一类含有结合至多种首基(head group)上的鞘氨醇(2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇)主链的脂质。
鞘磷脂(SM)指在动物细胞膜中,特别是在环绕一些神经细胞轴突的膜状髓鞘中发现的鞘脂类型。鞘磷脂具有神经酰胺核心(通过酰胺键与脂肪酸键连的鞘氨醇)以及极性首基,所述极性首基为磷酸胆碱或者磷酸乙醇胺。
如本文中所使用的术语“包封(encapsulated)”或“包封(entrapped)”意指被提及的物质位于脂质体的内部,或者在脂质体的内相或核心中。物质也可位于外相或者连续相中。
如本文中所使用的术语“包合率”指制备过程期间包封入脂质体囊泡中的物质或溶液相对于原料的百分比。
“药物组合物”指药用物质的组合物。术语“药物组合物”和“制剂”可相互交换地使用。
“多分散性指数”或者“PdI”是与溶液中颗粒的粒径分布相关的无量纲(dimensionless)数。PdI可通过对用称作动态光散射的技术测量的对比数据进行分析得到。该指数为由对比数据的简单双参数拟合(累积量分析,cumulants analysis)计算的数。PdI为无量纲的,并且度量使得除具有高度单分散标准之外几乎不会看到小于0.05的值。大于0.7的值表明该样品具有非常宽的粒径分布,并且可能不适合通过动态光散射法(DLS)技术进行粒径分布测量。多种粒径分布算法可用于这两个极值之间的数据。这些参数的计算如ISO标准文件13321:1996E和ISO 22412:2008中定义。
“公开的材料”意指提供信息的介质,其包括印刷的、音频的、可看得见的或者电子的介质,例如传单、广告、产品说明书、印刷的标签、互联网网站、互联网网页、互联网弹出窗口、无线电广播或者电视广播、光盘、DVD、播客、录音或者其它录制的或电子介质。
“安全性”意指与给药组合物相关的不良事件(包括与患者相关因素相关的副作用)的发病率或严重性。
如本文中所使用的术语“有效量”意指足以达到期望的结果的量,因此其会取决于成分及其期望的结果。但是,一旦已知期望的效果,测定有效量在本领域技术人员的技能范围内。
如本文中本申请的组合物的成分中所使用的术语“水”指药学上可接受的水。
如本文中所使用的术语“水性溶液”意指其中溶剂主要为水,但是可存在少量(例如小于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%(v/v))的非水性溶剂的溶液。
如本文中所使用的术语“w/v”意指100mL的溶液中溶质的克数。
如本文中所使用的术语“w/w”意指100g的溶液中溶质的克数。
如本文中所使用的术语“浑浊溶液”指由于存在单个颗粒或者悬浮的固体使外观不透明或者混浊的溶液,所述单个颗粒或者悬浮的固体分别通常用裸眼不可见。
如本文中所使用的术语“相变温度”指诱导脂质的物理状态从有序凝胶相(其中烃链完全伸展并紧密堆积)变化为无序液晶相(其中烃链在流体中任意定向)所需的温度。
通常,图中的“误差棒”表示平均值的标准误差,而实心的、阴影的棒的顶部表示单一数据值,其为数据值分布的平均值。
术语“药学上可接受的”意指与动物(特别是人)的治疗是相容的。
如本文中所使用的且本领域所熟知的术语“治疗(treating或treatment)”意指获得包括临床结果的有益的或者期望的结果的方法。有益的或者期望的临床结果可包括,但是不限于可检测或不可检测的一种或多种症状或病况的缓和或者改善、病变范围的缩小、疾病状态的稳定化(即不恶化)、疾病传播的预防、疾病恶化的延迟或者减慢、疾病状态的改善或者缓和、疾病复发的减少和减退(局部或者整体)。“治疗”也可意指与如果不接受治疗的预期存活相比,存活延长。如本文中所使用的“治疗”也包括预防性治疗。治疗方法包括向个体给药治疗有效量的活性药剂,并且其任选地由单次给药组成,或者其包括系列施用。治疗期的长度取决于多种因素,例如病况的严重性、患者的年龄、活性成分或者药剂的浓度、如本文中所述的组合物的活性,和/或其组合。治疗期也可包含周期,例如每天给药一次,持续约2-7天,然后停止约1-20天的时期,以构成一个治疗周期。患者可被治疗多于一个周期,例如至少两个、三个、四个或者五个周期。也会理解,在特定的治疗或预防方案过程中,用于治疗或预防的药剂的有效剂量可以增加或者减少。通过本领域已知的标准诊断测定法可得到剂量的变化,并且其变得清楚。在一些情况种可能需要慢性给药。例如,向个体给药足以治疗患者的量的组合物,并持续足以治疗患者的时间。
如本文中所使用的术语“个体”包括动物界的所有成员,包括哺乳动物,并且适合地指人。
“使用者”意指个体,如患者、医护工作者或者药物供应者。
“ζ电位”是与液体中颗粒的表面电荷相关的量,其指示分散于液体中的固体或者分散于液体中的液体的势稳定性。如果悬浮液中所有的颗粒具有大的负或者正ζ电位,则它们会倾向于彼此排斥,并且没有絮凝的趋势。但是,如果颗粒具有低ζ电位值,则会存在较小的阻止颗粒聚集的力,并且颗粒可能具有更大的絮凝趋势。关于ζ电位的更多信息可参照Hunter,R.J.(1988)Zeta Potential in Colloid Science:Principles And Applications,Academic Press,UK。
当在本申请的治疗方法和组合物的用途中使用时,“需要其的”个体可以是疑似患有、已经诊断患有或者之前已对要治疗的病况进行治疗的个体。
在理解本发明公开的范围中,如本文中所使用的术语“包含/包括(comprising)”及其派生词意图是开放式术语,其说明存在所描述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤,但是不排除存在其它未描述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤。上述内容也用于具有相似含义的词,如术语“包含/包括(including)”、“具有(having)”及其派生词。如本文中所使用的术语“由…组成(consisting)”及其派生词意图为封闭式术语,其说明存在所描述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤,但是排除其它未描述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在。如本文中所使用的术语“基本上由…组成”意图说明存在所描述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤,以及不实质上影响特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的基本上的和新颖的特征的那些。
如本文中所使用的程度的术语(如“基本上”、“约”和“大约”)意指所修饰术语的合理量的偏差,使得最终结果未显著变化。如果该偏差不会否定其修饰的词语的含义,则这些术语应被解释为包含所修饰的术语的至少±5%的偏差。
II.脂质体组合物
本申请涉及含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体组合物及其制备方法以及使用方法。
因此,本申请包括脂质体组合物,其包含具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。所述脂质体组合物含有许多脂质体,所述脂质体均含有双分子层包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。所述脂质体含有合适的脂质,其包括例如磷脂,如具有足够长的饱和和/或不饱和脂肪酸链的磷酯酰胆碱,和/或鞘脂,如鞘磷脂,或者显示期望的性质的这样的脂质的合适的混合物。这些脂质可以为天然的、半合成的或者合成的来源。所述脂质体还可包含如胆固醇或硫酸胆固醇的额外的组分,以使一个或多个双分子层和/或带电荷的脂质的刚性增加并且渗透性降低,以增强所述脂质体的稳定性。
本申请还包括脂质体,其包含至少一个脂双层和包封在脂质体内部中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。
本申请还包括脂质体组合物,其包含包封和未包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物,其中所述包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物在脂质体的内相中,并且未包封的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物在脂质体的外相中。在另一实施方案中,包封于至少一个脂双层中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物和存在于所述外相中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的比例为约100:1至约1:100,或约90:10至10:90。或者,所述外相可含有除了亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的物质,例如其它的治疗剂和/或氯化钠。
在本申请的一实施方案中,内相和外相的pH相同。在另一实施方案中,内相和外相的pH不同,例如,内相中的pH可为约6至约13、约8至约12.5或者约10至约12的pH,并且外相的pH可为大约中性,例如约6至8。在另一实施方案中,所述脂质体组合物的内部核心相和外部连续相之间的pH差异为约1至约7、约1至约5或者约1至约3。
在本申请的另一实施方案中,脂质体的内相和外相为等渗的,或者表现相同的渗量。即内相和外相的相互之间的渗量在1、2、3、4、5、6或7%之内。在一实施方案中,通过使脂质体的内部和外部的溶液的渗透压相同或者相似,减少脂质体的向内或向外渗漏的物质的量。在另一实施方案中,相对于个体的体液,脂质体组合物是等张的或等渗的。
或者,在一个实施方案中,脂质体内相和外相的渗量不同。例如,内相和外相之间的渗量差异可以为约8、10、15、20、25、50、100或200%。
在一实施方案中,本申请的脂质体组合物表现约3-48个月的药学上可接受的稳定性。在另一实施方案中,所述药学上可接受的稳定性是在约5℃至约50℃或约5℃至约30℃的温度下储存所述组合物实现的。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物可以为冻干的。脂质体的冻干技术是公知的,例如,Chen等人(J.Control Release 2010年3月19日;142(3):299-311)总结了决定冷冻干燥的脂质体的冻干保护(lyoprotective)效果的关键因素。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物包含脂质体,所述脂质体为平均直径为约80至约300nm、约90nm至约200nm或者约100nm至约140nm的单层和/或多层囊泡。在另一实施方案中,所述脂质体组合物包含脂质体,所述脂质体为平均直径为约80nm至约15微米、约300nm至约12微米或者约7微米至约10微米的单层和/或多层囊泡。粒度分布的性质可以为单式的或者多模式的,并且多分散性指数可以如本领域技术人员已知的制备方法进行控制,并基于期望的递送途径确定。
根据给药途径,可期望给药特定直径的囊泡。例如,直径为约80nm至约300nm的囊泡可用于静脉内给药,而直径为约80nm至约10微米的囊泡可以用于通过吸入给药,如经肺、气管或者鼻的途径。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物可被灭菌。适合的灭菌技术的非限制性实例包括过滤、高压灭菌、伽马射线和冻干(冷冻干燥)。在一个实施方案中,通过使用220nm的滤器过滤来进行灭菌。
考虑到亚氯酸盐和氯酸盐分别仅含有3或4个原子,令人惊奇地发现可以研发以下的脂质体:其中形成脂质体囊泡的脂双层对亚氯酸盐和/或氯酸盐是基本上不可渗透的(即所述囊泡为离子密封(ion-tight)的)。尽管已知其它分子(如乙醇、葡萄糖、氨和乙酸盐)渗透通过脂质体的脂双层的事实。因此,在本申请的一个实施方案中,脂双层对亚氯酸盐是基本上不可渗透的。在本申请的另一实施方案中,脂双层对氯酸盐是基本上不可渗透的。在另一实施方案中,脂双层对亚氯酸盐和氯酸盐是基本上不可渗透的。
本申请的离子密封的脂质体可以用单壁脂质体囊泡实现。在本申请的一个实施方案中,所述离子密封的脂质体表现商业上可接受的贮存期(例如在室温或者冷冻温度下约3-48个月)内的稳定性。在另一实施方案中,离子密封的脂质体囊泡分散其中的外部(或者外相)可被设计为含有不同于包封的内部(或者内相)的组合物。例如内相和外相可含有不同浓度的亚氯酸盐,或者两相中的任一相可基本上不含亚氯酸盐。作为另一实例,内相和外相可含有不同浓度的氯酸盐,或者两相中的任一相可基本上不含氯酸盐。在本申请的一个实施方案中,离子密封的脂质体制剂的内相和外相的pH不同。例如,外相可含有盐水溶液,并且其pH可与可含有亚氯酸盐和/或氯酸盐的内相基本上不同。在一个实施方案中,外相可含有氯化钠,基本上不含有亚氯酸盐和/或氯酸盐并且pH为大约中性,而内相含有亚氯酸盐和/或,并且pH高于外相。因此,形成脂质体囊泡的脂双层可以另外对H+和OH-是基本上不可渗透的。理论上,可以使用基于13C-NMR的方法测量脂质体中的pH。本申请中的离子密封的脂质体组合物可基本上不含氯酸盐,或者可包含含有与外相浓度不同的氯酸盐的脂质体囊泡。在本申请的另一实施方案中,含有脂质体组合物的离子密封的囊泡的直径分布具有多个值。在另一实施方案中,内相、外相或其二者含有多种物质。在其它实施方案中,脂质体分散液中的不同脂质体中包封的物质组成有变化。
在一实施方案中,本申请的脂质体组合物不含有过氧化氢、异噻唑啉和/或锌离子。在另一实施方案中,所述脂质体组合物不含有由卵磷脂制备的脂质体。在另一实施方案中,所述脂质体组合物不含有亚氯酸盐和/或亚氯酸盐仅包封在脂双层的两层脂质之间的脂质体。在另一实施方案中,所述脂质体组合物基本上不含降解产物。
在另一实施方案中,本申请的脂质体是稳定的,即亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物不从脂质体内部渗漏,持续可接受的贮存期(例如在食品和药品监督管理局(FDA)或者其它政府管理机构批准的产品说明书中所定义)。在一个实施方案中,所述脂质体在低于约30、25、20、15、10、9、8、7或6℃的温度下稳定,持续足以使其用于预期目的的时间。例如,持续1分钟至1小时、1小时至24小时、1天至30天、30天至200天、6个月至1年或者更久的时间。
A.亚氯酸盐、氯酸盐及其混合物
本申请的脂质体组合物包含亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有亚氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有稳定化的亚氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有亚氯酸盐和氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有亚氯酸盐,且基本上不含氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物含有氯酸盐,且基本上不含亚氯酸盐。在一个实施方案中,所述脂质体组合物为不含氯酸盐的组合物。在另一实施方案中,所述脂质体组合物为不含亚氯酸盐的组合物。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有稳定化的亚氯酸盐。基于稳定化的亚氯酸盐的组合物的非限制性实例包括在第6,350,438、6,251,372、6,235,269、6,132,702、6,077,502和4,574,084号美国专利中描述的那些,其各自的内容以其整体援引加入。
在另一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐为含有如OXO-K993(其包含亚氯酸盐和氯酸盐)的亚氯酸盐的组合物,或者含有约1-10%、10-20%、20-30%、30-50%或者50-90%(w/v)OXO-K993的组合物。在另一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐是含有WF10的组合物或者是WF10。
在一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐是含有约2%(w/v)OXO-K993的组合物;在另一实施方案中,所述稳定化的亚氯酸盐是含有约2%(w/v)OXO-K993、约2%(w/v)甘油和约96%(w/v)水的组合物。这样的组合物以OxovasinTM或OxoferinTM(Nuvo Manufacturing,Wanzleben,Germany)的名称销售,其中1mL的OxovasinTM包含在1.0mL水中的约0.85mg(或者约0.085%w/v)的亚氯酸盐。OxovasinTM的pH为10.75至11.90。
在本申请的一实施方案中,使用以下方法制备OXO-K993:
将亚氯酸钠(NaClO2)和次氯酸钠(NaOCl)以4.8至1的摩尔比在注射用水(WFI)中混合。溶液的pH应大于pH 11.0。向该混合物中加入催化剂、亚氯酰基硫酸(chlorylsulfuric acid)[ClO2 +][HSO4 -],然后可观察到以下反应:
2ClO2 +OCl+2H+→2ClO2+Cl+H2O   (1)
溶液的pH降低。在方程(1)所描述的氧化还原过程中部分亚氯酸盐被氧化为二氧化氯(ClO2)。在平衡反应中,生成的二氧化氯与过量的未氧化亚氯酸盐形成强烈的灰色电荷转移络合物,如方程(2)所示:
然后向溶液中加入9.65mmol(每kg的反应溶液)碳酸钠过氧化氢(sodium carbonate peroxohydrate,2Na2CO3·3H2O2)。在加入碳酸钠过氧化氢时,部分二氧化氯被还原为亚氯酸盐,并且同时形成氧气:
2ClO2+H2O2+2OH→2ClO2 +O2+2H2O   (3)
合适的时间(例如15分钟)后,向溶液中加入102mmol(每kg的反应溶液)过氧化钠(Na2O2),当剩下的二氧化氯完全被还原为亚氯酸盐时,溶液被完全脱色。在通常需要至少4周的缓慢过程(方程4)中,由过氧化钠生成氧气。同时形成氢氧根离子,导致溶液的高pH值(pH>13),由此稳定化活性物质亚氯酸盐。
2O2 2–+2H2O→O2+4OH   (4)
由该合成得到的最终反应产物OXO-K993为稳定的水溶液,其含有亚氯酸根阴离子(4.25%)、氯阴离子(2.0%)、氯酸根阴离子(1.5%)和硫酸根阴离子(0.7%),与阳离子形式的钠,以及维持制剂碱性pH的碳酸钠/氢氧化钠缓冲系统。
技术人员会认识到任意化学上稳定的亚氯酸盐溶液(包括OXO-K993、WF10、OxovasinTM的衍生物或者其它基于亚氯酸盐或基于氯酸盐的溶液及其衍生物)都在本申请的范围内。这些溶液可在本申请的组合物、方法和用途中使用,这样,本申请的范围不一定限于使用本文中所描述的产物。
OXO-K993及其衍生物(WF10、Oxoferin、Oxovasin)也是含有离子混合物的组合物的实例,因为所述制剂含有亚氯酸根离子、氯离子、氯酸根离子、硫酸根离子和钠离子。在本申请的一个实施方案中,含有离子混合物的组合物为含有至少两种不同种类的阴离子(氯酸根和亚氯酸根)的组合物。在本申请的另一实施方案中,所述组合物可含有至少三种不同种类的阴离子。在本申请的另一实施方案中,所述组合物可含有至少4种、至少5种或者至少6种不同种类的阴离子。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封亚氯酸盐。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封氯酸盐。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封离子含量的约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)或约0.5%(w/w)至约10%(w/w)的量存在的包封氯酸根离子和亚氯酸根离子的混合物。含有亚氯酸根和/或氯酸根离子的物质的任意组合物也含有至少一种反荷离子以保持电中性。因此,根据本申请中的一个实施方案,所述脂质体组合物含有一种或多种阳离子。可能的阳离子的非限制性实例包括碱金属阳离子(例如钠或Na+)和碱土金属阳离子。在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有亚氯酸根离子、氯酸根离子或其混合物,其还含有钠和/或钾反荷离子。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封阴离子含量的约0.1%(w/w)至约100%(w/w)、约1%(w/w)至约90%(w/w)、约2%(w/w)至约80%、约3%(w/w)至约70%(w/w)、约4%(w/w)至约60%或者约5%(w/w)至约50%的量存在的包封亚氯酸盐。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封阴离子含量的约0.1%(w/w)至约100%(w/w)、约1%(w/w)至约90%(w/w)、约2%(w/w)至约80%、约3%(w/w)至约70%(w/w)、约4%(w/w)至约60%或者约5%(w/w)至约50%的量存在的包封氯酸盐。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物含有以所述组合物的总包封阴离子含量的约0.1%(w/w)至约100%(w/w)、约1%(w/w)至约90%(w/w)、约2%(w/w)至约80%、约3%(w/w)至约70%(w/w)、约4%(w/w)至约60%或者约5%(w/w)至约50%的量存在的包封氯酸根离子和亚氯酸根离子的混合物。
