MX2014007664A - Composiciones liposomicas de clorito o clorato. - Google Patents

Abstract

La presente solicitud incluye liposomas y composiciones liposomales que comprenden clorito, clorato o una mezcla de los mismos atrapados dentro del núcleo de liposoma, métodos para su preparación y métodos de uso, en particular como medicamentos.

Description

COMPOSICIONES LIPOSÓMICAS DE CLORITO O CLORATO La presente invención reclama el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional copendiente de los Estados Unidos No. 61/579,326, presentada el 22 de diciembre de 201 1 , cuyo contenido se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones liposómicas que comprenden clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, métodos para su preparación y su uso, por ejemplo, como medicamentos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Liposomas Los liposomas se han estudiado extensamente como vehículos para el suministro de fármacos. Existen reportes del uso eficiente de liposomas para el suministro de fármacos y vacunas (Gregoriadis, G. TIBTECH, 1995, 13:527-537, y referencias ahí citadas). Por ejemplo, se usan ampliamente sistemas de suministro de fármaco basados en liposoma para quimioterapia anticancerosa intravenosa, para administrar fármacos tales como doxorrubicina HCI, que se comercializa como Doxil y Myocet (Abraham et al. Methods Enzymol. 2005, 391 :71-97). Los liposomas también se pueden usar para suministrar fármacos en aerosol para inhalación, por ejemplo: i) insulina (Huang et al. J. Control. Release, 2006, 1 13:9-14); ii) antibióticos, particularmente dirigidos a infección de tuberculosis en macrófagos alveolares (Vyas et al., Int. J. Pharm. 2005, 296: 12-25); iii) fármacos quimioterapéuticos anticancerosos (Verschraegen et al. Clin Cáncer Res. 2004, 10:2319-2326); y iv) otros (véase la patente de EE. UU. No. 5,049,388).

Es muy común que las moléculas orgánicas de cierto tamaño sean incorporadas en liposomas. Se sabe que las moléculas más pequeñas, tales como etanol, glucosa, amoniaco y acetato, penetran a través de las bicapas de lípido del liposoma. Esta comportamiento se conoce como fuga.

Aunque hay ejemplos del uso exitoso de liposomas como sistemas de suministro de fármaco, todavía existen retos que enfrentar para muchas aplicaciones. La estabilidad química y física, eliminación, eficiencia de atrapamiento y direccionamiento, son algunos de los retos más grandes, en particular cuando se van a atrapar moléculas más pequeñas.

Clorito. clorato v mezclas de los mismos El ion clorito, CI02 , referido aquí como clorito, se ha usado en varios contextos. El clorito de sodio es un agente oxidante fuerte y se ha utilizado en la purificación de agua, desinfección y blanqueo y desodorización. Bajo condiciones ácidas, el clorito de sodio produce gas dióxido de cloro muy tóxico, y por lo tanto usualmente las soluciones acuosas utilizadas se proveen como soluciones muy básicas (pH aproximadamente 13), ajustando el pH con un agente básico tal como hidróxido de sodio.

Las sales de clorato se han usado tambien en varios contextos. El ion clorato, CI03 , referido aquí como clorato, es un agente oxidante fuerte y se ha utilizado en piroteenia, desinfección y plaguicidas. Además, el clorato se ha usado como un agente antimicótico para el tratamiento de enfermedades de la piel (patente de EE. UU. 5,427,801 ) y se ha encontrado que inhibe reversiblemente la sulfatación de proteoglicano en células infectadas con Chlamydia trachomatis ( J Med Microbiol, febrero de 2004, vol. 53 No. 293-95).

También se han utilizado composiciones que comprenden una mezcla de clorito y clorato en varios contextos, por ejemplo para tratar varias enfermedades o afecciones. El clorito estabilizado es un ejemplo no limitativo de estas composiciones. Por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 4,725,437, 4,507,285 y 4,851 ,222 revelan el uso de un clorito estabilizado para tratar heridas e infecciones y causar la regeneración de la médula ósea. El uso de un clorito estabilizado para inhibir respuestas inmunes específicas de antígeno se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 201 1/0076344. La publicación de la solicitud de patente de PCT No. 2001/017030 revela el tratamiento de una amplia gama de trastornos relacionados con macrófago por medio de la administración de un agente oxidante, tal como un clorito estabilizado. La patente de EE. UU. No. 7,105,183 describe el uso de un clorito estabilizado para tratar enfermedades neurodegenerativas asociadas con macrófago. La patente de EE. UU. No. 5,877,222 describe el uso de un clorito estabilizado para tratar la demencia relacionada con el SIDA. La publicación de la solicitud de patente de PCT 2008/145376 reporta el uso de un clorito estabilizado para tratar asma alergica, rinitis alérgica y dermatitis atópica. La publicación de la solicitud de patente de PCT No. 2007/009245 revela el uso de un clorito estabilizado en combinación con fluoropirimidinas para el tratamiento del cáncer. La publicación de la solicitud de patente de PCT No. 2001/012205 revela el uso de un clorito estabilizado para tratar el cáncer y otras afecciones que son afectadas por la modulación de la función del macrófago. La solicitud de patente EP No. 255145 revela el uso de un clorito estabilizado en oftalmología. Se ha reportado un estudio de fase II que evalúa el uso de un clorito estabilizado en el tratamiento de pacientes con cistitis y proctitis hemorrágica tardía tras radioterapia (Veerasarn, V. et al. Gynecologic Oncology, 2006, 100: 179-184). Se ha mostrado que el clorito estabilizado prolonga la supervivencia del xenomjerto en un modelo cardiaco de roedor (Hansen, A. et al., Pharmacology & Toxicology, 2001 , 89:92-95) y en otros estudios (Kemp, E. et al., Transplantation Proceedings, 2000, 32: 1018-1019). También se han reportado los efectos antimicrobianos de un clorito estabilizado (Stoll, P. et al., Zeitschrift fuer Antimikrobielle und Antineoplastische Chemotherapie, 1993, 11 :15-20; Stoll, P. et al, Chemotherapy, 1993, 39:40-47; Hollfelder, K. et al. Reakt. Sauerstoffspezies Med. 1987, 253-262; Adamczyk, R. et al. Reakt. Sauerstoffspezies Med. 1987, 247-252; Gillissen, G. et al. Arzneimittel-Forschung, 1986, 36: 1778-1782; Ullmann, U. et al. Infection, 1985, 13:S236-S240; Ullmann, U. et al, Infection, 1984, 12:225-229). Un estudio reciente mostró que un clorito estabilizado es capaz de estimular la citotoxicidad de celulas asesinas naturales (NK) contra células malignas, que se relaciona con la capacidad del clorito estabilizado para intensificar la inmunidad contra las células de tumor (Kühne, L. et al., J. Biomedicine and Biotechnology, 2011 , p. 436587).

En las publicaciones anteriores, el clorito está en forma de formulaciones disponibles comercialmente de clorito estabilizado, conocidas como Oxovasin™ (una formulación tópica) o WF10 (un medicamento para administración intravenosa). El Oxovasin™ y WF10 son diluciones de OXO-K993, por sí solo una solución acuosa. Originalmente se consideró al OXO-K993 como una solución que comprende como ingrediente activo un compuesto denominado tetraclorodecaoxígeno (TODO), y los términos tetraclorodecaoxígeno, tetraclorodecaóxido y TODO se usan frecuentemente en la literatura más antigua para referirse al ingrediente activo de WF10 y Oxoferin. Sin embargo, los análisis analíticos subsiguientes determinaron que OXO-K993 no contiene TODO, sino que más bien es una solución acuosa de iones clorito, cloruro, clorato y sulfato, con sodio como catión. Por lo tanto, la administración intravenosa de WF10 o la aplicación tópica de Oxoferin™ a un paciente abarca el suministro de una mezcla de iones. El OXO-K993 está disponible de Nuvo Manufacturing GmbH (Wanzleben, Alemania). El OXO-K993 y su preparación se describen en la patente de EE. UU. No. 4,507,285. Se han publicado artículos de revisión que describen OXO-K993 y WF10, que describen los diversos usos de esta sustancia conocidos en la actualidad ( Drugs in R&D, 2004, 5:242-244; McGrath et ai. Current Opinión in Investigational Drugs, 2002, 3:365-373).

Metodos de encapsulación La patente de EE. UU. No. 5,269,979 revela un método para formar vehículos denominados microvehículos de dilución disolvente (SDMCs) para encapsular moléculas pasajeras. Los vehículos encapsulantes se forman usando un método de múltiples pasos que incluye primero la preparación de una “solución formada”, seguido por un paso de organización que resulta en la creación de los SDMCs de la “solución formada”. La “solución formada” se prepara disolviendo un material antipático y una molécula pasajera en un disolvente orgánico, seguido por la adición de agua para obtener una solución turbia, y después la adición de un disolvente más orgánico para obtener la “solución formada” clara. La solución formada se puede usar inmediatamente o almacenarse. Los SDMCs se preparan usando un paso de organización que puede comprender diluir la “solución formada” en un sistema acuoso, aerosolización, o rehidratación in situ. En los SDMCs, la molécula pasajera es atrapada en la bicapa misma, o en asociación con un componente de la bicapa, en lugar de dentro del espacio creado por una bicapa esférica. Entre las moléculas portadoras que fueron encapsuladas en un SDMC estaba el tetraclorodecaóxido (TCDO). Es de notar que el proceso descrito en esta invención no incluye un paso de “purificación”, de modo que todos los materiales usados en la preparación del SDMCs permanecen en la solución final usada para las pruebas.

La solicitud de patente canadiense No. 2,636,812 revela una membrana de envoltura para descargar un agente encerrado a un medio acuoso. En un ejemplo, el agente encerrado es un compuesto de cloro-oxígeno oxidante, en particular TCDO. La membrana de envoltura que es insoluble y permeable al agua en un medio acuoso neutro, y generalmente se hace de polímeros catiónlcos y/o amónicos insolubles en agua. Las composiciones preparadas en esta invención son útiles para la desinfección y purificación de líquidos y superficies de substrato y para la desinfección de agua.

La publicación de la solicitud de patente coreana No. KR2003/072766 revela composiciones de higiene oral que comprenden clorito, específicamente clorito de sodio y iones zinc encapsulados en un liposoma. Adicionalmente, la composición puede contener vehículos o excipientes, puede tener una estructura de fase doble o sencilla y un pH de 7-8.5. En un ejemplo, el liposoma se prepara de lecitina.

La publicación de la solicitud de patente de PCT No. WO 00/19981 revela preparados antimicrobianos que incluyen clorito en combinación con un compuesto peróxido (por ejemplo, peróxido de hidrógeno), y metodos para usar estos preparados para desinfectar artículos o superficies. Los preparados se pueden formular como liposomas y pueden tener un pH entre 6.8-7.8. Para la actividad antimicrobiana se requiere tanto el clorito como el compuesto peróxido. Notablemente, en esta solicitud no se prepararon formulaciones liposómicas reales.

La publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2007/0145328 revela formulaciones de clorito, tal como clorito de sodio, para administración parenteral, sistémica o intravenosa, que comprenden clorito y un agente ajustador de pH. El agente ajustador de pH ajusta el pH de las formulaciones de modo que quede en la escala de aproximadamente 7 a aproximadamente 11.5. Se enseña que las formulaciones son menos tóxicas que WF10.

Panasenko et al., Membr Cell Biol. 1997; 11 (2):253-8 revelan la capacidad del hipoclorito de sodio (NaCIO), clorito (NaCI02), clorato (NaCI03) y perclorato (NaCI04) para iniciar la peroxidación de lípido. Los liposomas se preparan de fosfatidilcolina de huevo a un pH de 7.4 en NaCI simple y amortiguador. Las sales de ácido oxoclórico solamente se agregan a la fase exterior. No se realizan pasos para cargar las vesículas con clorito o clorato o para quitar las sales de ácido oxoclórico de la fase externa.

La publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 201 1/0052655 describe la encapsulación de biocidas en micro- o nanocápsulas (que incluyen liposomas) para controlar los trofozoitos y quistes de protozoarios en sistemas acuosos.

La publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2011/0177147 describe la encapsulación de una composición antimicrobiana en combinación con al menos un estabilizador para eliminar el ensuciamiento biológico en sistemas de transporte de agua industrial. La composición antimicrobiana puede ser un compuesto biocida no oxidante, tal como isotiazolina, y el estabilizador puede ser un amortiguador que contiene clorato.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a composiciones liposómicas que comprenden clorito, clorato o una mezcla de los mismos, y métodos para su preparación y uso.

Por consiguiente, la presente invención incluye una composición liposómica que comprende liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido y clorito, clorato o una mezcla de los mismos, encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados. Típicamente, en la composición hay una pluralidad de liposomas separados (referidos también como vesículas). Típicamente, las vesículas se dispersan en una fase acuosa y encapsulan una o más composiciones acuosas. Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad, el clorito, clorato o mezcla de los mismos se encapsulan en una pluralidad de vesículas cuyas paredes comprenden una o más bicapas de lípido. La presente invención también incluye un liposoma que comprende por lo menos una bicapa de lípido y clorito o clorato o una mezcla de los mismos atrapados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados.

La presente invención, además, incluye una composición liposómica que comprende clorito, clorato o una mezcla de los mismos, encapsulados y no encapsulados, en donde el clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados están en la fase interna, y el clorito, clorato o mezcla de los mismos no encapsulados están en la fase externa de la composición. Alternativamente, la fase externa puede comprender una sustancia diferente de clorito, clorato o la mezcla de los mismos, tal como otro agente terapeutico o cloruro de sodio. En una modalidad, el pH de la fase interna y la fase externa es igual. En otra modalidad, el pH de la fase interna y la fase externa son diferentes, por ejemplo, el pH de la fase interior puede ser un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12; y el pH de la fase externa puede ser aproximadamente neutro, tal como aproximadamente 6-8. En una modalidad de la presente invención, el pH de las fases interna y externa se ajusta por medio de amortiguadores tales como por ejemplo un amortiguador de carbonato.

En una modalidad adicional, el liposoma está comprendido de I ¡pidos que son adecuados para el atrapamiento de clorito, clorato o mezclas de los mismos que tienen un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, de aproximadamente 9 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12. En una modalidad, los lípidos se seleccionan de los que forman liposomas que son impermeables a la fuga de iones clorito y/o clorato a aproximadamente 5°C o más. Tales lípidos incluyen, por ejemplo, fosfolípidos como fosfatidilcolinas que tienen cadenas de ácido graso saturadas y/o insaturadas de una longitud suficiente, y/o esfingolípidos como esfingomielina, o mezclas apropiadas de tales lípidos que muestran el comportamiento deseado.

En otra modalidad, el clorito es una composición de clorito estabilizado, tal como OXO-K993, o una composición que comprende 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-50% o 50-90% (p/v) de OXO-K993. En una modalidad adicional, el clorito estabilizado comprende 10% (p/v) de OXO-K993 (el OXO-K993 diluido de esta manera se conoce como WF 10).

En una modalidad, el clorito estabilizado comprende 2% (p/v) de OXO-K993. En una modalidad adicional, el clorito estabilizado comprende aproximadamente 2% (p/v) de OXO-K993, aproximadamente 2% (p/v) de glicerol y aproximadamente 96% (p/v) de agua. Tal composición está disponible comercialmente como Oxovasin™ u Oxoferin™ (Nuvo Manufacturing GmbH, Wanzleben, Alemania).

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorito encapsulado presente en una cantidad de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) , de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorato encapsulado presente en una cantidad de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición.

En una modalidad adicional más, la composición liposómica comprende una mezcla encapsulada de iones clorato y clorito presentes en una cantidad de 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición. Cualquier composición de materia que contiene iones clorito y/o clorato también puede tener por lo menos un contraion para mantener la neutralidad de carga. De esta manera, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, las composiciones liposómicas comprenden uno o más cationes. Ejemplos no limitativos de posibles cationes incluyen cationes de metal alcalino (tal como sodio o Na+) y cationes alcalinotérreos. En otra modalidad, las composiciones liposómicas que comprenden iones clorito, iones clorato o una mezcla de los mismos, también comprenden contraiones de sodio y/o potasio. En una modalidad adicional, las composiciones liposómicas son isotónicas con respecto a los fluidos corporales de un sujeto. En este aspecto, la determinación de la isotonicidad es del dominio del experto en la materia.

La presente invención también incluye un método de preparación de liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido, y clorito, clorato o una mezcla de los mismos encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados que pueden ser de una fuente natural, semisintética o sintética. En una modalidad, el método comprende: (a) agregar una solución acuosa de clorito, clorato o una mezcla de los mismos a un recipiente que tiene una película de los lípidos sobre por lo menos una porción de una superficie interior; (b) agitar el recipiente bajo condiciones suficientes para remover parcial o totalmente la película de la superficie interior para proveer una solución turbia que comprende los liposomas con clorito y/o clorato atrapados; (c) tratar la solución turbia para reducir el diámetro promedio de los liposomas a una cantidad deseada; y (d) opcionalmente tratar los liposomas para quitar el clorito, clorato o mezcla de los mismos de una solución externa a los liposomas.

Siguiendo los métodos de la invención, en una modalidad la tasa de inclusión de clorito, clorato o mezcla de los mismos en los liposomas de la invención es de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50%, de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10%, o de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5%.

En otra modalidad, los liposomas de la presente invención se preparan usando un método de inyección de etanol. En una modalidad adicional, los liposomas se preparan usando un método de inyección de etanol que comprende la téenica de flujo cruzado.

La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden liposomas con al menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable.

La invención también incluye el uso de las composiciones de la presente invención como medicamentos. Las composiciones de la invención pueden ser estériles o no estériles dependiendo del uso deseado. Las composiciones de la invención también pueden ser libres de pirógeno.

La invención incluye también un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección para la cual resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención a un sujeto en necesidad de la misma.

La invención también incluye el uso de una composición de la invención para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección para la cual resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos.

En una modalidad, un método de uso de la composición comprende informar a un usuario de cierta seguridad o efectos clínicos. Por ejemplo, se puede informar al usuario que las composiciones liposómicas son más estables, específicas de objetivo o terapéuticamente eficaces que las composiciones no liposómicas que proveen, o se espera que provean, un efecto terapéutico similar. También se le puede informar al usuario que la composición, en uno o más aspectos, es más segura que las formulaciones no liposómicas que proveen, o que se espera que provean, un efecto terapéutico similar. Por ejemplo, el tratamiento con las composiciones liposómicas puede resultar en menores efectos secundarios, tales como menor irritación de la vena (flebitis), aumentando así la tolerancia y cumplimiento terapéutico del paciente. Adicionalmente, al usuario se le puede informar que las composiciones liposómicas se pueden administrar a una velocidad más alta (por ejemplo, impulso i.v. contra infusión de dilución) o en un volumen reducido en comparación con las formulaciones no liposómicas que proveen, o se espera que provean, un efecto terapeutico similar. Al usuario también se le puede informar que las composiciones liposómicas proveen una liberación prolongada, controlada o retardada del ingrediente activo. Además, al usuario se le puede informar que esta liberación prolongada o retrasada se puede personalizar o ajustar dependiendo de la identidad de los lípidos del liposoma y los tiempos requeridos para el tratamiento terapéutico por el usuario. Al usuario se le puede informar por medio de material publicado, tal como una etiqueta o inserto de producto.

Otras características y ventajas de la presente invención se harán evidentes de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debe entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades de la invención, se dan únicamente a manera de ilustración, puesto que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la solicitud se harán evidentes para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las modalidades de la invención se describirán ahora en mayor detalle haciendo referencia a los dibujos anexos, en los cuales: La figura 1 muestra una curva de dilución de WF10 usada para relacionar la absorbancia medida de clorito/clorato con un cierto factor de dilución inverso en el metodo B de o-toludina del ejemplo 7 para la detección de clorito/clorato en una muestra. El factor de dilución inverso se gráfica contra la absorbancia medida a 447 nm. La gráfica izquierda muestra el conjunto de datos completo, mientras que la gráfica derecha presenta únicamente el dominio no lineal. Las líneas superior e inferior representan los ajustes sobre las partes lineal y no lineal del conjunto de datos, respectivamente. La primera intersección de ambas marca la transición entre los dos dominios.

La figura 2 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de 1 -palm itoil-2-oleioil-sn-3-glicero-3-fosfocolina (POPC) y almacenados a 5°C, 23°C y 37°C.

La figura 3 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de esfingomielina (SM) y almacenados a 5°C, 23°C y 37°C. El conglomerado de puntos datos al final de la gráfica a aproximadamente 522 h es una medición después de que la temperatura se incrementó resueltamente a 37°C.

La figura 4 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de POPC:POPG (1 -palmitoi l-2-oleoil-sr?-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) a una proporción de 3: 1 , y almacenados a 5°C, 23°C y 37°C.

La figura 5 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de POPC:POPG a una proporción de 2: 1 y almacenados a 5°C, 23°C y 37°C.

La figura 6 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de POPC:POPG a una proporción de 1 :1 y almacenados a 5°C, 23°C y 37°C.

La figura 7 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y almacenados a 5°C y 23°C durante 1 , 5 y 7 días.

La figura 8 es una gráfica que muestra la fuga de clorito y clorato de liposomas preparados de esfingomielina, SM. El almacenamiento fue a 5°C (azul) y 23°C (rojo), seguido por un aumento de temperatura a 37°C, que produjo fuga inmediata.

La figura 9 es una gráfica que muestra la figura de clorito y clorato de liposomas preparados de DPPC y DPPC/DMPC y almacenados a 22°C y 38°C.

La figura 10 presenta una vista general de los estudios de estabilidad a largo plazo sobre liposomas de DPPC y DPPC/DMPC. Cada barra representa el resultado de los experimentos de fuga de una muestra a temperatura ambiente (aproximadamente 22°C) y en refrigerador (aproximadamente 6°C). El eje x representa el tiempo en días. El color gris medio marca liposomas en donde se encontró el contenido de WF10 en el medio externo por abajo del LOD. El color gris más claro marca periodos en donde el contenido de WF10 en el medio externo estaba por abajo del LOQ. El color gris más oscuro indica el contenido de WF10 por arriba del LOQ.

La figura 11 muestra los resultados del experimento de fuga de alta resolución (HRL) realizado con SX122 el 12 de diciembre de 201 1 , descrito en el ejemplo 12. Se pueden ver las gráficas de ambas muestras. Las curvas de temperatura están referidas en el lado derecho del eje y. La cantidad de sustancia fugada se provee como una fracción del volumen total de la muestra. El experimento se usó para determinar la temperatura a la que empieza la fuga en el transcurso de pocas horas.

La figura 12 muestra los resultados del experimento de HRL realizado con SX122 el 6 de enero de 2012, descrito en el ejemplo 12. Se pueden observar las gráficas para ambas muestras. Las curvas de temperatura están referidas en el lado derecho del eje y. La cantidad de sustancia fugada se provee como una fracción del volumen total de la muestra. El experimento examina el comportamiento de fuga a 38°C. El experimento se realizó durante varios días, indicando una fuga muy lenta a esta temperatura.

La figura 13 muestra los resultados del experimento de HRL realizado con SX126 el 26 de enero de 2012, descrito en el ejemplo 12. Se pueden ver las gráficas para ambas muestras. Las curvas de temperatura están referidas en el lado derecho del eje y. La cantidad de sustancia fugada se provee como una fracción del volumen total de la muestra. En la gráfica se puede ver la fuga parcial.

La figura 14 muestra los resultados del experimento de HRL realizado con SX126 el 22 de febrero de 2012, descrito en el ejemplo 12. Se pueden ver las gráficas para ambas muestras. Las curvas de temperatura están referidas en el lado derecho del eje y. La cantidad de sustancia fugada se provee como una fracción del volumen total de la muestra.

La figura 15 muestra los resultados del experimento de HRL realizado con SX126 el 25 de enero de 2012, descrito en el ejemplo 12. Se pueden ver las gráficas para ambas muestras. Las curvas de temperatura están referidas en el lado derecho del eje y. La cantidad de sustancia fugada se provee como una fracción del volumen total de la muestra.

La figura 16 es una gráfica que muestra la cantidad de sustancia liberada como una fracción del volumen total de la muestra, graficada contra el tiempo, para los experimentos reportados en el ejemplo 14. La gráfica grande muestra el experimento completo y tambien el límite de fuga superior, en donde el WF10 encerrado habría sido completamente liberado. Este es aproximadamente 7.5% del volumen total de la muestra, mostrando también por lo tanto la capacidad de encapsulación de los liposomas. La gráfica más pequeña cubre en mayor detalle el periodo en el que ocurre algo de fuga.

La figura 17 muestra un esquema de la preparación de los liposomas usando el método de inyección de etanol en una modalidad de la presente invención. Los liposomas que salen de la cámara de acero encapsulan el WF10 y se dispersan en una fase externa que comprende WF 10.

La figura 18 es una gráfica que muestra la cantidad de clorito recolectado en el filtrado durante el proceso de diafiltración para preparar liposomas que contienen WF10, usando el método de inyección de etanol.

La figura 19 es una gráfica que muestra la cantidad de clorito recolectado en el filtrado durante el proceso de diafiltración para preparar liposomas que contienen WF10, usando el metodo de inyección de etanol (repetición de los experimentos reportados en la figura 18).

La figura 20 es una gráfica que muestra la cantidad de clorito recolectado en el filtrado durante el proceso de diafiltración para preparar liposomas que contienen WF10, usando el método de inyección de etanol. Los liposomas se prepararon usando el doble de concentración de WF10 en comparación con los experimentos reportados en las figuras 18 y 19.

La figura 21 es una gráfica que muestra la puntuación de artritis inducida por colágeno (AIC) de ratones que recibieron WF10, WF10 en forma liposómica o NaCI (i.p.) después de la inducción de AIC.