技术人员会认识到所述脂质体组合物中的阴离子比例可以基于其预期用途定性地或者定量地调节。例如,为了治疗特定疾病、病症和病况,可调节组合物中的阴离子比例。在一个实施方案中,第一种阴离子与第二种阴离子的比例为约100:1至约1:100、约90:10至约10:90、约1:1至约3:1(w/w)或约2:1(w/w)。在一实施方案中,第一种阴离子为亚氯酸根,并且第二种阴离子为氯酸根。
在一实施方案中,所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的pH大于约8、大于约9或者大于约10。在一实施方案中,所述pH为约8至约14、约8至约13、约9至约12.5或者约10至约12。
在另一实施方案中,所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的pH小于约8、小于约7或者小于约6。在一实施方案中,所述pH为约5至约8、约6至约7或者约7至约7.5。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物可有两个pH值,第一个值与内相或者包封相的pH有关,第二个值与外相的pH有关。例如,脂质体组合物内相的pH为约6-13,而脂质体组合物外相的pH可为约6-8。因此,在一个实施方案中,内相和外相之间的pH差异为约1-7、约1-6、约1-5、约1-4、约1-3、约1-2或者约1。
本申请中所使用的亚氯酸盐和氯酸盐可以由任意可用来源获得或者是商购可得的。在一实施方案中,所述亚氯酸盐或氯酸盐为钠盐,但是本领域技术人员会理解可以使用其它金属盐。
在本申请的脂质体组合物中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的量通常为使用制备方法可包封在脂质体中的最大量。在一实施方案中,所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的包封率或者包合率为约1%至约50%、约2%至约25%或约5%至约15%。
B.脂质
包含于本申请的脂质体中的脂质选自适合用于包封pH为约5至约14、约6至约13、约8至约12.5或约10至约12的离子的脂质。决定脂质对于制备本申请的脂质体的适合性的因素包括:(1)在水性介质中形成脂双层的能力;(2)包封可观的量的离子的能力;(3)形成的脂质体不渗透渗漏亚氯酸根离子和/或氯酸根离子;(4)形成的脂质体在碱性环境(例如,如果内部pH为8或者更高)中对水解作用的抵抗力;和/或(5)形成的脂质体在约5℃至约50℃的范围内的储存温度下保持稳定持续可接受的时间的能力。
本文中所提供的实例说明并非所有的脂质都适于制备用于包封如氯酸根或亚氯酸根的离子的稳定脂质体。通过本申请的教导,在一个实施方案中令人惊奇地发现合适的脂质选自磷脂和鞘脂。在另一实施方案中,合适的磷脂选自含有足够长的饱和或不饱和脂肪酰基链的磷酯酰胆碱(PC),所述足够长如大于12个、大于13个或大于14个碳原子,并且合适的鞘脂选自鞘磷脂(SM)。在另一实施方案中,所述合适的脂质选自鞘磷脂(SM)、1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂或者蛋黄磷脂及其混合物。在另一实施方案中,所述合适的脂质选自形成在约5℃或更高、约23℃或更高、约37℃或更高或者约50℃或更高的温度下不渗透渗漏离子的脂质体的脂质。在另一实施方案中,本申请的脂质体在形成它们的脂质的相变温度(PTT)下或附近温度下可以是或者不可以是不渗透性的。已知多种脂质的PTT,例如1-棕榈酰-2-油酰-sn-3-甘油基-3-磷酸胆碱(-2℃)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(23℃)、鞘磷脂(37℃)、1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(41℃)和氢化大豆磷脂或者蛋黄磷脂(如氢化大豆磷脂为50℃)。
本申请的脂质体可含有两种或者更多种合适的脂质。当脂质体含有两种合适的脂质时,所述脂质可以20:1至1:1、15:1至5:1或10:1至9:1的摩尔比存在。在一个实施方案中,所述两种合适的脂质选自鞘磷脂(SM)、1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)和氢化大豆磷脂或者蛋黄磷脂。
本申请的组合物还可包含至少一种如胆固醇或硫酸胆固醇的附加组分以提高所述脂双层的刚性和/或降低所述脂双层的渗透性。所述至少一种附加组分可以总脂质含量的约0.1%至约50%、约1%至约30%、约5%至约25%或者约10%至约20%的量存在。
在另一实施方案中,本申请组合物还含有至少一种使所述脂质体具有减少所述脂质体聚集的ζ电位的附加组分,例如至少大于约+0.5mV或者小于约-0.5mV的ζ电位。在一实施方案中,所述ζ电位为约+1mV至+50mV、约+10mV至+40mV或者约+15mV至+30mV。在另一实施方案中,所述ζ电位为约-1mV至-50mV、约-10mV至-40mV或者约-15mV至-30mV。在另一实施方案中,所述至少一种使所述脂质体具有减少所述脂质体聚集的ζ电位的附加组分为带电荷的脂质。在另一实施方案中,用于制备本申请的脂质体的脂质包含至少一种带电荷的脂质。尽管不希望受理论的限制,带电荷的脂质的存在导致当他们相互靠近时,临近的脂质体排斥,减少脂质体之间的接触量,因此减少导致脂质体尺寸增加的融合和聚集的量。因此,在本申请的一个实施方案中,脂质体含有提供使脂质体互相排斥的ζ电位的带电荷的脂质,所述ζ电位例如至少大于+1mV、+5mV、+10mV、+15mV、+25mV、+35mV或者+45mV,或者小于-1mV、-5mV、-10mV、-15mV、-25mV、-35mV或者-45mV。
在一实施方案中,所述带电荷的脂质为带负电荷的脂质,例如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或者磷脂酸。但是带电荷的脂质不一定为磷脂或者鞘脂。
对于制备本申请的脂质体,优选带负电荷的脂质,但是,本申请的脂质体不排除使用带正电荷的脂质。因此在一个实施方案中,本申请的脂质体可包含至少一种带正电荷的脂质。例如,1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱盐酸盐EPC(盐酸盐)、N-[1-(2,3-二油酰氧基(dioleyloyx))丙基]-N-N-N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二甲基二十八烷基溴化铵盐(DDAB)和其它pH敏感的阳离子磷脂。但是,带电荷的脂质不一定为磷脂或鞘脂。例如,其它带电荷的脂质,如N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵硫酸甲酯盐(DOTAP)可用于制备本申请的脂质体。
在一个实施方案中,所述带电荷的脂质以使未带电荷的脂质:带电荷的脂质的摩尔比为20:1至1:1、15:1至5:1或10:1至9:1的量存在。在另一实施方案中,脂质体中带电荷的脂质的存在改善所生成的脂质体的稳定性,特别是与除无带电荷的脂质外相同的脂质体相比。
在一实施方案中,包含于本申请的脂质体中的合适的脂质选自表1中所列的脂质。
在一实施方案中,合适的脂质选自1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)、二花生酰基(arachidoyl)磷脂酰胆碱(DAPC)、1,2-二山嵛酰(behenoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-二芥酰(erucoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、氢化大豆磷脂或蛋黄磷脂及其混合物。在另一实施方案中,所述脂质为鞘磷脂(SM)或乳鞘磷脂。在另一实施方案中,所述脂质为氢化大豆磷脂或蛋黄磷脂。在另一实施方案中,所述合适的脂质选自1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂或蛋黄磷脂及其混合物与带电荷的脂质或其它脂质的组合。在另一实施方案中,所述带电荷的脂质为带负电荷的磷脂。在另一实施方案中,所述带负电荷的磷脂为磷脂酰甘油,例如1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DOPG)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DSPG)的盐,磷脂酰乙醇胺如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-甲基-聚乙二醇(MPEG-DSPE)的盐,或其混合物。在另一实施方案中,所述磷脂酰甘油为DPPG或DSPG或其混合物。
在本申请的一实施方案中,当在脂质体中使用脂质的混合物时,以主要量存在的脂质为PTT大于约5℃至约30℃的脂质。这样的脂质为例如含有包含超过12个连续的碳原子的碳链的脂质。
在本申请的一个实施方案中,期望特定比率的脂质,在另一实施方案中,所述脂质选自摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)。在另一实施方案中,所述脂质选自摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)。在另一实施方案中,所述脂质选自摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)。在另一实施方案中,所述合适的脂质为纯DPPC。
也可选择具有特定PTT的脂质来制备本申请的脂质体组合物。因此在本申请的一实施方案中,脂质体含有PTT高于动物的体温的脂质。在本申请的另一实施方案中,脂质体含有PTT低于动物的体温的脂质。
这样的物质为可商购获得的,例如得自Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama USA)、LIPOID GmbH(Germany),或者可使用本领域已知的方法制备。
C.脂质体表面修饰剂
为了增加本申请的脂质体的循环时间,在一实施方案中,用增加亲水性的分子修饰(如用亲水聚合物修饰)脂质体的表面或者脂双层。
在一实施方案中,所述亲水聚合物为聚乙二醇(PEG)。已证明脂质体表面上的PEG的存在延长血液循环时间,同时减少单核巨噬细胞系统(MPS)的摄取。
可以数种方式实现脂质体用PEG的表面修饰:通过将聚合物物理性吸附至囊泡表面、通过在脂质体制备期间掺入PEG-脂质缀合物,或者通过将反应性基团共价连接至预先形成的脂质体表面。
已证明将PEG接合至脂质体具有数种生物学上和技术上的优势。PEG化囊泡的最显著特点为其有力地减少MPS的摄取及其延长的血液循环,从而改善其在灌注的组织中的分布。此外,脂质体表面上的PEG链避免囊泡聚集,改善其稳定性。PEG修饰的脂质体也常被称为“隔离的”脂质体。DoxilTM(盐酸多柔比星脂质体注射液)为脂质体包封的多柔比星,其利用附属的聚乙二醇(PEG)来逃避网状内皮系统(RES)并延长药物循环时间(参见Vail D M,Amantea M A,Colbern G T等人,“Pegylated LiposomalDoxorubicin.Proof of Principle Using Preclinical Animal Models andPharmacokinetic Studies.”Semin Oncol.(2004)31(Suppl 13):16-35)。
在由磷脂和胆固醇构成的脂质体中,发现PEG增加囊泡循环寿命的能力取决于接合的PEG的量和聚合物的长度或分子量(Allen T M等人,Biochim Biophys Acta.1989,981:27-35)。在大多数情况下,长链PEG产生对于血液滞留时间的最大改善。在一实施方案中,PEG的分子量为约500至约5000。
其它可用于本申请的脂质体表面修饰的亲水性聚合物包括水溶性的、亲水性的、具有弹性主链的和生物相容性的聚合物。在一实施方案中,亲水性聚合物选自PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺(PAA)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、L-氨基酸系生物可降解聚合物、聚乙烯乙醇(例如分子量为约20,000的PVA)、聚(2-甲基-2-噁唑林)、聚(2-乙基-2-噁唑林)及其混合物。
在另一实施方案中,脂质体的表面用神经节苷脂和/或唾液酸衍生物(如单唾液酸神经节苷脂(GM1))修饰。在静脉内注射后脂质体的MPS摄取的研究中测试数种糖脂:糖脂GM1(源自脑组织的单唾液酸神经节苷脂)在并入脂质体表面时显著减少MPS摄取,并且该制剂在血液循环中保留数小时。直径在90-200nm范围的GM1接合脂质体比不在该尺寸范围的脂质体具有更长的血液滞留,由此在肿瘤组织中蓄积。GM包被的脂质体可用于口服给药和向脑部的递送,特别地已表明在用作口服药物载体的脂质体制剂中,含有GM1和GM III型的脂质体制剂更可能在通过胃肠道后继续存在(TairaMC等人Drug Deliv.2004;11:123-8)。此外,在两个半球的皮层、基底神经节和中脑中对于GM1脂质体的脑部示踪剂摄取比对于对照脂质体的脑部示踪剂摄取更高;相反地,在示踪剂的肝摄取或者血液浓度中未观察到显著变化(Mora M等人Pharm Res.2002;19:1430-8)。
除了PEG修饰的脂质体,研究者研发了多种其它衍生的脂质。这些衍生的脂质也可掺入脂质体中。参见例如:国际专利申请WO 93/01828;ParkY S,Maruyama K,Huang L."Some negatively charged phospholipidsderivatives prolong the liposome circulation in vivo."Biochimica et BiophysicaActa(1992)1108:257-260;Ahl等人,Biochimica Biophys.Acta(1997)1329:370-382。
D.靶向基团
为了增加脂质体药物在期望的组织中的蓄积,产生更高和更具选择性的治疗活性,在一个实施方案中,通过将细胞特异性靶向基团连接至脂质体的表面来修饰本申请的脂质体,以便于它们和特定的细胞或组织类型结合。靶向基团包括例如单克隆抗体(MAb)或片段、多肽、生长因子、糖蛋白、糖或受体配体,或者其混合物。示例性靶向基团包括但不限于转铁蛋白、叶酸、叶酸盐、透明质酸、糖链(例如半乳糖、甘露糖等)、单克隆抗体的片段、脱唾液酸糖蛋白等,以及其它技术人员已知的靶向因子及其混合物。在具体的实施方案中,靶向因子为针对细胞表面受体的蛋白质、肽或者其它分子(如转铁蛋白、叶酸盐、叶酸、脱唾液酸糖蛋白)。
含有靶向因子的脂质组合物的实例包括在第5,049,390、5,780,052、5,786,214、6,316,024、6,056,973、6,245,427、6,524,613、6,749,863、6,177,059、和6,530,944号美国专利;第2004/0022842、2003/0224037、2003/143742、2003/0228285、2002/0198164、2003/0220284、2003/0165934和2003/0027779号美国专利申请公开;第WO 95/33841、WO 95/19434、WO 2001037807、WO 96/33698、WO 2001/49266、WO 9940789、WO 9925320、WO 9104014、WO 92/07959、EP 1369132和JP 2001002592号国际专利申请以及在IinumaH等人Int J Cancer,2002,99:130-137;Ishida 0等人Pharmaceutical Research,2001,18:1042-1048;Holmberg等人Biochem.Biophys.Res.Comm.1989,165(3):1272-1278;Nam等人,J.Biochem.Mol.Biol.1998,31(1):95-100和Nag等人J.Drug Target.1999,6(6):427-438中公开的那些。
特别地,Linuma等人(ibid)研发了Tf-PEG-脂质体,转铁蛋白结合在脂质体的表面,并且证明更大量的脂质体结合至肿瘤细胞的表面。肿瘤细胞对于Tf-PEG-脂质体比对于PEG脂质体具有更高的脂质体摄取(Inuma等人,ibid;Ishida等人,ibid)。
特异性靶向基团的实例以及它们的治疗靶点如下:抗HER2(曲妥珠单抗)-乳腺癌/卵巢癌;抗EGF-实体瘤;抗CD19-淋巴瘤;抗CD22-B细胞淋巴瘤;抗β1整联蛋白-癌症细胞;抗GD2-成神经细胞瘤;抗GAH-胃、结肠和乳腺癌;叶酸-癌细胞;转铁蛋白-癌细胞;茴香酰胺-乳腺癌、黑色素瘤和前列腺癌;血管活性肠肽28-mer-乳腺癌细胞的成像、RGD-成神经细胞瘤、黑色素瘤和结肠癌;血管生成归巢肽(Angiogenic homing peptide)-黑色素瘤、肉瘤和结肠癌。
在一实施方案中,将本申请的脂质体组合物注射入个体中,并加热相关身体部位以使囊泡内容物能够靶向递送。这对于在体温下稳定的脂质体时特别有用的。如癌症的升温治疗(hyperthermic treatment)的已知方法可受益于本申请的组合物的靶向递送。
在一实施方案中,本申请的脂质体含有表面修饰的亲水性肽和靶向基团。在另一实施方案中,通过将合适的脂质的PEG衍生物(在PEG链的端头含有马来酰亚胺基团)混合入脂质体制剂中来制备这些脂质体。制备脂质体后,例如含有亲核性的N、O和/或S原子的靶向基团通过表面键合结合至上述PEG脂质体的马来酰亚胺基团,得到稳定的键。或者,将市售预负载的长循环脂质体通过靶向基团的后插入进行修饰。
E.其它组分
在本申请的另一实施方案中,本申请的脂质体组合物和脂质体还含有对于特定应用所期望的其它添加剂或药剂。这样的添加剂或药剂包括但不限于湿润剂、溶剂、抗生素、着色剂、香料、芳香剂等。在一个实施方案中,所述组合物含有抗氧化剂。在一实施方案中,本申请中所使用的抗氧化剂包括丁羟甲苯、丁羟茴醚、抗坏血酸亚油酸酯、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸生育酚马来酸盐、抗坏血酸钙、类胡萝卜素、曲酸及其药学上可接受的的盐、巯基乙酸及其药物可用的盐(例如铵盐)、生育酚、维生素E、生育酚聚醚(tocophereth)-5、生育酚聚醚-12、生育酚聚醚-18或生育酚聚醚-80,或者其混合物。
III.制备方法
本申请的脂质体可使用用于制备脂质体的任意已知方法来制备,所述方法例如薄膜法、超声法、挤出法、高压/均质法、微流化法、洗涤剂透析法、乙醇注入法、包括交叉流技术的乙醇注入法、小脂质体囊泡的钙诱导融合法和乙醚输注法。这些方法是本领域中公知的(参见例如"LiposomeTechnology",G.Gredoriadis(Ed.),1991,CRC Press:Boca Raton,Fla.;D.Deamer and A.D.Bangham,Biochim.Biophys.Acta,1976,443:629-634;Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979,76:3348-3352;F.Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,1980,9:467-508;Hope等人,Biochim.Biophys.Acta,1985,812:55-65;L.D.Mayer等人,Biochim.Biophys.Acta,1986,858:161-168;Hope等人,Chem.Phys.Lip.,1986,40:89-1-7;K.J.Williams等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,1988,85:242-246;Wagner和Vorauer-Uhl,Journal ofDrug Delivery,2011,pp.1-9;Wagner等人,Journal of Liposome Research,2002,12(3):259-270;Wagner等人,European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics,2002,54:213-219以及第4,217,344、4,235,871、4,241,046、4,356,167、4,485,054、4,551,288、4,663,161、4,737,323、4,752,425、4,774,085、4,781,871、4,877,561、4,927,637、4,946,787、5,190,822、5,206,027、5,498,420、5,556,580和5,700,482号美国专利)。
在一个实施方案中,使用传统的薄膜法制备脂质体。在该方法中,将形成双分子层的元素与挥发性的有机溶剂或者溶剂混合物(例如氯仿、乙醚、甲醇、乙醇、丁醇、环己烷等)混合。然后将溶剂蒸发(例如使用旋转蒸发仪、干燥的氮气或氩气流或者其它方法),导致干燥脂质膜的形成。然后将所述膜用含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的水性介质水合。所使用的水合步骤影响形成的脂质体的类型(例如双分子层的数目、囊泡尺寸和包封体积)。水合的脂质薄膜在搅拌过程中分离,自封闭形成不同尺寸的,大的多层囊泡(MLV)。通过在更剧烈的搅拌条件下水合脂质,或者通过加入增溶洗涤剂(如脱氧胆酸盐),可使所生成的多层囊泡的尺寸变得更小。或者或另外,可通过超声法、冻融法或挤出法来减小囊泡尺寸(参见下述)。
大单层囊泡(LUV)可以由MLV通过使用多种方法中的任一种来制备。例如,通过滤器挤出MLV可提供LUV,其尺寸取决于所使用的滤器孔径。在这样的方法(例如在第5,008,050号美国专利中所描述)中,将MLV脂质体悬浮液反复通过挤出装置,得到一群粒径分布均匀的LUV。当使用由凝胶转变为液晶的温度大于环境温度的脂质时,可以使用具有加热圆筒的挤出机(或thermojacket)。如Mayer等人(Biochim.Biophys.Acta,1985,817:193-196)所描述,在挤出操作前,LUV可接受至少一次冷冻和融化循环。
其它制备单层囊泡的方法依赖于对脂质体的水性分散体应用剪切应力。这样的方法包括超声法和均质法。使用浴式超声波仪或者探头超声波仪(probe sonicator)来超声处理脂质体悬浮液导致尺寸逐渐减小为尺寸小于50nm的小单层囊泡。可通过准弹性光散射(QELs)(V.A.Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,1981,10:421-450)测定脂质体囊泡的尺寸。在代表性均质方法中,在3,000-14,000psi,优选10,000-14,000psi的压力和对应于具有最高Tc的脂质的凝胶-液晶转化温度下,将多层囊泡反复通过标准乳液匀化器中循环,直至观察到所选择的脂质体尺寸,通常为约100-500nm。
其它用于制备LUV的技术包括反相蒸发法(第4,235,871号美国专利)和输注法以及洗涤剂稀释法。例如,单层囊泡可通过以下制备:将脂质在氯仿或者乙醇中溶解,然后将所述脂质注射入缓冲液中,导致脂质自发地聚集并形成单层囊泡。或者,可将磷脂溶解于洗涤剂(例如胆酸盐、Triton-X或者正烷基葡糖苷)中。在溶解的脂质-清洁剂胶束形成后,通过透析、凝胶过滤、亲和色谱法、离心、超滤或者任意其它合适的方法移除清洁剂。
在一个实施方案中,本申请包括制备含有包封于至少一个脂双层内的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体的方法,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质,所述方法包括:
(a)向内表面至少部分具有所述一种或多种脂质的薄膜的容器中加入亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的水性溶液;
(b)在足以全部或者部分移除所述内表面的所述薄膜的条件下搅拌所述容器,以得到含有包封有亚氯酸盐和/或氯酸盐的脂质体的浑浊溶液;
(c)对所述浑浊溶液进行处理,以将所述脂质体的平均直径减小至所需的量,例如约50nm至约300nm;以及
(d)任选地对所述脂质体进行处理,以从所述脂质体的外部溶液中移除亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。
在另一实施方案中,使用乙醇注入法制备本申请的脂质体,例如Wagner和Vorauer-Uhl,Journal of Drug Delivery,2011,pp.1-9)中所述,其有关部分援引加入本文。在另一实施方案中,使用通过交叉流技术的乙醇注入法制备所述脂质体,例如在Wagner等人,Journal of Liposome Research,2002,12(3):259-270)中所述,其有关部分援引加入本文。
在一实施方案中,在(a)中的所述一种或多种合适的脂质与所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物之间的摩尔比为约0.01:1至约10000:1、约0.1:1至约5000:1、约0.5:1至约2500:1、约1:1至约1000:1或约0.1:1至约100:1。
可购买溶液形式的用于制备本申请的脂质体的脂质,特备是购自Avanti Lipids。LIPOID AG提供未稀释的固态的脂质。在特定实施方案中,所述溶液的浓度为每毫升的溶液约10mg至约100mg的脂质。用于制备脂质体的该溶液的量会根据所需脂质的量变化,所需脂质的量会取决于所需的样品体积。如果使用纯的、未溶解的脂质,则将它们在合适的体积的氯仿或者其它合适的有机溶剂中溶解。
为了得到内表面至少部分具有所述一种或多种脂质的薄膜的容器,在一实施方案中,将容器在减压下以及接近或者高于全部一种或多种脂质的相变温度(PTT)的温度下搅拌处理,以移除溶剂。注意,在蒸发步骤中不需要保持高于PTT。对于氯仿溶液,可使用37℃的水浴,所述温度低于DPPC的PTT(41℃)和氢化大豆磷脂的PTT(50℃)。在一实施方案中,使用旋转蒸发仪,在将容器保持在高于全部一种或多种脂质的相变温度的温度下,将溶剂移除。
向容器中添加水性溶液,并将容器在足以将薄膜从所述容器的内表面移除的条件下搅拌,以提供含有脂质体的浑浊溶液/分散体。在一实施方案中,足以移除薄膜的条件包括晃动容器,并将容器加热至高于全部一种或多种脂质的脂质相变温度的温度。在另一实施方案中,所述条件还包括在高于全部一种或多种脂质的脂质相变温度的温度下晃动,持续约1分钟至约2小时,或者约5分钟至约1小时。在此步骤中,随着脂质体的形成和亚氯酸盐、氯酸盐或者其混合物的溶液的包封,发生一种或多种脂质的再水合。这些所谓的初级脂质体为在脂质体内部(内相)和外部(外相)均含有所述溶液的大多层囊泡(LMV)。在该阶段,样品为浑浊的、乳白色溶液/分散体。
可使用用于减小脂质体尺寸的任意已知方法来处理所述浑浊溶液,以将脂质体的平均直径减小至约50nm至约300nm。在本申请的一实施方案中,使用冻融循环和挤出法的组合。在另一实施方案中,仅使用挤出法。
对于冻融循环,在一实施方案中,将样品转移至合适的容器中(如果需要),例如冻存管(cryotube),并将容器浸入液氮中,随后在高于全部一种或多种脂质的脂质相变温度的水浴中解冻。在一实施方案中,至少进行2、3、4、5、6、7、8、9或10次循环。尽管不希望受理论限制,冷冻导致初级脂质体的破坏,并且在高于全部一种或多种脂质的脂质相变温度下解冻导致平均直径较小的脂质体自发再形成。但是,冻融法是任选的。
在本申请的一实施方案中,挤出法通过使脂质体样品通过至少一个约50nm至约200nm的滤片的挤压下进行;在一实施方案中,通过向含有合适的滤器的挤出机施加压力下进行挤压。在另一实施方案中,在高于全部一种或多种脂质的脂质相变温度的温度下进行挤出,并且重复至少2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
在一实施方案中,使用挤出法仅提供平均直径为约50nm至约150nm或者约100nm的单层脂质体。在另一实施方案中,可使用超声法来减小粒度或者将MLV转化为LUV/SUV。
在另一实施方案中,本申请的方法提供基本上不含降解产物(例如通过MALDI-TOF监测)的脂质体组合物。在另一实施方案中,本申请的方法提供含有降解产物的水平符合由FDA或者其它管理机构批准的准则的脂质体组合物。
在该阶段,样品含有分散在亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的溶液中的填充有离子的脂质体。在一实施方案中,含有所述溶液的外相被例如盐水,使用任选的透析处理来置换。在一实施方案中,将样品填充至透析室内,并将其置于温度低于全部一种或多种脂质的PTT的盐水溶液中。在约1小时后,在搅拌下,交换过量的介质,并将该步骤重复至少1、2、3或4次。在一实施方案中,重复该步骤直到亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的浓度低于邻联甲苯胺(o-tolidin)法的检出限。这种用于分析亚氯酸盐/氯酸盐的方法基于以下事实:亚氯酸根和氯酸根(分别为ClO2 -和ClO3 -)与在强盐酸溶液中的邻联苯甲胺反应,产生颜色的变化,该颜色的变化高度取决于存在于溶液中的ClO2 -和ClO3 -的量。该方法提供单独检测两种物质的两步法。然而,由于WF10中亚氯酸盐与氯酸盐的恒定比,仅需要使用一步其中两种组分对颜色的变换都有贡献的步骤。实施邻联甲苯胺法的方法在实施例7中描述。
在本申请的实施方案中,将含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体和含有这些脂质体的组合物在低于约10、9、8、7或者6℃,适合地低于约6℃下储存。
在另一实施方案中,所述脂质体组合物可被灭菌。适合的灭菌技术的非限制性实例包括过滤、高压灭菌、伽马射线和冻干(冷冻干燥)。在一个实施方案中,通过使用220nm的滤器过滤来进行灭菌。
IV.治疗应用
亚氯酸盐和氯酸盐为公知的强氧化剂。这些物质的氧化能力倾向于随着pH的降低而增加。因此,用于医药用途的市售稳定化的亚氯酸盐制剂(例如WF10和Oxoferin(用于治疗慢性伤口的治疗))通常以高pH水性溶液的形式提供,其含有少量或者不含有可与亚氯酸盐反应或者由于高pH环境(例如由于酯基的水解作用)而分解的有机物质。可使用该策略确保产品具有商业上可接受的架存期,但是就产品副作用而言可能是不利的,并且限制了可研发的产品的种类。
例如,通过静脉内输注给药强碱性溶液(例如WF10)可导致静脉炎(血管炎症),除非缓慢地进行输注,并且仅在WF10用约250-500mL的盐水稀释后进行。鉴于此,WF10的输注通常可能在如1.5小时的时期内给药,这导致患者的不便和大量医疗资源的使用。类似地,在数个国家中批准Oxoferin用于治疗伤口,并且不出意料地,考虑到它的高pH,最常见的副作用之一为疼痛(参见Hinz J,Hautzinger H,Stahl KW.Rationale for andresults from a randomised,double-blind trial of tetrachlorodecaoxygen anioncomplex in wound healing.Lancet.19864月12日;1(8485):825-8)。也预料到WF10和Oxoferin的强碱性本质也使其不适合其它部位的给药,例如给药至肺部递送模式所靶向的肺泡的脆弱上皮细胞。
药物剂型研发领域的技术人员也会理解亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物与许多有机物质的共同配制的困难可造成不期望的限制。例如,当一些敷料(dressing)材料用Oxoferin浸透时不表现长期稳定性,这使研发如预负载有Oxoferin的袋形伤口愈合敷料的产品是挑战性的。研发包含多于一种活性药物成分的药物产品也是常见作法,会预计到如果活性剂与含有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的溶液混合,许多活性剂不会表现出商业上可接受的稳定性。
认为WF10通过其对巨噬细胞的作用来发挥其治疗益处(参见McGrath,Kodelja,V.Balanced macrophage activation hypothesis:a biological model fordevelopment of drugs targeted at macrophage functional states.Pathobiology,67,277-281(1999))。另一方面,WF10经常以非常接近可能出现毒副作用的限度的剂量给药。例如,在WF10对患有晚期AIDS患者的试验中,使用0.5mL/kg的WF10剂量,因为在之前的使用0.1mL/kg至1.5mL/kg的剂量范围的剂量范围试验中,接受大于0.5mL/kg的患者中表现静脉炎、高铁血红蛋白水平升高以及红细胞(RBC)谷胱甘肽还原酶水平降低,因此认为0.5mL/kg是最大耐受剂量(参见Raffanti,S.P.,Schaffner,W.,Federspiel,C.F.,Blackwell,R.B.,Ah Ching,O.,Kühne,F.W.Randomized,double blind,placebo-controlled trial of the immune modulator WF10in patients withabvanced AIDS.Infection,Vol.26,4,201-206(1998))。
也已研究(WF10形式的)OXO-K993对由患有晚期颈板瘤的患者的放射疗法引起的并发症的治愈和预防中的作用(参见Rattka,P.,Hinz,J.Influence of TCDO on the results of radiotherapy in advanced collumcarcinoma stage IIIB.Abstract:Int.Symp.on Tissue Repair,Pattaya,Thailand,Dec.6-8(1990)in:Highlights-International Symposium on Tissue Repair,30-31(1990))。在该研究中,在照射治疗组的患者1.5小时前给药WF10,并且该论文作者得到了以下印象:照射前给予WF10治疗显著增加辐射期间对肿瘤组织的生物学作用。对于这样的治疗,具有将稳定化的亚氯酸盐制剂靶向至肿瘤组织的方法是期望的,但是不幸地,静脉内给药稳定化的亚氯酸盐(如WF10)的溶液制剂是困难的。
在其中外相基本上不含这些药剂的制剂的脂质体中包封亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的能力具有很多优势。例如,含有脂质体的组合物的外相也可含有与亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物不相容的物质(如有机物质),其包括例如特定活性药物成分或者赋形剂。所述脂质体制剂也可分散于固体基质中,否则所述固体基质与如施用于伤口的敷料材料的这些物质不容易相容。类似地,可有利地利用制备大约中性pH的不含亚氯酸盐或氯酸盐的外相的能力以减少当向身体静脉内或局部给药高pH溶液剂时观察到的副作用(如静脉炎和疼痛)的发生,并使亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物可以通过新的给药方式(例如肺部途径)递送。
也会理解可将脂质体的结构设计为优选被巨噬细胞循环清除,巨噬细胞被认为是基于亚氯酸盐或氯酸盐的药物的作用部位。例如,脂质体可降低亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物实现给定治疗效果所必须的剂量,并且可改善药剂的安全界限。或者,脂质体可用于在不诱发不可接受的毒性下,增加亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的药理作用。
或者,可将脂质体设计为递送至除巨噬细胞的靶点。例如,可应用如化疗药物Doxil(盐酸多柔比星脂质体注射剂,Centocor Ortho BiotechProducts LP)中所使用的技术以靶向患者体内的肿瘤。当期望使用亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物作为放射疗法前的敏化剂时,应用这样的靶向作用可以是有利的。
因此,本申请还包括本文中所述脂质体和含有所述脂质体的组合物的所有用途,以及包括这些实体的方法。在特定实施方案中,本申请包括本申请的脂质体或组合物作为药物的用途。
通过将活性物质并入脂质体中可改善所述活性物质的益处。改善的脂质体组合物的特性包括:例如改变的药物代谢动力学、生物分布和/或对亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的保护。通过提供持续释放制剂,也可降低给药药剂的频率或提供更快的输注速率。用本申请的脂质体组合物也可向肺部的巨噬细胞或者向发炎组织靶向递送亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。通过向靶位靶向递送,可以降低剂量,例如,按约1至约1000的系数降低。益处还可包括减少当向身体静脉内或局部给药高pH亚氯酸盐溶液剂时观察到的副作用(如静脉炎和疼痛)的发生,并使药剂可以通过新的给药方式递送,例如通常需要较低剂量体积的肺部途径或弹丸注射,如在短时间(例如小于30分钟、小于15分钟、小于5分钟)内静脉内递送组合物。
本申请的脂质体的一个具体优势为通过改变脂质膜的组成调整所包封的药剂的释放时间的能力。因此所包封的一种或多种药剂的释放时间可以通过选择具有期望的温度释放曲线的脂质的组合来控制。例如,对于伤口愈合应用,可选择脂质使得释放温度为或者接近皮肤温度,并且将脂质体向皮肤给药导致当组合物达到皮肤温度时小量或逐步释放,此时大量药剂释放。
因此,本申请还包括治疗给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况的方法,其包括向需要其的个体给药有效量的本申请的组合物。
本申请还包括本申请的组合物用于治疗给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况的用途,以及用于治疗给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况的本申请的组合物。
在一个实施方案中,本申请包括调节巨噬细胞功能的方法,其包括向需要其的个体给药有效量的本申请的组合物。本申请还包括本申请的组合物用于调节巨噬细胞功能的用途,以及用于调节巨噬细胞功能的本申请的组合物。
不受理论束缚,调节巨噬细胞功能与治疗由于不适当的免疫应答产生慢性炎症的症状的疾病有关(参见例如第2011/0076344号美国专利申请公开)。因此,在一实施方案中,所述给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况选自可由抗原特异性免疫应答引发的那些,例如,自身免疫病和由不适当的免疫应答引起的疾病,如重症肌无力、系统性红斑狼疮、血清病、糖尿病、类风湿关节炎、幼年型类风湿关节炎、风湿热、干燥综合征(Sjorgen syndrome)、系统性硬化病、椎关节病变、莱姆病、结节病、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性多腺性疾病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化、炎性肠病、结肠炎、克罗恩氏病、慢性疲劳综合征等。至少在一些患者中,慢性阻塞性肺病(COPD)也可能具有一些自身免疫病因。在自身免疫反应中,患者身体产生过多的细胞毒性T-淋巴细胞(CTL),或者其它变为针对自身健康细胞并破坏它们的细胞因子。有接受移植(transplant)或移植(graft)的患者中,由于免疫系统将移植的器官或者移植物的抗原识别为外来的并因此要破坏它们,因此产生不适当的免疫应答。这导致移植物排斥。同样地,当移植的器官或者移植物的免疫系统将宿主的抗原识别为外来的并要破坏它们,接受移植(transplant)和移植(graft)的患者可产生移植物对抗宿主的反应。这导致移植物抗宿主病。在变应性哮喘、变应性鼻炎和特应性皮炎中观察到其它不适当的免疫应答。此外,产生慢性炎症症状的疾病也涉及不适当的免疫应答,其特征在于过度的巨噬细胞活化。例如,对组织损伤(如身体的伤口)或病原性生物(如细菌或病毒)侵入的健康反应涉及巨噬细胞的活化(通过“常规的”促炎途径)并导致炎症应答。但是,如果促炎免疫应答不能被抑制,该应答可能以不适当的方式“超调”,导致慢性炎症。如乙型肝炎和丙型肝炎、慢性肝炎以及COPD的表现(如明显由长期暴露于非特异性支气管和肺部刺激物所导致的阻塞性支气管炎和肺气肿)的疾病的特征在于由过度的巨噬细胞活化引起的慢性炎症(肝炎中肝部的慢性炎症以及COPD中肺组织的慢性炎症)。
其它给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况选自肿瘤性疾病(癌症)、HIV感染、AIDS、神经变性疾病、AIDS相关的痴呆、中风、脊髓病状、微生物感染及其它病毒感染。
神经变性疾病的实例包括例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)和多发性硬化(MS)。所述癌症可为但不限于肾上腺皮质癌、直肠癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、中枢神经系统(CNS)癌症、周围神经系统(PNS)癌症、乳腺癌、卡斯尔曼病、宫颈癌、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肿瘤家族(如尤文氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、多毛细胞白血病、霍奇金氏病、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、小儿白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病、肝癌、肺癌、肺类癌瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、男性乳癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生病、鼻腔和鼻侧癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤(成人软组织癌)、黑色素皮肤癌、非黑色素皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(如子宫肉瘤)、阴道癌、外阴癌和Waldenstrom's巨球蛋白血症。
在一实施方案中,所述给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的疾病、病症或病况选自变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、肿瘤性疾病、HIV感染及AIDS。在一实施方案中,所述肿瘤性疾病或者癌症为胃肠道、头、颈、乳腺或者胰脏的癌症。