La figura 22 es una gráfica de barras que muestra la puntuación de AIC el día 16 de ratones que recibieron WF10, WF10 en forma liposómica o NaCI (i.p.).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION I. DEFINICIONES A menos que se indique de otra manera, las definiciones y modalidades descritas en esta y otras secciones son aplicables a todas las modalidades y aspectos de la invención aquí descrita para la cual son adecuadas, como entendería el experto en la materia.

Los términos “un/una” o “el/la” usados en este documento no solo incluyen aspectos con un miembro, sino que también incluyen aspectos con más de un miembro. Por ejemplo, se entendería que una modalidad que incluye “un fosfolípido” presenta ciertos aspectos con un fosfolípido o dos o más fosfolípidos adicionales.

En las composiciones que comprenden un componente “adicional” o un “segundo” componente, el segundo agente se considera aquí químicamente diferente de los otros componentes o del primer componente. Un “tercer” componente es diferente de los otros componentes, el primero y el segundo; y similarmente los componentes enumerados extras o “adicionales” son diferentes.

El termino “agente” usado en este documento indica un compuesto o mezcla de compuestos que, cuando se agrega a una composición, tiende a producir un efecto particular sobre las propiedades de la composición.

El término “clorito” usado en este documento se refiere al anión “CI02“. Típicamente las especies aniónicas existen en las soluciones acuosas en forma disociada; sin embargo, frecuentemente el anión deriva de una sal original que contiene un anión y un catión.

El término “clorato” usado en este documento se refiere al anión “CI03“. Típicamente las especies aniónicas existen en las soluciones acuosas en forma disociada; sin embargo, frecuentemente el anión deriva de una sal original que contiene un anión y un catión.

El término “clorito estabilizado” usado en este documento se refiere a una composición o sustancia que comprende iones clorito (CI02 ) en la que la concentración de los iones clorito, el pH y/o la actividad permanecen estables durante un periodo aceptable antes de usarse. En un clorito estabilizado, los iones clorito no se degradan sustancialmente y la actividad de los iones clorito se mantiene sustancialmente antes de usarse. El clorito estabilizado puede contener un amortiguador, tal como un sistema amortiguador de carbonato de sodio/hidróxido de sodio, que mantiene el pH alcalino de la formulación. La concentración de los iones clorito se puede monitorear, por ejemplo, por medio de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

Como se usa en este documento, “WF10” se refiere a una dilución acuosa al 10% (p/v) de la sustancia fármaco OXO-K993, caracterizada analíticamente como una solución que contiene los iones clorito (4.25%), clorato (1.5%), cloruro (2.0%), sulfato (0.7%) y sodio (4.0%).

El término “un periodo aceptable” usado en este documento significa por lo menos aproximadamente 1 día, por lo menos aproximadamente 1 semana, por lo menos aproximadamente 30 días, por lo menos aproximadamente seis meses, por lo menos aproximadamente un año, por lo menos aproximadamente dos años, o por lo menos aproximadamente el tiempo entre la preparación y el uso.

El término “liposoma” usado en este documento se refiere a vesículas preparadas artificialmente compuestas de por lo menos una bicapa de lípido que rodea a un núcleo interior. La fase interior, fase interna o núcleo interior (usados aquí intercambiablemente) contiene sustancias tales como clorito, clorato, o una mezcla de los mismos. La vesícula se puede usar para suministrar las sustancias, por ejemplo, por vía tópica o dentro del cuerpo. Existen tres tipos de liposomas -MLV (vesículas multilaminares), SUV (vesículas unilaminares pequeñas de diámetro = 25-300 nm) y LUV (vesículas unilaminares grandes de diámetro >300 nm). El volumen del material exterior de las vesículas puede ser referido como la fase externa, fase exterior o fase continua. Estos términos se usan aquí intercambiablemente. Una composición liposómica comprenderá una pluralidad de liposomas individuales separados, y la fase interior y exterior usualmente comprenden agua.

Los esfingolípidos son una clase de lípidos que contienen como esqueleto esfingosina (2-amino-4-octadeceno-1 ,3-diol), unida a una variedad de grupos de cabeza.

La esfingomielina (SM) se refiere a un tipo de esfingolípido encontrado en membranas celulares de animales, especialmente en la vaina de mielina membranosa que rodea algunos axones de la célula nerviosa. La esfingomielina tiene un núcleo de ceramida (esfingosina unida a un ácido graso por medio de un enlace de amida) y un grupo de cabeza polar que es fosfocolina o fosfoetanolamina.

El término “encapsulado” o “atrapado” usado en este documento significa que el agente referido está localizado dentro, o en la fase interna o núcleo del liposoma. Es posible que el agente también esté localizado en la fase externa, exterior o continua.

El término “tasa de inclusión” usado en este documento se refiere al porcentaje de un material o solución que ha sido encapsulado en las vesículas liposómicas con respecto al material inicial durante un proceso de fabricación.

La “composición farmacéutica” se refiere a una composición de materia para uso farmacéutico. Los términos “composición farmacéutica” y “formulación” se usan intercambiablemente.

El “índice de polidispersividad” o “Pdl” es un número adimensional que está relacionado con la distribución de tamaño de partículas en una solución. El Pdl se puede obtener mediante el análisis de los datos de correlación medidos con la teenica conocida como dispersión de luz dinámica. Este índice es un número calculado de un ajuste simple de dos parámetros para los datos de correlación (el análisis de cumulantes). El Pdl es adimensional y se escala de tal manera que raramente se observan valores menores de 0.05 aparte de los estándares altamente monodispersos. Los valores mayores de 0.7 indican que la muestra tiene una distribución de tamaño muy amplia y probablemente no es adecuada para medición de distribución de tamaño por medio de la técnica de dispersión de luz dinámica (DLS). Los diversos algoritmos de distribución de tamaño funcionan con datos que se encuentran entre estos dos extremos. Los cálculos para estos parámetros se definen en el documento de la norma ISO 13321 :1996 E, e ISO 22412:2008.

El “material publicado” significa un medio que provee información, que incluye un medio audible, visual o electrónico, por ejemplo un folleto, anuncio, inserto de producto, etiqueta impresa, sitio web de internet, página web de internet, ventana instantánea de internet, transmisión de radio o televisión, disco compacto, DVD, podcast, grabación de audio, u otro medio de grabación o electrónico.

“Seguridad” significa la incidencia o severidad de eventos adversos asociados con la administración de una composición, que incluyen los efectos adversos asociados con factores relacionados con el paciente.

El término “cantidad eficaz” usado en este documento significa una cantidad suficiente para obtener el resultado deseado y por consiguiente dependerá del ingrediente y del resultado deseado. No obstante, una vez que se conoce el efecto deseado, la determinación de la cantidad eficaz es del dominio del experto en la materia.

El término “agua” usado en este documento como ingrediente de las composiciones de la invención se refiere a agua farmacéuticamente aceptable.

El término “solución acuosa” usado en este documento significa una solución en donde el disolvente es principalmente agua, aunque pueden estar presentes cantidades pequeñas de un disolvente no acuoso, por ejemplo menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 % (v/v).

El término “p/v” usado en este documento significa el número de gramos de soluto en 100 ml_ de solución.

El término “p/p” usado en este documento significa el número de gramos de soluto en 100 g de solución.

El término “solución turbia” se refiere a una solución que tiene apariencia lechosa o turbia debido a la presencia de partículas individuales o sólidos suspendidos que, individualmente, son generalmente invisibles a simple vista.

El término “temperatura de transición de fase” usado en este documento se refiere a la temperatura requerida para inducir un cambio en el estado físico del I í pido , de la fase ordenada de gel en donde las cadenas de hidrocarburo están completamente extendidas y estrechamente empaquetadas, a la fase cristalina líquida desordenada, en donde las cadenas de hidrocarburo están orientadas aleatoriamente en el fluido.

En general, las “barras de error” de las gráficas representan el error estándar del valor medio, mientras que la cima de la barra continua sombreada representa un solo valor dato que es el valor medio de la distribución de los valores datos.

El término “farmacéuticamente aceptable” significa compatible con el tratamiento de animales, en particular humanos.

El término “tratar” o “tratamiento” usado en este documento y como es bien entendido en la téenica, significa una aproximación para obtener resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, sin limitación, alivio o mejoramiento de uno o más síntomas o afecciones, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, prevención de diseminación de la enfermedad, retraso o retardo del avance de la enfermedad, mejoramiento o paliación del estado de la enfermedad, disminución de recurrencia de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. “Tratar” y “tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibiera el tratamiento. Como se usa en este documento, “tratar” y “tratamiento" también incluyen tratamiento profiláctico. Los métodos de tratamiento comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente activo y opcionalmente consiste en una sola administración, o alternativamente comprende una serie de aplicaciones. La duración del periodo de tratamiento depende de una variedad de factores tales como la severidad de la afección, la edad del paciente, la concentración del ingrediente o agente activo, la actividad de las composiciones aquí descritas, y/o una combinación de los mismos. El periodo de tratamiento también puede comprender ciclos, por ejemplo administración una vez al día durante aproximadamente dos a siete días, seguido por un periodo de descanso de aproximadamente 1 a 20 días, para constituir un ciclo de tratamiento. Los pacientes se pueden tratar con más de un ciclo, por ejemplo, por lo menos dos, tres, cuatro o cinco ciclos. También se apreciará que la dosis eficaz del agente usado para el tratamiento o profilaxis puede aumentar o disminuir durante el curso de un régimen de tratamiento o profilaxis particular. Por medio de ensayos diagnósticos estándares conocidos pueden resultar y hacerse evidentes cambios de la dosis. En algunos casos puede ser necesaria la administración crónica. Por ejemplo, las composiciones se administran al sujeto en una cantidad y durante un tiempo suficientes para tratar al paciente.

El término “sujeto” usado en este documento incluye todos los miembros del reino animal, incluso mamíferos, y convenientemente se refiere a los humanos.

Un “usuario” significa un sujeto tal como un paciente, un trabajador de atención médica o un proveedor farmacéutico.

El “potencial zeta” es una cantidad que está relacionada con la carga de superficie de una partícula en un líquido y da una indicación de la estabilidad potencial de un sólido disperso en un líquido o un líquido disperso en un líquido. Si todas las partículas de una suspensión tienen un potencial zeta negativo o positivo grande, entonces tenderán a repelerse entre sí y no habrá tendencia de flocular. Sin embargo, si las partículas tienen valores de potencial zeta bajos entonces tenderán a que menos fuerza impida que las partículas se acerquen y tendrán una mayor tendencia a flocular. Mayor información acerca del potencial zeta se puede encontrar en Hunter, R.J. (1988) “Zeta Potential in Colloid Science: Principies And Applications”, Academic Press, Reino Unido.

Cuando se usa con respecto a los métodos de tratamiento y al uso de las composiciones de la invención, un sujeto “en necesidad del mismo" puede ser un sujeto de quien se sospecha que tiene la afección por tratar, o al que se le ha diagnosticado la afección, o que ha sido tratado previamente por la afección.

En la comprensión del alcance de la presente revelación, el término “que comprende” y sus derivados, como se usan en este documento, se consideran términos de extremos abiertos que especifican la presencia de los atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos mencionados, pero no excluyen la presencia de otros atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos no mencionados. Lo anterior también se aplica a palabras que tienen significados similares tales como los términos “que incluye”, “que tiene”, y sus derivados. El término “que consiste" y sus derivados, como se usan en este documento, se consideran términos cerrados que especifican la presencia de los atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos mencionados, pero excluyen la presencia de otros atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos no mencionados. Como se usa en este documento, se considera que el término “que consiste esencialmente en”, especifica la presencia de los atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos mencionados, y también los que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de los atributos, elementos, componentes, grupos, enteros y/o pasos.

Los términos de grado tales como “sustancialmente”, “alrededor de” y “aproximadamente” usados en este documento significan una cantidad de desviación razonable del término modificado, de tal manera que el resultado final no cambia significativamente. Se considera que estos términos de grado incluyen una desviación de por lo menos ±5% del término modificado, si esta desviación no anula el significado de la palabra que modifica.

II. COMPOSICIONES LIPOSÓMICAS La presente invención está dirigida a composiciones liposómicas que comprenden clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, y métodos para su preparación y uso.

Por consiguiente, la presente invención incluye una composición liposómica que comprende liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido, y clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados. La composición liposómica comprende una pluralidad de liposomas que a su vez comprenden clorito, clorato o una mezcla de los mismos, encapsulados en la bicapa. Los liposomas comprenden lípidos adecuados que incluyen, por ejemplo, fosfolípidos tales como fosfatidilcolinas que tiene cadenas de ácido graso saturadas y/o insaturadas de longitud suficiente y/o esfingolípidos tales como esfingomielina, o mezclas apropiadas de estos lípidos que muestran el comportamiento deseado. Estos lípidos pueden ser de una fuente natural, semisintetica o sintética. Los liposomas, además, pueden comprender componentes adicionales tales como colesterol o sulfato de colesterol para incrementar la rigidez y reducir la permeabilidad de las bicapas, y/o lípidos cargados para incrementar la estabilidad de los liposomas.

La presente invención también incluye un liposoma que comprende por lo menos una bicapa de lípido, y clorito, clorato o una mezcla de los mismos, atrapados dentro del liposoma, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados.

La presente invención incluye, además, una composición liposómica que comprende clorito, clorato o una mezcla de los mismos encapsulados y no encapsulados, en donde el clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados están en la fase interna, y el clorito, clorato o mezcla de los mismos no encapsuiados están en la fase externa del liposoma. En otra modalidad, la proporción del clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados dentro de por lo menos una bicapa de lípido y los que están presentes en la fase externa, es de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1 : 100, o aproximadamente de 90: 10 a 10:90. Alternativamente, la fase externa puede comprender una sustancia diferente de clorito, clorato o la mezcla de los mismos, tal como otro agente terapéutico y/o cloruro de sodio.

En una modalidad de la invención, el pH de la fase interna y la fase externa es el mismo. En otra modalidad, el pH de la fase interna y la fase externa es diferente, por ejemplo, el pH en la fase interior puede ser un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12, y el pH de la fase externa puede ser aproximadamente neutro, tal como aproximadamente 6-8. En otra modalidad, la composición liposómica tiene una diferencia de pH entre la fase interior de núcleo y la fase exterior continua de aproximadamente 1 a aproximadamente 7, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.

En otra modalidad de la invención, la fase interna y la fase externa de los liposomas son isoosmóticas o exhiben la misma osmolaridad. Esto es, las osmolaridades de la fase interna y la fase externa están dentro del 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% o 7% una de otra. En una modalidad, al tener las soluciones en el interior y el exterior del liposoma a la misma o similar presión osmótica, la cantidad de fuga de sustancias hacia dentro o hacia fuera del liposoma se reduce. En una modalidad adicional, las composiciones liposómicas son isotónicas o isoosmóticas con respecto a los fluidos corporales de un sujeto.

Alternativamente, en una modalidad las osmolaridades de la fase interna y la fase externa de los liposomas son diferentes. Por ejemplo, la diferencia en osmolaridad entre la fase interna y la fase externa puede ser de aproximadamente 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 100% o 200%.

En una modalidad, las composiciones liposómicas de la presente invención muestran una estabilidad farmacéuticamente aceptable de aproximadamente 3-48 meses. En otra modalidad más, la estabilidad farmacéuticamente aceptable se obtiene con almacenamiento de la composición a una temperatura de aproximadamente 5°C a aproximadamente 50°C, o de aproximadamente 5°C a aproximadamente 30°C.

En una modalidad adicional, la composición de liposoma se puede liofilizar. Las téenicas de liofilización de liposomas son muy conocidos, por ejemplo, Chen et al. ( J . Control Release, 19 de marzo de 2010;142(3):299-311 ) resumen factores clave que determinan el efecto lipoprotector de liposomas criodesecados.

En una modalidad adicional, la composición de liposoma comprende liposomas que son vesículas unilaminares y/o multilaminares con un diámetro promedio de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 200 nm, o de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 140 nm. En otra modalidad, la composición liposómica comprende liposomas que son vesículas unilaminares y/o multilaminares con un diámetro promedio de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 15 micrómetros, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 12 micrómetros, o de aproximadamente 7 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros. La naturaleza de la distribución del tamaño de partícula puede ser unimodal o multimodal, y el índice de polidispersividad se puede controlar por medio del método de fabricación, como es conocido por el experto en la materia, y se puede determinar basándose en la vía de suministro deseada.

Puede ser conveniente administrar vesículas de un diámetro específico dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las vesículas con un diámetro de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 300 nm pueden ser útiles para administración intravenosa, mientras que las vesículas con un diámetro de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 10 micrómetros pueden ser útiles para administración por inhalación, tal como las vías pulmonar, traqueal o nasal.

En una modalidad adicional, las composiciones de liposoma se pueden esterilizar. Ejemplos no limitativos de las téenicas de esterilización adecuadas incluyen filtración, esterilización en autoclave, radiación gamma y liofilización (criodesecación). En una modalidad, la esterilización se realiza por filtración usando un filtro de 220 nm.

Sorprendentemente, dado que el clorito y el clorato contienen solo tres o cuatro átomos, respectivamente, se ha descubierto que es posible desarrollar liposomas en donde la bicapa de lípido que forma la vesícula liposómica es sustancialmente impermeable al clorito y/o clorato (es decir, las vesículas son herméticas a los iones). Esto a pesar del hecho de que se sabe que otras moléculas como etanol, glucosa, amoniaco y acetato penetran a través de las bicapas de lípido de los liposomas. Así, en una modalidad de la invención, la bicapa de lípido es sustancialmente impermeable al clorito. En otra modalidad de la invención, la bicapa de lípido es sustancialmente impermeable al clorato. En una modalidad adicional, la bicapa de lípido es sustancialmente impermeable al clorito y al clorato.

Los liposomas herméticos a iones de la presente invención se pueden obtener con una vesícula liposómica de una pared simple. En una modalidad de la invención, los liposomas herméticos a iones muestran estabilidad durante una vida en almacenamiento comercialmente aceptable (por ejemplo, aproximadamente 3-48 meses, a temperatura ambiente o de refrigeración). En otra modalidad, la fase externa (o exterior), en la que están dispersas las vesículas liposómicas herméticas a iones, se puede modificar por ingeniería para contener una composición que es diferente de la fase interna (o interior) encapsulada. Por ejemplo, las fases interior y exterior pueden contener diferentes concentraciones de clorito o, alternativamente, cualquiera de las fases puede estar sustancialmente libre de clorito. Como otro ejemplo, las fases interior y exterior pueden contener diferentes concentraciones de clorato o, alternativamente, cualquiera de las fases puede estar sustancialmente libre de clorato. En una modalidad de la invención, los pH de las fases interior y exterior de las formulaciones liposómicas herméticas a iones son diferentes. La fase exterior, por ejemplo, puede comprender una solución salina y puede tener un pH sustancialmente diferente que la fase interior, que puede contener clorito y/o clorato. En una modalidad, la fase exterior puede comprender cloruro de sodio, estar sustancialmente libre de clorito y/o clorato, y tener un pH aproximadamente neutro, mientras que la fase interior comprende clorito y/o, y tiene un pH más alto que la fase exterior. De esta manera, la bicapa de lípido que forma la vesícula liposómica, adicionalmente, puede ser sustancialmente impermeable a H+ y OH . Teóricamente, es posible medir el pH en los liposomas usando un metodo basado en RMN de 13C. Las composiciones liposómicas herméticas a iones de la presente invención pueden estar sustancialmente libres de clorato o pueden comprender vesículas liposómicas que contienen concentraciones de clorato diferentes que la fase externa. En otra modalidad de la invención, la distribución de los diámetros de las vesículas herméticas a iones que comprenden la composición liposómica tiene una escala de valores. En otra modalidad, la fase interior, la fase externa, o ambas, contienen una pluralidad de sustancias. En otras modalidades hay una variación en la composición del material atrapado en los diferentes liposomas de la dispersión liposómica.

En una modalidad, las composiciones liposómicas de la presente invención no contienen peróxido de hidrógeno, isotiazolina y/o iones zinc. En otra modalidad, las composiciones liposómicas no contienen liposomas preparados de lecitina. En una modalidad adicional, las composiciones liposómicas no contienen liposomas con clorito y/o contienen únicamente el clorito atrapado entre los dos lípidos de una bicapa de lípido. En otra modalidad más, las composiciones liposómicas están sustancialmente libres de productos de degradación.

En una modalidad adicional, los liposomas de la presente invención son estables, esto es, el clorito, clorato o mezcla de los mismos no se fuga del interior de los liposomas durante una vida en almacenamiento aceptable, por ejemplo, como se define en una especificación de producto aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) u otra agencia regulatoria gubernamental. En una modalidad, los liposomas son estables a temperaturas por debajo de aproximadamente 30°C, 25°C, 20°C, 15°C, 10°C, 9°C, 8°C, 7°C o 6°C, durante un periodo suficiente para permitir su uso para un propósito deseado. Por ejemplo, durante un periodo de 1 minuto a 1 hora, 1 hora a 24 horas, 1 día a 30 días, 30 días a 200 días, 6 meses a 1 año o más.

A. Clorito clorato v mezclas de los mismos Las composiciones liposómicas de la presente invención comprenden clorito, clorato, o una mezcla de los mismos. En una modalidad las composiciones liposómicas comprenden clorito. En una modalidad las composiciones liposómicas comprenden clorito estabilizado. En una modalidad las composiciones liposómicas comprenden clorato. En una modalidad las composiciones liposómicas comprenden clorito y clorato. En una modalidad, las composiciones liposómicas comprenden clorito y están sustancialmente libres de clorato. En una modalidad, las composiciones liposómicas comprenden clorato y están sustancialmente libres de clorito. En una modalidad la composición liposómica es una composición libre de clorato. En otra modalidad la composición liposómica es una composición libre de clorito.

En otra modalidad la composición liposómica comprende un clorito estabilizado. Ejemplos no limitativos de las composiciones de clorito estabilizadas incluyen las que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 6,350,438; 6,251 ,372; 6,235,269; 6,132,702; 6,077,502; y 4,574,084, el contenido de cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

En otra modalidad, el clorito estabilizado es una composición que comprende clorito, tal como OXO-K993 (que comprende tanto clorito como clorato), o una composición que comprende aproximadamente 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-50% o 50-90% (p/v) de OXO-K993. En una modalidad adicional, el clorito estabilizado es una composición que comprende WF10 o es WF10.

En una modalidad adicional, el clorito estabilizado es una composición que comprende aproximadamente 2% (p/v) de OXO-K993. En una modalidad adicional, el clorito estabilizado es una composición que comprende aproximadamente 2% (p/v) de OXO-K993, aproximadamente 2% (p/v) de glicerol y aproximadamente 96% (p/v) de agua. Este tipo de composiciones están disponibles comercialmente bajo las denominaciones Oxovasin™ y Oxoferin™ (Nuvo Manufacturing, Wanzleben, Alemania), en donde 1 mi de Oxovasin™ comprende aproximadamente 0.85 mg de clorito en 1.0 mi de agua (o aproximadamente 0.085% p/v). El pH de Oxovasin™ es entre 10.75 y 11.90.

En una modalidad de la invención, el OXO-K993 se prepara usando el siguiente metodo: Se mezcla clorito de sodio (NaCI02) e hipoclorito de sodio (NaOCI) en una proporción molar de 4.8 a 1 en agua para inyección (WFI). El pH de la solución debe ser mayor de 1 1.0. Después de la adición del catalizador (ácido clori Isu If ú rico, [CI02+] [HSO4 ]) a esta mezcla, se puede observar la siguiente reacción: 2 CICV + ocr + 2 H+ 2 CI02 + CI + H2O (1 ) El pH de la solución disminuye. Una porción del clorito se oxida a dióxido de cloro (CI02) en el proceso redox descrito por la ecuación (1 ). En una reacción en equilibrio, el dióxido de cloro en desarrollo forma un complejo de transferencia de carga de color pardo intenso con el exceso de clorito no oxidado, como se muestra en la ecuación (2): CI02 + CI02- ¾ [Cl204] (2) Después se agregan a la solución 9.65 mmol (por kg de la solución de reacción) de carbonato de sodio peroxohidrato (2 Na2CO3*3 H202). Tras la adición del carbonato de sodio peroxohidrato, una parte del dióxido de cloro se reduce de nuevo a clorito, y simultáneamente se forma oxígeno: 2 CI02 + H202 + 2 OH ® 2 CICV + 02 + 2 H20 (3) Después de un tiempo adecuado, por ejemplo 15 minutos, se agregan a la solución 102 mmol (por kg de la solución de reacción) de peróxido de sodio (Na202), con lo que la solución se decolora completamente ya que el dióxido de cloro remanente se reduce completamente a clorito. Del peróxido de sodio se desprende oxígeno en un proceso lento que típicamente requiere por lo menos de 4 semanas (ecuación 4). Simultáneamente se forman iones hidroxilo, dando como resultado un valor alto de pH (pH > 13) de la solución, con lo que se estabiliza la sustancia activa, el clorito. 2 022 + 2 H2O ® 02 + 4 OH (4) El producto de reacción final que resulta de esta síntesis, OXO-K993, es una solución acuosa estable que contiene los aniones clorito (4.25%), cloruro (2.0%), clorato (1.5%) y sulfato (0.7%), y sodio como catión, y también un sistema amortiguador de carbonato de sodio/hidróxido de sodio que mantiene el pH alcalino de la formulación.

El experto en la materia reconocerá que cualquier solución de clorito estabilizada químicamente, que incluye derivados de OXO-K993, WF10, Oxovasin™ u otras soluciones basadas en clorito o basadas en clorato y sus derivados, está completamente dentro del alcance de la invención. Estas soluciones se pueden usar en las composiciones, métodos y usos de la presente invención, y por tanto el alcance de la solicitud no necesariamente está limitado al uso de los productos aquí descritos.