其它给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物是有益的治疗应用包括对遭受放射综合征或者暴露于环境毒素的患者的治疗。所述放射综合征可包括由放射疗法或者如战斗或恐怖袭击中使用的核武器所导致的急性放射综合征或辐射照射的迟发效应。也考虑到对于伤口愈合的治疗应用,所述伤口愈合包括压力、术后的或创伤后的伤口愈合,或者如在如糖尿病性溃疡、静脉溃疡、动脉溃疡或褥疮溃疡中的慢性伤口愈合。
可使用任意合适的途径向个体给药本申请的组合物及其制剂,所述合适的途径例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、皮下给药、真皮内给药、关节内给药、鞘内给药、脑室内给药、直肠给药、眼部给药、作为鼻腔喷雾剂通过肺部吸入给药和口服给药,以及本领域技术人员已知的其它适合的给药途径。可使用本申请的方法和用途来治疗的组织包括但不限于鼻、肺、肝、肾、骨、胰腺、再生性软组织、肌肉、肾上腺组织和乳腺。可治疗的组织既包括癌性组织,其它患病的或受损(compromised)组织,也包括如果如此期望的健康组织。
进一步明确,术语“本申请的组合物”指本文中所述的脂质体组合物,其为所制备的形式或者与另外的载体和/或其它成分组合。
本申请的组合物及其制剂被单独使用或者与其它治疗形式(例如辅助性癌症疗法、综合治疗(combined modality treatment))联合(例如,之前、与其并行或之后)使用。例如,与其它治疗剂(例如,本文中所述和本领域技术人员已知的癌症化疗剂(如烷化剂、抗代谢药、紫杉烷、代谢抑制物、抗肿瘤抗生素、植物碱、激素治疗药物、分子靶向药物等))、外科手术和/或放射疗法组合。如果被治疗的病况为癌症,本文中所述组合物及其制剂可以与一种或多种如本文中所述和本领域已知的其它抗癌药或细胞毒性化合物、一种或多种用于降低副反应和/或其临床表现的发生和/或严重性的额外的药剂、外科手术(例如用于移除肿瘤或淋巴结等)或放射联合给药。其中一种或多种外科手术或者放射为治疗方案的一部分,所述组合物或者其制剂可在放射疗法或者外科手术之前、与其并行或者之后给药。同样,本文中所述的组合物及其制剂可在给药一种或多种抗癌药之前、与其并行或者之后给药。本文中所述组合物及其制剂也可与减轻与病况或者治疗方案有关的药物(如减少呕吐、脱发、免疫抑制、腹泻、疹、感觉障碍、贫血、疲劳、口炎、手足综合征等的药物)联合(例如,之前、与其并行或之后)给药。所述组合物也可在治疗方案(如手术后,以及与放射疗法并行和之后等)的多于一个阶段(包括全程)给药。在一个实施方案中,将本申请的组合物或其制剂与5-氟脲嘧啶及其前药(如卡培他滨)中的一种或两者联合给药。
在本申请的另一实施方案中,当所述组合物及其制剂用于治疗变应性哮喘或者变应性鼻炎,或者其它肺部或者呼吸系统疾病、病症或病况时,通常将它们通过静脉内途径或者跨黏膜(transmucosally)(更具体地,经鼻、经眼或经肺)给药。例如,可将本申请的组合物以鼻腔喷雾剂、滴鼻剂和/或滴眼剂的形式给药。也可使用任意电动或者气动喷雾器通过喷雾疗法将本申请的组合物以精细的雾的形式向肺部给药。对于鼻腔粘膜给药,可使用任意最先进的适合用于制备水性脂质体组合物的喷雾的设备。本申请的组合物及其制剂被单独使用或者与其它用于变应性哮喘和变应性鼻炎的治疗形式联合(例如,之前、与其并行或之后)使用。例如,与本领域技术人员已知的其它治疗剂(例如类固醇和抗组织胺药)组合。也可将本申请的组合物在使用前缓冲或稀释,例如在通过静脉内输注前用合适的稀释剂(如盐水)缓冲或稀释。
在本申请的另一实施方案中,当所述组合物及其制剂用于治疗特应性皮炎或其它皮肤疾病、病症或者病况时,通常将它们例如以洗剂、搽剂、胶冻剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、水凝胶剂、气雾剂、喷雾剂、散剂、颗粒剂、粒剂(granulate)、锭剂、栓剂、油膏剂(salve)、口香糖、软锭剂(pastille)、囊剂、漱口药、片剂、牙线、硬膏剂、绷带、板、泡沫剂、膜剂、海绵、敷料、浸液剂(drench)、生物吸附性贴剂、棒剂(stick)等的形式局部或者经皮给药。本申请的组合物及其制剂被单独使用或者与其它用于特应性皮炎的治疗形式联合(例如,之前、与其并行或之后)使用。例如,与本领域技术人员已知的其它治疗剂组合。
V.制剂和给药
如之前所述,将本申请的组合物和药物制剂向需要其的个体按照本文中所述的使用方法给药,以治疗本文中所述的病况。
所述脂质体组合物可以其自身给药,也可以药物组合物或者制剂的形式给药。因此本申请还包括含有包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体与至少一种生理学上可接受的载体或者赋形剂混合的药物组合物。在一个实施方案中,所述药物组合物提供持续释放的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物,因此其包括持续释放的制剂。
如上所述,将所述脂质体组合物或者其药物组合物或制剂使用任意合适的途径向个体给药,所述途径例如静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、皮下给药、真皮内给药、经皮肤给药、皮内(epicutaneous)给药、关节内给药、鞘内给药、脑室内给药、作为鼻腔喷雾剂通过肺部吸入给药和口服给药,以及本领域技术人员已知的其它合适的给药途径,并将其相应地配制。
根据给药方式,所述药物组合物可以为液体、固体或者半固体剂型的制剂。例如,所述组合物可以配制为溶液剂、分散剂、混悬剂、乳剂、合剂、洗剂、搽剂、胶冻剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂(包括牙膏)、凝胶剂、水凝胶剂、气雾剂、喷雾剂(包括口喷雾剂)、散剂(包括牙粉)、颗粒剂、粒剂、锭剂、栓剂、油膏剂(salve)、口香糖、软锭剂(pastille)、囊剂、漱口药、片剂、牙线、硬膏剂、绷带、板、泡沫剂、膜剂、海绵、敷料、浸液剂、生物吸附性贴剂、棒剂(stick)、片剂、口含片剂、糖锭剂(troches)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂(wafer)、修饰释放片剂等。
本申请的药物组合物可以根据一般药学实践(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences(2000-20th edition)以及在美国药典:国家处方集(USP 34NF19)中)进行配制。
本申请的药物组合物中所使用的生理学上可接受的载体或者赋形剂可由本领域技术人员根据具体用途常规选择。所述载体或赋形剂包括但不限于溶剂、缓冲剂、惰性稀释剂或者填充剂、助悬剂、分散剂或者湿润剂、防腐剂、稳定剂、螯合剂、乳化剂、消泡剂、胶凝剂、软膏基质、渗透促进剂、致湿剂、软化剂和护肤剂。
溶剂的实例为水、醇、植物油、海油和矿物油、聚乙二醇、丙二醇、甘油和液体聚烷基硅氧烷。惰性稀释剂和填充剂可以为蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或者磷酸钠。缓冲剂的实例包括柠檬酸、乙酸、乳酸、氢磷酸(hydrogenophosphoric acid)和二乙胺。合适的助悬剂为例如天然存在的树胶(如金合欢胶、阿拉伯胶、黄原胶和黄蓍胶)、纤维素(如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、藻酸盐和壳聚糖。分散剂或者湿润剂的实例为天然存在的磷脂(如卵磷脂或者大豆卵磷脂)、环氧乙烷与脂肪酸或者长链脂肪醇的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)。
可向本申请的药物组合物中加入防腐剂,以防止可影响制剂的稳定性并导致患者中感染的微生物污染。合适的防腐剂的实例包括对羟苯甲酸酯(例如羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、对羟基苯甲酸酯、羟苯丁酯、羟苯异丁酯和羟苯异丙酯)、山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、溴硝丙二醇、bronidox、MDM乙内酰脲、碘丙炔正丁胺甲酸酯、苯扎氯铵(benzalconium chloride)、西三溴胺和苯甲醇。螯合剂的实例包括EDTA钠和柠檬酸。
乳化剂的实例为天然存在的树胶、天然存在的磷脂(如大豆卵磷脂、山梨聚糖单油酸酯衍生物)、山梨坦酯、单脂肪酸甘油酯、脂肪醇和脂肪酸酯(如脂肪酸的甘油三酯)。消泡剂通常促进生产,它们通过使空气-液体界面不稳定并使液体从气袋中流出来使泡沫消散。消泡剂的实例包括西甲硅油、二甲硅油、乙醇和乙醚。
凝胶基质或增粘剂的实例为液状石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶体硅或胶体铝、甘油、丙二醇、羧乙烯基聚合物、镁-铝硅酸盐、亲水性聚合物(如淀粉或纤维素衍生物)、水可溶胀的水胶体、角叉菜胶、透明质酸盐和藻酸盐。适用于本申请的组合物的软膏基质可以为疏水性的或者亲水性的,并且其包括石蜡、羊毛脂、液体聚烷基硅氧烷、鲸蜡醇、鲸蜡醇棕榈酸酯、植物油、脂肪酸的山梨坦酯、聚乙二醇和脂肪酸的山梨坦酯、环氧乙烷之间的缩合产物(例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)以及聚山梨酯。
致湿剂的实例为乙醇、异丙醇甘油、丙二醇、山梨糖醇、乳酸和尿素。合适的软化剂包括胆固醇和甘油。护肤剂的实例包括维生素E、尿囊素(allatoin)、甘油、氧化锌、维生素和防晒剂。
在一个实施方案中,本申请的组合物储存于低于约10、9、8、7或6℃,合适地低于约6℃的温度下。
在另一实施方案中,本申请的组合物为冻干的或冷冻干燥的。脂质体冻干的技术是公知的,例如Chen等人(J.Control Release 2010年3月19日;142(3):299-311)总结了决定冷冻干燥的脂质体的冻干保护效果的关键因素。
本申请的组合物通常会以有效达到所期望的结果的量使用,例如,以有效治疗或者预防所治疗的具体病况、疾病或者病症的量使用。本领域技术人员容易确定使用本申请的组合物和脂质体向个体给药的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的剂量和/或比例。在一个实施方案中,与使用治疗相同疾病或病症的标准给药方案所给药的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的有效量相比,所给药的包封于治疗疾病或病症的脂质体制剂中的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的有效量降低约1至约1000的系数。
在一个实施方案中,将本申请的组合物或其制剂在延长的时间内(例如大于约1分钟至数小时,如2、3、4、6、24个小时或者更多个小时)静脉内给药。
在一个实施方案中,治疗为每天给药一次。在另一实施方案中,治疗为每天给药两次。在另一实施方案中,治疗为每天给药三次。在另一实施方案中,治疗为每天给药四次。在另一实施方案中,治疗为每天给药1-2次,持续持续一、二、三、四、五、六或七天。在另一实施方案中,治疗为每天给药至少一次,持续更长的时期,如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在另一实施方案中,治疗为每天给药至少一次,直到病况改善至不需进一步治疗。在另一实施方案中,治疗提供活性的持续释放并需要更低频率地给药,例如,每周一次、每月一次、每六个月一次、每年一次、每两年一次或者每五年一次。在另一实施方案中,给药所述脂质体组合物后,疾病或者病症的持续时间减少,例如六个月、一年或者两年。
在另一实施方案中,治疗为每周给药至少一次。在另一实施方案中,治疗为每周给药两次。在另一实施方案中,治疗为每周给药三次。在另一实施方案中,治疗为每周给药四次。在另一实施方案中,治疗为每周给药五次。在另一实施方案中,治疗为每周给药六次。在另一实施方案中,治疗为每周给药一至六次,持续一、二、三、四、五、六或七周。在另一实施方案中,治疗为每周给药至少一次,持续更长的时期,如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在另一实施方案中,治疗为每周给药至少一次,直到病况改善至不需进一步治疗。
在另一实施方案中,治疗可以使用输液泵连续地、间断地或者患者控制地输注形式给药。在一个实施方案中,输液泵用于静脉内给药所述治疗。
VI.实施例
实施例1:制备鞘磷脂/WF10脂质体
将2700μL的鞘磷脂(鸡蛋SM(MW 703.3),Avanti Polar Lipids,Alabama,USA)溶液(在氯仿中的25mg/mL溶液=67.5mg,0.095mmol SM)加入至装有1/3氯仿的圆底烧瓶(通常为25mL)中。将溶液蒸发至干燥,以提供在烧瓶内表面上的薄的、清晰可见的脂质膜。
加入4800μL的WF10(0.095mmol/4.8mL),并将烧瓶在涡旋混合器中,于大约45℃(高于脂质的相变温度)下摇动。当薄膜不再可见时停止涡旋。在该步骤中脂质的再水合导致为大多层囊泡(LMV)的脂质体的形成。WF10在脂质体的内部(内相)和外部(外相)中。
为减小初级脂质体的尺寸,将所述混合物反复冻融。使用液氮作为冷冻剂,并将其在通常为45℃的水浴中融化,在约30至40分钟的总持续时间内,使冷冻/融化循环重复10次。冷冻导致初级脂质体的破坏。融化在高于相变温度下进行。这样,小于初级脂质体的脂质体再次自发地形成。由于给定的温度方案(-180℃/45℃),所有样品均远高于室温,持续约20分钟。
然后将上述混合物(大约5mL)反复通过(相同的)100nm孔隙宽度的盘式滤器进行挤压。使用带有加热夹套的不锈钢隔室和叠放两层的100nm的盘式滤器(但是也可使用单一滤器)。对于SM的工作温度为45℃。使用30bar的氮气来实现挤压,重复挤出10次,已知这得到为相对一致的直径的单层囊泡。包合率为大约2%至3%,理论上可能为7%。
将挤出的混合物(外相:WF10,内相:WF10)分离至3个透析室中。将所述室放置以漂浮在0.9%的氯化钠溶液中。所用透析室为“Slide-A-LyzerDialysis Cassettes,20K MWCO”,其最大体积为3mL,至多可渗透20kDa。将脂质体混合物(1mL)置于内室中,并且外部介质为NaCl 0.9%(盐水,1L)。将该过程用新鲜的盐水重复4次。其余的脂质体混合物(大约5mL-3×1mL透析的)用于磷酸酯的测定和DSC
在透析阶段结束时,脂质体制剂的外相由0.9%的氯化钠溶液(盐水)构成。目的是使外相中的亚氯酸盐和氯酸盐的浓度低于定量所使用的方法的检出限。通过这样做,可通过监测这些离子的重现来测试脂质体的渗漏性质。
实施例2:制备POPC/WF10脂质体
使用如实施例1中所述的方法,并且挤出步骤的工作温度为室温(不连接加热夹套),制备由POPC制成的并含有WF10的脂质体。
实施例3:制备POPC:POPG/WF10脂质体
使用如实施例1中所述的方法,并且冷冻/融化的工作温度为35℃,挤出步骤的工作温度为23℃,制备由1-棕榈酰-2-油酰-sn-3-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1’-消旋-甘油)(POPG)(3:1、2:1和1:1)制成的并含有WF10的脂质体。POPG得自Avanti Polar Lipids,Alabama,USA。
实施例4:制备DPPC/WF10脂质体
使用如实施例1中所述的方法,并且挤出步骤的工作温度为45℃,制备由1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)制成的并含有WF10的脂质体。DPPC得自Avanti Polar Lipids,Alabama,USA。
实施例5:制备DMPC/WF10脂质体
使用如实施例1中所述的方法,并且挤出步骤的工作温度为30℃,制备由1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)制成的并含有WF10的脂质体。DMPC得自Avanti Polar Lipids,Alabama,USA。
实施例6:另外的制备方法
(a)脂质的蒸发
将溶解于氯仿中的脂质加入至100mL的圆底烧瓶中。在多数情况中,已购买的脂质是溶液的形式,代表性浓度为约25mg/mL。通常将以粉末形式递送的脂质在加入烧瓶前溶解,使其具有相似的浓度。然后将所加入的脂质总量通过体积控制。对于14mL的40mM样品,代表性的量为300-400mg。然后,将烧瓶装在Buchi`RotavaporTM R-210'旋转蒸发仪上,抽真空同时在37℃的水浴中以15rpm旋转。在此操作期间,烧瓶中的压力降低至约5-15mbar的值。当全部溶剂被移除,并且在烧瓶中不能闻到氯仿的气味时,认为蒸发结束。在该阶段的结果为瓶壁上有可见的脂质膜,并且(取决于脂质的量)烧瓶底部有额外的蓄积的松散粉末。
(b)水合作用
在水合步骤期间,将脂质在水性介质中悬浮,随后将其包封于最终的脂质体中。已知在此步骤期间形成多层囊泡(MLV)。首先,将必要量的WF10介质加入至圆底烧瓶中。其体积与所期望的总样品体积(通常约8-14ml)相当。所得到的为含有大脂质聚集体的浑浊溶液。然后,准备温度比脂质的脂质相变温度(PTT)高5K的水浴,在此期间轻轻摇动烧瓶。一达烧瓶中的温度达到PTT,悬浮液变成均匀的乳白色液体。在高于PTT的温度下大约5分钟后,将脂质膜从烧瓶壁移除,并且在底部无脂质粉末残留。最后,将烧瓶用涡旋混合器摇动数秒。立即将仍然热的样品送至挤出装置,以开始下一制备步骤或者将其在冰箱温度下储存直到该进行下一制备步骤时。
(c)挤出
在挤出步骤期间,将样品通过220nm的滤片反复挤压。这迫使大囊泡重组,并形成具有更少层的较小结构。通常这得到单层囊泡,然而,对于较大的孔径(如220nm),仍可能得到多层囊泡,但其仅具有数层。在挤出步骤前,将挤出机装备上3个层叠的220nm滤片(Millipore GPWP,直径25mm),并将其加热至比LPTT高5K的温度。将脂质悬浮液装入挤出室,然后向室施加25bar的压力,迫使样品通过滤器。通过压缩氮气施加压力。在挤出机的排出口处收集样品。整个挤出进行至少10次。
(d)透析
在该阶段,脂质体已处于其最终状态,但是仍然悬浮于WF10溶液中。为了将外部WF10介质用0.9%盐水溶液代替,进行了一系列连续的透析步骤。首先将样品引入Thermo Scientific Slide-A-LyzerTM透析框架中。所述框架的膜的分子量截留为20,000Da并且容量为3-12mL。对于体积大于6mL的样品,将样品分流并分配至两个这样的框架中,将二者放置在相同的烧杯中。透析装备包括置于磁力搅拌装置上的装有0.9%盐水溶液的1L玻璃烧杯。盐水溶液通常由去离子水和标准的实验室NaCl(最低纯度99%)制成,并且其体积为约900-950mL。将所述框架浸没在透析介质中,持续大约1小时,然后对于随后的步骤,将介质用新鲜的介质置换。通常取所述透析介质的少量样品用于“邻联甲苯胺快速检查”,其与通常的邻联甲苯胺分析方法相似。当样品呈现深黄色时,在之前置换介质。也进行这样的快速检查来测定透析系列的终点。当测试期间两个连续的透析步骤未表现可见的颜色变化时以及透析持续一小时后,认为透析完成。在每个透析步骤后,置换透析介质,直至进行至少5个步骤。在最后的步骤后,将样品在大约6℃下储存,以供进一步使用。
实施例7:用于检测亚氯酸盐和氯酸盐的邻联甲苯胺法
方法A
该邻联甲苯胺法包括将50μL的155mg邻联甲苯胺在200mL水和67mL 12M盐酸的混合物中的溶液加入至200mL的过量介质中。将该混合物制备两次。分别加入250μL的4.8M或12M盐酸,并将混合物孵育5-10分钟。使用较低浓度的盐酸仅能检测亚氯酸盐,而使用较高浓度的盐酸还能检测氯酸盐。分别在442nm(4.8M HCl)或445nm(12M HCl)下测量测试溶液的吸收。使用由未处理的WF10制备的标准稀释来确立校正曲线。
方法B
方法B为方法A的改进,所述改进在于方法B可以检测亚氯酸盐和氯酸盐二者。所述方法包括将114mg的邻联甲苯胺在150mL水中溶解,加入50mL的盐酸(37%),以制备邻联甲苯胺溶液。要在首次使用之前至少24小时制备邻联甲苯胺溶液,并且其可在6℃下储存数月。注意在开始分析步骤后要同时测量所有的样品,以避免在制备分析混合物后立即发生的漂白的影响。设计分析方案以同时分析至多96个样品,并以确保那些能力的方式选择时间。在分析步骤开始时,将400μL的待分析样品装入标准2mL反应容器。在时间t0时,向各反应容器中加入100μL的邻联甲苯胺溶液。十分钟(t0+10min)后,加入500μL的盐酸(37%)。再过10分钟(t0+20min)后,将200μL的各容器中的样品转移至标准96孔板中,用于测量在447nm波长下的吸光度。这些测量在TECAN Infinite 200PROTM酶标仪上进行,并且在15分钟(t0+35min)后开始。
在计算中,WF10在储存介质中的浓度由反稀释因子d表示。该量表示每体积的储存介质中未稀释的WF10的体积。因此,它是无量纲的,对于未稀释的WF10,d=1。
为了将所测量的吸光度值与特定反稀释因子相关联,记录WF10的稀释曲线。所述曲线如图1中所示。对于d大于大约6×10-5的值,数据显示强线性相关,并且发现相应方程:
d(A)=mA+n   (1)
中的参数为m=(3.87±0.02)×10-4并且n=(7±2)×10-6。对于低于所述值的浓度的非线性域使用以下方程拟合:
d(A)=α│A–A0P   (2)
其中A0=0.0787±0.0007,α=(3.36±0:05)×10-4并且p=0.631±0.009。在两种情况中,根据数据点的不确定性对拟合加权。为了考虑吸收度值的相对大的不确定性,还使用反函数进行反数据集的拟合。所呈现的参数为两个结果的算术平均值。