OXO-K993 y sus derivados (WF10, Oxoferin, Oxovasin) también son ejemplos de composiciones que comprenden una mezcla de iones, puesto que las formulaciones comprenden una combinación de iones clorito, cloruro, clorato, sulfato y sodio. En una modalidad de la invención, una composición que comprende una mezcla de iones es una composición que comprende por lo menos dos tipos diferentes de aniones (clorato y clorito). En otra modalidad de la invención, la composición puede comprender por lo menos tres tipos diferentes de aniones. En una modalidad adicional de la invención, la composición puede comprender por lo menos 4, por lo menos 5 o por lo menos 6 tipos diferentes de aniones.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorito encapsulado, presente en una cantidad de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) , de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorato encapsulado, presente en una cantidad de aproximadamente 0.01% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición.

En una modalidad más, la composición liposómica comprende una mezcla encapsulada de iones clorito y clorato, presentes en una cantidad de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), o aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p) del contenido total de iones encapsulados de la composición. Cualquier composición de materia que contiene iones clorito y/o clorato también tiene por lo menos un contraion para mantener neutralizadad de carga. De esta manera, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, la composición liposómica comprende uno o más cationes.

Ejemplos no limitativos de posibles cationes incluyen cationes de metal alcalino (tales como sodio o Na*) y cationes alcalinotérreos. En otra modalidad, las composiciones liposómicas que comprenden iones clorito, iones clorato o una mezcla de los mismos, también comprenden contraiones sodio y/o potasio.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorito encapsulado, presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 100% (p/p) , de aproximadamente 1 % (p/p) a aproximadamente 90% (p/p), de aproximadamente 2% (p/p) a aproximadamente 80% (p/p), de aproximadamente 3% (p/p) a aproximadamente 70% (p/p), de aproximadamente 4% (p/p) a aproximadamente 60% (p/p), o de aproximadamente 5% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) del contenido total de aniones encapsulados de la composición.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende clorato encapsulado, presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 100% (p/p), de aproximadamente 1 % (p/p) a aproximadamente 90% (p/p), de aproximadamente 2% (p/p) a aproximadamente 80% (p/p), de aproximadamente 3% (p/p) a aproximadamente 70% (p/p), de aproximadamente 4% (p/p) a aproximadamente 60% (p/p), o de aproximadamente 5% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) del contenido total de aniones encapsulados de la composición.

En una modalidad adicional, la composición liposómica comprende una mezcla encapsulada de iones clorato y clorito, presentes en una cantidad de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 100% (p/p), de aproximadamente 1 % (p/p) a aproximadamente 90% (p/p), de aproximadamente 2% (p/p) a aproximadamente 80% (p/p), aproximadamente 3% (p/p) a aproximadamente 70% (p/p), de aproximadamente 4% (p/p) a aproximadamente 60% (p/p), o de aproximadamente 5% (p/p) a aproximadamente 50% (p/p) del contenido total de aniones encapsulados de la composición.

El experto en la materia reconocerá que la proporción de aniones en la composición iiposómica se puede ajustar cualitativa o cuantitativamente basándose en el uso deseado. Por ejemplo, la proporción de aniones en la composición se puede ajustar para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección específica. En una modalidad, la proporción del primer tipo de anión al segundo tipo de anión es de aproximadamente 100: 1 a aproximadamente 1 :100, de aproximadamente 90: 10 a 0:90, de aproximadamente 1 :1 a aproximadamente 3:1 (p/p), o aproximadamente 2: 1 (p/p). En una modalidad, el primer tipo de anión es el clorito y el segundo tipo de anión es el clorato.

En una modalidad, el pH del clorito, clorato o mezcla de los mismos es mayor de aproximadamente 8, mayor de aproximadamente 9, o mayor de aproximadamente 10. En una modalidad, el pH es de aproximadamente 8 a aproximadamente 14, de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, de aproximadamente 9 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12.

En otra modalidad, el pH del clorito, clorato o mezcla de los mismos es menor de aproximadamente 8, menor de aproximadamente 7, o menor de aproximadamente 6. En una modalidad, el pH es de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5.

En una modalidad adicional, la composición liposómica puede contener dos valores de pH; el primer valor se refiere al pH de la fase interior, interna o encapsulada, y el segundo valor se refiere al pH de la fase externa o exterior. Por ejemplo, el pH de la fase interior de una composición liposómica puede ser de aproximadamente 6-13, mientras que el pH de la fase exterior de una composición liposómica puede ser de aproximadamente 6-8. Por consiguiente, en una modalidad hay una diferencia de pH entre la fase interior y la fase exterior de entre aproximadamente 1 -7, aproximadamente 1 -6, aproximadamente 1-5, aproximadamente 1-4, aproximadamente 1 -3, aproximadamente 1 -2, o aproximadamente 1.

El clorito y clorato para usarse en la presente invención se pueden obtener de cualquier fuente disponible y están disponibles comercialmente. En una modalidad, el clorito o clorato es una sal de sodio, aunque el experto en la materia apreciará que se pueden usar otras sales de metal.

La cantidad de clorito, clorato o mezcla de los mismos en las composiciones liposómicas de la presente invención típicamente es la cantidad máxima que puede ser atrapada en el liposoma usando el método de preparación. En una modalidad, el clorito, clorato o mezcla de los mismos son atrapados con una eficiencia o tasa de inclusión de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 25%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%.

B. Lípidos Los lípidos comprendidos en los liposomas de la presente invención se seleccionan de los que son adecuados para el atrapamiento de iones que tienen un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12. Los factores que determinan la conveniencia de un lípido para preparar los liposomas de la presente invención incluyen: (1 ) la capacidad para formar bicapas de lípido en un medio acuoso; (2) la capacidad para encapsular cantidades apreciables de iones; (3) la impermeabilidad de los liposomas formados a la fuga de iones clorito y/o clorato; (4) la resistencia de los liposomas formados a la hidrólisis en medios alcalinos (p. ej., si el pH interior es de 8 o mayor); y/o (5) la capacidad de los liposomas formados para permanecer estables durante un periodo aceptable a temperaturas de almacenamiento dentro de la escala de aproximadamente 5°C a aproximadamente 50°C.

Los ejemplos aquí provistos demuestran que no todos los lípidos son adecuados para preparar liposomas estables para el atrapamiento de iones como clorito o clorato. Sorprendentemente, a traves de las enseñanzas de la presente invención, en una modalidad se encontró que los lípidos adecuados se seleccionan de fosfolípidos y esfingolípidos. En otra modalidad, los fosfolípidos adecuados se seleccionan de una fosfatidilcolina (PC) que comprende cadenas de acilo graso saturadas o insaturadas de longitud suficiente, tal como más de 12 átomos de carbono, o más de 13 o más de 14, y los esfingolípidos adecuados se seleccionan de esfingomielina (SM). En otra modalidad, los lípidos adecuados se seleccionan de esfingomielina (SM); 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimiristoil-2-sn-glicero-3-fosfocollna (DMPC), fosfolípidos hidrogenados de soya o yema de huevo, y mezclas de los mismos. En una modalidad adicional, los lípidos adecuados se seleccionan de los que forman liposomas que son impermeables a la fuga de iones a aproximadamente 23°C o más, a aproximadamente 37°C o más, o a aproximadamente 50°C o más. En otra modalidad, los liposomas de la invención pueden o no ser impermeables a la temperatura de transición de fase (PPT) de los lípidos de los que se forman, o a una temperatura cercana a la misma. Las PPTs para varios lípidos son conocidas, por ejemplo, 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-3-glicero-3-fosfocolina (-2°C), 1 ,2-dimiristoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (23°C), esfingomielina (37°C), 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (41 °C), y fosfolípidos hidrogenados de soya o yema de huevo (p. ej . , 50°C para el fosfolípido hidrogenado de soya).

Los liposomas de la invención pueden incluir dos o más tipos de lípidos adecuados. Cuando los liposomas comprenden dos tipos de lípidos adecuados, éstos pueden estar presentes en una proporción molar de 20:1 a 1 :1 , de 15: 1 a 5: 1 , o de 10:1 a 9:1. En una modalidad, los dos tipos de lípidos adecuados se seleccionan de esfingomielina (SM), 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimiristoil-2-sr7-glicero-3-fosfocolina (DMPC), y fosfolípidos hidrogenados de soya o yema de huevo.

Las composiciones de la invención pueden comprender, además, por lo menos un componente adicional tal como colesterol o sulfato de colesterol, para aumentar la rigidez y/o reducir la permeabilidad de las bicapas de lípido. El componente adicional puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, o de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% del contenido total de lípido.

Otra modalidad es la composición de la invención que comprende, además, por lo menos un componente adicional que da a los liposomas un potencial zeta que reduce la agregación de los liposomas, tal como un potencial zeta que es, por lo menos, más positivo que aproximadamente +0.5mV o más negativo que aproximadamente -0.5mV. En una modalidad, el potencial zeta es aproximadamente de +1 mV a +50mV, aproximadamente de +10mV a +40mV, o aproximadamente de + 15mV a +30mV. En otra modalidad, el potencial zeta es aproximadamente de -1 mV a -50mV, aproximadamente de -10mV a -40mV, o aproximadamente de -15mV a -30mV. En una modalidad adicional, el componente adicional que da a los liposomas un potencial zeta que reduce la agregación de los liposomas es un lípido cargado. En otra modalidad, los lípidos usados para preparar los liposomas de la presente invención incluyen por lo menos un lípido cargado. Aunque sin desear limitarse por teoría, la presencia de un lipido cargado ocasiona la repulsión de liposomas adyacentes conforme estos se aproximan entre sí, reduciendo la cantidad de contacto entre los liposomas y por lo tanto la cantidad de fusión o agregación de los liposomas, que ocasiona un aumento de su tamaño. Por consiguiente, una modalidad de la invención es de liposomas que comprenden I í pidos cargados que dan un potencial zeta que les permite repelerse entre sí, por ejemplo por lo menos más positivos que +1 mV, +5mV, +10mV, +15mV, +25mV, +35mV o +45mV, o más negativos que -1 mV, -5mV, -10mV, -15mV, -25mV, -35mV o -45mV.

En una modalidad, el lipido cargado es un lipido cargado negativamente, tal como un fosfatidilglicerol, una fosfatidiletanolamina, una fosfatidilserina, o un ácido fosfatídico. Sin embargo, no es necesario que el lipido cargado sea un fosfolípido o esfingolípido.

Los lípidos cargados negativamente son preferibles para preparar el liposoma de la presente invención; sin embargo, los liposomas de la presente invención no excluyen el uso de lípidos cargados positivamente. Por consiguiente, en una modalidad los liposomas de la invención pueden incluir por lo menos un lipido cargado positivamente. Por ejemplo, sal cloruro de 1 ,2-dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina, EPC (sal cloruro); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N-N-N-trimetilamonio (DOTMA), sal bromuro de dimetildioctadecilo (DDAB); y otros fosfolípidos catiónicos sensibles al pH. Sin embargo no es necesario que el lipido catiónico sea un fosfolípido o esfingolípido. Por ejemplo, se pueden usar otros lípidos cargados tales como metilsulfato de N-[1-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) para preparar los liposomas de la invención.

En una modalidad, el lípido cargado está presente en una cantidad que provee una proporción molar de lípido no cargado : lípido cargado de 20: 1 a 1 :1 , de 15:1 a 5: 1 , o de 10: 1 a 9:1. En una modalidad adicional, la presencia de un lípido cargado en los liposomas mejora la estabilidad del líposoma resultante, en particular en comparación con un liposoma por lo demás idéntico que carece del lípido cargado.

En una modalidad, los lípidos adecuados que están comprendidos en los liposomas de la presente invención se seleccionan de los que se listan en la tabla 1.

En una modalidad, los lípidos adecuados se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimiristoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1 -miristoil-2-estearoil-SA7-glicero-3-fosfocolina (MSPC), 1 -palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PMPC), 1 ,2-diestearoil-s/7-glicero-3-fosfocolina (DSPC), PC hidrogenada de huevo (HEPC), 1-palmitoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosf ocolina (PSPC), 1-estearoil-2-miristoil-sr7-glicero-3-fosfocolina (SMPC), 1-estearoil-2-oleoil-sr7-glicero-3-fosfocolina (SOPC), 1-estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (SPPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), 1 ,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1 ,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfolípidos hidrogenados de soya o yema de huevo, y mezclas de los mismos. En otra modalidad, el lípido es esfingomielina (SM) o esfingomielina de leche. En una modalidad adicional, el lípido es un fosfolípido hidrogenado de soya o yema de huevo. En otra modalidad, los lípidos adecuados se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimiristoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), fosfolípidos hidrogenados de soya o yema de huevo, y mezclas de los mismos, en combinación con un lípido cargado u otro lípido. En una modalidad adicional, el lípido cargado es un fosfolípido cargado negativamente. En otra modalidad, el fosfolípido cargado negativamente es un fosfatidilgl icerol , tal como las sales de 1 ,2,-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG), 1 ,2-dioleoil-sn-gl¡cero-3-fosfoglicerol (DOPG), o 1 ,2-diestearoil-s/?-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG), una fosfatidiletanolamina tal como las sales de 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), o 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-metil-polietilenglicol (MPEG-DSPE), o una mezcla de los mismos. En una modalidad adicional, el fosfatidilglicerol es DPPG o DSPG, o una mezcla de los mismos.

Una modalidad de la invención es cuando se usa una mezcla de lípidos en los liposomas y el lípido que está presente en cantidad mayoritaria es un lípido con una PTT mayor de aproximadamente 5°C a aproximadamente 30°C. Tales lípidos son aquellos que por ejemplo comprenden una cadena de carbono que contiene más de 12 átomos de carbono contiguos.

En una modalidad de la invención son deseables proporciones particulares de lípidos. En otra modalidad, los lípidos se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1 ,2-dimiristoil-2-sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC), en una proporción molar de 9:1. En una modalidad adicional, los lípidos se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG), en una proporción molar de 9: 1. En otra modalidad, los lípidos se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1 ,2,-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), en una proporción molar de 9: 1. En otra modalidad más, el lípido adecuado es DPPC pura.

También se pueden seleccionar lípidos con una PPT particular para la preparación de la composición liposómica de la invención. Por consiguiente, una modalidad de la invención es la de liposomas que comprenden lípidos con una PPT que está por arriba de la temperatura corporal de un animal. Otra modalidad de la invención es la de liposomas que comprenden lípidos con una PPT por debajo de la temperatura corporal de un animal.

Tales materiales están disponibles comercialmente, por ejemplo de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, EE. UU.), LIPOID GmbH (Alemania), o se pueden preparar usando los métodos conocidos.

C. Agentes modificadores de superficie del liposoma Para aumentar el tiempo de circulación de los liposomas de la presente invención, una modalidad es que la superficie de los liposomas, o la bicapa de lípido, se modifica con moléculas que aumentan la hidrofilicidad, tal como con polímeros hidrófilos.

En una modalidad, el polímero hidrófilo es poli(etilenglicol) (PEG). Se ha mostrado que la presencia de PEG en la superficie de los liposomas prolonga el tiempo de circulación en la sangre reduciendo la captación del sistema de fagocito mononuclear (MPS).

La modificación de la superficie de los liposomas con PEG se puede lograr de varias maneras: adsorbiendo físicamente el polímero sobre la superficie de las vesículas, incorporando el conjugado PEG-lípido durante la preparación del liposoma, o enlazando covalentemente grupos reactivos sobre la superficie de los liposomas preformados.

La inserción de PEG sobre los liposomas ha mostrado varias ventajas biológicas y teenológicas. Las propiedades más significativas de las vesículas pegiladas son su captación de MPS fuertemente reducida y su circulación prolongada en la sangre, mejorando así la distribución en los tejidos perfundidos. Además, las cadenas de PEG sobre la superficie del liposoma evitan la agregación de vesículas mejorando la estabilidad. Los liposomas modificados con PEG también son referidos frecuentemente como liposomas “protegidos”. El Doxil™ (inyección de liposoma de doxorrubicina HCI) es una doxorrubicina encerrada en liposoma con polietilenglicol (PEG) auxiliar, utilizado para esquivar el sistema reticuloendotelial (RES) y prolongar el tiempo de circulación del fármaco (véase Vail D M, Amantea M A, Colbern G T, et al., “Pegylated Liposomal Doxorublcin. Proof of Principie Using Preclinical Animal Models and Pharmacokinetic Studies” Semin Oncol. (2004) 31 (Supl. 13): 16-35).

En liposomas compuestos de fosfolípidos y colesterol se ha encontrado que la capacidad del PEG para aumentar la vida en circulación de las vesículas depende tanto de la cantidad del PEG injertado como de la longitud o peso molecular del polímero (Alien T M, ef al. Biochim Biophys Acta. 1989, 981 :27-35). En la mayoría de los casos, los PEG de cadena más larga han producido los mejoramientos más grandes en el tiempo de residencia en la sangre. En una modalidad, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 1500 a aproximadamente 5000.

Otros polímeros hidrófilos que se pueden usar para modificar la superficie de los liposomas de la presente invención incluyen polímeros que son solubles en agua, hidrófilos, que tienen una cadena principal flexible y biocompatibilidad. En una modalidad, los polímeros hidrófilos se seleccionan de PEG, poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(acrilamida) (PAA), fosfatidilpoligliceroles, poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], polímeros biodegradables basados en L-aminoácidos, alcohol polivinílico (p. ej . , PVA con un PM de aproximadamente 20,000), poli(2-metil-2-oxazolina), poli(2-etil-2-oxazolina), y mezclas de los mismos.

En otra modalidad, la superficie del liposoma se modifica con un gangliósido y/o un derivado de ácido siálico, tal como monosialogangliósido (GM1 ). Se han probado varios glicolípidos en estudios de captación de MPS de liposomas después de inyección i.v.: el glicolípido GM1 (un monosialogangliósido derivado de tejido cerebral) disminuyó significativamente la captación de MPS cuando se incorporó en la superficie del liposoma, y la formulación permaneció en la circulación sanguínea por varias horas. Los liposomas injertados con GM1 con un diámetro en la escala de 90-200 nm tienen una mayor retención en la sangre con la acumulación consecuente en los tejidos del tumor, en comparación con los de tamaño fuera de esta escala. Los liposomas recubiertos con GM pueden ser útiles para administración oral y suministro al cerebro. En particular, se ha sugerido que entre las formulaciones liposómicas usadas como vehículos de fármacos orales, los que contienen GM1 y GM de tipo III tienen más posibilidades de sobrevivir a través del tracto gastromtestinal (Taira M C, et al. Drug Deliv. 2004; 11 :123-8). Además, hubo una captación del trazador cerebral más alta con los liposomas de GM1 que con los liposomas de control en la corteza, ganglios básales y mesencéfalo de ambos hemisferios; inversamente, no se observaron cambios significativos en la captación en el hígado o la concentración en la sangre del trazador (Mora M, et al. Pharm Res. 2002; 19: 1430-8).

Además de los liposomas modificados con PEG, los investigadores desarrollaron una variedad de otros lípidos modificados. Estos lípidos modificados también pudieron incorporarse en liposomas. Véase por ejemplo la solicitud de patente internacional WO 93/01828; Park Y S, Maruyama K, Huang L. “Some negatively charged phospholipids derivatives prolong the liposome circulation in vivo”, Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1108: 257-260; Ahí et al., Biochimica Biophys. Acta (1997) 1329: 370-382.

D. Porciones de direccionamiento Para aumentar la acumulación del fármaco liposómico en los tejidos deseados, produciendo una actividad terapéutica más alta y más selectiva, en una modalidad los liposomas de la presente invención se modifican pegando en su superficie porciones de direccionamiento específicas de celula para facilitar su asociación con un tipo específico de célula o tejido. Las porciones de direccionamiento incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales (mAb) o fragmentos, péptidos, factores de crecimiento, glicoproteínas, carbohidratos, o ligandos de receptor, o mezclas de los mismos. Las porciones de direccionamiento ejemplares incluyen, sin limitación, transferrina, ácido fólico, folato, ácido hialurónico, cadenas de azúcar (p. ej . , galactosa, mañosa, etc.), fragmentos de anticuerpos monoclonales, asialoglicoproteína, etc., y también otros factores de direccionamiento conocidos para el experto en la materia, y mezclas de los mismos. En modalidades particulares el factor de direccionamiento es una proteína, péptldo u otra molécula dirigida a un receptor de superficie celular (p. ej., transferrina, folato, ácido fólico, aisialoglicoproteína, etc.).

Ejemplos de composiciones de lípido que incluyen factores de direccionamiento incluyen los que se describen en las patentes de EE. UU. Nos. 5,049,390; 5,780,052; 5,786,214; 6,316,024; 6,056,973; 6,245,427; 6,524,613; 6,749,863; 6, 177,059; y 6,530,944; las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. Nos. 2004/0022842; 2003/0224037; 2003/143742; 2003/0228285; 2002/0198164; 2003/0220284; 2003/0165934; y 2003/0027779; las solicitudes de patente internacional Nos. WO 95/33841 ; WO 95/19434; WO 2001037807; WO 96/33698; WO 2001/49266; WO 9940789; WO 9925320; WO 9104014; WO 92/07959; EP 1369132; y JP 2001002592; y en linuma H, et al. Int J Cáncer, 2002, 99: 130-137; Ishida O, et al.

Pharmaceutical Research, 2001 , 18: 1042-1048; Holmberg et al.

Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 165(3):1272-1278; Nam et al., J. Biochem. Mol. Biol. 1998, 31 (1): 95-100; y Nag et al. J. Drug Target. 1999, 6(6): 427-438.

En particular, linuma et al. (ib.) desarrollaron un Tf-PEG-liposoma, con transferrina (Tf) pegada en la superficie del liposoma, y mostraron que un número más grande de liposomas se unieron a la superficie de las células de tumor, y hubo una mayor captación de liposomas por parte de las células de tumor del Tf-PEG-liposoma en comparación con PEG-liposoma (Inuma et al., ib.; Ishida et al., ib.).

Ejemplos de porciones de direccionamiento específicas y sus blancos terapéuticos son como sigue: anti-HER2 (trastuzumab) -cáncer de mama/ovario; anti-EGF -tumores sólidos; anti-CD19 -linfoma; anti-CD22 -linfoma de células B; anti-integrina betal -células cancerosas; anti-GD2 -neuroblastoma; anti-GAH -cáncer gástrico, colónico y mamario; ácido fólico -células cancerosas; transferrina -células cancerosas; anisamida -cáncer de mama, melanoma y próstata; péptido vasoactivo intestinal octacosamérico -imaginología de células de cáncer de mama; RGD -neuroblastoma, melanoma y cáncer de colon; péptido de homing angiogénico -melanoma, sarcoma y cáncer de colon.

En una modalidad, las composiciones liposómicas de la invención se inyectan a un sujeto y se aplica calor a la parte del cuerpo relevante para permitir el suministro dirigido del contenido de la vesícula. Esto es particularmente útil con liposomas que son estables a la temperatura corporal. Métodos conocidos como el tratamiento hipertérmico del cáncer se pueden beneficiar del suministro dirigido de las composiciones de la invención.

En una modalidad, los liposomas de la presente invención comprenden un péptido hidrófilo modificador de superficie y una porción de direccionamiento. En otra modalidad, estos liposomas se preparan incorporando en la formulación de liposoma un derivado de PEG de un lípido adecuado que contiene un grupo maleimida en el extremo de la cadena de PEG. Después de la preparación del liposoma, las porciones de direccionamiento que comprenden un átomo nucleofílico de N, O y/o S, por ejemplo, se unen mediante enlace de superficie a un grupo maleimida del PEG-liposoma antes mencionado, obteniendo un enlace estable. Alternativamente liposomas de circulación prolongada comercialmente precargados se modifican por postinserción de la porción de direccionamiento.

E. Otros componentes En modalidades adicionales de la presente invención, las composiciones liposómicas y liposomas de la invención comprenden además otros aditivos o agentes que son convenientes para aplicaciones particulares. Tales aditivos o agentes incluyen, sin limitación, humectantes, disolventes, antibióticos, colorantes, perfumes, fragancias y similares. En una modalidad las composiciones comprenden un antioxidante. En una modalidad, los antioxidantes para usarse en la presente invención incluyen hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, linoleato de ascorbilo, dipalmitato de ascorbilo, maleato de ascorbil tocoferol, ascorbato de calcio, carotenoides, ácido kójico y sus sales farmaceuticamente aceptables, ácido tioglicólico y sus sales farmacéuticamente aceptables (p. ej . , de amonio), tocoferol, acetato de tocoferol, tocofereth-5, tocofereth-12, tocofereth-18 o tocofereth-80, o mezclas de los mismos.

III. MÉTODOS DE PREPARACIÓN Los liposomas de la presente invención se pueden preparar usando cualquier método conocido para la preparación de liposomas, por ejemplo métodos de película delgada, sonicación, extrusión, homogeneización a presión alta, microfluidización, diálisis con detergente, método de inyección de etanol, el método de inyección de etanol comprendiendo la téenica de flujo cruzado, fusión inducida por calcio de vesículas pequeñas de líposoma y métodos de infusión de éter. Tales métodos son muy conocidos (véase por ejemplo “Liposome Technology”, G. Gredoriadis (ed.), 1991 , CRC Press: Boca Ratón, Florida; D. Deamer y A. D. Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 1976, 443: 629-634; Fralcy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1979, 76: 3348-3352; F. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1980, 9: 467-508; Hope et al., Biochim. Biophys. Acta, 1985, 812: 55-65; L. D. Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1986, 858: 161 -168; Hope et al., Chem. Phys. Lip., 1986, 40: 89-1-7; K. J. Williams et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 1988, 85: 242-246; Wagner y Vorauer-Uhl, 10urnal of Drug Delivery, 2011 , p. 1-9; Wagner et al., Journal of Liposome Research, 2002, 12(3): 259-270; Wagner et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2002, 54:213-219, y patentes de EE. UU. Nos. 4,217,344; 4,235,871 ; 4,241 ,046; 4,356, 167; 4,485,054; 4,551 ,288; 4,663, 161 ; 4,737,323; 4,752,425; 4,774,085; 4,781 ,871 ; 4,877,561 ; 4,927,637; 4,946,787; 5,190,822; 5,206,027; 5,498,420; 5,556,580; y 5,700,482).

En una modalidad, los liposomas se preparan usando el método de película delgada tradicional. En este método, los elementos formadores de la bicapa se mezclan con un disolvente o mezcla de disolventes orgánicos volátiles (p. ej . , cloroformo, éter, metanol, etanol, butanol, ciclohexano, y similares). Después se evapora el disolvente (p. ej., usando un evaporador rotativo, una corriente de nitrógeno seco o argón, u otros medios) dando como resultado la formación de una película de lípido seca. La película se hidrata entonces con un medio acuoso que contiene clorito, clorato o una mezcla de los mismos. Los pasos de hidratación usados afectan el tipo de liposomas formados (p. ej., el número de bicapas, tamaño de vesícula y volumen de atrapamiento). La película delgada de lípido hidratado se separa durante la agitación y se cierra por sí sola para formar vesículas multilaminares (MLVs) grandes de tamaños heterogéneos. La distribución del tamaño de las vesículas multilaminares resultantes se puede desviar hacia tamaños más pequeños hidratando los lípidos bajo condiciones de agitación más vigorosas, o agregando detergentes solubilizantes tales como desoxicolato. Alternativa o adicionalmente, el tamaño de la vesícula se puede reducir por sonicación, congelación/descongelación o extrusión (véase más abajo).

Se pueden preparar vesículas unilaminares grandes (LUVs) de las MLVs usando una variedad de métodos. Por ejemplo, la extrusión de MLVs a través de filtros puede proveer LUVs cuyos tamaños dependen del tamaño de poro del filtro usado. En tales métodos (que se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 5,008,050), la suspensión de liposoma de MLV se pasa repetidamente a través del dispositivo de extrusión, dando como resultado una población de LUVs de distribución de tamaño homogénea. Cuando se usan lípidos que tienen una transición de gel a cristal líquido arriba de la temperatura ambiente, se puede utilizar un extrusor que tiene un cilindro caliente (o camisa térmica). Las LUVs se pueden exponer a por lo menos un ciclo de congelación-descongelación antes del procedimiento de extrusión, como lo describen Mayer et al. ( Biochim . Biophys. Acta, 1985, 817: 193-196).

Otros métodos para la preparación de vesículas unilaminares se basan en la aplicación de una fuerza cortante a una dispersión acuosa de liposomas. Tales métodos incluyen sonicación y homogeneización. La sonicación de una suspensión de liposoma usando un sonicador de baño o sonda resulta en una reducción progresiva de tamaño, hasta vesículas unilaminares pequeñas de tamaño menor de 50 nm. El tamaño de las vesículas liposómicas se puede determinar por medio de dispersión de luz cuasielástica (QELs) (V. A. Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1981 , 10: 421-450). En un procedimiento de homogeneización típico, las vesículas multilaminares se hacen circular repetidamente a través de un homogeneizador estándar de emulsión a una presión de 207 bar a 965 bar (3,000 a 14,000 libras por pulgada cuadrada), preferiblemente de 689 bar a 965 bar (10,000 a 14,000 libras por pulgada cuadrada) y a una temperatura que corresponde a la temperatura de transición de gel-cristal líquido del lípido con la Te más alta, hasta que se observan los tamaños de liposoma seleccionados, típicamente entre 100 y 500 nm, aproximadamente.

Otras téenicas para preparar LUVs incluyen evaporación de fase inversa (patente de EE. UU. No. 4,235,871 ) y procedimientos de infusión y dilución de detergente. Por ejemplo, se pueden producir vesículas unilaminares disolviendo lípidos en cloroformo o etanol y después inyectando los lípidos en un amortiguador, haciendo que los lípidos se agreguen espontáneamente y formen vesículas unilaminares. Alternativamente, los fosfolípidos se pueden solubilizar en un detergente (p. ej . , colatos, Triton-X o n-alquilglucósidos). Después de la formación de las micelas solubilizadas de lípido-detergente, el detergente se separa por diálisis, filtración en gel, cromatografía de afinidad, centrifugación, ultracentrifugación o cualquier otro método adecuado.

En una modalidad, la presente invención incluye un método de preparación de liposomas que comprenden clorito, clorato o una mezcla de los mismos atrapados dentro de por lo menos una bicapa de lípido, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados, el método comprendiendo: (a) añadir una solución acuosa de clorito, clorato o una mezcla de los mismos a un recipiente que tiene una película de uno o más lípidos sobre por lo menos una porción de una superficie interior; (b) agitar el recipiente bajo condiciones suficientes para separar parcial o totalmente la película de la superficie interior para proveer una solución turbia que comprende los liposomas de clorito y/o clorato atrapados; (c) tratar la solución turbia para reducir el diámetro promedio de los liposomas a una cantidad deseada, por ejemplo entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 300 nm; y (d) opcionalmente tratar los liposomas para separar el clorito, clorato o la mezcla de los mismos de una solución externa a los liposomas.

En otra modalidad, los liposomas de la presente invención se preparan usando un método de inyección de etanol, por ejemplo como se describe en Wagner y Vorauer-Uhl, 10urnal of Drug Delivery, 2011 , p. 1 -9, cuyas porciones relevantes se incorporan aquí como referencia. En una modalidad adicional, los liposomas se preparan usando un método de inyección de etanol por medio de la téenica de flujo cruzado, por ejemplo, como se describe en Wagner et al., Journal of Liposome Research, 2002, 12(3): 259-270, cuyas porciones relevantes se incorporan aquí como referencia.

En una modalidad, la proporción molar de los lípidos adecuados al clorito, clorato o mezcla de los mismos en (a) es de aproximadamente 0.01 : 1 a aproximadamente 10000: 1 , de aproximadamente 0.1 :1 a aproximadamente 5000: 1 , de aproximadamente 0.5:1 a aproximadamente 2500: 1 , de aproximadamente 1 : 1 a aproximadamente 1000:1 , o de aproximadamente 0.1 :1 a aproximadamente 100: 1.

Los lípidos usados para la preparación de los liposomas de la presente invención se pueden comprar como soluciones, en particular de Avanti Lipids. LIPOID AG suministra los lípidos no diluidos en estado sólido. En algunas modalidades la concentración de la solución es de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg de lípido por mililitro de solución. La cantidad de esta solución usada para la preparación de los liposomas variará dependiendo de la cantidad de lípidos necesaria, lo que dependerá del volumen de muestra deseado. Si se usan lípidos puros no disueltos, los lípidos se disuelven en un volumen apropiado de cloroformo u otro disolvente orgánico adecuado.

Para obtener un recipiente que tiene una película de uno o más lípidos sobre por lo menos una porción de una superficie interior, en una modalidad el recipiente se trata con agitación bajo presión reducida y a una temperatura cercana o superior a la temperatura de transición de fase (PPT) de los lípidos, para eliminar el disolvente. Es de notar que no es necesario estar arriba de la PTT en el paso de evaporación. Para soluciones de cloroformo se puede aplicar un baño de agua de 37°C, que está por debajo de la PTT de DPPC (41 °C) y del fosfolípido hidrogenado de soya (50°C). En una modalidad el disolvente se elimina usando un evaporador rotativo, manteniendo el recipiente a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos.

La solución acuosa se agrega al recipiente y el recipiente se agita bajo condiciones suficientes para separar la película de la superficie interior del recipiente, para proveer una solución/dispersión turbia que comprende liposomas. En una modalidad, las condiciones suficientes para separar la película comprenden agitar el recipiente y calentar el recipiente a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos. En otra modalidad, las condiciones comprenden también agitar a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 2 horas, o de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora. En este paso, ocurre rehidratación de los lípidos con formación de liposomas y atrapamiento de la solución de clorito, clorato o mezcla de los mismos. Estos, denominados liposomas primarios, son vesículas multilaminares grandes (LMV) con la solución tanto dentro (fase interior) como fuera (fase exterior) de los liposomas. En esta etapa la muestra es una solución/dispersión turbia de color blanco lechoso.

El tratamiento de la solución turbia para reducir el diámetro promedio de los liposomas a entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 300 nm, se puede hacer usando cualquier método conocido para reducir el tamaño de los liposomas. En una modalidad de la invención se usa una combinación de ciclos de congelación-descongelación y métodos de extrusión. En otra modalidad solo se usan métodos de extrusión.

Para el ciclo de congelación-descongelación, en una modalidad la muestra se transfiere a un recipiente adecuado (si se requiere), tal como un criotubo, y el recipiente se sumerge en nitrógeno líquido y subsiguientemente se descongela en un baño de agua a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos. En una modalidad se efectúan por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 ciclos. Aunque no se desea limitarse por teoría, la congelación resulta en la destrucción de los liposoma primarios y la descongelación, a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos, resulta en la reformación espontánea de los liposomas con un diámetro promedio más pequeño. Sin embargo, los métodos de congelación-descongelación son opcionales.

En una modalidad de la invención, los métodos de extrusión se efectúan prensando la muestra de liposoma a través de por lo menos un filtro de disco de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm. En una modalidad el prensado se hace aplicando una presión a un extrusor que comprende el filtro apropiado. En una modalidad adicional, la extrusión se efectúa a una temperatura por arriba de la temperatura de transición de fase de los lípidos y se repite por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces.

En una modalidad, el uso de los métodos de extrusión solo provee liposomas unilaminares con un diámetro promedio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, o aproximadamente 100 nm. En otra modalidad se puede usar un método de sonicación para reducir el tamaño de partícula o convertir MLVs en LUV/SUVs.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención proveen composiciones liposómicas que están sustancialmente libres de productos de degradación, por ejemplo, monitoreados por MALDI-TOF. En una modalidad adicional, los métodos de la presente invención proveen composiciones liposómicas que contienen cantidades de productos de degradación que cumplen con las guías aprobadas por la FDA u otras autoridades regulatorias.

En esta etapa, la muestra comprende liposomas llenos de iones dispersos en una solución de clorito, clorato o una mezcla de los mismos. En una modalidad, la fase exterior que comprende la solución se reemplaza, por ejemplo, con solución salina, usando un tratamiento de diálisis opcional. En una modalidad, la muestra se llena en una cámara de diálisis y se pone en una solución salina a una temperatura por debajo de la PPT de los lípidos. Después de 1 hora, con agitación, el exceso de medio se intercambia y el procedimiento se repite por lo menos 1 , 2, 3 o 4 veces. En una modalidad, el procedimiento se repite hasta que la concentración de clorito, clorato o la mezcla de los mismos está por debajo del límite de detección del método de o-tolidina. Este método para el análisis de clorito/clorato se basa en el hecho de que el clorito y clorato (CI02 y CI03 , respectivamente) reaccionan con orto-tolidina (o-tolidina) en soluciones fuertes de ácido clorhídrico para producir un cambio de color altamente dependiente de la cantidad de CI02 y CI03 que está presente en la solución. Este método provee una aproximación de dos pasos para detectar ambas especies separadamente. Sin embargo, debido a la proporción constante de clorito a clorato en WF10, solo se requiere usar un paso en el que los dos constituyentes contribuyen al cambio de color. En el ejemplo 7 se describen métodos para realizar el método de o-tolidina.

En una modalidad de la invención, los liposomas que comprenden clorito, clorato o una mezcla de los mismos, y las composiciones que comprenden estos liposomas, son almacenados a una temperatura por debajo de aproximadamente 10, 9, 8, 7 o 6 °C, convenientemente por debajo de aproximadamente 6°C.

En una modalidad adicional, las composiciones de liposoma se pueden esterilizar. Ejemplos no limitativos de las teenicas de esterilización adecuadas incluyen filtración, esterilización por autoclave, radiación gamma y liofilización (criodesecado). En una modalidad, la esterilización se realiza por filtración usando un filtro de 220 nm.

IV. APLICACIONES TERAPÉUTICAS Es muy conocido que el clorito y el clorato son agentes oxidantes fuertes. El poder oxidante de estas sustancias tiende a aumentar conforme disminuye el pH. Por lo tanto, generalmente se proveen formulaciones comerciales de clorito estabilizado para uso medicinal, tal como WF10 y Oxoferin (un tratamiento para heridas crónicas), como soluciones acuosas de pH alto que contienen poco o nada de materia orgánica que pudiera reaccionar con el clorito o descomponerse debido al medio de pH alto (por ejemplo, debido a la hidrólisis de los grupos éster). Esta estrategia se puede utilizar para asegurar que los productos tengan vidas en almacenamiento comercialmente aceptables, pero puede ser desventajoso con respecto a los efectos secundarios del producto y restringir los tipos de productos que pueden ser desarrollados.

Por ejemplo, la administración de una solución muy básica, tal como WF10, por infusión intravenosa puede dar producir flebitis (inflamación de la vena), a menos de que la infusión se realice lentamente, y sólo después de diluir el WF10 usando aproximadamente 250-500 mL de solución salina. Por esta razón, típicamente una infusión de WF10 podría ser administrada durante un periodo como de 1.5 horas, dando como resultado la inconveniencia para el paciente y utilización significativa de recursos médicos. Similarmente, Oxoferin está aprobado en varios países para el tratamiento de heridas y, de manera no sorprendente debido su pH alto, una de las reacciones adversas observadas más frecuentemente es el dolor (véase Hinz J, Hautzinger H, Stahl KW., “Rationale for and results from a randomised, double-blind trial of tetrachlorodecaoxygen anión complex in wound healing”, Lancet, 12 de abril de 1986; 1 (8485):825-8). También se puede esperar que la naturaleza muy básica del WF10 y Oxoferin los haga inadecuados para otros sitios de administración, tal como el delicado epitelio de los alveolos alcanzados con el modo de suministro pulmonar.

También será apreciado por los expertos en la téenica de desarrollo de formas farmacéuticas que la dificultad para formular conjuntamente clorito, clorato o mezclas de los mismos con muchos materiales orgánicos, puede imponer limitaciones indeseables. Por ejemplo, algunos materiales de apósito no muestran estabilidad a largo plazo cuando se impregnan con Oxoferin, haciendo difícil desarrollar un producto tal como un apósito de curación de heridas embolsado individualmente que está precargado con Oxoferin. También es práctica común desarrollar medicamentos que contienen más de un ingrediente farmacéutico activo y sería de esperar que muchos ingredientes activos no muestren estabilidad comercialmente aceptable si se mezclan con soluciones que contienen clorito, clorato o una mezcla de los mismos.

Se cree que el WF10 ejerce su beneficio terapéutico por su acción sobre los macrófagos (véase McGrath, Kodelja, V. “Balanced macrophage activation hypothesis: A biological model for development of drugs targeted at macrophage functional States”, Pathobiology, 67, 277-281 (1999)). Un aspecto adicional de WF10 es que frecuentemente se administra a una dosis que es muy cercana al límite en el que pueden aparecer efectos secundarios tóxicos. Por ejemplo, en una prueba de WF10 sobre pacientes con SIDA avanzado, se utilizó una dosis de WF10 de 0.5 mL/kg porque una prueba de graduación de dosis previa que había utilizado dosis que varían de 0.1 mL/kg a 1.5 mL/kg, había mostrado flebitis, aumento de los niveles de metemoglobina, y reducción de los niveles de glutatión reductasa de eritrocitos (RBC) en pacientes que reciben más de 0.5 ml/kg, que por lo tanto se consideró que era la dosis máxima tolerada (véase Raffanti, S.P. Schalfner, W., Federspiel, C.F., Blackwell, R.B., Ah Ching, O., Kühne, F.W., “Randomized, double blind, placebo-controlled trial of the immune modulator WF10 in patients with abvanced AIDS”, Infection, vol. 26, 4, 201-206 (1998)).

También se han estudiado los efectos de OXO-K993 (en forma de WF10) sobre la cicatrización y prevención de complicaciones causadas por radioterapia en pacientes con carcinoma de colon avanzado (véase Rattka, P. , Hinz, J. “Influence of TCDO on the results of radiotherapy in advanced collum carcinoma stage IIIB. Resumen; Int. Symp. On Tissue Repair, Pattaya, Tailandia, 6-8 diciembre (1990) en: Highlights - International Symposium on Tissue Repair, 30-31 (1990)). En este estudio, se administró WF10 1.5 horas antes de la irradiación a los pacientes del brazo de tratamiento, y los autores del documento tuvieron la impresión de que el tratamiento con WF10 antes de la irradiación aumenta significativamente los efectos biológicos sobre el tejido del tumor durante la radiación. Para tales tratamientos sería conveniente tener un medio para dirigir una formulación de clorito estabilizada al tejido de tumor, aunque desafortunadamente esto es difícil con una formulación en solución de clorito estabilizado tal como WF10 administrado intravenosamente.

La capacidad para encapsular clorito, clorato o una mezcla de los mismos en liposomas en una formulación en la que la fase externa está sustancialmente libre de estos agentes, tiene varias ventajas. Por ejemplo, la fase externa de la composición que contiene liposomas también puede contener materia tal como sustancias orgánicas, que no serían compatibles con clorito, clorato o una mezcla de los mismos, incluso por ejemplo, algunos ingredientes activos farmacéuticos y excipientes. La formulación liposómica también se puede dispersar en una matriz sólida que de otra manera no sería muy compatible con estos agentes, tal como un material de apósito para su aplicación en heridas. Similarmente, puede aprovecharse convenientemente la capacidad para crear una fase externa libre de clorito o clorato, a pH aproximadamente neutro, para reducir la ocurrencia de efectos secundarios como flebitis y dolor, observados cuando se administran en el cuerpo soluciones de pH alto por vja intravenosa o tópica, y para permitir suministrar clorito, clorato o una mezcla de los mismos por medio de nuevos modos de administración tales como la vía pulmonar.

También se apreciará que se pueden diseñar estructuras liposómicas para ser eliminadas preferentemente de la circulación por los macrófagos, que se cree son el sitio de acción que los fármacos basados en clorito o clorato. Por ejemplo, los liposomas pueden reducir la dosis de clorito, clorato o mezclas de los mismos, necesarias para obtener un efecto de tratamiento dado, y pueden mejorar el margen de seguridad de los agentes. Alternativamente, los liposomas se pueden usar para aumentar el efecto farmacológico del clorito, clorato o mezcla de los mismos, sin inducir toxicidad inaceptable.

Alternativamente, los liposomas se pueden diseñar para ser suministrados en blancos diferentes de los macrófagos. Por ejemplo, se puede utilizar una teenología como la usada por el fármaco quimioterapéutico Doxil (inyección de liposoma de doxorrubicina HCI, Centocor Ortho Biotech Products LP) para hacer blanco en tumores del cuerpo de un paciente. Tal direccionamiento se puede utilizar beneficiosamente cuando se desea usar clorito, clorato o una mezcla de los mismos como un sensibilizante antes de la radioterapia.

Por lo tanto, la presente invención incluye todos los usos de los liposomas aquí descritos y las composiciones que los comprenden, y también métodos que incluyen estas entidades. En una modalidad particular, se incluye un uso de los liposomas o composiciones de la presente invención como medicamentos.

Los beneficios de los agentes activos pueden mejorarse mediante su incorporación en liposomas. Las características mejoradas de las composiciones liposómicas incluyen, por ejemplo, farmacocinetica, biodistribución y/o protección alterada del clorito, clorato o mezcla de los mismos. También es posible reducir la frecuencia de administración de los agentes o proveer una velocidad de infusión más rápida suministrando formulaciones de liberación sostenida. Con las composiciones liposómicas de la presente invención también es posible el suministro dirigido de clorito, clorato o una mezcla de los mismos a los macrófagos del pulmón o tejido inflamado. Mediante el suministro dirigido a un sitio objetivo es posible reducir la dosificación, por ejemplo, en un factor de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000. Los beneficios también pueden incluir reducir la ocurrencia de efectos secundarios, tales como flebitis y dolor, observados cuando se administran en el cuerpo soluciones de clorito de pH alto por vía intravenosa o tópica, y permiten el suministro de agentes mediante modos de administración nuevos tales como la vía pulmonar o inyección de bolo (por ejemplo, una composición suministrada vía i.v. durante un periodo corto, por ejemplo menor de 30 minutos, menor de 15 minutos, menor de 5 minutos), lo que típicamente requiere volúmenes de dosis más bajos.

Un beneficio particular de los liposomas de la presente invención es la capacidad para ajustar el tiempo de la liberación del agente encapsulado variando la composición de la membrana de lípido. Por consiguiente, el tiempo de liberación del agente o agentes encapsulados se puede controlar seleccionando una combinación de lípidos que tengan un perfil de liberación deseado con la temperatura. Por ejemplo, para aplicaciones de cicatrización de heridas, los lípidos se pueden seleccionar de tal manera que la temperatura de liberación sea la temperatura de la piel o cercana a la misma, y la administración de los liposomas a la piel causa liberación mínima o gradual conforme la composición alcanza la temperatura de la piel, momento en el cual se libera la mayor parte del agente.

Por consiguiente, la invención incluye también un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección para la cual resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención a un sujeto en necesidad de lo mismo.

La invención incluye además el uso de una composición de la invención para tratar una enfermedad, trastorno o afección para la cual resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos; y una composición de la invención para usarse para tratar una enfermedad, trastorno o afección para la cual resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos.

En una modalidad, la presente invención incluye un método para regular la función del macrófago, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención al sujeto en necesidad del mismo. La invención incluye también el uso de una composición de la invención para regular la función del macrófago y una composición de la invención para usarse para regular la función del macrófago.

Sin desear limitarse por teoría, la regulación de la función del macrófago se ha asociado con el tratamiento de enfermedades que producen síntomas de inflamación crónica como resultado de una respuesta inmune inapropiada (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 201 1/0076344). Por consiguiente, en una modalidad, las enfermedades, trastornos o afecciones para las cuales es beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos, se seleccionan de las que son derivables de una respuesta inmune específica de antígeno, que incluyen por ejemplo enfermedades autommunes y enfermedades causadas por una respuesta inmune inapropiada, tales como miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del suero, diabetes, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fiebre reumática, síndrome de Sjorgen, esclerosis sistémica, espondiloartropatías, enfermedad de Lyme, sarcoidosis, hemolisis autoinmune, hepatitis autoinmune, neutropenia autoinmune, enfermedad poliglandular autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn, síndrome de fatiga crónica y similares. La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) también puede tener cierta etiología autoinmune, por lo menos en algunos pacientes. En una respuesta autoinmune, el cuerpo del paciente produce demasiados linfocitos T citotóxicos (CTLs), u otras citocinas que se vuelven contra las propias células sanas del cuerpo y las destruyen. En pacientes de trasplante o injerto ocurre una respuesta inmune inapropiada porque el sistema inmune reconoce los antígenos del órgano o injerto trasplantado como ajenos y por lo tanto los destruye. Esto resulta en rechazo del injerto. Similarmente, los pacientes de trasplante e injerto pueden desarrollar una respuesta de injerto contra hospedero, en donde el sistema inmune del órgano o injerto trasplantado reconoce el antígeno del hospedero como extraño y lo destruye. Esto resulta en enfermedad de injerto contra hospedero. Otras respuestas inmunes inapropiadas se observan en asma alérgica, rinitis alérgica y dermatitis atópica. Además, las enfermedades que producen síntomas de inflamación crónica también incluyen una respuesta inmune inapropiada, caracterizada por activación excesiva del macrófago. Por ejemplo, una respuesta sana a una lesión de tejido, tal como una herida física o invasión por organismos patógenos como bacterias o virus, incluye la activación de macrófagos (mediante la ruta promflamatoria “convencional”) y conduce a una respuesta inflamatoria. Sin embargo, esta respuesta puede “excederse” de una manera inapropiada, produciendo inflamación crónica si la respuesta inmune proinflamatoria no puede ser suprimida. Enfermedades como la hepatitis B y C, hepatitis crónica y manifestaciones de COPD como bronquitis obstructiva y enfisema, que aparentemente son causadas por exposición prolongada a irritantes bronquiales y pulmonares no específicos, están caracterizados por inflamación crónica (del hígado en la hepatitis y del tejido pulmonar en la COPD) inducida por activación excesiva del macrófago.

Otras enfermedades, trastornos o afecciones para las cuales resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos se seleccionan de trastornos neoplásicos (cáncer), infección de V1H, SIDA, enfermedad neurodegenerativa, demencia asociada con el SIDA, apoplejía, patología de la médula espinal, infecciones microbianas y otras infecciones virales.

Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas incluyen, por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD) y esclerosis múltiple (MS). El cáncer puede ser, sin limitación, cáncer adrenal cortical, cáncer anal, anemia aplásica, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga, cáncer de hueso, metástasis ósea, cáncer del sistema nervioso central (SNC), cáncer del sistema nervioso periférico (SNP), cáncer de mama, enfermedad de Castleman, cáncer cervical, linfoma no Hodgkin infantil, cáncer del colon y recto, cáncer endometrial, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing (p. ej., sarcoma de Ewing), cáncer del ojo, cáncer de la vesícula biliar, tumores carcinoides gastromtestinales, tumores estromales gastrointestinales, enfermedad trofoblástica gestacional, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer del riñón, cáncer laríngeo e hipofaríngeo, leucemia I inf ocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia infantil, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer del hígado, cáncer del pulmón, tumores carcinoides del pulmón, linfoma no Hodgkin, cáncer de seno masculino, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer del pene, tumor de pituitaria, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de la glándula salival, sarcoma (cáncer de tejido blando del adulto), cáncer de piel melanoma, cáncer de piel no melanoma, cáncer del estómago, cáncer testicular, cáncer del timo, cáncer de tiroides, cáncer uterino (por ejemplo, sarcoma uterino), cáncer vaginal, cáncer vulvar y macroglobulinemia de Waldenstrom.

En una modalidad, la enfermedad, trastorno o afección para la que resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos se selecciona de asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, trastornos neoplásicos, infección de V1H y SIDA. En una modalidad, el trastorno neoplásico o cáncer es un cáncer de tracto gastromtestinal, cabeza, cuello, mama o páncreas.