由所测定的储存介质中反WF10稀释因子d,计算从脂质体内部释放的WF10的量(xWF10)。给出样品体积V样品以及储存介质的体积V储存,使用以下方程计算d的值:
因此,
xWF10=d(V样品+V储存)   (4)。
当然,这仅在渗漏的物质已与样品介质和储存介质完全混合后才是正确的。当选择合适的装备时,实验证明这在相对短的时间内发生。当渗漏的物质从实验装备移除时,会产生问题,这在当取部分储存介质用于分析时经常发生。但是,为了将这种移除考虑在内,在计算当前稀释因子中,需要考虑所有之前的测得量。在这样的隐式(implicit)测定中,随每次新的浓度测定,会积累所有误差和不确定性,这使得一个单独的坏数据点会改变所有后续的实验测得量。因此使用显式(explicit)途径,其中仅考虑当前分析步骤的d和V储存,并且忽略在之前分析步骤中取出的物质。然而,可忽略的最大可能量被加入至不确定性中。与由其它因素产生的不确定性相比,该由隐式方法简化的显式途径的偏差通常较小。尽管如此,在每个评估过程期间进行交替计算,以单独检验方法对于各情况的用途。
方法C
该方法为方法A的另一改进,所述改进在于方法C可检测亚氯酸盐,但不能检测氯酸盐。在使用其之前至少24小时制备邻联甲苯胺溶液要。将其在暗处,于6℃下储存,其稳定持续数月。首先,通过将50mL浓(37%)盐酸加入至150mL H2O(在该阶段使用高纯水)中来制备临时HCl溶液。然后,使用临时HCl溶液,将58mg的邻联甲苯胺(二盐酸化物,H2O含量1.5mol/mol,285.2g/mol,SiGMA Prod.No.:T-6269)冲入100mL容量瓶中。将烧瓶填满(100mL)。摇动该溶液,然后将其装入棕色玻璃瓶中。24小时后,溶液为无色,并且在烧瓶底部发现一些沉淀。
在测量前现制备4.8M的盐酸。其通过将40mL浓盐酸(37%)加入至60mL H2O中制备。
反应导致样品的颜色变化,其可通过吸光度测量来检测。但是,在反应开始后立即开始褪色,所以在该方法中时间是一重要的参数。按照每次能够分析至多96个样品的时间表进行。开始时,将400μL的各样品装入1.5mL的反应容器中。然后向所述容器中加入100μL的邻联甲苯胺溶液。在开始加入邻联甲苯胺15分钟后,向各容器中加入500μL的4.8M盐酸。然后将350μL各样品从反应容器中转移至透明的96孔板(带盖子)的腔中。另外25分钟后,通过记录在442nm处的吸光度,开始样品的光度测量。
将所记录的吸光度值与在相同条件下记录的已知浓度的标准曲线对比。在2μΜ-60μΜ的亚氯酸盐浓度下,吸光度与亚氯酸盐浓度的相关性为线性的。
渗漏监测
所有渗漏监测实验的基本目的是检测从脂质体内部释放的物质。这类实验的通用方法与实施例6(d)中描述的透析方法相似。从样品中的脂质体释放的物质进入围绕的样品介质,并且其可容易地穿过透析膜,这使得围绕透析框架的储存介质含有一定浓度的渗漏物质。对于渗漏的亚氯酸盐/氯酸盐,使用上述邻联甲苯胺法来定量或者定性测定渗漏。从该浓度,使用下述计算可测定渗漏物质的总量。以下是清楚的:该浓度随着储存溶液的体积增加而降低,因此选择相对少的储存溶液。但是为了测定渗漏物质的浓度,通常需要1mL的储存介质,因此需要至少十或者二十毫升的储存体积。
实施例8:实施例1-5中的脂质体的稳定性
制备脂质体后,将样品留在透析框架中,然后将其置于120mL盐水溶液中用于储存。每间隔1-3天,取1mL的过量介质,并使用邻联甲苯胺法A(实施例7)进行分析。
在全部温度(5℃、23℃和37℃)下的POPC脂质体中均检测到渗漏(参见图2)。在SM脂质体的情况中,仅在37℃下检测到渗漏(参见图3)。其它渗漏实验对POPC/POPG脂质体以及纯DMPC脂质体进行。POPC/POPG混合物(3:1、2:1和1:1)与纯POPC样品表现类似,其在短时间后出现完全渗漏(分别参见图4、图5和图6)。如在第1、5和7日对5℃和23℃下储存的样品所取的光谱仪读数所示(参见图7),DMPC在接近其相变温度(23℃)下渗漏。
另外,重复SM实验,得到如上所述的相同结果(参见图8)。在实验的最后,将所有样品在37℃下放置以监测离子渗漏。发现主要的渗漏在置于37℃后约2小时开始,在置于37℃后4小时完成。
实施例9:制备DPPC、DPPC/DMPC、S_PC3和S_PC3/DMPC的WF10脂质体
使用实施例1中所述方法的修改版本(省略冷冻/融化的步骤;膜的孔径为220nm),脂质体由DPPC、DPPC/DMPC、氢化大豆磷脂(S_PC3)和S_PC3/DMPC制成。成分和挤出温度在表2中提供。DPPC得自Avanti PolarLipids,Alabama,USA,而S_PC3和DMPC得自LIPOID AG。
在DPPC的相变温度(41℃)下检测由DPPC脂质体的渗漏(参见图9)。在38℃(比DPPC的相变温度(41℃)低3度)下,脂质体是紧密的。DPPC:DMPC 9:1在38℃(低于DPPC的相变温度(PTT))下渗漏。其它渗漏实验对S_PC3脂质体和S_PC3:DMPC 3:5脂质体进行,在60℃下检测到S_PC3脂质体的渗漏(表2)。
实施例10:MALDI-TOF MS测量以寻找可能的降解产物
制备和实验-样品
使用实施例6中所述的方法制备3种样品。对于所有样品都使用1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)。将样品如下命名:
SX123:普通的WF10
SX124:PBS缓冲的WF10
SX125:牛磺酸缓冲的WF10
SX123:
向圆底烧瓶中加入9.2mL的25mg/mL DPPC-氯仿溶液。这对应于233mg脂质的量。DPPC购自Avanti Polar Lipids(产品编号:850355C)。用7.92mL的由OXO-K993制备的WF10(25.03g OXO-K993在250mL溶液中)进行水合。在水合过程中,将样品加热至46℃,持续5分钟。在50℃下进行挤出,并持续19分钟。进行10次连续穿过。将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.001g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续22、40、47、61和71分钟的5个后续步骤,第6步为在6℃的冰箱中过夜进行。
SX124
“WF10/PBS”的制备:将10g OXO-K993用注射用水(WFI)稀释至80g。通过加入磷酸二氢钠一水合物的水性溶液(4.31g/25mL)将pH调节至7.36的即时pH。使用WFI使混合物达到(complete)100g,并且其含有WF10中所存在的浓度的氯化物、亚氯酸盐、氯酸盐和硫酸盐。
向圆底烧瓶中加入9.2mL的25mg/mL DPPC-氯仿溶液。这对应于233mg脂质的量。DPPC购自Avanti Polar Lipids(产品编号:850355C)。用7.92mL的WF10/PBS(使用时pH 7.63)进行水合。在水合过程中,将样品加热至50℃,持续2分钟。在50℃下进行挤出,并持续7分钟。进行连续穿过。将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.001g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续22、40、47、61和71分钟的5个后续步骤,第6步为在6℃的冰箱中过夜进行。
SX125
“WF10/牛磺酸”的制备:将10g OXO-K993用WFI稀释至80g。使用牛磺酸的水性溶液(3.91g/50mL)将pH调节至8.49的即时pH。使用WFI使混合物达到100g,并且其含有WF10中所存在的浓度的氯化物、亚氯酸盐、氯酸盐和硫酸盐。
向圆底烧瓶中加入9.2mL的25mg/mL DPPC-氯仿溶液。这对应于233mg脂质的量。DPPC购自Avanti Polar Lipids(产品编号:850355C)。用7.92mL的WF10/牛磺酸(使用时pH 8.47)进行水合。在水合过程中,将样品加热至50℃,持续4分钟。在50℃下进行挤出,并持续7分钟。进行10次连续穿过。然后将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用44.998g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续22、40、47、61和71分钟的5个后续步骤,第6步为在6℃的冰箱中过夜进行。
储存实验
在2011年12月16日,将样品从透析框架中移出,并将其在6℃下储存直至2011年12月19日。在这一天,移取2mL各样品,将其在单独的容器中于6℃下储存。将另外2mL以相同的方式在室温下(约22℃)储存。将剩余的样品用于不同的目的。在2011年12月19日、2012年1月6日和2012年2月1日,从各容器中移取0.2mL的样品,并将其置于-80℃的冰箱中用于后面的MALDI-TOF测量。
MALDI-TOF MS
使用以下方法,总共制备18个样品用于MALDI-TOF MS测量(3种样品类型,各自在两个温度下储存,全部在三个不同的日期时):
制备前使用560μL 0.9%的盐水溶液和40μL的原始样品(在-80℃下储存)来将样品稀释。然后进行脂质挤出过程。从而将100μL预稀释的样品与200μL氯仿/甲醇混合物(1:1)混合。然后将所得的混合物以800g离心,持续5分钟,这导致可见的相分离。取50μL下层相用于进一步制备。向该体积中加入3.7μL 25mg/mL的DMPC-氯仿溶液和2.5μL 25mg/mL14:0-Lyso PC-氯仿溶液作为标准。然后,真空离心下移除所有溶剂。然后向蒸发的样品中加入100μL的DHB-Matrix(156mg二羟基苯甲酸,1998μL,2μL三氟醋酸)和100μL的氯仿。最后,将1μL所制备的样品置于暖空气流下的金包被靶上。
MALDI-TOF MS测量在autoflex LRF MS谱仪(Bruker Daltronics,Leipzig)上进行。
结果和讨论
在所有18个案例中,所记录的波谱表明绝对没有lyso产物的迹象。术语“lyso”用于指其中两个O-酰基链中之一被移除的磷脂。清楚地鉴定出两种加入的标准以及用于脂质体制备的脂质的信号。在波谱中未发现其它信号。
因此,在6℃或者室温下,在普通WF10的高pH值或者其它缓冲形式的较低pH值下,未发生水解和/或其它降解过程。
实施例11:DPPC和DPPC/DMPC脂质体的长期稳定性试验
样品
分析6种脂质体样品。前三种样品为如实施例10中所述制备的基于DPPC的脂质体样品SX123、SX124和SX125。其余三种样品(样品SX130、SX131和SX132)含有如下所述用9:1(摩尔比)的DPPC和DMPC的混合物制备的脂质体。
SX130:普通的WF10
向圆底烧瓶中加入3.14mL 84.3mg/mL的DPPC-氯仿溶液和2.00mL13.4mg/mL的DMPC-氯仿溶液。这分别对应于264mg和27mg脂质的量。用10.00mL的WF10进行水合。在水合过程中,将样品加热至46±1℃,持续4分钟。然后在46±1℃下进行10次连续的挤出穿过,并总计持续20分钟。然后将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.008g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续46、65、75和174分钟的4个后续步骤,第5步过夜进行。
SX131:牛磺酸缓冲的WF10
向圆底烧瓶中加入3.14mL 84.3mg/mL的DPPC-氯仿溶液和2.00mL13.4mg/mL的DMPC-氯仿溶液。这分别对应于264mg和27mg脂质的量。用10.00mL牛磺酸缓冲的WF10进行水合。在水合过程中,将样品加热至46℃,持续4分钟。然后在46℃下进行10次连续的挤出穿过,并总计持续13分钟。然后将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.010g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续46、65、75和174分钟的4个后续步骤,第5步过夜进行。
SX132:PBS缓冲的WF10
向圆底烧瓶中加入3.14mL 84.3mg/mL的DPPC-氯仿溶液和2.00mL13.4mg/mL的DMPC-氯仿溶液。这分别对应于264mg和27mg脂质的量。用如实施例10中所述制备的10.00mL PBS缓冲的WF10进行水合。在水合过程中,将样品加热至46℃,持续3分钟。然后在46℃下进行10次连续的挤出穿过,并总计持续11分钟。然后将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.015g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续46、65、75和174分钟的4个后续步骤,第5步过夜进行。
长期稳定性(LTS)实验
建立LTS实验以检测数周或者数月期间的脂质体渗漏。因此,以能够平行运行大量实验的方式设计装备。为了该目的,使用市售可得的尺寸为大约(75×110×25)mm3的凝胶染色托盘,使得需要相对少量的储存介质来完全浸没透析框架。提供盖子以在适合的关注的条件下储存它们时紧密地密封托盘。常见的LTS装备包括含有1mL样品的Slide-A-LyzerTM透析框架,其浸没于120mL作为储存介质的0.9%盐水溶液中。透析框架与透析(实施例6(d))中所使用的类似,但是其容量仅为0.5-3.0mL。
储存实验
透析步骤后,将样品从透析框架中移出,并将其在6℃下过夜储存。如上所述准备LTS实验,使用Slide-A-Lyzer透析箱(Thermo Scientific,0.5-3.0mL,20K MWCO)和在标准聚丙烯凝胶染色托盘中的120mL 0.9%盐水溶液。对于各个样品,准备4个单独的LTS装备,各自的样品体积为1mL。将那些装备中的两个在室温下储存,而将另外两个在6℃的冰箱中储存。为了分析外部介质中的WF10浓度以及从脂质体中渗漏的氯酸盐和亚氯酸盐的量,移取400μL的外部盐水介质进一步用邻联甲苯胺法(如实施例7,方法B中所述)分析。下表表明分析样品的取出日期。
评价
根据实施例7方法B中关于将吸光度转化为WF10稀释因子中所定义的方法进行对所记录的吸收数据的评价。为了展示的目的,将WF10稀释因子转换为更方便的量:渗漏的WF10的量作为总样品量的体积分数。因此,1mL样品中2%渗漏的值意指从脂质体内部总共释放20μL的WF10。检出限和定量限在下面的小部分中定义。在以下还提供对于由储存体积引起的不确定性的讨论。
检出限(LOD)
将测量值定义为检出限。定义所述值使得大于此值时,认为可证实介质中亚氯酸盐/氯酸盐WF10的存在。使用0.095的吸光度值,其稍高于0值的不确定范围。该明确的值仅对于根据实施例7方法B进行的测量有效。
定量限
当计算作为样品体积一部分的渗漏的WF10的量时,处理接近LOD的数据点时,经常得到具有不确定性的结果。因此定义第二限值(定量限LOQ),其考虑所有对最终结果的计算有贡献的参数(例如样品的体积和外部透析介质的体积)。这些参数在整个实验中保持恒定,因此得到单一的LOQ,其表明最终结果的总相对不确定性在其值的50%以下。在本研究中,将相当于样品体积的0.61体积%的渗漏的WF10的量定义为LOQ。
结果
所有结果在图10的概览条形图中总结。
在6℃下储存的样品
将冰箱中的样品储存,将DPPC脂质体总计储存200天,将DPPC/DMPC脂质体总计储存121天。对于所述两种类型的脂质体,在储存介质中未检测到亚氯酸盐/氯酸盐。
室温下的样品
将室温下的样品储存,将DPPC脂质体总计储存158天,将DPPC/DMPC脂质体总计储存79天。在全部实例中,在储存介质中检测到亚氯酸盐/氯酸盐,并且其随时间持续增加。
DPPC脂质体
SX123、SX124和SX125的结果保持低于LOD,分别持续至少101天、28天和79天。第二次和第三次测量(第28天和79天)之间的时间相对较长,使得在此期间SX124超过LOD和LOQ。SX123从未超过LOQ,而SX125在储存的第77天和第101天之间超过了LOQ。
DPPC/DMPC脂质体
包封纯WF10的脂质体(SX130)的结果保持低于LOD,持续至少51天。读数从未超过LOQ。对于SX132(PBS)和SX131(牛磺酸),在第22天至51天之间超过了LOD,然后在第51天至79天之间超过了LOQ。
讨论&结论
通过这些LTS实验,可以了解WF10脂质体的长期特性,并证明DPPC脂质体可在6℃下储存且无明显渗漏持续至少200天。这对于DPPC/DMPC脂质体在121天的时间内也是正确的。在室温下,样品在80天后出现渗漏。
实施例12:DPPC脂质体的渗漏特性的表征
当涉及脂质体包封物质的长期储存,要考虑脂质的相变温度(LPTT)。当设计包封亚氯酸盐和/或氯酸盐的制剂时,关于该温度下的渗漏过程的知识是有用的。在本实施例中报道纯DPPC脂质体的渗漏研究的结果。
制备和实验
样品
由1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱,按照实施例6中所描述的制备方法制备两种相似的样品。样品为SX122和SX126,并且其脂质浓度为约40mM。以下给出详细参数:
SX122
向圆底烧瓶中加入12.0mL的25mg/mL DPPC-氯仿溶液。这对应于300mg脂质的量。DPPC购自Avanti Polar Lipids(产品编号:850355C)。用10.22mL的由OXO-K993制备的WF10(25.03g OXO-K993在250mL溶液中)进行水合。在水合过程中,将样品加热至42℃,持续5分钟。在45.4℃下进行挤出,并持续20分钟。进行10次连续穿过,并将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。在900mL的盐水溶液(每5000mL溶液用45.004g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续74、73、38、39和69分钟的5个后续步骤。然后将样品在6℃下储存,以供之后使用。
SX126
向圆底烧瓶中加入14mL的25mg/mL DPPC-氯仿溶液。这对应于350mg脂质的量。DPPC购自Avanti Polar Lipids(产品编号:850355C)。用11.9mL的由OXO-K993制备的WF10(25.03g OXO-K993在250mL溶液中)进行水合。OXO-K993得自Nuvo Research GmbH。在水合过程中,将样品加热至46±3℃,持续4分钟。在46±1℃下进行挤出,并持续12分钟。进行10次连续穿过。然后将样品在冰箱中于6℃下储存持续一周末。在900mL的盐水溶液(0.9%)(每5000mL溶液用45.08g NaCl制备)中进行透析步骤。进行持续78、68、68、85和51分钟的5个后续步骤。然后将样品在6℃下储存,以供之后使用。
HRL实验
设计HRL实验用于监测数小时至最多数天的范围内脂质体的渗漏。可以>5分钟的时间分辨率查看渗漏特性的变化。此外,关注的温度可以0.1K的步长在室温至60℃之间准确调节。
HRL装备包括温度的准确控制和搅拌储存介质的可能性。使用500mL的量筒作为储存容器,其装有200mL 0.9%的盐水溶液作为储存介质。如在LTS装备中所进行(实施例11),将样品引入Slide-A-LyzerTM透析框架,然后将其浸没在储存溶液中。如在透析期间所进行,也将框架用泡沫燕麦浮子托起。磁力搅拌器持续搅拌储存溶液。将量筒置于Julabo U3/B加热浴中,其以约0.1K的精度控制温度,持续<12小时,并以0.3K的精度控制温度,持续>12小时。用精度为约0.1K的官方校准的温度计监测温度。该装备能够监测两个在单独的储存筒中的样品。通常观测两个相同的样品,以提供可靠的数据。
进行以下HRL实验:
结果和讨论
实验结果如图11-15中所描绘。在此将WF10的渗漏量相对于从实验开始后经过的时间绘图。也将温度在右手边的Y轴上显示。将渗漏的WF10的量以总样品体积的分数的形式给出,即例如对于1mL样品2%的值相当于从样品脂质体总计释放20μL的WF10。
如前述,通常每个实验每次用两个单独的相同样品进行。在图中将所述样品称为“样品A”和“样品B”。
在39℃下开始渗漏
在数小时的时间尺度上,在高于38℃的温度下开始明显的渗漏。图11显示温度扫描的结果。将温度保持为38℃持续约3小时,在外部介质中WF10的浓度无可测量的变化。然后将温度升高1K,导致在仅数分钟内WF10从脂质体中渗漏。进一步加热至约50℃,使渗漏速率增加。
然而,图12显示在38℃下持续5天的HRL实验的结果,其表明总样品体积的大约2.5%的轻微渗漏。该样品(SX122)的最大容量在8-9%的范围,这样此时只释放三分之一的包封量。
在39℃下部分渗漏
图13显示39℃下的HRL实验。可见在大约4小时后,释放总样品体积的约2%体积的WF10。此后,未出现渗漏,甚至在将实验装备留在39℃下过夜后。只有在进一步加热后,其余的包封WF10泄露,直至释放样品体积的约6-7%的体积。
高于39℃下的渗漏
图14和图15分别说明在40℃和41℃下的HRL实验结果。在约4小时的时间释放全部量的包封的物质。
包封体积
发现SX122中脂质体所包封的体积为样品体积的大约8-9%。对于SX126,其为6-7%,因此更低。虽然样品经历相同的制备步骤,具有几乎相同的参数,其差异不可忽略。
稳定性
对于两种样品,从制备到最后的实验之间的时间为大约一个月,期间在6℃下于储存容器中没有发生渗漏。因此,可以断定在不断冷却下,DPPC脂质体稳定持续至少一个月。
实施例13:4周稳定性研究
(a)溶液的制备和表征
关于渗透应力的考虑
由于它们的不理想的特性,不能由盐溶液的摩尔浓度以必须的精度计算它们的“真实”(实验的)渗透压。因此预计溶液渗透压(重量摩尔渗透压浓度)的实验值会由理论值(渗量)偏离-5%至-10%。对于盐水(0.9%氯化钠)的渗量所报道的代表性理论值为308mosmol/L。这应对应于310.8mosmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。通常假设这会是“真实”值。
所说明的WF10的重量摩尔渗透压浓度为290-330mosmol/kg(平均:310)(其为实验值)。其明显与盐水的值(308mosmol/L(渗量)或者310.8mosmol/kg(重量摩尔渗透压浓度))匹配。然而,经实验确证,对于盐水的真实值为287mosmol/kg(由290、287、284平均)。
为了避免渗透应力,设计待制备的溶液的重量摩尔渗透压浓度,使其接近理想的WF10的值(其为310mosmol/kg),以缩小其与盐水的值(其为287mosmol/kg)的差异。这只有通过大量的实验工作才成为可能。
样品1:不含亚氯酸盐的等渗WF10(注意在该样品中涉及的TCDO为OXO-K993)
起始的浓缩物:不含亚氯酸盐的TCDO(yTCDO)
重量[g]
亚氯酸钠(固体) 0
氯化钠 1.649
氯酸钠 0.957
硫酸钠* 0.518
碳酸钠* 0.353
1N氢氧化钠 6.0mL
#,使总计 50.0
*无水的;#注射用水
将7.84g的yTCDO在注射用水中稀释,以构成50.0mL的最终体积。
样品2:不含氯酸盐的等渗WF10(注意在该样品中涉及的TCDO为OXO-K993)
起始的浓缩物:不含氯酸盐的TCDO(zTCDO)
重量[g]
亚氯酸钠(固体) 3.540
氯化钠 1.295
氯酸钠 0
硫酸钠* 0.394
碳酸钠* 0.141
1N氢氧化钠 6.0mL
#,使总计 50.0
*无水的;#注射用水
将5.44g的zTCDO在注射用水中稀释,以构成50.0mL的最终体积。
样品3:等渗的无缓冲氯酸盐ClO3 -
将883mg的氯酸钠(相当于662.2mg的氯酸盐)在50g注射用水中溶解。
样品4:缓冲至pH 7.4的等渗亚氯酸盐
(i)磷酸盐缓冲液,pH 7.2
溶液1:将2.84g磷酸氢二钠(Na2HPO4,无水的)在100g的注射用水中溶解。
溶液2:将2.76g磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)在100g的注射用水中溶解。
pH 7.2的缓冲液:在控制玻璃电极下,将溶液2加入至溶液1中,直至达到pH 7.21。
重量摩尔渗透压浓度:403mosmol/kg(由400、406平均)
(ii)亚氯酸钠溶液
将9.0g市售可得的亚氯酸钠溶液(25%(wt/wt))用93g注射用水稀释。
重量摩尔渗透压浓度:506.5mosmol/kg(由504、509平均)
(iii)等渗磷酸盐缓冲液,pH 7.2
将得自(a)的38.0g pH 7.2的磷酸盐缓冲液用注射用水补足50.0g。
重量摩尔渗透压浓度:310mosmol/kg(由309、310、311平均)。
(iv)等渗亚氯酸钠溶液
将得自(ii)的30.3g亚氯酸钠溶液用注射用水补足50.0g。
重量摩尔渗透压浓度:294.7mosmol/kg(由293、295、296平均)。
(v)缓冲为pH 7.4的等渗亚氯酸盐溶液
在控制玻璃电极下,将得自(iii)的pH 7.2的等渗磷酸盐缓冲液加入至得自(iv)的等渗亚氯酸钠溶液(50g),直至达到pH 7.39。
在表3中报告所制备的溶液的分析表征。
(b)包封所制备的溶液的脂质体的制备
使用下列磷脂中的一种或两种来制备脂质体样品:
·1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC),从Lipoid GmbH以粉末的形式购买(LIPOID PC 14:0/14:0),其中将801mg在60mL的氯仿中溶解(13.35mg/mL)。
·1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC),从Lipoid GmbH以粉末的形式购买(LIPOID PC 16:0/16:0),其中将10.617g在126mL的氯仿中溶解(84.26mg/mL)。
·氢化磷酯酰胆碱(大豆),氢化大豆PC,从Lipoid GmbH以粉末的形式购买(LIPOID S PC-3),其中将1,208mg在25mL的氯仿中溶解(48.32mg/mL)。
将样品1-4包封于上述脂质中。为了避免渗透应力(内部对外部),将这些溶液制成等渗的(大约300mosmol/kg)。另外,对于其中一个样品,使用由Pharma Hameln,Germany制备的WF10的i.v.溶液剂(ImmunokineTM)。还由氯化钠和去离子水制备0.9%的盐水溶液(NaCl得自VWR,GPRRectapure)。
制备了13种实验用的脂质体样品,并将其如下表征:
样品制备
使用大体如实施例6中所述的方法(含一些修改)制备样品。准确的参数在以下的小部分中提供。
制备时间线
以下提供整个样品制备的大事记:
2012年9月5日,样品5、6、7、9、10和11的蒸发、水合和挤出
2012年9月6日,样品8、12、13、14、15、16和17的蒸发、水合和挤出
2012年9月10日,样品5-8的透析
2012年9月11日,样品9-12的透析
2012年9月12日,样品13-17的透析
2012年9月14日,样品17的透析
在制备结束时或不同制备步骤之间分别将所有样品或部分完成的样品在冰箱(1-4℃)中储存。
蒸发和水合
对于DPPC样品,蒸发2000μL的DPPC-氯仿溶液(84.26mg/mL),并用574μL相应的离子混合物进行水合。
通过蒸发1300μL的DPPC-氯仿溶液和2000μL的DMPC-氯仿溶液(13.35mg/mL)制备DPPC/DMPC样品。将6390μL相应的离子混合物用于水合。
在上述两例中,水合均在47℃下进行,并持续少于5分钟。
对于氢化大豆PC样品,将水合温度设置为60℃,同时步骤的持续时间也少于5分钟。在水合前,蒸发4000μL的脂质氯仿溶液(48.32mg/mL),用6170μL相应的离子混合物进行水合。
挤出
DPPC和DPPC/DMPC样品的挤出在47℃的温度下进行,氢化大豆PC样品的挤出在60℃下进行。所有样品都经历10次连续的挤出步骤,但是样品17经历9次连续的步骤。对于所有样品,这些步骤的总持续时间少于15分钟,但是对于13、14和16,其少于25分钟。
透析
透析介质为0.9%的盐水溶液,其通过将45.0g NaCl加入至5000mL的容量瓶中,然后用去离子水达到体积。
将所有样品在3-12mL的透析框架中透析。进行5次连续的步骤,每次用900mL的透析介质并且持续时间为至少45分钟。注意,可用利用微透析(Roth Mini-Dialyzer)的新的透析方法。其仅需100μL范围内的样品体积(即脂质体制剂)和1-2mL范围内的透析体积(即盐水)。与之前的方法相比,使用该方法使定量限以大约10的系数增加。
4周储存
如实施例11中描述的LTS装备被以下通用方法代替:透析后,将样品从透析框架移除,并将其在看起来适合的小瓶中储存。脂质体从它们的外部介质中的分离在检测当天进行,其中取出一部分样品并将其进行微透析,然后监测透析液中可能存在的渗漏组分。细节如下文所述。
在2012年9月17日,将4mL的各样品均等地分配在四个1.5mL的容器中(每个1mL)。然后将这些容器中的两个在1-4℃的冰箱中储存,同时将另外两个保持在室温下。将储存在相同温度下的所有容器适当地标记并将其连同温度记录仪(将其编程以每5分钟记录温度)放置在相同的容器中。然后将容器密封,并将其储存在它们各自的温度下。日志数据记录恒定的温度,对于冰箱的样品为1-4℃,对于在室温下储存的样品为21-23℃。
为确保所有样品在实验开始时的完整性,移取100μL的样品并将外部介质如下部分所述分离。然后将这些样品在-25℃下储存,并将其连同其它实验后的样品进行邻联甲苯胺分析。
将容器在2012年10月24日再次打开,并从各容器中移取100mL的样品以进行外部样品介质的邻联甲苯胺分析。操作如下面的小部分中所述。
外部介质的分离和分析
如之前所提到,并且与实施例8和11中所述的LTS装备相反,在LTS实验期间,未将样品储存在透析室中,而是储存在合适的容器中。因此,脂质体从其外部介质中的分离需要在外部介质中渗漏物质的检测之前进行。对于该分离,使用最大体积为100μL的小透析单元(ZelluTrans/RothMini-Dialyzer MWCO 12000,由Carl Roth制备,产品号:4775.1)。相对1500μL的0.9%盐水溶液作为透析介质进行透析,并且其在封闭的2mL反应容器中进行。对于当前对的实验,在2012年10月24日将100μL的各样品装入透析单元中,并将其置于相应的温度(室温或者1-4℃)下,直至2012年10月29日。在这一天,将透析单元转移至另一2mL的反应容器(装有1500μL的0.9%盐水溶液)中。然后将“先前的”2mL容器在1-4℃下过夜储存。将“新”装备加热至60℃,并放置过夜,以迫使完全渗漏。
将在2012年9月17日所取的初始样品在当天进行过夜分离操作。在第二天,移除透析单元,并将含有分离的外部介质的小瓶在-25℃下储存,以连同其它样品进行分析。
在2012年10月30日,按照实施例7方法B中所述的邻联甲苯胺法,对全部三个实例(初始完整性测试、储存后的介质、储存和加热后的介质)进行透析介质的邻联甲苯胺分析。
未计算组分的浓度,而是所述操作限于监测吸收值以作出结论:是否渗漏。这是由于以下事实:所有的定量方法都参照纯WF10,其亚氯酸盐/氯酸盐含量与多数包封的物质不同。比较迫使完全渗漏之前和之后测量中的吸收数据,可对渗漏程度进行大致评估。
结果和分析
吸光度值相互之间可进行比较,但是未将其相对于1cm的标准光程标准化。对于吸收测量,使用如实施例14中所定义的检测限(LOD)(0.095)。在吸光度值小于LOD的实例中,则渗漏太弱而无法检测或者完全未发生渗漏。表4给出吸收测量的数值。
各样品的值为两个单独储存的容器的平均值。包括迫使渗漏的结果,与所有其它信号相比,其表现大的信号,这表明所有的样品包含适当填充的脂质体。从所有初始测量中得到的信号均低于LOD,因此说明没有样品在外部介质中已包含渗漏的物质。对于单独的结果而言,应考虑三个角度:储存温度、脂质组成和包封的物质。
储存温度的结果
储存温度对样品的渗漏特性具有最大的影响。除了一个实例,所有渗透均发生于在室温下储存的样品中,并且在仅有的渗漏的冰箱-样品(样品8)的实例中,其在室温下的渗漏表现出所有测试的样品中最强的信号。
包封的物质的结果
所有表现高于LOD的信号的脂质体填充有亚氯酸盐或者氯酸盐。填充有氯酸盐的样品在所有室温下的情形中渗漏,并且甚至在冰箱温度下,一个样品(样品8)略微超过了LOD。至于亚氯酸盐,除一例(样品14)外,所有室温下样品都渗漏。
脂质的结果
由氢化大豆PC(S PC-3)(其PTT(55℃)高于DPPC(41℃)和DMPC(23℃))制备的样品渗漏较弱。在DPPC/DMPC的混合物的实例中,其PTT未清楚描述,并且处于DPPC和DMPC的PTT的温度范围之间。
实施例14:包封WF10的脂质体的渗量作用
已知在一定程度上脂质膜对小分子(如水)是可渗透的,然而大分子以及带电荷分子不能通过这种膜,或者以更低的比率通过。渗透作用是该效应的直接结果。其在两个含有不同浓度的渗透性颗粒(例如大分子)的水性贮器之间的半渗透性边界出现。系统趋于使两个浓度平衡,这只有通过用来自较低浓度的贮器的水分子稀释较高浓度的贮器才可能。因为颗粒不能通过所述边界,所以溶解的颗粒移动至较低浓度的贮器以提高那里的浓度是不可能的。水分子“侵入”的结果就是较高浓度的贮器的体积增加,这导致对贮器壁的压力。最终,该压力可变的太大使得壁无法承受,并且其会破裂。
脂质体的双分子层外壳为半渗透性膜,因此易于具有渗透作用。人们可能想到渗透梯度可能诱发脂质体的渗漏,或者甚至导致其破裂。在一简单的实验中,对填充有WF10的脂质体的渗漏特性进行研究,其中浓WF10用于提高内部相对于周围的盐水介质的渗量。
本研究的目的不是要获得关于在渗透作用下渗漏参数的详细信息,而是要寻找在这样的条件下渗漏的一般趋势。
样品
按照以下方式,用由OXO-K993溶液制备的2×或者3×的浓缩WF10制备两个样品,OXO-K993溶液由Nuvo Research GmbH(Lot 4053)提供:
2×WF10:10g OXO-K993用水达到50mL
3×WF10:15g OXO-K993用水达到50mL
样品的制备于2012年7月4日开始,并且其根据通常操作(实施例6)进行。将2.1mL的84.26mg/mL的DPPC-氯仿溶液加入圆底烧瓶中。这对应177mg的脂质重量。DPPC购自LIPOID GmbH。用6.0mL的如上述制备的各WF10浓缩物(2×或3×)进行水合反应。在水合过程中,将样品加热至46±3℃,持续大约5分钟。在50±3℃下进行挤出,并持续大约20分钟,其包括总共10次连续通过。然后将样品在冰箱中于6℃下过夜储存。透析步骤在900mL的盐水溶液中进行,所述盐水溶液每5000mL用90.034gNaCl(对于2×WF10)和135.063g NaCl(对于3×WF10)制备。进行持续95、80、80、60和80分钟的5个后续步骤。然后将样品从透析框架中移除并将其在6℃下储存。
HRL渗漏
HRL渗漏试验于2012年7月6日,在50分钟的透析步骤下开始,所述透析步骤在0.9%的盐水溶液(每5000mL溶液含有45.016g NaCl)中进行,以将脂质体的较高浓度的储存介质移除。然后如实施例12中所述进行操作(未使用加热浴),使得其在室温(22℃)下进行。如通常一样,将两种样品在实验前分份(split),并在两个平行的量筒中处理,使得对于各样品,得到两个数据集,并在结果部分中作图。
包封体积的测定
为了测定样品中包封的WF10的体积,通过将HRL装备加热(如上所述)至60℃维持数小时以诱导完全渗漏。然后使用周围盐水介质的邻联甲苯胺分析来评估WF10的含量。
结果和评估
实验期间所取的介质样品的评估如实施例7(方法B)中所述进行。在由测定的储存介质中WF10的浓度计算释放的WF10的量时应考虑以下事实:WF10的浓度比通常高2或3倍。图16说明就与整个样品体积有关的渗漏的WF10而言的结果。可见,在1-2小时后检测到渗漏。在整个实验期间,释放大约5%的包封的双倍浓缩的WF10和18%的三倍浓缩的WF10。几乎所有渗漏的WF10在渗漏开始的前6小时内被释放。在随后的4天中,变化小到不能说明渗漏停止或者以非常低的速率进行。
实施例15:使用乙醇注入法制备脂质体
用以下脂质组合物,使用交叉流乙醇注入法制备含有WF10的脂质体:1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、含有10%部分的1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)的DPPC、含有10%部分的1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)的DPPC和含有10%部分的1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)的DPPC。加入带电荷的脂质(DPPG和DMPG)以防止加工和储存期间脂质体的聚集。
图17显示使用乙醇注入法制备脂质体的示意图。该方法直接形成粒径分布可接受的具有期望尺寸的小单层脂质体。
所应用的交叉流乙醇注入法的特征如下:
·由样品容器的体积决定(但不限制)批量
·所得的脂质体的即是所控制的尺寸和粒径分布
·最小的热应力
·外相必须置换,并且残留的乙醇必须移除:
○使用超滤以浓缩初级产物
○渗滤会
■用盐水置换外相(WF10)
■移除外相的和包封的WF10/乙醇混合物中的乙醇
材料和方法
DPPC、DMPC、DMPG和DPPG由Lipoid GmbH(Germany)提供。用于溶解脂质组分的96%Pharm.Eur.级乙醇从Merck KGaA(Germany)购买。
用于囊泡制备的水相为WF10溶液—按照Nuvo Manufacturing GmbH的说明书,活性成分OXO-K993在水中的10%稀释物。0.154M(生理)NaCl溶液用作用于稀释的水相。所有购买的试剂均为最高纯度,并且如果可能,为USP级或者Pharm.Eur.级。
脂质体用Polymun的脂质体技术(交叉流注射技术)制备,如Wagner等人,Journal of Liposome Research,2002,12(3):259-270中所述。超滤/渗滤(小规模)用Sartocoon Slice Casette 100kD UF膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH,Germany)进行。
用于测定脂质体尺寸的测量通过用Malvern Nano ZS的Dynamic-Laser-Light-Scattering进行。该系统装备有633nm波长的4mWHelium/Neon Laser,并且用171°的探测角的非侵入性反向散射技术测量脂质体样品。将脂质体在水相中稀释,以达到最优的脂质体浓度,并且实验在25℃下进行。结果表示为脂质体悬浮液的平均直径(z-均值),用多分散性指数来测定脂质体的同质性。此外,还用Malvern Nano ZS进行ζ电位的测定。因此,将样品用0.154M的NaCl溶液稀释。
通过反相HPLC进行DPPC的定量。
通过邻联甲苯胺法(参见实施例7,方法B)(测量442nm处的吸光度)进行WF10的定量。
实验和结果
所有实验均用Polymun的脂质体技术进行。用于所有实验的注射模块装备有350μm直径的注射孔。在研发过程中,纯DPPC和DPPC/DMPC脂质体表现较小的ζ电位。因此使用另外两种脂质制剂(DPPC/DMPG、DPPC/DPPG)。变化数个处理参数,以研究其对脂质体性质的作用并优化处理参数以满足对最终产物的要求。
用于纯DPPC和DPPC/DMPC脂质体的方法研发的起始条件如下:
·水相的温度:40℃
·脂质-乙醇溶液的温度:40℃
·用于囊泡制备的水相:WF10溶液
·用于稀释的水相:0.154M(生理)NaCl
·乙醇相(脂质-乙醇溶液):对于1000mL水相,75mL(总制备体积:1075mL)
·WF10浓度(中间体积):79.1μg/mL
用于DPPC/DMPG和DPPC/DPPG脂质体的方法研发的起始条件如下:
·水相的温度:55℃
·脂质-乙醇溶液的温度:55℃
·用于囊泡制备的水相:WF10溶液
·用于稀释的水相:0.154M(生理)NaCl
·乙醇相(脂质-乙醇溶液):对于1000mL水相,75mL(总制备体积:1075mL)
·WF10浓度(中间体积):79.1μg/mL
表5显示使用乙醇注入法制备的多种包封有WF10的脂质体的数据,其包括脂质体尺寸、多分散性指数(PdI)、DPPC定量和亚氯酸盐定量。表6显示重复进行表5中所报道的实验的相同结果。图18和图19分别显示在表5和表6所报道的实验的渗滤处理期间,滤液中收集的亚氯酸盐的量。表7显示多种使用乙醇注入法制备的,并且含有两倍于(2×)表5和表6中制备的脂质体的WF10浓度的包封有WF10的脂质体的数据,其包括脂质体尺寸、多分散性指数(PdI)、DPPC定量和亚氯酸盐定量,并且图20显示在同一2×WF10脂质体的渗滤处理期间,滤液中收集的亚氯酸盐的量。
表8显示对表6和表7中所报道的样品进行的长期稳定性研究的结果。
实施例16:胶原诱导性关节炎(CIA)的动物模型研究
在第0天时,用胶原II溶液将雌性DBA/1小鼠敏化,并在第21天进行加强。从第17天起对动物的胶原诱导性关节炎(CIA)的临床体征进行评分。如果评估的分数超过5的值,认为建立CIA。本研究中包含在免疫后的前35天中患有CIA的动物。排除在该时间点后患有CIA的动物。从CIA发作那天起,将动物用WF10(0.25ml/kg)、脂质体形式的WF10(LipoWF10)或者NaCl治疗。在发作后总共21天内进行评分。在该期间后将动物处死。
研究地点:
Medizinisch-Experimentelles Zentrum der MedizinischenLeipzig,Liebigstraβe 26a,04103Leipzig;Max-Bürger-Forschungszentrum(MBZ),Johannisallee 30,04103Leipzig。
方法:
使雌性DBA/1小鼠(Janvier)(7-8周大,体重约17g(±2))在运送后适应设施,持续4周。将动物放置在专用的和合格的设施中(Medizinisch-Experimentelles Zentrum(MEZ)Leipzig,Medizinische)。将动物通过耳标进行区分。
在第0天,将所有小鼠通过皮内注射100μL胶原-CFA-乳剂(CFA表示完全弗氏佐剂)进行免疫。在第21天,通过注射100μL胶原-IFA-乳剂(IFA表示不完全弗氏佐剂)进行加强。
当动物超过5的评分阈值时,认为建立了CIA。在当天开始药理学治疗,并在不同的时间间隔进行。八只小鼠在CIA发作后的第1、3和5天以0.25ml/kg体重的剂量得到100μL的静脉注射的WF10。十一只小鼠得到100μL静脉注射的S_PC-3-LipoWF10(提供大约0.25ml/kg体重的WF10剂量),并且十二只小鼠得到100μL静脉注射的S_PC-3-LipoWF10(1:10稀释)(提供大约0.025ml/kg体重的WF10剂量)。对照组包含10只小鼠,其接受200μL的NaCl。所有给药都在CIA发作后的第1、3和5天进行。脂质体制剂“S_PC-3-LipoWF10”包含作为内相的WF10和作为外相的盐水以及作为脂质的氢化大豆磷脂(参见实施例9)。所述脂质体的WF10包合率为5%,在100μL制剂中提供大约5μL体积的WF10。S_PC-3-LipoWF101:10稀释液为原脂质体制剂的按10的系数的稀释液,因此虽然预计脂质体囊泡会继续含有基本上纯的WF10,WF10的绝对量减少。本研究中包含在免疫后的前35天中患有CIA的动物。排除在该时间点后患有CIA的动物。