Otras aplicaciones terapéuticas para las cuales resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o mezclas de los mismos incluyen el tratamiento de pacientes que padecen del síndrome de radiación o exposición a toxinas ambientales. El síndrome de radiación puede incluir un síndrome de radiación aguda o un efecto retardado por exposición a radiación causada por radioterapia o, por ejemplo, un arma nuclear usada en una guerra o ataque terrorista. También están contempladas las aplicaciones terapéuticas para cicatrización de heridas, que incluyen cicatrización de herida de presión, postoperatoria o postraumática, o cicatrización de herida crónica como en la cicatrización de úlceras diabéticas, úlceras venosas, úlceras arteriales o úlceras de decúbito.

Las composiciones y formulaciones de las mismas de la invención se pueden suministrar a un sujeto usando cualquier vía adecuada, por ejemplo, administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intraarticular, administración intratecal, administración intracerebroventricular, administración rectal, administración ocular, como un espray nasal, por medio de inhalación pulmonar, y administración oral, así como también otras vías de administración adecuadas conocidas por el experto en la materia. Los tejidos que se pueden tratar usando los métodos y usos de la presente invención incluyen, sin limitación, nasal, pulmonar, hígado, riñón, hueso, páncreas, reproductivo, tejido blando, músculo, tejido adrenal y mama. Los tejidos que se pueden tratar incluyen tejido canceroso, tejido enfermo o comprometido de otra manera, y también tejido sano si así se desea.

Para mayor certidumbre, el término “composición de la invención” se refiere a las composiciones liposómicas descritas en la presente, ya sea preparadas o en combinación con vehículos adicionales y/u otros ingredientes.

Las composiciones y formulaciones de la invención se usan solas o en conjunto con otros modos de tratamiento (por ejemplo, terapia auxiliar del cáncer, tratamientos de modalidad combinada, antes, concurrentemente, o después). Por ejemplo, se usan en combinación con otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos para el cáncer como los que aquí se describen y son conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, taxanos, antagonistas metabólicos, antibióticos antitumorales, alcaloides de planta, farmacoterapia hormonal, fármaco de direccionamiento molecular, etc.)), cirugía, y/o terapia de radiación. Cuando la afección tratada es el cáncer, las composiciones y sus formulaciones descritas en la presente se pueden administrar en conjunto con uno o más de otros agentes anticancerosos o compuestos citotóxicos aquí descritos y conocidos, uno o más agentes adicionales para reducir la ocurrencia y/o severidad de reacciones adversas y/o manifestaciones clínicas de las mismas, cirugía (por ejemplo, para quitar un tumor o nodulos linfáticos, etc.) o radiación. Cuando la cirugía o la radiación, o ambas, son parte de un régimen de tratamiento, las composiciones o sus formulaciones se pueden administrar antes, concurrentemente o después de la terapia de radiación o cirugía. Similarmente, las composiciones y formulaciones aquí descritas se pueden administrar antes, concurrentemente o después de la administración de uno o más agentes anticancerosos. Las composiciones y formulaciones aquí descritas también se pueden administrar en conjunto con (por ejemplo, antes de, concurrentemente o después de) fármacos para aliviar los síntomas asociados con la afección o el régimen de tratamiento (por ejemplo, fármacos para reducir el vómito, pérdida del cabello, inmunosupresión, diarrea, sarpullido, perturbación sensorial, anemia, fatiga, estomatitis, síndrome de mano-pie, etc.). Las composiciones también se pueden administrar en más de una etapa del régimen de tratamiento (que incluye durante todo el tratamiento) (por ejemplo, después de cirugía, y concurrentemente y después de terapia de radiación, etc.)· En una modalidad, las composiciones o formulaciones de la invención se administran en combinación con uno de 5-fluorouracilo y un profármaco del mismo, o ambos, tal como capecitabina.

En una modalidad adicional de la invención, cuando las composiciones y sus formulaciones se usan para tratar asma alérgica o rinitis alérgica, u otra enfermedad, trastorno o afección pulmonar o respiratoria, normalmente se administran por vía intravenosa o por vía transmucosal y más particularmente nasal, ocular o pulmonar. Por ejemplo, las composiciones de la invención se administran por medio de un espray nasal, gotas nasales y/o gotas oftálmicas. También es posible administrar las composiciones de la invención como una niebla fina a los pulmones por medio de nebulización, usando cualquier nebulizador electrónico o neumático. Para administración nasal se puede usar cualquier dispositivo del estado de la téenica adecuado para producir aerosoles de composiciones liposómicas acuosas. Las composiciones y formulaciones de la invención se usan solas o en conjunto con (por ejemplo, antes de, concurrentemente o después de) otros modos de tratamientos para el asma alérgica o rinitis alérgica. Por ejemplo, se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos (por ejemplo, esteroides y antihistamínicos) como es conocido por los expertos en la materia. Las composiciones de la invención también se pueden hacer amortiguadoras o diluidas antes de usarse, por ejemplo, agregando un diluente adecuado (por ejemplo, solución salina) antes de su administración por infusión intravenosa.

En una modalidad adicional de la invención, cuando las composiciones y sus formulaciones se usan para tratar dermatitis atópica u otra enfermedad, trastorno o afección de la piel, normalmente se administran por vía tópica o transdérmica, por ejemplo en forma de lociones, linimentos, jaleas, ungüentos, cremas, pastas, geles, hidrogeles, aerosoles, espráis, polvos, gránulos, granulados, pastillas, supositorios, pomadas, goma de mascar, pastillas, bolsitas, enjuagues bucales, tabletas, hilo dental, pastas, apósitos, láminas, espumas, películas, esponjas, vendas, pociones, parches bioadsorbibles, barras, y similares. Las composiciones y formulaciones de la invención se usan solas o en conjunto con (p. ej . , antes de, concurrentemente, o después de) otros modos de tratamiento para la dermatitis atópica. Por ejemplo, en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos para los expertos en la materia.

V. FORMULACIONES Y DOSIFICACIÓN Como se indicó anteriormente, las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la invención se administran a sujetos en necesidad de la mismas para el tratamiento de afecciones que se describen en la presente, en conjunto con los métodos de uso descritos en la presente.

La composición liposómica se puede administrar per se o como una composición o formulación farmacéutica. Por consiguiente, la presente invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden liposomas con clorito, clorato o una mezcla de los mismos encapsuiados, mezclados con al menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica provee la liberación sostenida de clorito, clorato o una mezcla de los mismos y por lo tanto comprende una formulación de liberación sostenida.

Como se indicó arriba, las composiciones liposómicas o composiciones farmacéuticas o formulación de las mismas se administran a un sujeto usando cualquier vía adecuada, por ejemplo, administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración subcutánea, administración intradérmica, administración transdérmica, administración epicutánea, administración intraarticular, administración intratecal, administración intracerebroventricular, como un espray nasal, por medio de inhalación pulmonar, y administración oral, asi como también otras vías de administración adecuadas conocidas por el experto en la materia, y se formulan correspondientemente.

Dependiendo del modo de administración, las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma farmacéutica líquida, sólida o semisólida. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular como soluciones, dispersiones, suspensiones, emulsiones, mezclas, lociones, linimentos, jaleas, ungüentos, cremas, pastas (que incluye pastas dentales), geles, hidrogeles, aerosoles, espráis (que incluyen espráis bucales), polvos (que incluyen polvos dentales), gránulos, granulados, pastillas, pomadas, goma de mascar, pastillas, bolsitas, enjuagues bucales, tabletas, hilo dental, pastas, apósitos, láminas, espumas, películas, esponjas, vendas, pociones, parches bioadsorbibles, barras, tabletas, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, tabletas de liberación modificada, y similares.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica general (véase, por ejemplo, “Remington’s Pharmaceutical Science” (2000 -20a edición) y “The United States Pharmacopeia: The National Formulary” (USP 34 NF19)).

Los vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables para usarse con las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser seleccionados rutinariamente por los expertos en la materia para un uso particular. Estos incluyen, sin limitación, disolventes, agentes amortiguadores, diluentes o rellenos inertes, agentes de suspensión, agentes dispersantes o de mojado, conservadores, estabilizadores, agentes quelantes, agentes emulsionantes, agentes antiespumantes, agentes formadores de gel, bases para ungüento, incrementadores de penetración, humectantes, emolientes y agentes protectores de la piel.

Ejemplos de disolventes son agua, alcoholes, aceites vegetales, marinos y minerales, polietilenglicoles, propilenglicoles, glicerol y polialquisiloxanos líquidos. Los diluentes o rellenos inertes pueden ser sacarosa, sorbitol, azúcar, manitol, celulosa microcristalina, almidones, carbonato de calcio, cloruro de sodio, lactosa, fosfato de calcio, sulfato de calcio o fosfato de sodio. Ejemplos de agentes amortiguadores incluyen ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido metafosfórico y dietilamina. Los agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, las gomas naturales (por ejemplo, goma acacia, goma arábiga, goma xantano y tragacanto), celulosas (por ejemplo, carboximetil-, hidroxietil-, hidroxipropil- e hidroxipropilmetilcelulosa), alginatos y quitosanos. Ejemplos de agentes de dispersión o mojado son los fosfátidos naturales (por ejemplo, lecitina o lecitina de soya), productos de condensación de óxido de etileno con ácidos grasos o con alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, estearato de polioxietileno, monooleato de sorbitol polioxietileno, y monooleato de sorbitán polioxietileno).

Para prevenir la contaminación microbiana de la composición farmacéutica de la invención, que puede afectar la estabilidad de la formulación y causar infección en el paciente, se le pueden agregar conservadores. Los ejemplos adecuados de conservadores incluyen parabenos (tales como metil-, etil-, propil-, p-hidroxibenzoato-, butil-, isobutil-, e isopropil-parabeno), sorbato de potasio, ácido sórbico, ácido benzoico, benzoato de metilo, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, butilcarbamato de yodopropinilo, cloruro de benzalconio, cetrimida y alcohol bencílico. Ejemplos de agentes quelantes incluyen EDTA sódico y ácido cítrico.

Ejemplos de agentes emulsionantes son las gomas naturales, fosfátidos naturales (por ejemplo, lecitina de soya; derivados de monooleato de sorbitán), ésteres de sorbitán, monoglicéridos, alcoholes grasos y ésteres de ácido graso (por ejemplo, triglicéridos de ácidos grasos). Los agentes antiespumantes usualmente facilitan la fabricación, disipan la espuma desestabilizando la interfaz aire-líquido, y permiten el escape de líquido de las cavidades de aire. Ejemplos de agentes antiespumantes incluyen simeticona, dimeticona, etanol y éter.

Ejemplos de bases de gel o agentes incrementadores de viscosidad son la parafina líquida, polietileno, aceites grasos, sílice o alúmina coloidal, glicerol, propilenglicol, polímeros de carbovinilo, silicatos de magnesio-aluminio, polímeros hidrófilos (tales como por ejemplo, derivados de almidón o celulosa), hidrocoloides hinchables en agua, carragenanos, hialuronatos y alginatos. Las bases de ungüento adecuadas para usarse en las composiciones de la presente invención pueden ser hidrófilas o hidrófobas, e incluyen parafina, lanolina, polialquilsiloxanos líquidos, cetanol, paimitato de cetilo, aceites vegetales, ésteres de sorbitán de ácidos grasos, polietilenglicoles y productos de condensación entre ésteres de sorbitán de ácidos grasos, óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de sorbitán poloxietileno), y polisorbatos.

Ejemplos de humectantes son el etanol, isopropanol, glicerina, propilenglicol, sorbitol, ácido láctico y urea. Los emolientes adecuados incluyen colesterol y glicerol. Ejemplos de protectores de la piel incluyen vitamina E, alantoína, glicerina, óxido de zinc, vitaminas y agentes bloqueadores solares.

En una modalidad, las composiciones de la invención se almacenan a una temperatura por debajo de aproximadamente 10, 9, 8, 7 o 6 °C, convenientemente por debajo de aproximadamente 6°C.

En una modalidad adicional, las composiciones de la presente invención son liofilizadas o criodesecadas. Las téenicas para liofilización de liposomas son muy conocidas, por ejemplo, Chen et al.

( J . Control Release, marzo 19 de 2010; 142(3):299-31 1 ) resumen factores clave que determinan el efecto lioprotector de los liposomas criodesecados.

Las composiciones de la invención generalmente se usarán en una cantidad eficaz para obtener el resultado deseado, por ejemplo, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la afección, enfermedad o trastorno particular tratado. La dosis y/o proporción de clorito, clorato o mezcla de los mismos, administrada al sujeto que usa las composiciones y liposomas de la invención, son determinadas fácilmente por los expertos en la materia. En una modalidad, la administración de la cantidad eficaz de clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados en la formulación liposómica para tratar una enfermedad o trastorno, se reduce por un factor de aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,000, en comparación con la cantidad eficaz de clorito, clorato o mezcla de los mismos que se administra usando los regímenes de dosificación estándares para tratar la misma enfermedad o trastorno.

En una modalidad, las composiciones o formulaciones de la invención se administran por vía intravenosa durante un periodo prolongado, por ejemplo, de más de aproximadamente 1 minuto, a varias horas, por ejemplo, 2, 3, 4, 6, 24 o más horas.

En una modalidad, el tratamiento se administra una vez al día. En otra modalidad, el tratamiento se administra dos veces al día. En otra modalidad, el tratamiento se administra tres veces al día. En otra modalidad, el tratamiento se administra cuatro veces al día. En una modalidad adicional el tratamiento se administra de una a dos veces al día durante uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete días. En una modalidad adicional, el tratamiento se administra por lo menos una vez al día durante un periodo más largo, tal como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas. En una modalidad adicional, el tratamiento se administra por lo menos una vez al día hasta que la afección haya mejorado o hasta que ya no sea necesario el tratamiento. En una modalidad alternativa, el tratamiento provee la liberación sostenida del ingrediente activo y la administración se requiere menos frecuentemente, por ejemplo, una vez a la semana, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada año, una vez cada dos años, o una vez cada cinco años. En otra modalidad, la persistencia de la enfermedad o trastorno es reducida durante un tiempo despues de la administración de la composición liposómica, por ejemplo, durante 6 meses, un año o dos años.

En otra modalidad, el tratamiento se administra por lo menos una vez a la semana. En otra modalidad, el tratamiento se administra dos veces a la semana. En otra modalidad, el tratamiento se administra tres veces a la semana. En otra modalidad, el tratamiento se administra cuatro veces a la semana. En otra modalidad, el tratamiento se administra cinco veces a la semana. En otra modalidad, el tratamiento se administra seis veces a la semana. En una modalidad adicional, el tratamiento se administra de una a seis veces por semana durante una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete semanas. En una modalidad adicional, el tratamiento se administra por lo menos una vez a la semana durante un periodo prolongado tal como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 o 12 semanas. En una modalidad adicional más, el tratamiento se administra por lo menos una vez a la semana hasta que la afección haya mejorado o hasta que ya no sea necesario más tratamiento.

En otra modalidad, el tratamiento se puede administrar como una infusión continua, intermitente, o controlada por el paciente usando una bomba de infusión. En una modalidad, se usa una bomba de infusión para administrar el tratamiento por vía intravenosa.

VI. EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de liposomas de esfingomielina/WF10 Se agregaron 2700 mI de solución de esfingomielina (SM de huevo de pollo (MW 703.3); Avanti Polar Lipids, Alabama, EE. UU.) (solución a 25 mg/mL en cloroformo = 67.5 mg, 0.095 mmol de SM) a un matraz de fondo redondo (típicamente de 25 mL) lleno a 1/3 con cloroformo. La solución se evaporó a sequedad para dejar una película delgada de lípido claramente visible sobre la superficie interior del matraz.

Se agregaron 4800 mL de WF10 (0.095 mmol/4.8 mL) y el matraz se agitó en un mezclador de vórtice aproximadamente a 45°C (arriba de la temperatura de transición de fase del lípido). La agitación de vórtice se detuvo cuando la película ya no era visible. La rehidratación de los lípidos en este paso resulta en la formación de liposomas que son vesículas multilaminares grandes (LMV). El WF10 está tanto dentro (fase interior) como fuera de los liposomas (fase exterior).

Para reducir el tamaño de los liposomas primarios, la mezcla se congeló y se descongeló repetidamente. El ciclo de congelación/descongelación se repitió 10 veces usando nitrógeno líquido como refrigerante y descongelando en un baño de agua, típicamente a 45°C, con una duración general de aproximadamente 30 a 40 min. La congelación resulta en una destrucción de los liposomas primarios. La descongelación se hizo por arriba de la temperatura de transición de fase. En este caso, de nuevo se forman espontáneamente liposomas más pequeños que los liposomas primarios. Todas las muestras estuvieron bien por arriba de la temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos debido al esquema de temperatura dado (-180°/45°C).

La mezcla arriba mencionada (aproximadamente 5 mL) se extruyó entonces repetidamente a traves de (el mismo) filtro de disco con un ancho de poro de 100 nm. Se usó una cámara de acero inoxidable con camisa de calentamiento y un doble filtro de disco de 100 nm (aunque también se puede usar un solo filtro). La temperatura de trabajo fue de 45°C para SM. La presurización se logró usando nitrógeno a 30 bar y la extrusión se repitió 10 veces, lo que se sabe que resulta en vesículas unilaminares de un diámetro relativamente uniforme. La tasa de inclusión fue de aproximadamente 2% a 3%; teóricamente era posible 7%.

La mezcla extruída (fase exterior: WF10, fase interior: WF10) se dividió en 3 cámaras de diálisis. Las cámaras se colocaron flotando en una solución de cloruro de sodio al 0.9%. La cámara de diálisis era “Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20K MWCO”, que tiene un volumen máximo de 3 mL, permeable hasta 20 kDa. La mezcla de liposomas (1 mL) se puso en la cámara interna y NaCI al 0.9% (solución salina, 1 L) era el medio exterior. El proceso se repitió 4 veces con solución salina nueva. El resto de la mezcla de liposomas (aproximadamente 5 mL -3 x 1 L dializado) se usó para la determinación de fosfato y DSC (Calorimetría de Barrido Diferencial => determinación de la temperatura de transición de fase).

Al final de la etapa de diálisis, la fase exterior de la preparación de liposoma consistía en una solución de cloruro de sodio al 0.9% (= solución salina). El propósito fue obtener una concentración de clorito y clorato en la fase exterior por abajo del límite de detección del método usado para cuantificación. Al hacer esto, el comportamiento de fuga de los liposomas se puede probar monitoreando la recurrencia de estos iones.

Ejemplo 2 Preparación de liposomas de POPC/WF10 Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 , y una temperatura de trabajo para el paso de extrusión de temperatura ambiente (la camisa de calentamiento no conectada), se prepararon liposomas hechos de POPC y comprendiendo WF10.

Ejemplo 3 Preparación de liposomas de POPC:POPG/WF1Q Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 , y una temperatura de trabajo para congelación/descongelación de 35°C, y para el paso de extrusión de 23°C, se prepararon liposomas hechos de 1-palmitoil-2-oleioil-s/i-3-glicero-3-fosfocolina (POPC) y 1 -pal m itoi I-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) (POPG) (3:1 , 2: 1 y 1 :1 ) que comprenden WF10. El POPG se obtuvo de Avanti Polar Lipids, Alabama, EE. UU.

Ejemplo 4 Preparación de liposomas de DPPC/WF10 Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 y una temperatura de trabajo para el paso de extrusión de 45°C, se prepararon liposomas hechos de 1 ,2-dipalitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) que comprenden WF10. El DPPC se obtuvo de Avanti Polar Lipids, Alabama, EE. UU.

Ejemplo 5 Preparación de liposomas de DMPC/WF10 Usando el procedimiento descrito en el ejemplo 1 , y una temperatura de trabajo para el paso de extrusión de 30°C, se prepararon liposomas hechos de 1 ,2-dimiristoil-s/7-glicero-3-fosfocolina (DMPC) que comprenden WF10. El DMPC se obtuvo de Avanti Polar Lipids, Alabama, EE. UU.

Ejemplo 6 Metodo de preparación adicional (a) Evaporación de I í pidos En un matraz de fondo redondo de 100 mL se agregaron lípidos disueltos en cloroformo. En la mayoría de los casos los lípidos fueron comprados ya en solución con una concentración típica de aproximadamente 25 mg/mL. Los lípidos suministrados como polvo usualmente se disolvieron antes de su adición al matraz, teniendo una concentración similar. La masa total de lípido añadido fue controlada entonces por medio del volumen. Las masas típicas fueron de 300-400 mg para 14 mi de una muestra a 40 mM. Posteriormente, el matraz se montó en un evaporador rotativo Buchi‘Rotavapor™ R-210’ y se evacuó girando a 15 rpm en un baño de agua a 37°C. La presión del matraz disminuyó a valores de aproximadamente 5-15 mbar durante la operación. La evaporación se consideró terminada cuando todo el disolvente se eliminó y no podía olerse el cloroformo en el matraz. El resultado de esta etapa fue una película de lípido visible sobre las paredes del frasco (dependiendo de la cantidad de lípido) y adicionalmente polvo esponjoso acumulado en el fondo del matraz. (b) Hidratación Durante el procedimiento de hidratación, los lípidos se suspendieron en un medio acuoso, que después se atrapó en los liposomas finales. Como se sabe, durante este proceso se forman vesículas multilaminares (MLVs). En primer lugar, se agregó la cantidad necesaria del medio de WF10 al matraz de fondo redondo. El volumen era equivalente al volumen total deseado de la muestra (usualmente 8 a 14 mL, aproximadamente). El resultado fue una solución turbia que contenía agregados de I í pido grandes. Después se preparó un baño de agua a una temperatura 5K arriba de la temperatura de transición de fase (PTT) del lípido, durante lo cual el matraz se agitó ligeramente. Una vez que la temperatura del matraz alcanzó la PTT, la suspensión se convirtió en un líquido blanco lechoso homogéneo. Después de aproximadamente cinco minutos a una temperatura por arriba de la PTT, la película de lípido se retiró de las paredes del matraz y no quedó polvo de lípido en el fondo. Finalmente, el matraz se agitó en un mezclador de vórtice durante unos segundos. La muestra, todavía caliente, se pasó inmediatamente al dispositivo de extrusión para iniciar el siguiente paso de preparación, o se almacenó a una temperatura de refrigerador hasta el momento de realizar el siguiente paso de preparación. (c) Extrusión Durante el proceso de extrusión, la muestra se comprimió repetidamente a través de un filtro de disco de 220 nm. Esto forzó a las vesículas grandes a reorganizarse y formar estructuras más pequeñas que tienen menos capas. Generalmente, esto produjo vesículas unilaminares, sin embargo, para tamaños de poro relativamente grandes tales como 220 nm, todavía era probable obtener vesículas multilaminares pero sólo con unas pocas capas. Antes del paso de extrusión, el extrusor se equipó con tres filtros de disco de 220 nm apilados (Millipore GPWP, diámetro 25 mm), y después se calentó 5K arriba de la LPTT. Después de llenar la suspensión de lípido en la cámara de extrusión, se aplicó a la cámara una presión de 25 bar, forzando la muestra a través de los filtros. La presión se aplicó por medio de nitrógeno comprimido. La muestra se recolectó en la salida del extrusor. La extrusión completa se realizó por lo menos 10 veces. (d) Diálisis En esta etapa, los liposomas estaban en su estado final pero permanecían suspendidos en una solución de WF10. Para reemplazar el medio de WF10 externo con solución salina al 0.9%, se hizo una serie de pasos de diálisis sucesivos. Primero se introdujo la muestra en un marco de diálisis Thermo Scientific Slide-A-Lyzer™. Las membranas del marco tienen un corte de peso molecular de 20,000 Da y una capacidad de 3-12 mL. Para volúmenes de muestra mayores de 6 mL, la muestra se dividió y se distribuyó en dos de estos marcos, y ambos se colocaron en el mismo matraz. El montaje de la diálisis incluyó un matraz de vidrio de 1 L con solución salina al 0.9% colocado sobre un dispositivo de agitación magnética. Usualmente la solución salina se hizo de agua desionizada y NaCI estándar de laboratorio (pureza mínima de 99%), y el volumen era de aproximadamente 900-950 mL. Los marcos se sumergieron en el medio de diálisis durante aproximadamente una hora, después el medio se intercambió con medio nuevo para pasos subsiguientes. Típicamente, se tomó una muestra pequeña del medio de diálisis para una “comprobación rápida de o-tolidina”, que fue similar al procedimiento de análisis usual de o-tolidina. Cuando la muestra apareció de color amarillo oscuro, el medio se intercambió más tempranamente. Esta comprobación rápida también se hizo para determinar el final de la serie de diálisis. La diálisis se consideró completa cuando dos pasos de diálisis sucesivos no mostraron cambio visible de color durante la prueba y despues de una duración de diálisis de una hora. Después de cada paso de diálisis, el medio de diálisis se intercambió hasta que por lo menos se habían realizado 5 pasos. Después del último paso, las muestras se guardaron aproximadamente a 6°C para uso ulterior.

Ejemplo 7 Métodos de o-tolidina para la detección de clorito v clorato Método A Este método de o-tolidina incluyó agregar 50 ml de una solución de 155 mg de o-tolidina en una mezcla de 200 ml_ de agua y 67 mL de ácido clorhídrico 12M a 200 mL de medio en exceso. Esta mezcla se preparó dos veces. Se agregaron 250 pL de ácido clorhídrico 4.8M o 12M, respectivamente, y la mezcla se incubó durante 5 a 10 minutos. El uso de ácido clorhídrico de la concentración más baja permitió la detección de clorito solamente, mientras que el uso de la concentración más alta permitió adicionalmente la detección de clorato. La absorción de la solución de prueba se midió a 442 nm (HCI 4.8M) o 445 nm (HCI 12M), respectivamente. Se establéció una curva de calibración usando diluciones normales preparadas a partir de WF10 no tratado.