从首次胶原注射算起的第17天开始,每天对所有小鼠评分。评估动物得分的人员不知道药理学治疗的情况。检查所有四肢的发红或者肿胀。每个肢体的最大得分为15/天,并且一只动物的最大得分为总计60/天。从这些单个的值计算各组的平均值。
结果
从首次免疫后第17天开始,对动物的胶原诱导性关节炎(CIA)的体征进行评分。当动物的得分超过5的值时,认为诱导了CIA,并将这一天称为该动物的d1。类似地,将CIA发作后的第n天表示为各动物的dn。图21显示从d0(CIA发作之前的一天)至d22的实验期间的CIA得分的平均值。
在CIA实验中,治疗的效果通常在d12左右开始,并在d15-d17左右差距(separation)最大。之后,由于模型,疾病得分降低。图22显示d16的得分平均值。
所有出版物、专利和专利申请的相关部分援引加入本文,其程度如同明确地且单独地表明各单独的出版物、专利或专利申请被援引加入。当发现本申请中的术语与援引加入的文档中的定义不同,将本文中的定义用作该术语的定义。
表1
表1(续)
表1(续)
1Chemical Abstracts Service Registry Number
表2:由DPPC、DPPC/DMPC、氢化大豆磷脂(3_PC3)和3_PC3/DMPC制备的WF10脂质体
表3:实施例15中所制备溶液的分析表征
表4:实施例15中的吸收测量
表5
Int=中间产物
Ret=残余物(超滤或者渗滤后)
*假设100%DPPC回收,包封的亚氯酸盐的理论回收。
表6
Int=中间产物
Ret=残余物(超滤或者渗滤后)
*假设100%DPPC回收,包封的亚氯酸盐的理论回收。
表7
Int=中间产物
Ret=残余物(超滤或者渗滤后)
*假设100%DPPC回收,包封的亚氯酸盐的理论回收。
表8
a WF10(1X)表示所述脂质体含有其常规浓度的WF10。这避免了相对于作为外相的盐水的渗透压上的显著差异。WF10(2X)表示脂质体中含有两倍浓度的WF10,这导致相对于外相的盐水的渗透应力。
b LOD已确立为0.095的吸收值。

Claims (61)

1.脂质体组合物,其包含具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物含有亚氯酸盐,并且其中所述亚氯酸盐为稳定化的亚氯酸盐。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中所述组合物含有亚氯酸盐,并且其中所述亚氯酸盐为OXO-K993。
4.根据权利要求2所述的组合物,其中所述稳定化的亚氯酸盐含有1-10%、10-20%、20-30%、30-50%或50-90%(w/v)的OXO-K993。
5.根据权利要求1所述的组合物,其中以在所述组合物中的总包封离子含量为基础,所述组合物含有约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)、约0.5%(w/w)至约10%(w/w)、约0.3%(w/w)至约3%(w/w)或约1.0%(w/w)的包封亚氯酸盐。
6.根据权利要求1所述的组合物,其中以在所述组合物中的总包封离子含量为基础,所述组合物含有约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)、约0.5%(w/w)至约10%(w/w)、约0.3%(w/w)至约3%(w/w)或约1.0%的包封氯酸盐。
7.根据权利要求1所述的组合物,其中以在所述组合物中的总包封离子含量为基础,所述组合物含有约0.01%(w/w)至约50%(w/w)、约0.1%(w/w)至约20%(w/w)、约0.5%(w/w)至约10%(w/w)、约0.3%(w/w)至约3%(w/w)或约1.0%的包封亚氯酸盐和氯酸盐的混合物。
8.根据权利要求1所述的组合物,其中所述包封亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的pH为大于约5、大于约6、大于约8或者大于约10。
9.根据权利要求1所述的组合物,其中所述包封亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的pH为约5至约14、约6至约13、约8至约12.5或约10至约12。
10.根据权利要求1所述的组合物,其中包含于所述脂质体中的所述脂质适合用于包封pH为约5至约14、约6至约13、约8至约12.5或约10至约12的亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物,其中所述合适的脂质选自磷脂、鞘脂及其混合物。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述磷脂为含有足够长的饱和或者不饱和脂肪酰基链的磷脂酰胆碱(PC),并且所述鞘脂为鞘磷脂(SM)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物,其中所述合适的脂质选自形成在约5℃至约50℃的范围内的储存温度下保持稳定持续可接受的时间的脂质体的脂质。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述合适的脂质选自形成在约5℃的温度下不渗透渗漏离子的脂质体的脂质。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物,其中所述脂质体含有两种或者两种以上类型的合适的脂质。
16.根据权利要求15所述的组合物,其中所述脂质体含有两种类型的合适的脂质,并且所述脂质以20:1至1:1、15:1至5:1或10:1至9:1的摩尔比存在。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物,其还含有至少一种提高所述脂双层的刚性和/或降低所述脂双层的渗透性的附加组分。
18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述至少一种附加组分以总脂质含量的约0.1%至约50%、约1%至约30%、约5%至约25%或者约10%至约20%的量存在。
19.根据权利要求17或18所述的组合物,其中所述至少一种附加组分选自胆固醇和硫酸胆固醇。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物,其还含有至少一种使所述脂质体具有减少所述脂质体聚集的ζ电位的附加组分。
21.根据权利要求20所述的组合物,其中所述减少所述脂质体聚集的ζ电位至少大于+5mV或者至少小于-5mV。
22.根据权利要求20或21所述的组合物,其中所述至少一种使所述脂质体具有减少所述脂质体聚集的ζ电位的附加组分为带电荷的脂质。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中所述带电荷的脂质为带负电荷的脂质。
24.根据权利要求23所述的组合物,其中所述带负电荷的脂质为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或者磷脂酸。
25.根据权利要求24所述的组合物,其中所述带负电荷的脂质选自以下物质的盐:1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DOPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DSPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-甲基-聚乙二醇(MPEG-DSPE)及其混合物。
26.根据权利要求25所述的组合物,其中所述带负电荷的脂质选自1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DSPG)及其混合物。
27.根据权利要求22-25中任一项所述的组合物,其中所述带电荷的脂质以使未带电荷的脂质:带电荷的脂质的比为20:1至1:1、15:1至5:1或10:1至9:1的量存在。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物,其中所述一种或多种合适的脂质选自1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(MSPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PMPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PSPC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SMPC)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SOPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(SPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、1,2-二山嵛酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1,2-二芥酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、氢化大豆磷脂、蛋黄磷脂、鞘磷脂(SM)、乳鞘磷脂及其混合物。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的组合物,其中所述一种或多种合适的脂质选自1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、氢化大豆磷脂、蛋黄磷脂及其混合物。
30.根据权利要求23-27中任一项所述的组合物,其中所述一种或多种合适的脂质为摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DMPG)、摩尔比为9:1的1,2-二棕榈酰-2-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油(DPPG),或DPPC。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物,其中所述脂双层用增加亲水性的分子修饰表面。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的组合物,其中所述脂双层通过将细胞特异性靶向基团与其表面连接进行修饰,以促进其与特定细胞或组织类型结合。
33.脂质体,其包含至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质。
34.根据权利要求33所述的脂质体,其平均直径为约80nm至约300nm、约90nm至约200nm、约100nm至约140nm、约80nm至约15μm、约300nm至约12μm或约7μm至约10μm。
35.根据权利要求33或34所述的脂质体,其中所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的包封率或者包合率为1%至约50%、约2%至约25%或约5%至约15%。
36.制备具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体的方法,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质,所述方法包括:
(a)向内表面至少部分具有所述一种或多种脂质的薄膜的容器中加入亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的水性溶液;
(b)在足以全部或者部分去除所述内表面的所述薄膜的条件下搅拌所述容器,以得到含有包封有亚氯酸盐和/或氯酸盐的脂质体的浑浊溶液;
(c)对所述浑浊溶液进行处理,以将所述脂质体的平均直径减小至所需的量;以及
(d)任选地对所述脂质体进行处理,以从所述脂质体的外部溶液中移除亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物。
37.根据权利要求36所述的方法,其中(a)中所述一种或多种合适的脂质与所述亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物之间的摩尔比为约0.01:1至约10000:1、约0.1:1至约5000:1、约0.5:1至约2500:1、约1:1至约1000:1或约0.1:1至约100:1。
38.制备具有至少一个脂双层且内部包封有亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的脂质体的方法,其中所述脂双层含有一种或多种合适的脂质,其中所述方法为乙醇注入法。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述乙醇注入法使用交叉流技术进行。
40.药物组合物,其含有如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物或者如权利要求33-35中任一项所述的脂质体,所述脂质体组合物或者脂质体与至少一种生理学上可接受的载体或者赋形剂混合。
41.如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物作为药物的用途。
42.如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物,其用作药物。
43.用于治疗受益于给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的疾病、病症或病况的方法,其包括向需要其的个体给药有效量的如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物。
44.调节巨噬细胞功能的方法,其包括向需要其的个体给药有效量的如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物。
45.根据权利要求44所述的方法,其中调节巨噬细胞功能导致对于因不适当的免疫应答而产生慢性炎症症状的疾病的治疗。
46.根据权利要求43所述的方法,其中所述受益于给药亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物的疾病、病症或病况选自自身免疫病、由不适当的免疫应答、伤口愈合、放射综合征或暴露于环境毒素引起的疾病。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述疾病、病症或病况选自重症肌无力、系统性红斑狼疮、血清病、糖尿病、类风湿关节炎、幼年型类风湿关节炎、风湿热、干燥综合征、系统性硬化病、椎关节病变、莱姆病、结节病、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性多腺性疾病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化、炎性肠病、结肠炎、克罗恩氏病、慢性疲劳综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、移植物排斥、移植物抗宿主病、变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、对组织损伤的不适当反应、乙型肝炎、丙型肝炎、慢性肝炎、阻塞性支气管炎、肺气肿、肿瘤性疾病(癌症)、HIV感染、AIDS、神经变性疾病、AIDS相关的痴呆、微生物感染及其它病毒感染。
48.根据权利要求46所述的方法,其中所述疾病、病症或病况选自变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、肿瘤性疾病、脊髓病状、HIV感染及AIDS。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述肿瘤性疾病为胃肠道、头、颈、胸或者胰腺的癌症。
50.方法,其包括向使用者提供如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物,以及告知所述使用者特定的安全性或临床效果。
51.方法,其包括向使用者提供如权利要求1-32中任一项所述的脂质体组合物、如权利要求33-35中任一项所述的脂质体或者如权利要求40所述的药物组合物,以及告知所述使用者所述脂质体组合物比提供或预计会提供类似治疗效果的非脂质体组合物更稳定、更具靶向特异性或更具治疗有效性。
52.根据权利要求50或51所述的方法,其中通过公开的材料的方式告知所述使用者。
53.根据权利要求52所述的方法,其中所述公开的材料为标签或者产品说明书。
54.脂质体组合物,其包含外部连续相和一个或多个内部核心相,所述内部核心相包含亚氯酸盐、氯酸盐或其混合物,并且被包含在多个脂质体囊泡中,其中所述囊泡的壁含有至少一个脂双层,并且所述脂质体组合物的外部连续相基本上不含亚氯酸盐和氯酸盐。
55.根据权利要求54所述的组合物,其中所述外部连续相含有氯化钠。
56.根据权利要求54所述的组合物,其中所述外部连续相的pH为约5-8。
57.根据权利要求54-56中任一项所述的组合物,其中所述内部核心相的pH为约8-13。
58.根据权利要求54所述的组合物,其所述内部核心相和外部连续相之间的pH差异为约1至约7。
59.根据权利要求54所述的组合物,其中所述脂质体组合物表现约3-48个月的药学上可接受的稳定性。
60.根据权利要求59所述的组合物,其中所述药学上可接受的稳定性是在约5℃至约50℃的温度下储存所述组合物实现的。
61.根据权利要求59所述的组合物,其中所述组合物基本上不含降解产物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108883069A (zh) * 2016-01-04 2018-11-23 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN110563829A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 中国人民解放军国防科技大学 用于调控脂质体囊泡行为、功能的反光蛋白体系及其应用
CN112136044A (zh) * 2018-02-15 2020-12-25 耶迪特普大学 通过两相流体系统的外来体分离方法
CN112716973A (zh) * 2019-10-28 2021-04-30 卢序 一种降低细胞还原应激的氧化剂的用途

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8226975B2 (en) 2005-12-08 2012-07-24 Insmed Incorporated Lipid-based compositions of antiinfectives for treating pulmonary infections and methods of use thereof
US9119783B2 (en) 2007-05-07 2015-09-01 Insmed Incorporated Method of treating pulmonary disorders with liposomal amikacin formulations
WO2014037927A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Nuvo Research Gmbh Chlorate compositions and use of chlorate for treating radiation exposure
ES2743039T3 (es) 2012-11-29 2020-02-18 Insmed Inc Formulaciones de vancomicina estabilizada
US20140271815A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Aryo Sorayya Heat-and freeze-stable vaccines and methods of making and using same
US9603799B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Htd Biosystems Inc. Liposomal vaccine adjuvants and methods of making and using same
SI3142643T1 (sl) 2014-05-15 2019-11-29 Insmed Inc Postopki za zdravljenje pljučnih netuberkuloznih mikobakterijskih infekcij
BR112018003227A2 (pt) * 2015-08-20 2018-09-25 Oxo Chemie Thailand Co Ltd uso de clorito para tratar doenças dos glóbulos vermelhos e indicações mediadas desta forma
WO2019075202A2 (en) * 2017-10-11 2019-04-18 California Institute Of Technology METHODS AND SYSTEM FOR INTERFERING WITH THE VIABILITY OF BACTERIA, ASSOCIATED ANTIMICROBIALS, AND COMPOSITIONS
US11571386B2 (en) 2018-03-30 2023-02-07 Insmed Incorporated Methods for continuous manufacture of liposomal drug products
TR202012260A2 (tr) * 2020-08-05 2020-10-21 Emin Zuemruetdal Oral kullanim i̇çi̇n potasyum hi̇droksi̇t/sodyum hi̇droksi̇t solüsyonu
US20230390331A1 (en) * 2022-05-19 2023-12-07 Neuvivo, Inc. Biomarkers For Neurogenerative Disease

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000019981A1 (en) * 1998-10-08 2000-04-13 Karagoezian Hampar L Synergistic antimicrobial, dermatological and ophthalmic preparations containing chlorite and hydrogen peroxide
KR20030072766A (ko) * 2002-03-06 2003-09-19 (주)인터커머스 구취 억제능이 우수한 구강 위생용 조성물 및 그의제조방법
CN101600348A (zh) * 2006-12-04 2009-12-09 S.K.药物公司 包含亚氯酸盐和过氧化氢的协同抗微生物制备物

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4356167A (en) 1978-01-27 1982-10-26 Sandoz, Inc. Liposome drug delivery systems
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4241046A (en) 1978-11-30 1980-12-23 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
DE3213389A1 (de) 1982-04-10 1983-10-20 Friedrich-Wilhelm Dr. 7107 Neckarsulm Kühne Stabilisierter aktivierter sauerstoff und arzneimittel, die diesen stabilisierten aktivierten sauerstoff enthalten
US4551288A (en) 1982-08-16 1985-11-05 Sandoz, Inc. Processes for the preparation of liposome drug delivery systems
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4574084A (en) 1983-02-25 1986-03-04 Peter Berger Process for the preparation of a modified aqueous chlorite solution, the solution prepared by this process and the use thereof
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4663161A (en) 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
DE3515745A1 (de) 1985-05-02 1986-11-06 Oxo Chemie GmbH, 6900 Heidelberg Waessrige chloritmatrix-loesung
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
JPH0751496B2 (ja) 1986-04-02 1995-06-05 武田薬品工業株式会社 リポソ−ムの製造法
DE3625867C2 (de) 1986-07-31 1995-10-19 Elstner Erich F Prof Dr Verwendung von Tetrachlordecaoxid in der Ophthalmologie
US4752425A (en) 1986-09-18 1988-06-21 Liposome Technology, Inc. High-encapsulation liposome processing method
US4781871A (en) 1986-09-18 1988-11-01 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US5049388A (en) 1986-11-06 1991-09-17 Research Development Foundation Small particle aerosol liposome and liposome-drug combinations for medical use
EP0414663A4 (en) 1987-04-16 1991-07-17 The Liposome Company, Inc. Liposome continuous size reduction method and apparatus
US5049390A (en) 1987-09-02 1991-09-17 Allergy Immuno Technologies, Inc. Liposome containing immunotherapy agents for treating IgE mediated allergies
US4851222A (en) 1988-01-27 1989-07-25 Oxo Chemie Gmbh Method of promoting regeneration of bone marrow
US5269979A (en) 1988-06-08 1993-12-14 Fountain Pharmaceuticals, Inc. Method for making solvent dilution microcarriers
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
CA2025907A1 (en) 1989-09-21 1991-03-22 Franklin D. Collins Method of transporting compositions across the blood brain barrier
US5190822A (en) 1990-04-20 1993-03-02 Fuji Photo Film Co., Ltd. Surface-modifiable liposome and process for producing surface-modified liposome
US5206027A (en) 1990-09-13 1993-04-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Amphipathic compound and liposome comprising the same
WO1992007959A1 (en) 1990-11-05 1992-05-14 Biowhittaker Inc. Homogeneous membrane lytic immunoassay method utilizing contact sensitive liposome formulations
US5498420A (en) 1991-04-12 1996-03-12 Merz & Co. Gmbh & Co. Stable small particle liposome preparations, their production and use in topical cosmetic, and pharmaceutical compositions
US5554728A (en) 1991-07-23 1996-09-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Lipid conjugates of therapeutic peptides and protease inhibitors
JPH06206825A (ja) 1992-12-11 1994-07-26 Nippon Rooshiyon Kk 白癬菌、湿疹等による皮膚病の治療剤及び 皮膚殺菌活性化剤
DE59406065D1 (de) 1993-03-24 1998-07-02 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung einer Liposomendispersion im Hochdruckbereich
WO1995016774A1 (en) 1993-12-17 1995-06-22 Spinal Cord Society Method for inducing dna synthesis in neurons
US5830686A (en) 1994-01-13 1998-11-03 Calydon Tissue-specific enhancer active in prostate
US6110666A (en) 1994-06-09 2000-08-29 Medical Research Council Locus control subregions conferring integration-site independent transgene expression abstract of the disclosure
US5786214A (en) 1994-12-15 1998-07-28 Spinal Cord Society pH-sensitive immunoliposomes and method of gene delivery to the mammalian central nervous system
US5780052A (en) 1995-04-24 1998-07-14 Northeastern University Compositions and methods useful for inhibiting cell death and for delivering an agent into a cell
JP3735921B2 (ja) 1996-02-07 2006-01-18 三菱ウェルファーマ株式会社 GPIb・脂質複合体およびその用途
US5877222A (en) 1996-07-19 1999-03-02 The Regents Of The University Of California Method for treating aids-associated dementia
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6524613B1 (en) 1997-04-30 2003-02-25 Regents Of The University Of Minnesota Hepatocellular chimeraplasty
DK1021196T3 (da) 1997-10-06 2004-06-07 Oxo Chemie Ag Anvendelse af en kemisk stabiliseret chloritoplösning til inhibering af en antigenspecifik immunreaktion
WO1999025320A1 (en) 1997-11-19 1999-05-27 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6749863B1 (en) 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6573101B1 (en) 1998-02-12 2003-06-03 The Regents Of The University Of California Compositions for receptor/liposome mediated transfection and methods of using same
US6077502A (en) 1998-02-27 2000-06-20 The Procter & Gamble Company Oral care compositions comprising chlorite and methods
US6350438B1 (en) 1998-02-27 2002-02-26 The Procter & Gamble Company Oral care compositions comprising chlorite and methods
US6132702A (en) 1998-02-27 2000-10-17 The Procter & Gamble Company Oral care compositions comprising chlorite and methods
US6251372B1 (en) 1998-02-27 2001-06-26 The Procter & Gamble Company Oral care compositions comprising chlorite and methods
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
JP4727816B2 (ja) * 1998-10-08 2011-07-20 エル. カラジョージアン、ハンパー 亜塩素酸塩と過酸化水素とを含有する共同作用抗菌性皮膚科・眼科製剤
JP2001002592A (ja) 1999-06-18 2001-01-09 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd 遺伝子導入用組成物
CA2382293A1 (en) 1999-08-18 2001-02-22 Oxo Chemie Ag Chemically-stabilized chlorite solutions for treating cancer and other diseases
WO2001017030A1 (en) 1999-08-27 2001-03-08 Macronix America, Inc. Non-volatile memory structure for twin-bit storage and methods of making same
CA2391606A1 (en) 1999-11-24 2001-05-31 The Liposome Company, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
CA2733819A1 (en) 1999-12-30 2001-07-12 Judith K. Gwathmey Iron chelator delivery system
US6530944B2 (en) 2000-02-08 2003-03-11 Rice University Optically-active nanoparticles for use in therapeutic and diagnostic methods
US7101985B2 (en) 2001-11-20 2006-09-05 Baylor College Of Medicine Methods and compositions in checkpoint signaling
US20030220284A1 (en) 2002-02-22 2003-11-27 Patricia Yotnda Delivery of adenoviral DNA in a liposomal formulation for treatment of disease
US20030228285A1 (en) 2002-05-03 2003-12-11 Mien-Chie Hung Bipartite T-cell factor (Tcf)-responsive promoter
JP3415131B1 (ja) 2002-06-03 2003-06-09 メビオファーム株式会社 リポソーム製剤
US20040022842A1 (en) 2002-06-03 2004-02-05 Mebiopharm Co., Ltd. Liposome preparations containing oxaliplatin
US7105183B2 (en) 2004-02-03 2006-09-12 The Regents Of The University Of California Chlorite in the treatment of neurodegenerative disease
US8765808B2 (en) * 2005-03-23 2014-07-01 Chs Pharma, Inc. Treatment or prevention of cancer and precancerous disorders
US20080292729A1 (en) 2005-07-21 2008-11-27 Nuvo Research Inc. Stabilized Chlorite Solutions in Combination with Fluoropyrimidines for Cancer Treatment
US8067035B2 (en) * 2005-12-22 2011-11-29 Neuraltus Pharmaceuticals, Inc. Chlorite formulations, and methods of preparation and use thereof
EP1971426A1 (de) 2006-01-11 2008-09-24 P & W Invest Vermögensverwaltungsgesellschaft mbH Hüllenmembran zur abgabe eines eingeschlossenen wirkstoffs, ein verfahren zur herstellung sowie deren verwendung
US8252343B2 (en) 2007-06-01 2012-08-28 Nuvo Research Ag Use of WF10 for treating allergic asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis
US20110052655A1 (en) 2007-08-08 2011-03-03 Wilson Kurt Whitekettle Methods and vesicles for controlling protozoa
IL292615B2 (en) * 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US20110177147A1 (en) 2010-01-21 2011-07-21 General Electric Company Stable biocidal delivery systems

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000019981A1 (en) * 1998-10-08 2000-04-13 Karagoezian Hampar L Synergistic antimicrobial, dermatological and ophthalmic preparations containing chlorite and hydrogen peroxide
KR20030072766A (ko) * 2002-03-06 2003-09-19 (주)인터커머스 구취 억제능이 우수한 구강 위생용 조성물 및 그의제조방법
CN101600348A (zh) * 2006-12-04 2009-12-09 S.K.药物公司 包含亚氯酸盐和过氧化氢的协同抗微生物制备物

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108883069A (zh) * 2016-01-04 2018-11-23 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN108883069B (zh) * 2016-01-04 2021-07-20 中央研究院 基于酯化/皂化的用于微脂体负载的方法
CN112136044A (zh) * 2018-02-15 2020-12-25 耶迪特普大学 通过两相流体系统的外来体分离方法
CN112136044B (zh) * 2018-02-15 2024-05-28 耶迪特普大学 通过两相流体系统的外来体分离方法
CN110563829A (zh) * 2019-09-17 2019-12-13 中国人民解放军国防科技大学 用于调控脂质体囊泡行为、功能的反光蛋白体系及其应用
CN112716973A (zh) * 2019-10-28 2021-04-30 卢序 一种降低细胞还原应激的氧化剂的用途

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