Método B El método B es un mejoramiento del método A, ya que permite la detección tanto de clorito como de clorato. El método incluye disolver 114 mg de o-tolidina en 150 mL de agua y agregar 50 mL de ácido clorhídrico (37%) para preparar una solución de o-tolidina. La solución de o-tolidina se preparó por lo menos 24 horas antes de la primera aplicación y se podía guardar a 6°C durante unos meses. Se tuvo cuidado de medir todas las muestras al mismo tiempo despues del inicio del procedimiento de análisis para evitar la influencia de blanqueo, que ocurrió inmediatamente después de la preparación de la mezcla para análisis. El esquema de análisis se diseñó para analizar simultáneamente hasta 96 muestras y los tiempos se escogieron a modo de asegurar estas capacidades. Al principio del procedimiento de análisis, muestras de 400 mL por analizar se vaciaron en recipientes de reacción estándares de 2 mL. En el tiempo t0, se agregaron 100 pL de la solución de o-tolidina a cada uno de los recipientes de reacción. Diez minutos después, (t0+10 min), se agregaron 500 pL de ácido clorhídrico (37%). Otros diez minutos después (to+20 min), se transfirieron 200 pL de muestra de cada recipiente a una placa estándar de 96 pocilios para medir la absorbencia a una longitud de onda de 447 nm. Las mediciones se hicieron en una lectora de microplaca TECAN Infinite 200PRO™, y se iniciaron 15 minutos después (t0+35 min).

En los cálculos, la concentración de WF10 en el medio de almacenamiento fue representada por un factor de dilución inverso, d. Esta cantidad representa el volumen de WF10 no diluido por volumen de medio de almacenamiento. Por lo tanto, fue adimensional, siendo d = 1 para WF10 no diluido.

Para relacionar los valores de absorbancia medidos con un cierto factor de dilución inverso, se registró una curva de dilución de WF10. La curva se muestra en la figura 1. Los datos mostraron una fuerte dependencia lineal de los valores de d arriba de aproximadamente 6 x 10 5, y se encontró que los parámetros para I ecuación correspondiente: d(A) = mA + n (1) son m = (3.87 ± 0.02) x 10 4 y n = (7 ± 2) x 10 6. El dominio no lineal para las concentraciones por abajo del valor mencionado se ajustaron usando la ecuación: d(A) = a A - A» (2) con A0 = 0.0787 ± 0.0007, a = (3.36 ± 0.05) x 1 CT4 y p = 0.631 ± 0.009. En ambos casos, los ajustes se ponderaron con respecto a la incertidumbre de los puntos datos. Para considerar la incertidumbre relativamente grande de los valores de absorbancia, también se establecieron correspondencias sobre el conjunto de datos inverso usando las funciones inversas. Los parámetros presentados fueron las medias aritméticas para ambos resultados.

A partir del factor de dilución inverso determinado de WF10, d, en el medio de almacenamiento, se calculó la cantidad de WF10 que liberado del interior de los liposomas, XWFIO Dado el volumen de la muestra, Vmuestra, y también el volumen del medio de almacenamiento, almacenamiento, el valor para d se calculó usando la siguiente ecuación: d = WF 10 V muestra + v almacenamiento (3) y así: X WF 10 =d<r m.uestra + v a.lmacenamiento (4) Desde luego, esto es cierto solamente después de que la sustancia fugada se ha mezclado completamente con el medio de la muestra y el medio de almacenamiento. Los experimentos muestran que esto sucedió en un tiempo relativamente corto cuando se escogió el montaje apropiado. Ocurren problemas cuando la sustancia fugada es retirada del montaje experimental, que siempre sucede cuando se toman para análisis fracciones del medio de almacenamiento. Sin embargo, para tomar en cuenta esta separación, es necesario considerar todas las mediciones previas en el cálculo del factor de dilución actual. En tal determinación implícita, todos los errores e incertidumbres se acumulan con cada nueva determinación de concentración, de tal manera que un solo punto dato defectuoso alteraría todas las mediciones subsecuentes de un experimento. Por lo tanto, se usó un enfoque explícito en el cual solamente se consideró d y Vaimacenamient0 del paso de análisis actual, y la sustancia se despreció, sustraída en pasos de análisis anteriores. Sin embargo, la cantidad máxima posible que habría sido despreciada se agregó a las incertidumbres. Las desviaciones de este enfoque explícito simplificado a partir del método implícito usualmente fueron pequeñas en comparación con las incertidumbres que se originan de otros factores. No obstante, se hicieron cálculos alternativos en el curso de cada proceso de evaluación para verificar el uso del metodo separadamente para cada caso.

Método C Este método es otro mejoramiento del método A, ya que permite la detección de clorito pero no de clorato. Se preparó la solución de o-tolidina por lo menos 24 horas antes de su aplicación. Almacenada a 6°C en un lugar oscuro, fue estable durante varios meses. En primer lugar, se preparó una solución de HCI temporal agregando 50 mL de ácido clorhídrico concentrado (37%) a 150 mL de H2O (en esta etapa se usó agua de alta pureza). Después, 58 mg de o-tolidina (diclorhidrato, contenido de H20, 1.5 mol/mol, 285.2 g/mol, SIGMA Prod. No.: T-6269) se vació en un matraz medidor de 100 mL, usando la solución de HCI temporal. El matraz se llenó completamente (100 mL). Después de agitar la solución, ésta se vacío en un frasco de vidrio ámbar. Después de 24 horas, la solución era incolora y se encontró algo de precipitación en el fondo del matraz.

Inmediatamente antes de la medición se preparó ácido clorhídrico 4.8M. Se preparó agregando 40 mL de ácido clorhídrico concentrado (37%) a 60 mL de H20.

La reacción causa un cambio de color en la muestra que puede ser detectado por mediciones de absorbancia. Sin embargo, empieza el desvanecimiento de color inmediatamente después de que ocurre la reacción, de tal manera que el tiempo es un parámetro importante en este procedimiento. Se siguió un programa de tiempo que permitió el análisis de hasta 96 muestras a la vez. Al comienzo, 400 mL de cada muestra se vaciaron en recipientes de reacción de 1.5 ml_. Posteriormente, se agregaron a los recipientes 100 pl_ de la solución de o-tolidina. Qumce minutos despues de empezar la adición de o-tolidina, se agregaron a cada recipiente 500 pL de ácido clorhídrico 4.8M. Después, se transfirieron 350 mI_ de cada muestra del recipiente de reacción a la cavidad de una placa transparente de 96 pocilios (con cubierta). Otros 25 minutos después, se inició la medición fotométrica de las muestras registrando la absorbancia a 442 nm.

Los valores de absorbancia registrados se compararon con una curva patrón de concentraciones conocidas, registrada bajo las mismas condiciones. La dependencia de la absorbancia en la concentración de clorito es lineal para concentraciones de clorito entre 2 mM y 60 mM.

Monitoreo de fuga El propósito básico de todos los experimentos de monitoreo de fuga fue la detección de sustancia que se había liberado desde el interior del liposoma. El enfoque general para estos experimentos fue similar al procedimiento de diálisis descrito en el ejemplo 6(d). Una sustancia que había sido liberada de los liposomas en una muestra pasó al medio de la muestra circundante y podría pasar fácilmente la membrana de diálisis, de tal manera que el medio de almacenamiento, que rodea la marco de diálisis, contenía sustancia fugada a ciertas concentraciones. Para el clorito/clorato fugado, los métodos de o-tolidina arriba descritos se usan para determinar la fuga cuantitativa o cualitativamente. A partir de esta concentración se puede determinar la cantidad total de sustancia fugada usando los cálculos que se describen más abajo. Fue claro que esta concentración disminuyó al aumentar el volumen de la solución de almacenamiento, y de esta manera la solución de almacenamiento se eligió relativamente pequeña. Sin embargo, para determinar la concentración de la sustancia fugada, se requiere típicamente 1 mL de medio de almacenamiento y por lo tanto se desea un volumen de almacenamiento de por lo menos diez o veinte mililitros.

Ejemplo 8 Estabilidad de los liposomas de los ejemplos 1 a 5 Después de que se prepararon los liposomas, la muestra se dejó en el marco de diálisis, que entonces se puso en 120 mL de solución salina para almacenamiento. En intervalos de 1-3 días, se tomó 1 mL del medio en exceso y se analizó usando el método A de o-tolidina (ejemplo 7).

La fuga se detectó de los liposomas de POPC a todas las temperaturas (5°C, 23°C y 37°C) (véase la figura 2). En el caso de liposomas de SM, la fuga sólo se detectó a 37°C (véase la figura 3). Se realizaron más experimentos de fuga en liposomas POPC/POPG y también liposomas de DMPC puro. Las mezclas de POPC/POPG (3:1 , 2: 1 y 1 : 1 ) se comportaron de manera similar a las muestras de POPC puro y mostraron fuga completa después de un tiempo breve (véanse las figuras 4, 5 y 6, respectivamente). La DMPC se fugó casi en su temperatura de transición de fase (23°C) como lo muestran las lecturas del espectrómetro tomadas los días 1 , 5 y 7 de las muestras almacenadas a 5°C y 23°C (véase la figura 7).

Adlclonalmente, se repitieron los experimentos de SM, produciendo los mismos resultados anteriormente descritos (véase la figura 8). Al final de los experimentos todas las muestras se pusieron a 37°C para monitorear la fuga de iones. Se encontró que la fuga mayor empezó aproximadamente 2 horas después de ponerse a 37°C, y se completó 4 horas después de ponerse a 37°C.

Ejemplo 9 Preparación de liposomas de DPPC. DPPC/DMPC. S PC3 v S PC3/DMPC WF10 Usando una versión modificada del procedimiento descrito en el ejemplo 1 (se omite el paso de congelación/descongelación; tamaño de poro de la membrana de 220 nm), se hicieron liposomas de DPPC, DPPC/DMPC, fosfolípido de soya hidrogenado (S_PC3) y S_PC3/DMPC. Los ingredientes y temperaturas de extrusión se proveen en la tabla 2. El DPPC se obtuvo de Avanti Polar Lipids, Alabama, EE. UU., mientras que S_PC3 y DMPC se obtuvieron de LIPOID AG.

Se detectó fuga de los liposomas de DPPC a la temperatura de transición de fase de 41 °C de DPPC (véase la figura 9). A 38°C, tres grados por debajo de la temperatura de transición de fase de DPPC (41 °C), los liposomas estaban apretados. Hubo una fuga de DPPC:DMPC 9: 1 a 38°C, por debajo de la temperatura de transición de fase (PTT) de DPPC. Se hicieron más experimentos de fuga sobre los liposomas S_PC3 y también S_PC3:DMPC 3:5, detectándose fuga de los Mposomas S_PC3 a 60°C (tabla 2).

Ejemplo 10 Mediciones de MALDI-TOF MS para encontrar posibles productos de degradación Preparación v experimentos- Muestras Se prepararon tres muestras usando el metodo descrito en el ejemplo 6. En todas las muestras se usó 1 ,2-diapalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC). Las muestras se nombraron como sigue: SX123: WF10 común SX124: WF10 con amortiguador PBS SX125: WF10 con amortiguador taurina SX123 A un matraz de fondo redondo se le agregaron 9.2 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 25 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 233 mg. La DPPC se le compró a Avanti Polar Lipids (producto no: 850355C). Se hidrató con 7.92 mL de WF10 preparado de OXO-K993, 25.03 g de OXO-K993 en 250 mL de solución. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C por 5 min. La extrusión ocurrió a 50°C y duró 19 min. Se hicieron 10 pases consecutivos. Las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.001 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 22, 40, 47, 61 y 71 min; se efectuó un sexto paso durante la noche en un refrigerador a 6°C.

SX124 Preparación de “WF10/PBS”: Se diluyeron 10 g de OXO-K993 a 80 g con agua para inyección (WFI). El pH se ajustó a un pH inmediato de 7.36 agregando una solución acuosa de fosfato diácido de sodio monohidrato (4.31 g/25 mL). La mezcla se completó a 100 g usando WFI y contenía cloruro, clorito, clorato y sulfato en las concentraciones presentes en WF10.

A un matraz de fondo redondo se le agregaron 9.2 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 25 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 233 mg. La DPPC se le compró a Avanti Polar Lipids (producto no: 850355C). Se hidrató con 7.92 mL de WF10/PBS (pH 7.63 durante el uso). Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 50°C por 2 min. La extrusión ocurrió a 50°C y duró 7 min. Se hicieron pases consecutivos. Las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.001 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 22, 40, 47, 61 y 71 min; se efectuó un sexto paso durante la noche en un refrigerador a 6eC.

SX125 Preparación de “WF10/taurina”: Se diluyeron 10 g de OXO-K993 a 80 g con WFI. El pH se ajustó a un pH inmediato de 8.49 usando una solución acuosa de taurina (3.91 g/50 mL). La mezcla se completó a 100 g usando WFI y contenía cloruro, clorito, clorato y sulfato en las concentraciones presentes en WF10.

A un matraz de fondo redondo se le agregaron 9.2 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 25 mg/mL. Esto corresponde a una masa de I í pido de 233 mg. La DPPC se le compró a Avanti Polar Lipids (producto no: 850355C). Se hidrató con 7.92 mL de WF10/taurina (pH 8.47 durante el uso). Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 50°C por 4 min. La extrusión ocurrió a 50°C y duró 7 min. Se hicieron 10 pases consecutivos. Posteriormente las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 44.998 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 22, 40, 47, 61 y 71 min; se efectuó un sexto paso durante la noche en un refrigerador a 6°C.

Experimentos de almacenamiento El 16 de diciembre de 2011 , las muestras se retiraron de los marcos de diálisis y se guardaron a 6°C hasta el 19 de diciembre de 201 1. Ese día, se tomaron 2 mL de cada muestra para almacenamiento en un recipiente separado a 6°C. Se guardaron otros 2 mL de la misma manera a temperatura ambiente (~22°C). El resto de las muestras se usaron para diferentes propósitos. El 19 de diciembre de 2011 , el 6 de enero de 2012 y el 1 de febrero de 2012, se tomaron 0.2 mL de muestra de cada recipiente y se pusieron en un congelador a -80°C para mediciones de MALDI-TOF posteriores.

MALDI-TOF MS Se prepararon 18 muestras en total para mediciones de MALDI-TOF MS (3 tipos de muestra, cada una almacenada a dos temperaturas, todas en fechas diferentes) usando el siguiente procedimiento: Las muestras se diluyeron antes de la preparación usando 560 pL de solución salina al 0.9% y 40 mL de la muestra original almacenada a -80°C. Posteriormente se efectuó un proceso de extracción de lípido. Por lo tanto, 100 pL de la muestra prediluida se mezclaron con 200 pL de una mezcla cloroformo/metanol (1 : 1 ). La mezcla resultante se centrifugó entonces a 800g por 5 min, produciendo una separación de fase visible. Se tomaron 50 pL de la fase inferior para preparación ulterior. A este volumen se le agregaron como estándares 3.7 pL de una solución de DMPC en cloroformo a 15 mg/mL, y 2.5 pL de una solución de Liso PC 14:0 en cloroformo a 25 mg/mL. Posteriormente todo el disolvente se eliminó en una centrífuga de vacío. Después, a las muestras evaporadas se les agregaron 100 pL de DHB-matriz (156 mg de ácido dihidroxi-benzoico, 1998 mL, 2 pL de ácido trifluoroacético) y 100 pL de cloroformo. Finalmente, 1 pL de la muestra preparada se puso en un blanco revestido de oro bajo una corriente de aire caliente.

Las mediciones de MALDI-TOF MS se hicieron en un espectrómetro Autoflex LRF MS de Bruker Daltronics, Leipzig.

Resultados v discusión En los 18 casos, los espectros registrados no indicaron en absoluto alguna señal de productos liso. El término “liso" se usa para hacer referencia a fosfolípidos en los que se ha quitado una de las dos cadenas O-acilo. Las señales de los dos estándares añadidos y también de los lípidos usados para la preparación del liposoma fueron claramente identificadas. No se encontraron otras señales en los espectros.

Por consiguiente no ocurrió hidrólisis ni otros procesos de degradación a 6°C o temperatura ambiente a los valores altos de pH de WF10 común, o a los valores de pH más bajos de las versiones alternas con amortiguador.

Ejemplo 11 Pruebas de estabilidad a largo plazo sobre liposomas de DPPC v DPPC/D PC Muestras Se ensayaron seis muestras de liposoma. Las primeras tres muestras fueron las muestras de liposomas basados en DPPC, SX123, SX124 y SX125, preparadas como se describe en el ejemplo 10. Las tres muestras restantes (muestras SX130, SX131 y SX132) contenían liposomas que fueron preparados con una mezcla de DPPC y DMPC 9: 1 (proporción molar) como se describe más abajo.

SX130: WF10 común A un matraz de fondo redondo se le agregaron 3.14 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 84.3 mg/mL y 2.00 mL de una solución de DMPC en cloroformo a 13.4 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 264 mg y 27 mg, respectivamente. Se hidrató con 10.00 mL de WF10. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C ±1 °C por 4 min. Siguieron 10 pases de extrusión consecutivos a 46°C ± 1 °C y duraron 20 min en total. Posteriormente las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.008 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 4 pasos subsiguientes que duraron 46, 65, 75 y 174 min; se efectuó un qumto paso durante la noche.

SX131 : WF10 con amortiguador taurina A un matraz de fondo redondo se le agregaron 3.14 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 84.3 mg/mL y 2.00 mL de una solución de DMPC en cloroformo a 13.4 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 264 mg y 27 mg, respectivamente. Se hidrató con 10.00 mL de WF10 con amortiguador taurina. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C por 4 min. Siguieron 10 pases de extrusión consecutivos a 46°C y duraron 13 min en total. Posteriormente las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.010 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 4 pasos subsiguientes que duraron 46, 65, 75 y 174 min; se efectuó un quinto paso durante la noche.

SX132: WF10 con amortiguador PBS A un matraz de fondo redondo se le agregaron 3.14 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 84.3 mg/mL y 2.00 mL de una solución de DMPC en cloroformo a 13.4 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 264 mg y 27 mg, respectivamente. Se hidrató con 10.00 mL de WF10 con amortiguador PBS, preparado como se describe en el ejemplo 10. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C por 3 min. Siguieron 10 pases de extrusión consecutivos a 46°C y duraron 11 min en total. Posteriormente las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.015 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 4 pasos subsiguientes que duraron 46, 65, 75 y 174 min; se efectuó un qumto paso durante la noche.

Experimentos de estabilidad a largo plazo (LTS) Se establecieron experimentos de LTS para monitorear la fuga del liposoma durante periodos de semanas o meses. Por lo tanto, el montaje se diseñó para poder correr en paralelo una pluralidad de experimentos. Para este propósito se usaron bandejas de tinción de gel disponibles comercialmente con dimensiones aproximadas de 75 x 110 x 25 mm3, de tal manera que se requiere un volumen relativamente pequeño de medio de almacenamiento para sumergir completamente el marco de diálisis. Se usó una tapa para sellar herméticamente las bandejas mientras estaban almacenadas bajo las condiciones apropiadas de interés. El montaje de LTS usual incluyó un marco de diálisis Slide-A-Lyzer™ que contenía 1 mL de muestra, sumergido en 120 mL de solución salina al 0.9% como medio de almacenamiento. El marco de diálisis fue similar al usado durante la diálisis (ejemplo 6(d)), pero tiene una capacidad de solo 0.5-3.0 mL.

Experimentos de almacenamiento: Después del procedimiento de diálisis, las muestras se retiraron de los marcos de diálisis y se guardaron a 6°C durante la noche. Los experimentos de LTS se prepararon como se describe arriba, usando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific, 0.5-3.0 mL, 20K MWCO) y 120 mL de solución salina al 0.9% en bandejas de tinción de gel estándares de polipropileno. Para cada muestra se prepararon 4 montajes de LTS separados, cada uno teniendo un volumen de muestra de 1 mL. Dos de los montajes se guardaron a temperatura ambiente, mientras que los otros dos se pusieron en un refrigerador a 6°C. Para analizar la concentración de WF10 en el medio exterior, y por lo tanto la cantidad de clorato y clorito fugados de los liposomas, se tomaron 400 mL del medio salino exterior para su análisis ulterior con el método de o-tolidina, como se describe en el método B del ejemplo 7. La siguiente tabla indica las fechas en las que se tomaron las muestras para el análisis.

Fecha Muestras 19-12-2011 SX123, SX124 y SX125 (inicio) 06-01-2012 SX123, SX124 y SX125 (análisis) 16-01-2012 SX123, SX124 y SX125 (análisis) 07-03-2012 SX130, SX131 y SX132 (inicio) SX123, SX124 y SX125 (análisis) 29-03-2012 análisis de todas las muestras 27-04-2012 análisis de todas las muestras 25-05-2012 análisis de todas las muestras 06-07-2012 análisis de todas las muestras de 6°C Evaluación La evaluación de los datos de absorción registrados se hizo de acuerdo con los procedimientos definidos en el método B del ejemplo 7, considerando la transformación de la absorbancia para un factor de dilución de WF10. Para fines de visualización, los factores de dilución de WF10 se convirtieron a una cantidad más conveniente: la cantidad fugada de WF10 como una fracción de volumen del total de la muestra. De esta manera, un valor de 2% de fuga en una muestra de 1 ml_ significa que un total de 20 mL de WF10 fueron liberados del interior de los liposomas. Los límites de detección y cuantificación se definen en las secciones que se dan más abajo. También se provee más abajo una discusión sobre las incertidumbres que surgen del volumen de almacenamiento.

Límite de detección (LOD): Un valor de medición se definió como el límite de detección. El valor se definió de tal manera que, arriba del valor, la presencia de clorito/clorato de WF10 en el medio se puede considerar verificada. Se usó el valor de absorbancia de 0.095, que es ligeramente mayor que el intervalo de incertidumbre del valor cero. Este valor explícito es válido solamente para mediciones realizadas de acuerdo con el método B del ejemplo 7.

Límite de cuantificación: Cuando se calcula la cantidad fugada de WF10 como una fracción del volumen de la muestra, el procesamiento de puntos datos cerca del LOD muchas veces produce resultados con incertidumbres. Por lo tanto se definió un segundo límite (el límite de cuantificación (LOQ)) que considera todos los parámetros que contribuyen a los cálculos de los resultados finales (tales como los volúmenes de la muestra y el medio de diálisis exterior). Los parámetros se mantuvieron constantes en todo el experimento y por lo tanto resultaron en un solo LOQ que indica el punto en donde la incertidumbre relativa total del resultado final desciende por debajo de 50% de su valor. En el presente estudio se definió como el LOQ la cantidad fugada de WF10 igual a 0.61 % vol. del volumen de la muestra.

Resultados Todos los resultados se resumen en la figura 10 en un diagrama de barras panorámico.

Muestras almacenadas a 6°C: Las muestras de refrigerador se guardaron un total de 200 días para el caso de liposomas de DPPC, y 121 días para el caso de liposomas de DPPC/DMPC. Con ambos tipos de liposomas no se detectó clorito/clorato en el medio de almacenamiento.

Muestras de temperatura ambiente: Las muestras de temperatura ambiente se guardaron un número total de 158 días para el caso de los liposomas de DPPC, y 79 días para el caso de los liposomas de DPPC/DMPC. En todos los casos se detectó clorito/clorato en el medio de almacenamiento y aumentaron continuamente con el tiempo.

Liposomas de DPPC Los resultados permanecieron por abajo del LOD durante por lo menos 101 , 28 y 79 días para SX123, SX124 y SX125, respectivamente. El periodo entre la segunda y tercera medición (28 y 79 días) fue relativamente grande, de tal manera que SX124 rebasó el LOD y tambien el LOQ en este periodo. SX123 nunca rebasó el LOQ, mientras que SX125 sí lo hizo entre los días 77 y 101 del almacenamiento.

Llposomas de DPPC/DMPC Los resultados de los llposomas encapsulantes de WF10 puro (SX130) permanecieron por abajo del LOD durante por lo menos 51 días. Las lecturas nunca rebasaron el LOQ. Para SX132 (PBS) y SX131 (taurina), el LOD se rebasó entre los días 22 y 51 , seguido por una extralimitación del LOQ entre los días 51 y 79.

Discusión v conclusión Con estos experimentos de LTS, fue posible obtener una visión del comportamiento a largo plazo de los liposomas de WF10, y mostrar que los liposomas de DPPC se pueden almacenar a 6°C sin fuga significativa durante por lo menos 200 días. Lo mismo es válido para los liposomas de DPPC/DMPC dentro de un periodo de 121 días. A temperatura ambiente, la muestra exhibió fuga después de 80 días.

Ejemplo 12 Caracterización del comportamiento de fuga de los liposomas de DPPC La temperatura de transición de fase de lípido (LPTT) es una consideración para el almacenamiento a largo plazo del material encapsulado liposómico. El conocimiento de los procesos de fuga alrededor de esta temperatura es útil para diseñar formulaciones para encapsular clorito y/o clorato. En este ejemplo se reportan los resultados de los estudios de fuga sobre liposomas de DPPC puros. 113 Preparación v experimentos Muestras Se prepararon dos muestras similares de 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina, siguiendo el procedimiento de preparación descrito en el ejemplo 6. Las muestras son SX122 y SX126 y tienen una concentración de lípido de aproximadamente 40 mM. A continuación se dan parámetros detallados.

SX122 A un matraz de fondo redondo se le agregaron 12.0 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 25 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 300 mg. La DPPC se le compró a Avanti Polar Lipids (producto no: 850355C). Se hidrató con 10.22 mL de WF10 preparado OXO-K993, 25.03 g de OXO-K993 en 250 mL de solución. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 42°C por 5 min. La extrusión ocurrió a 45.4°C y duró 20 min. Se hicieron 10 pases consecutivos y la muestra se guardó durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 45.004 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 74, 73, 38, 39 y 69 min. Posteriormente la muestra se guardó a 6°C para uso posterior.

SX126 A un matraz de fondo redondo se le agregaron 14 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 25 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 350 mg. La DPPC se le compró a Avanti Polar Lipids (producto no: 850355C). Se hidrató con 1 1.9 mL de WF10 preparado OXO-K993, 25.03 g de OXO-K993 en 250 mL de solución. El OXO-K993 se recibió de Nuvo Research GmbH. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C ±3°C por 4 min. La extrusión ocurrió a 46°C ±1 °C y duró 12 min. Se hicieron 10 pases consecutivos. Posteriormente las muestras se guardaron durante el fin de semana a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina (0.9%), preparada de 45.08 g de NaCI por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 78, 68, 68, 85 y 51 min. Posteriormente las muestras se guardaron a 6°C para uso posterior.

Experimentos de HRL Se diseñaron experimentos de HRL para monitorear la fuga del liposo a durante algunas horas hasta un máximo de algunos días. Fue posible ver cambios del comportamiento de fuga con un tiempo de resolución >5 min. Adicionalmente la temperatura de interes se pudo ajustar con precisión entre la temperatura ambiente y 60°C en pasos de 0.1 K.

El paso de HRL incluyó el control exacto de la temperatura y también la posibilidad de agitar el medio de almacenamiento. Como recipiente de almacenamiento se usó una probeta medidora de 500 mL, llena con 200 mL de solución salina al 0.9%como medio de almacenamiento. La muestra se introdujo en un marco de diálisis Slide-A-Lyzer™, como se hizo en el montaje de LTS (ejemplo 1 1 ), que después se sumergió en la solución de almacenamiento. El marco se sostiene con una boya flotante de espuma como también se hizo durante la diálisis. La solución de almacenamiento se agitó constantemente con un agitador magnetico. Las probetas medidoras se pusieron en un baño de calentamiento Julabo U3/B que controla la temperatura con una precisión de aproximadamente 0.1 K, durante periodos <12h y de 0.3K durante periodos >12h. La temperatura se monitoreó con termómetros calibrados oficialmente que tienen una precisión de aproximadamente 0.1 K. El montaje permitió el monitoreo de dos muestras en probetas de almacenamiento separadas. Usualmente se observaron dos muestras idénticas para proveer datos confiables.

Se hicieron los siguientes experimentos de HRL.

Fecha Muestra Tipo 12-12-2011 SX122 escaneo de temperatura 13-12-2011 SX122 HRL a 41 °C 06-01-2012 SX122 HRL a 38°C 11-01-2012 SX122 HRL a 39°C 25-01-2012 SX126 HRL a 41 °C 26-01-2012 SX126 HRL a 39°C 22-02-2012 SX126 HRL a 40°C Resultados v discusión Los resultados de los experimentos se representan en las figuras 11 a 15. Aquí, la cantidad fugada de WF10 se gráfica contra el tiempo transcurrido desde el comienzo del experimento. La temperatura también se presenta en el eje y, parte derecha. La cantidad de WF10 fugado se da como una fracción del volumen total de la muestra; es decir, un valor de 2% para una muestra de 1 mL, por ejemplo, corresponde a una liberación total de 20 mL de WF10 de los liposomas de la muestra.

Como se mencionó antes, usualmente cada experimento se hizo a un tiempo con dos muestras idénticas separadas. Las muestras se denominan “muestra A” y “muestra B” en las gráficas.

La fuga empieza a 39°C: En un periodo de pocas horas empieza una fuga significativa a temperaturas por arriba de 38°C. La figura 11 muestra los resultados de un escaneo de temperatura. La temperatura se mantuvo a 38°C durante aproximadamente tres horas sin cambio mensurable en la concentración de WF10 en el medio exterior. Después la temperatura se elevó 1 K induciendo una fuga de WF10 de los liposomas en el transcurso de apenas unos minutos. El calentamiento adicional a ~50°C aumentó la velocidad de la fuga.

Sin embargo, la figura 12 muestra el resultado de un experimento de HRL a 38°C durante 5 días, indicando una ligera fuga a aproximadamente 2.5% del volumen total de la muestra. La capacidad máxima de esta muestra (SX122) estuvo en la escala de 8-9%, de tal manera que solo un tercio de la cantidad encerrada fue liberada en este tiempo.

Fuga parcial a 39°C: La figura 13 muestra un experimento de HRL a 39°C. Se puede ver que fue liberado WF10 con un volumen de aproximadamente 2% del volumen total de la muestra después de aproximadamente 4 horas. Además, no aparece fuga incluso después de dejar el montaje experimental a 39°C durante la noche. Solo después de calentamiento adicional se fuga el resto del WF10 encerrado, hasta que fue liberado un volumen de aproximadamente 6-7% del volumen de la muestra.

Fuga arriba de 39°C: Las figuras 14 y 15 ilustran los resultados de los experimentos de HRL a 40°C y 41 °C, respectivamente. La cantidad total de sustancia encerrada fue liberada durante un periodo de aproximadamente 4 horas.

Volumen encerrado: Se encontró que el volumen encerrado por los liposomas en SX122 es de aproximadamente 8-9% del volumen de la muestra. Para SX126 fue 6-7% y, por lo tanto, más bajo. Aunque las muestras experimentaron el mismo procedimiento de preparación con parámetros casi idénticos, la diferencia no fue despreciable.

Estabilidad: Para ambas muestras el tiempo entre la preparación y el último experimento fue de aproximadamente un mes, durante el cual no ocurrió fuga en el recipiente de almacenamiento a 6°C. Por lo tanto, se puede concluir que los liposomas de DPPC son estables durante por lo menos un mes bajo enfriamiento constante.

Ejemplo 13 Estudio de estabilidad en 4 semanas (a) Fabricación y caracterización de las soluciones Clorito de sodio (sólido) Clariant Clorito de sodio (líquido, 25%) Merck Cloruro de sodio Merck Clorato de sodio Sigma-Aldrich, A.C.S.

Sulfato de sodio anhidro Sigma-Aldrich, A.C.S.

Carbonato de sodio anhidro Merck Hidróxldo de sodio 1 N Merck, TitriPur™ Fosfato de sodio dibásico anhidro Merck Fosfato de sodio monobásico monohidrato Merck Agua para inyección (WFI) Fresenius Consideraciones de estrés osmótico: Debido a su comportamiento no ideal, la presión osmótica “real” (experimental) de las soluciones salinas no puede ser calculada a partir de sus concentraciones molales con la precisión necesaria. Por lo tanto, es de esperar que el valor experimental de la presión osmótica (osmolalidad) de una solución se desvíe del valor teórico (osmolaridad) aproximadamente de -5% a -10%. El valor teórico típico reportado de la osmolaridad de la solución salina (cloruro de sodio al 0.9%) es 308 mOsmol/L. Esto correspondería a una osmolalidad de 310.8 mOsmol/kg. Comúnmente se asume que éste sería el valor “real”.

La osmolalidad especificada para WF10 es de 290 a 330 mOsmol/kg (media: 310) como el valor experimental. Este comcide aparentemente con el valor de la solución salina que es 308 mOsmol/L (osmolaridad) o 310.8 mOsmol/kg (osmolalidad). Sin embargo, se ha establecido experimentalmente que, para una solución salina, el valor real es de 287 mOsmol/kg (media de: 290; 287; 284).

Para evitar el estrés osmótico, las osmolalidades de las soluciones por fabricar se diseñaron cercanas al valor de un WF10 ideal, que fue 310 mOsmol/kg, para minimizar la diferencia del valor para solución salina, que es de 287 mOsmol/kg. Esto solamente fue posible por medio de un extenso trabajo experimental.

Muestra 1 : WF10 isotónico sin clorito (Nota: el TCDO referido en esta muestra era OXO-K993) Concentrado inicial: TCDO sin clorito (yTCDO) * anhidro; # Agua para inyección Se diluyeron en agua para inyección 7.84 g de yTCDO para hacer un volumen final de 50.0 mL.

Muestra 2: WF10 isotónico sin clorato (Nota: el TCDO referido en esta muestra era OXO-K993) Concentrado inicial: TCDO sin clorato (zTCDO) * anhidro; * Agua para inyección Se diluyeron en agua para inyección 5.44 g de zTCDO para hacer un volumen final de 50.0 mL.

Muestra 3: Clorato, CI03 , isotónico, sin amortiguador Se disolvieron 883 mg de clorato de sodio (equivalentes a 662.2 mg de clorato) en 50 g de agua para inyección.

Muestra 4: Clorito isotónico con amortiguador a pH 7.4 (i) Amortiguador de fosfato pH 7.2 Solución 1 : Se disolvieron 2.84 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HP04, anhidro) en 100 g de agua para inyección.

Solución 2: Se disolvieron 2.76 g de fosfato de sodio monobásico (NaH2P04*H2O) en 100 g de agua para inyección.

Amortiguador pH 7.2: Bajo el control de un electrodo de vidrio, la solución 2 se agregó a la solución 1 hasta que se alcanzó un pH de 7.21.

Osmolalidad: 403 mOsmol/kg (media de 400; 406) (ii) Solución de clorito de sodio Se diluyeron 9.0 g de solución de cloruro de sodio al 25% (p/p) disponible comercialmente con 93 g de agua para inyección.

Osmolalidad: 506.5 mOsmol/kg (media de 504; 509). (iii) Amortiguador isotónico de fosfato, pH 7.2 38.0 g del amortiguador de fosfato pH 7.2 del inciso (a) se llevaron a 50.0 g con agua para inyección.

Osmolalidad: 310 mOsmol/kg (media de 309; 310; 311). (iv) Solución isotónica de clorito de sodio 30.3 g de la solución de clorito de sodio del inciso (ii) se llevaron a 50.0 g con agua para inyección.

Osmolalidad: 294.7 mOsmol/kg (media de 293; 295; 296). (v) Solución isotónica de clorito con amortiguador a pH 7.4 Bajo el control de un electrodo de vidrio, el amortiguador isotónico de fosfato pH 7.2 del inciso (iii) se agregó a la solución isotónica de clorito de sodio del inciso (iv) (50 g) hasta que se alcanzó un pH de 7.39.

En la tabla 3 se reporta la caracterización analítica de las soluciones preparadas. (b) Preparación de liposomas que encapsulan las soluciones preparadas Se prepararon muestras de liposoma usando uno de los siguientes fosfolípidos, o los dos: • 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DMPC, comprada como polvo a Lipoid GmbH (LIPOID PC 14:0/14:0), de la cual se disolvieron 801 mg en 60 mL de cloroformo (13.35 mg/mL) • 1 ,2-dipalmito¡l-sn-glicero-3-fosfocolina, DPPC, comprada como polvo a Lipoid GmbH (LIPOID PC 16:0/16:0), de la cual se disolvieron 10.617 g en 126 mL de cloroformo (84.26 mg/mL) • fosfatidilcolina hidrogenada (soya), PC hidro/soya, comprada como polvo a Lipoid GmbH (LIPOID S PC-3), de la cual se disolvieron 1 ,208 mg en 25 mL de cloroformo (48.32 mg/mL) Las muestras 1 -4 se encapsularon en los lípidos antes mencionados. Para evitar el estrés osmótico (interior contra exterior), estas soluciones se hicieron isotónicas (aproximadamente 300 mOsmol/kg). Adicionalmente, para una de las muestras se usó una solución i.v. de WF10 (Immunokine™) fabricada por Pharma Hameln, Alemania. También se preparó una solución salina al 0.9% a partir de cloruro de sodio y agua desionizada (NaCI de VWR, GPR Rectapure).

Se prepararon 13 muestras liposómicas para los experimentos, y se identificaron como sigue: Nombre Contenido Lípido Muestra 5 Muestra 2 DPPC Muestra 6 Muestra 3 DPPC Muestra 7 Muestra 1 DPPC Muestra 8 Muestra 4 DPPC Muestra 9 Muestra 2 DPPC/DMPC (9 mol /1 mol) Muestra 10 Muestra 3 DPPC/DMPC (9 mol /1 mol) Muestra 11 Muestra 1 DPPC/DMPC (9 mol /1 mol) Muestra 12 Muestra 4 DPPC/DMPC (9 mol /1 mol) Muestra 13 Muestra 2 PC hidro/soya (S PC-3) Muestra 14 Muestra 3 PC hidro/soya (S PC-3) Muestra 15 Muestra 1 PC hidro/soya (S PC-3) Muestra 16 Muestra 4 PC hidro/soya (S PC-3) Muestra 17 WF10 PC hidro/soya (S PC-3) Preparación de muestras Las muestras se prepararon usando los procedimientos descritos generalmente en el ejemplo 6, con algunas modificaciones. Los parámetros precisos se proveen en las secciones siguientes.

Orden cronológico A continuación se da la cronología de toda la preparación de muestras 5 de septiembre de 2012: Evaporación, hidratación y extrusión de las muestras 5, 6, 7, 9, 10 y 1 1 6 de septiembre de 2012: Evaporación, hidratación y extrusión de las muestras 8, 12, 13, 14, 15, 16 y 17 10 de septiembre de 2012: Diálisis de las muestras 5-8 1 1 de septiembre de 2012: Diálisis de las muestras 9-12 12 de septiembre de 2012: Diálisis de las muestras 13-17 14 de septiembre de 2012: Diálisis de la muestra 17 Todas las muestras o muestras parcialmente terminadas se guardaron en un refrigerador (1 -4 °C) al final de la preparación, o entre los diferentes pasos de preparación, respectivamente.

Evaporación e hidratación Para las muestras de DPPC se evaporaron 2000 pl_ de la solución de DPPC-cloroformo (84.26 mg/mL) y se hidrataron con 574 mI_ de la mezcla iónica correspondiente.

Las muestras de DPPC/DMPC se prepararon evaporando 1300 pL de la solución de DPPC en cloroformo y 2000 mL de la solución de DMPC en cloroformo (13.35 mg/mL). Se usaron 6390 pL de la mezcla iónica correspondiente para la hidratación.

En ambos casos la hidratación ocurrió a 47°C y duró menos de 5 minutos.

Para las muestras de PC hidro/soya, la temperatura de hidratación se puso a 60°C, mientras que la duración del procedimiento tambien fue menor de 5 minutos. Se evaporaron 4000 pL de la solución de lípido en cloroformo (48.32 mg/mL) antes de la hidratación, que ocurrió con 6170 pL de la mezcla iónica correspondiente.

Extrusión La extrusión se hizo a una temperatura de 47°C con las muestras de DPPC y DPPC/DMPC, y a 60°C con las muestras de PC hidro/soya. Se aplicaron 10 pasos sucesivos de extrusión para todas las muestras, excepto la muestra 17 en donde se aplicaron 9 pasos sucesivos. La duración general de los pasos fue menor de 15 minutos para todas las muestras, excepto las muestras 13, 14 y 16, en donde fue menor de 25 minutos.

Diálisis El medio de diálisis fue una solución salina al 0.9%, preparada agregando 45.0 g de NaCI a un matraz volumétrico de 5000 mL, que entonces se llevó al volumen con agua desionizada.

Todas las muestras se dializaron en un marco de diálisis de 3-12 mL. Se hicieron 5 pasos sucesivos, cada uno con 900 L de medio de diálisis y una duración de por lo menos 45 min. Es de notar que está disponible un método de diálisis nuevo que utiliza microdiálisis (Roth Mini-Dialyzer). Requiere volúmenes de muestra (es decir, preparación de liposoma) en la escala de solo 100 mL, y un volumen de diálisis (es decir, solución salina) en la escala de 1 -2 mL. El uso de este método mejora el límite de cuantificación en un factor de aproximadamente 10 en comparación con el método anterior.

Almacenamiento de 4 semanas: El montaje de LTS descrito en el ejemplo 11 se reemplazó con el método general siguiente: Después de la diálisis, las muestras se retiraron del marco de diálisis y se guardaron en cualquier vial apropiado. La separación de los liposomas de su medio exterior ocurrió el día del examen, en donde una fracción de la muestra se retiró y se sometió a microdiálisis, seguida por monitoreo de los componentes potencialmente fugados en el dializado. A continuación se presentan los detalles.

El 17 de septiembre de 2012, se distribuyeron equitativamente 4 ml_ de cada muestra en cuatro recipientes de 1.5 ml_ (1 mL cada uno). Después, dos de los recipientes se guardaron en un refrigerador a 1-4 °C, mientras que los otros dos permanecieron a temperatura ambiente. Todos los recipientes almacenados a la misma temperatura se marcaron apropiadamente y se pusieron en el mismo contenedor junto con un registrador de temperatura, que se programó para registrar la temperatura cada 5 minutos. Posteriormente los contenedores se sellaron y se guardaron a sus respectivas temperaturas. Los datos registrados son temperaturas constantes entre 1 -4 °C de las muestras del refrigerador y 21 -23 °C de las muestras a temperatura ambiente.

Para asegurar la integridad de todas las muestras al comienzo del experimento, se retiraron 100 mL de los volúmenes de muestra y el medio exterior se separó como se describe en la siguiente sección. Estas muestras se guardaron entonces a -25°C para realizar después del experimento un análisis de o-tolidina junto con las otras muestras.

Los contenedores se reabrieron el 24 de octubre de 2012, y se retiraron 100 mL de muestra de cada recipiente para realizar un análisis de o-tolidina del medio exterior de la muestra. El procedimiento se describe en la siguiente sección.

Separación y análisis del medio exterior Como se mencionó arriba, y al contrario del montaje de LTS descrito en los ejemplos 8 y 11 , las muestras no se guardaron en la cámara de diálisis durante el experimento de LTS, sino en recipientes apropiados. Por lo tanto, fue necesaria la separación de los liposomas de su medio exterior antes de detectar las sustancias fugadas en el medio exterior. Para esta separación se usaron unidades de diálisis pequeñas con un volumen máximo de 100 mL (ZelluTrans/Roth Mini-Dyalyzer, MWCO 12000, de Cari Roth, producto no.: 4775.1 ). La diálisis se hizo contra 1500 pL de solución salina al 0.9% como medio de diálisis y ocurrió en recipientes de reacción de 2 mL. Para los experimentos actuales, el 24 de octubre de 2012 se vaciaron 100 pL de cada muestra en las unidades de diálisis y se dejaron a la temperatura correspondiente (ya sea temperatura ambiente o 1-4 °C) hasta el 29 de octubre de 2012. Ese día, las unidades de diálisis se transfirieron a otro recipiente de reacción de 2 mL, lleno con 1500 pL de solución salina al 0.9%. Los recipientes de 2 mL “viejos” se guardaron entonces durante la noche a 1-4 °C. El montaje “nuevo” se calentó a 60°C y se dejó durante la noche para forzar una fuga completa.

Las muestras iniciales, tomadas el 17 de septiembre de 2012, se sometieron a un procedimiento de separación durante la noche de ese día. Al día siguiente, las unidades de diálisis se retiraron y los viales con el medio exterior separado se guardaron a -25°C para ser analizados junto con las otras muestras.

El 30 de octubre de 2012 se hizo un análisis de o-tolidina del medio de diálisis de los tres casos (prueba de integridad inicial, medio despues de almacenamiento, y medio después de almacenamiento y calentamiento), siguiendo las descripciones del procedimiento de o-tolidina del método B del ejemplo 7.

Las concentraciones de los componentes no se calcularon. En vez de eso, el procedimiento se restringió a monitorear los valores de absorción para tomar la decisión: hubo fuga o no la hubo. Esto se debe al hecho de que todos los métodos de cuantificación se refieren a WF10 puro, el cual tiene un contenido de clorito/clorato diferente de la mayoría de las sustancias encapsuladas. La comparación de los datos de absorción de las mediciones antes y después de la fuga forzada completa puede dar una estimación aproximada de la magnitud de la fuga.

Resultados v análisis Los valores de absorbancia fueron comparables entre sí pero no se normalizaron con respecto a una longitud de trayectoria óptica estándar de 1 cm. Para las mediciones de absorción se usó el límite de detección (LOD) definido en el ejemplo 14 (0.095). En los casos en donde los valores de absorbancia estaban por abajo del LOD, la fuga fue demasiado débil para ser detectada o no ocurrió en absoluto. La tabla 4 provee los valores numéricos de las mediciones de absorción.

Los valores de cada muestra fueron el promedio de los dos recipientes almacenados separadamente. Se incluyen los resultados de la fuga forzada, que muestran una señal enorme en comparación con todas las otras señales, indicando que todas las muestras contenían liposomas llenados apropiadamente. La señal de todas las mediciones iniciales estuvo por abajo del LOD y por lo tanto ilustra que ninguna muestra contenía sustancia ya fugada en el medio exterior. Con respecto a los resultados individuales se deben considerar tres perspectivas: almacenamiento, temperatura, composición de lípido y sustancia encerrada.

Resultados por temperatura de almacenamiento La temperatura de almacenamiento tuvo el impacto más fuerte sobre el comportamiento de fuga de las muestras. Todas las fugas, excepto en un caso, ocurrieron en las muestras almacenadas a temperatura ambiente, y en el caso de la única muestra de refrigerador con fuga (muestra 8), su fuga a temperatura ambiente exhibió la señal más fuerte de todas las muestras de la prueba.

Resultados por sustancia encerrada Todos los liposomas que exhibieron señales por arriba del LOD se llenaron con clorito o clorato. Las muestras llenadas con clorato presentaron fuga en todos los escenarios de temperatura ambiente e incluso a la temperatura de refrigerador una muestra (muestra 8) rebasó ligeramente el LOD. Todas las muestras con clorito de temperatura ambiente presentaron fuga excepto una (muestra 14).

Resultados por lípido La fuga fue mucho más debil en muestras hechas con PC hidro/soya (S PC-3) que tiene una PTT más alta (55°C) que DPPC (41 °C) y DMPC (23°C). En el caso de la mezcla DPPC/DMPC, la PTT no está claramente definida y abarca un intervalo de temperatura entre las PTTs de DPPC y DMPC.

Ejemplo 14 Efectos de la osmolaridad sobre liposomas encaosulantes de WF10 Se sabe que las membranas de lípido son, hasta cierto punto, permeables a las moleculas pequeñas tales como agua, mientras que las moléculas grandes y también las cargadas no pueden pasar tal membrana, o lo hacen a velocidades mucho más bajas. La osmosis es una consecuencia directa de este efecto. Aparece en un límite semipermeable entre dos depósitos acuosos con diferentes concentraciones de partículas osmóticas (p. ej., moléculas más grandes). Los sistemas tienen a equilibrar ambas concentraciones, lo cual solo es posible diluyendo el depósito más concentrado con moléculas de agua del menos concentrado. El movimiento de las partículas disueltas al depósito de concentración más baja para elevar la concentración no es posible, puesto que las partículas no pueden pasar el límite. La consecuencia de la “invasión” de las moléculas de agua es un aumento de volumen del depósito de concentración más alta, lo que produce una presión sobre las paredes del depósito. Finalmente esta presión se hace demasiado alta para que la resista la pared y entonces estallará.

La envoltura de bicapa de un liposoma es una membrana semipermeable y por lo tanto es susceptible a los efectos osmóticos. Se podría sugerir que los gradientes osmóticos pueden inducir fuga de los liposomas o incluso hacer que estallen. En un experimento breve se estudió el comportamiento de fuga de liposomas llenos con WF10, en donde se usó WF10 concentrado para aumentar la osmolaridad del interior con respecto al medio salino circundante.

La finalidad de este estudio fue obtener información detallada acerca de los parámetros de fuga bajo efectos osmóticos, pero para encontrar una tendencia general de fuga bajo tales condiciones.

Muestras Se prepararon dos muestras usando WF10 concentrado 2x o 3x, preparado con solución de OXO-K993 provista por Nuvo Research GmbH (Lote 4053), de la siguiente manera: WF10 2x: 10 g de OXO-K993 llevados a 50 mL con agua WF10 3x: 15 g de OXO-K993 llevados a 50 mL con agua La preparación de la muestra empezó el 4 de julio de 2012 y se hizo de acuerdo con el procedimiento usual (ejemplo 6). Al matraz de fondo redondo se le agregaron 2.1 mL de una solución de DPPC en cloroformo a 84.26 mg/mL. Esto corresponde a una masa de lípido de 177 mg. La DPPC se le compró a LIPOID GmbH. Se hidrató con 6.0 mL de la concentración respectiva de WF10 (2x o 3x) preparado como se describe arriba. Durante el proceso de hidratación la muestra se calentó a 46°C ± 3°C por 5 min aproximadamente. La extrusión ocurrió a 50°C ± 3°C y duró 20 min aproximadamente, incluyendo 10 pases consecutivos. Posteriormente las muestras se guardaron durante la noche a 6°C en un refrigerador. Los pasos de diálisis se hicieron en 900 mL de solución salina, preparada con 90.034 g de NaCI (para WF10 2x) y 135.063 g de NaCI (para WF10 3x) por 5000 mL de solución. Se efectuaron 5 pasos subsiguientes que duraron 95, 80, 80, 60 y 80 min. Posteriormente las muestras se retiraron de los marcos de diálisis y se guardaron a 6°C.

Fuga de HRL La prueba de fuga de HRL empezó el 6 de julio de 2012 con un paso de diálisis de 50 minutos en solución salina al 0.9% con 45.016 g de NaCI por 5000 mL de solución, para quitar el medio de almacenamiento de concentración más alta de los liposomas. Posteriormente el procedimiento se efectuó como se describe en el ejemplo 12, sin usar el baño de calentamiento, de tal manera que ocurrió a temperatura ambiente, 22°C. Como es usual, las dos muestras se dividieron antes de los experimentos y se procesaron en dos probetas medidoras paralelas, de tal manera que para cada muestra estuvieron disponibles dos conjuntos de datos que se graficaron en la sección de resultados.

Determinación del volumen encerrado Para determinar el volumen del WF10 encerrado en las muestras se indujo fuga completa calentando el montaje de HRL, descrito arriba, a 60°C durante varias horas. Despues se usó un análisis de o-tolidina del medio salino circundante para evaluar el contenido de WF10.

Resultados v evaluación La evaluación de las muestras de medio tomadas durante el experimento se hizo como se describe en el ejemplo 7 (método B). Se consideró el hecho de que la concentración de WF10 fuera dos o tres veces más alta que lo usual cuando se calcula la cantidad liberada de WF10 a partir de las concentraciones de WF10 determinadas en el medio de almacenamiento. La figura 16 ilustra los resultados en función de WF10 fugado con respecto al volumen total de la muestra. Se puede ver que fue detectada fuga despues de 1-2 horas. Durante todo el periodo experimental se liberó aproximadamente 5% del WF10 doblemente concentrado y 18% del WF10 triplemente concentrado encerrados. Casi todo el WF10 fugado fue liberado durante las primeras 6 horas después de que empezó la fuga. Durante los 4 días subsiguientes los cambios fueron tan pequeños que no se puede afirmar si la fuga se detuvo o continuó a una velocidad muy baja.

Ejemplo 15 Preparación de liposomas usando el método de invección de etanol Se prepararon liposomas que contienen WF10 usando el método de inyección de etanol de flujo cruzado con las siguientes composiciones de lípido: 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), DPPC con una fracción de 10% de 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), DPPC con una fracción de 10% de 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), y DPPC con una fracción de 10% de 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG). Los lípidos cargados (DPPG y DMPG) se agregaron para impedir la agregación de los liposomas durante el procesamiento y almacenamiento.

La figura 17 muestra un esquema de la preparación de liposomas usando el método de inyección de etanol. Esté método resulta en la formación directa de liposomas unilaminares pequeños del tamaño deseado con una distribución de tamaño aceptable.

Las características del método aplicado de inyección de etanol de flujo cruzado incluyen las siguientes: • El tamaño del lote es determinado (no limitado) por el volumen de los recipientes de las muestras • Los liposomas resultantes son instantáneamente de tamaño y distribución de tamaño controlados • Mínimo estrés térmico • La fase exterior debe ser intercambiada y el etanol residual debe ser quitado: 0 Se aplica ultrafiltración para concentrar el producto primario ° La diafiltración: intercambiará la fase exterior (WF10) por solución salina quitará el etanol de la fase exterior y de la mezcla encerrada de WF10/etanol Materiales v métodos La DPPC, DMPC, DMPG y DPPG fueron provistos por Lipoid GmbH (Alemania). El etanol al 96% grado Farmacopea Europea para disolver los componentes lipidíeos se le compró a Merck KgaA (Alemania).

La fase acuosa para la preparación de la vesícula fue solución de WF10 -una dilución al 10% del ingrediente activo OXO-K993 en agua, de acuerdo con las instrucciones de Nuvo Manufacturing GmbH. Se usó solución de NaCI 0.154M (fisiológica) como fase acuosa para dilución. Todos los reactivos se compraron de la pureza más alta y, cuando fue posible, grado USP o Farmacopea Europea.

Los liposomas se produjeron con teenología de liposoma de Polymun (tecnica de inyección de flujo cruzado) como lo describen Wagner et al., 10urnal of Liposome Research, 2002, 12(3): 259-270. Se realizó ultra/diafiltración (pequeña escala) usando una membrana de UF Sartocoon Slice Casette 100 kD (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania).

La determinación del tamaño de liposoma se hizo por dispersión de luz dinámica de láser con un Malvern Nano ZS. Este sistema se equipó con un láser de helio/neón de 4 mW a longitud de onda de 633 nm, y mide las muestras de liposoma con la tecnología no invasiva de retrodispersión a un ángulo de detección de 171 °. Los liposomas se diluyeron en fase acuosa para alcanzar una concentración de liposoma óptima y los experimentos se efectuaron a 25°C. Los resultados se presentan como el diámetro promedio de la suspensión de liposoma (media del promedio de z) con el índice de polidispersividad para determinar la homogeneidad del liposoma. Además, también se determinó el potencial zeta con el Malvern Nano ZS. Por lo tanto, las muestras se diluyeron con solución de NaCI 0.154 M.

La cuantificación de DPPC se hizo por HPLC de fase inversa.

La cuantificación de WF10 se hizo por medio del método de o-tolidina (véase el método B del ejemplo 7) midiendo la absorbancia a 442 nm.

Parte experimental v resultados Todos los experimentos se hicieron con teenología de liposoma Polymun. El módulo de inyección usado para todos los experimentos se equipó con un diámetro de agujero de inyección de 350 pm. Durante el desarrollo, los liposomas de DPPC pura y de DPPC/DMPC mostraron un potencial zeta pequeño. Por lo tanto se usaron dos formulaciones de lípido adicionales (DPPC/DMPG, DPPC/DPPG). Se variaron varios parámetros de proceso para estudiar el efecto sobre las propiedades del liposoma y para optimizar los parámetros del proceso para satisfacer los requerimientos del producto final.

Las condiciones iniciales del desarrollo del proceso para los liposomas de DPPC pura y de DPPC/DMPC fueron las siguientes: • Temperatura de las fases acuosas: 40°C • Temperatura de la solución de lípido-etanol: 40°C • Fases acuosas para la preparación de la vesícula: solución de WF10 • Fases acuosas para dilución: NaCI 0.154 M (fisiológico) • Fase de etanol (solución lípido-etanol): 75 mL para 1000 mL de fase acuosa (volumen total de producción: 1075 mL) • Concentración de WF10 (volumen intermedio): 79.1 mg/mL Las condiciones iniciales del desarrollo del proceso para los liposomas de DPPC/DMPG y DPPC/DPPG fueron las siguientes: • Temperatura de las fases acuosas: 55°C • Temperatura de la solución de lípido-etanol: 55°C • Fases acuosas para la preparación de la vesícula: solución de WF 10 Fases acuosas para dilución: NaCI 0.154 M (fisiológico) • Fase de etanol (solución lípido-etanol): 75 mL para 1000 mL de fase acuosa (volumen total de producción: 1075 mL) • Concentración de WF10 (volumen intermedio): 79.1 mg/mL La tabla 5 muestra los datos de los diversos liposomas encapsulantes de WF10 preparados usando el metodo de inyección de etanol, que incluyen el tamaño de liposoma, índice de polidispersividad (Pdl), cuantificación de DPPC y cuantificación de clorito. La tabla 6 muestra los mismos resultados de una corrida repetida de los experimentos reportados en la tabla 5. Las figuras 18 y 19 muestran la cantidad de clorito recolectado en el filtrado durante el proceso de diafiltración de los experimentos reportados en las tablas 5 y 6, respectivamente. La tabla 7 muestra los datos de varios liposomas encapsulantes de WF10 preparados usando el método de inyección de etanol y conteniendo 2x la concentración de WF10 en comparación con los liposomas preparados de las tablas 5 y 6, que incluyen el tamaño de liposoma, índice de polidispersividad (Pdl), cuantificación de DPPC y cuantificación de clorito; y la figura 20 muestra la cantidad de clorito recolectada en el filtrado durante el proceso de diafiltración de los mismos liposomas de WF10 2x.

La tabla 8 muestra los resultados de un estudio de estabilidad a largo plazo realizado en las muestras reportadas en las tablas 6 y 7.

Ejemplo 16 Estudio de modelo de animal de artritis inducida por colágeno 1AIC1 Ratones DBA/1 hembras se sensibilizaron con una solución de colágeno II el día 0 y se les administró un refuerzo el día 21. Desde el día 17 se calificaron los signos clínicos de artritis inducida por colágeno (AIC) en los animales. La AIC se consideró establecida si la puntuación evaluada excedía un valor de 5. Se incluyeron en el estudio los animales que desarrollaron AIC los primeros 35 días despues de la inmunización. Los animales que desarrollaron AIC después de este punto tiempo fueron excluidos. Desde el día del inicio de la AIC los anímales se trataron con WF10 (0.25 ml/kg), WF10 en forma liposómica (LipoWFI O), o NaCI. La calificación se hizo durante un total de 21 días después del inicio de la AIC. Después de este periodo los animales fueron sacrificados.

Localización del estudio Medizinisch-Experimentelles Zentrum der Medizinischen Fakultát Leipzig, Liebigstrape 26a, 04103, Leipzig; Max-Bürger- Forschungszentrum (MBZ), Johannisallee 30, 04103, Leipzig.

Método Ratones DAB/1 hembras (Janvier), de 7-8 semanas de edad, con pesos corporales de aproximadamente 17 g (±2) se aclimataron en la instalación durante 4 semanas después del envío. Los animales se alojaron en una instalación especializada y calificada (Medizinisch- Experimentelles Zentrum (MEZ) Universitát Leipzig, Medizinische Fakultát). Los animales se identificaron por medio de marcación en la oreja.

Todos los ratones se inmunizaron por inyección intradérmica de 100 mI de emulsión de colágeno-CFA el día 0 (CFA representa adyuvante de Freund completo). El día 21 se reforzó la AIC inyectando 100 ml de emulsión de colágeno-IFA (IFA representa adyuvante de Freund incompleto).

La AIC se consideró establecida cuando un animal excedía un umbral de puntuación de 5. Ese día se inició el tratamiento farmacológico y se hizo durante diferentes intervalos de tiempo. Ocho ratones recibieron 100 m! i.v. de WF10 en una dosificación de 0.25 ml/kg de peso corporal, los días 1 , 3 y 5 después del inicio de la AIC. Once ratones recibieron 100 mI i.v. de S_PC-3-LipoWF10, suministrando una dosificación de WF10 de aproximadamente 0.25 ml/kg de peso corporal, y doce ratones recibieron 100 mI i.v. de S_PC-3-LipoWF10 (diluido 1 : 10) suministrando una dosificación de WF10 de aproximadamente 0.025 ml/kg de peso corporal. El grupo de control comprendía 10 ratones que recibieron 200 mI de NaCI. Toda administración se hizo los días 1 , 3 y 5 después del inicio de la AIC. La preparación de liposoma “S_PC-3-LipoWFI O” contenía WF10 como la fase interior y solución salina como la fase exterior, y fosfolípido hidrogenado de soya como el lípido (véase el ejemplo 9). Los liposomas tenían una tasa de inclusión de 5%, que provee un volumen aproximado de 5 mL de WF10 en los 100 pL de la preparación. La dilución de S_PC-3-LipoWF10 1 : 10 fue una dilución de la preparación de liposoma original en un factor de 10; por lo tanto, como resultado, la cantidad absoluta de WF10 se redujo, aunque se espera que las vesículas liposómicas sigan conteniendo WF10 esencialmente puro. Se incluyeron en el estudio los animales que desarrollaron AIC en los primeros 35 días después de la inmunización. Los animales que desarrollaron AIC después de este punto de tiempo fueron excluidos.

Todos los ratones se calificaron diariamente empezando el día 17 medido desde la inyección inicial de colágeno. Las personas que evaluaron la puntuación de los animales desconocían el tratamiento farmacológico. Se examinaron todas las extremidades en busca de enrojecimiento e hinchazón. La puntuación máxima por extremidad fue de 15/día y la puntuación máxima para un animal fue un total de 60/día. A partir de estos valores simples se calculó el valor medio de cada grupo.

Resultados Los signos de artritis inducida por colágeno (AIC) en los animales se calificaron empezando el día 17 después de la primera inmunización. Se consideró que se había inducido AIC cuando la puntuación de un animal excedía un valor de 5, y ese día se denotó como d1 para ese animal. Similarmente, el día n después del inicio de AIC fue denotado como dn para cada animal. La figura 21 muestra los valores medios de la puntuación de AIC durante el experimento desde dO (un día antes del inicio de la AIC) hasta d22.

En los experimentos de AIC, el efecto del tratamiento usualmente empieza alrededor del d 12 y la separación es más fuerte alrededor de los d15-d17. Despues de eso, la puntuación de la enfermedad declina debido al modelo. La figura 22 muestra las puntuaciones de valores medios para el d16.

Las porciones relevantes de todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan aquí como referencia como si se indicara específica e individualmente que cada publicación, patente o solicitud de patente individual se incorpora como referencia. Si en la presente invención se encuentra un término definido diferentemente de un documento incorporado aquí como referencia, la definición aquí provista servirá como la definición de dicho término.

Tabla 1 Tabla 1 (Continuación) Tabla 1 (Continuación) 1 Número de Registro del Chemical Abstracts Service Tabla 2 Liposomas de WF10 preparados a partir de DPPC, DPPC/DMPC, fosfolípido hidrogenado de soya (3_PC3) y 3_PC3/DMPC Tabla 3 Caracterización analítica de las soluciones fabricadas del ejemplo 15 Tabla 4 Mediciones de absorción del ejemplo 15 Muestra Prueba inicial Almacenamiento Almacenamiento Fuga forzada No. en refrigerador a temperatura ambiente 5 < LOD < LOD < LOD 3.7623 6 < LOD < LOD 0.1816 3.7970 7 < LOD < LOD < LOD 3.1831 8 < LOD 0.1243 1.1388 3.8322 9 < LOD < LOS < LOD 3.6707 10 < LOD < LOD 0.4243 3.7630 11 < LOD < LOD < LOD 3.3011 12 < LOD < LOD 1.0170 3.8020 13 < LOD < LOD < LOD 3.5692 14 < LOD < LOD < LOD 3.5893 15 < LOD < LOD < LOD 3.5574 16 < LOD < LOD 0.2286 3.7784 17 < LOD < LOD < LOD 3.8766 Tabla 5 Int = producto intermedio Ret = producto retenido (después de u ltra/di afi Itración) * Recuperación teórica del clorito encapsulado asumiendo 100% de recuperación de DPPC Tabla 6 Int = producto intermedio Ret = producto retenido (después de ultra/d i afi Itraci ón ) * Recuperación teórica del clorito encapsulado asumiendo 100% de recuperación de DPPC Tabla 7 Int = producto intermedio Ret = producto retenido (despues de ultra/diafiltración) * Recuperación teórica del clorito encapsulado asumiendo 100% de recuperación de DPPC Tabla 8 a WF10 (1x) indica que los liposomas contenían WF10 en su concentración normal. Esto evita una diferencia significativa de presión osmótica con respecto a la solución salina como la fase exterior. WF10 (2x) indica que los liposomas contenían WF10 a una concentración doble, causando estrés osmótico con respecto a la solución salina en la fase exterior. b El LOD se estableció como un valor de absorción de 0.095.

Claims (53)

REIVINDICACIONES

1.- Una composición liposómica que comprende liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido y clorito, clorato o una mezcla de los mismos encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados.

2.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende clorito, en donde el clorito es un clorito estabilizado.

3.- La composición de la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende clorito, en donde el clorito es OXO-K993.

4.- La composición de la reivindicación 2, en donde el clorito estabilizado comprende 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-50% o 50-90% (p/v) de OXO-K993.

5.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende, basándose en el contenido total de iones encapsulados de la composición, de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p), de aproximadamente 0.3% (p/p) a aproximadamente 3% (p/p), o aproximadamente 1.0% (p/p) de clorito encapsulado.

6.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende, basándose en el contenido total de iones encapsulados de la composición, de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p), de aproximadamente 0.3% (p/p) a aproximadamente 3% (p/p), o aproximadamente 1.0% de clorato encapsulado.

7.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende, basándose en el contenido total de iones encapsulados de la composición, de aproximadamente 0.01 % (p/p) a aproximadamente 50% (p/p), de aproximadamente 0.1 % (p/p) a aproximadamente 20% (p/p), de aproximadamente 0.5% (p/p) a aproximadamente 10% (p/p), de aproximadamente 0.3% (p/p) a aproximadamente 3% (p/p), o aproximadamente 1.0% de una mezcla de clorito y clorato encapsulados.

8.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque el clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados tienen un pH que es mayor de aproximadamente 5, mayor de aproximadamente 6, mayor de aproximadamente 8, o mayor de aproximadamente 10.

9.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque el clorito, clorato o mezcla de los mismos encapsulados tienen un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12.

10.- La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque los lípidos comprendidos en los liposomas son adecuados para el atrapamiento de clorito, clorato o mezclas de los mismos que tienen un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 14, de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, de aproximadamente 8 a aproximadamente 12.5, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 12.

11.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada además porque los lípidos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en un fosfolípido, un esfingolípido, y mezclas de los mismos.

12.- La composición de la reivindicación 11 , caracterizada además porque el fosfolípido es una fosfatidilcolina (PC) que comprende cadenas de acilo graso saturadas o insaturadas de longitud suficiente, y el esfingolípido es esfingomielina (SM).

13.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque los lípidos adecuados se seleccionan de los que forman liposomas que permanecen estables durante un periodo aceptable, a temperaturas de almacenamiento dentro de la escala de aproximadamente 5°C a aproximadamente 50°C.

14.- La composición de la reivindicación 13, caracterizada además porque los lípidos adecuados se seleccionan de los que forman liposomas que son impermeables a la fuga de iones a una temperatura de aproximadamente 5°C.

15.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada además porque los liposomas comprenden dos o más tipos de lípidos adecuados.

16.- La composición de la reivindicación 15, caracterizada además porque los liposomas comprenden dos tipos de lípidos adecuados y los 1 í pidos están presentes en una proporción molar de 20: 1 a 1 : 1 , de 15: 1 a 5: 1 , o de 10: 1 a 9: 1.

17.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada además porque comprende por lo menos un componente adicional que aumenta la rigidez y/o reduce la permeabilidad de las bicapas de lípido.

18.- La composición de la reivindicación 17, caracterizada además porque el componente adicional está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 50%, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, o de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% del contenido total de lípido.

19.- La composición de la reivindicación 17 o 18, caracterizada además porque el componente adicional se selecciona de colesterol y sulfato de colesterol.

20.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada además porque comprende por lo menos un componente adicional que da a los liposomas un potencial zeta que reduce la agregación de los liposomas.

21.- La composición de la reivindicación 20, caracterizada además porque el potencial zeta que reduce la agregación de los liposomas es por lo menos más positivo que +5mV o más negativo que -5mV.

22.- La composición de la reivindicación 20 o 21 , caracterizada además porque el componente adicional que da a los liposomas un potencial zeta que reduce la agregación de los liposomas, es un lípido cargado.

23.- La composición de la reivindicación 22, caracterizada además porque el lípido cargado es un lípido cargado negativamente.

24.- La composición de la reivindicación 23, caracterizada además porque el lípido cargado negativamente es un fosfatidi Iglicerol, una fosfatidiletanolamina, una fosfatidilserina o un ácido fosfatídico.

25.- La composición de la reivindicación 24, caracterizada además porque el lípido cargado negativamente se selecciona de las sales de 1 ,2,-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG), 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DOPG), o 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG), 1 ,2-diestearoil-sí7-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), o 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-metil-polietilenglicol (MPEG-DSPE), y mezclas de los mismos.

26.- La composición de la reivindicación 25, caracterizada además porque el lípido cargado negativamente se selecciona de 1 ,2,-dipalmitoil-sr7-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG), 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DSPG), y mezclas de los mismos.

27.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizada además porque el lípido cargado está presente en una cantidad que provee una proporción de lípidos no cargados : lípidos cargados de 20:1 a 1 : 1 , de 15: 1 a 5: 1 , o de 10: 1 a 9: 1.

28.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizada además porque los lípidos adecuados se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimir¡stoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1 -m¡ristoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (MSPC), 1 -pal mito il-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PMPC), 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), PC hidrogenada de huevo (HEPC), 1-palmito¡l-2-estearo¡l-s/7-glicero-3-fosfocolina (PSPC), 1 -estearoil-2-miristoil-s/7-glicero-3-fosfocolina (SMPC), 1-estearoil-2-oleoil-SA7-glicero-3-fosfocolina (SOPC), 1-estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (SPPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), 1 ,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1 ,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), 1 ,2-dioleoil-sr7-glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfolípidos hidrogenados de soya, fosfolípidos de yema de huevo, esfingomielina (SM), esfingomielina de leche, y mezclas de los mismos.

29.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizada además porque los lípidos adecuados se seleccionan de 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1 ,2-dimiristoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), fosfolípidos hidrogenados de soya, fosfolípidos de yema de huevo, y mezclas de los mismos.

30.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada además porque los lípidos adecuados son 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1 ,2-dimiristoil-2-SA7-glicero-3-fosfocolina (DMPC) en una proporción molar de 9: 1 ; 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1 ,2-dimiristoi l-s/?-g I icero-3-fosfog licerol (DMPG) en una proporción molar de 9: 1 ; 1 ,2-dipalmitoil-2-sn-glicero-3- fosfocolina (DPPC) y 1 ,2,-dipalmitoil-SA7-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG) en una proporción molar de 9: 1 , o DPPC.

31.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizada además porque la superficie de la bicapa de lípido está modificada con moléculas que aumentan la hidrofilicidad.

32.- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 , caracterizada además porque la bicapa de lípido se modifica pegando en su superficie porciones de direccionamiento específicas de célula para facilitar su asociación con un tipo específico de célula o tejido.

33.- Un liposoma que comprende por lo menos una bicapa de lípido y clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, atrapados dentro del liposoma, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados.

34.- El liposoma de la reivindicación 33, caracterizado además porque tiene un diámetro promedio de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 300 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 140 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 15 micrómetros, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 12 micrómetros, o de aproximadamente 7 micrómetros a aproximadamente 10 micrómetros.

35.- El liposoma de la reivindicación 33 o 34, caracterizado además porque el clorito, clorato o mezcla de los mismos son atrapados con una eficiencia o tasa de inclusión de 1 % a aproximadamente 50%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 25%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%.

36.- Un metodo de preparación de liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido y clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más I í pidos adecuados, el método comprendiendo: (a) agregar una solución acuosa de clorito, clorato o una mezcla de los mismos a un recipiente que tiene una película de dichos lípidos sobre por lo menos una porción de una superficie interior; (b) agitar el recipiente bajo condiciones suficientes para separar parcial o totalmente la película de la superficie interior para proveer una solución turbia que comprende los liposomas de clorito y/o clorato atrapados; (c) tratar la solución turbia para reducir el diámetro promedio de los liposomas a una cantidad deseada; y (d) opcionalmente tratar los liposomas para separar el clorito, clorato o la mezcla de los mismos de una solución externa a los liposomas.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la proporción molar de dichos lípidos adecuados al clorito, clorato o mezcla de los mismos en el inciso (a) es de aproximadamente 0.01 : 1 a aproximadamente 10000:1 , de aproximadamente 0.1 :1 a aproximadamente 5000: 1 , de aproximadamente 0.5:1 a aproximadamente 2500:1 , de aproximadamente 1 : 1 a aproximadamente 1000:1 , o de aproximadamente 0.1 : 1 a aproximadamente 100: 1.

38.- Un método de preparación de liposomas que tienen por lo menos una bicapa de lípido y clorito, clorato, o una mezcla de los mismos, encapsulados dentro de los liposomas, en donde la bicapa de lípido está comprendida de uno o más lípidos adecuados, en donde el método es un método de inyección de etanol.

39.- El método de la reivindicación 38, caracterizado además porque el método de inyección de etanol se realiza usando una téenica de flujo cruzado.

40.- Una composición farmacéutica que comprende la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, o los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, mezclados con al menos un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable.

41.- El uso de la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40, como un medicamento.

42.- La composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40, para usarse como un medicamento.

43.- Un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección para los que resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o una mezcla de los mismos, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40, a un sujeto en necesidad de lo mismo.

44.- Un método para regular la función del macrófago, que comprende administrar una cantidad eficaz de la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40, a un sujeto en necesidad de lo mismo.

45.- El método de la reivindicación 44, en donde la regulación de la función del macrófago resulta en el tratamiento de enfermedades que producen síntomas de inflamación crónica como resultado de una respuesta inmune inapropiada.

46.- El método de la reivindicación 43, en donde las enfermedades, trastornos o afecciones para los que resulta beneficiosa la administración de clorito, clorato o la mezcla de los mismos, se seleccionan de enfermedades autommunes, enfermedades causadas por una respuesta inmune inapropiada, cicatrización de heridas, síndrome de radiación y exposición a toxinas ambientales.

47.- El método de la reivindicación 46, en donde las enfermedades, trastornos o afecciones se seleccionan de miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del suero, diabetes, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, fiebre reumática, síndrome de Sjorgen, esclerosis sistémica, espondiloartropatías, enfermedad de Lyme, sarcoidosis, hemolisis autoinmune, hepatitis autommune, neutropenia autoinmune, enfermedad poliglandular autoinmune, enfermedad tiroidea autoinmune, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis, enfermedad de Crohn, síndrome de fatiga crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra hospedero, asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, respuesta inapropiada a lesión de tejido, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis crónica, bronquitis obstructiva, enfisema, trastornos neoplásicos (cáncer), infección de V1H, SIDA, enfermedad neurodegenerativa, demencia asociada con SIDA, infecciones microbianas y otras infecciones virales.

48.- El método de la reivindicación 46, en donde la enfermedad, trastorno o afección se selecciona de asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, trastorno neoplásico, patología de la médula espinal, infección de V1H y SIDA.

49.- El método de la reivindicación 48, en donde el trastorno neoplásico es un cáncer de tracto gastrointestinal, cabeza, cuello, mama o páncreas.

50.- Un método que comprende proveer la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40 a un usuario, e informar al usuario de cierta seguridad o efectos clínicos.

51.- Un método que comprende proveer la composición liposómica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, los liposomas de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, o la composición farmacéutica de la reivindicación 40 a un usuario, e informar al usuario que la composición liposómica es más estable, más específica de tejido o más terapéuticamente eficaz que una composición no liposómica que provee, o que se espera que provea, un efecto terapéutico similar.

52.- El método de la reivindicación 50 o 51 , en donde el usuario es informado por medio de material publicado.

53.- El método de la reivindicación 52, en donde el material publicado es una etiqueta o inserto de producto.